Hyalines Knorpelgewebe besteht aus
einem einzigen Zelltyp, den Chondrozyten, die eine elastische extrazelluläre Matrix
(EZM) synthetisieren. Die gesunde EZM setzt sich hauptsächlich aus
Kollagenen und Proteoglykanen (PG) zusammen. Das im hyalinen Knorpel
vorherrschende Kollagen ist vom Typ II, das sehr elastische Fasern
bildet. Proteoglykane sorgen für
eine Quervernetzung der kollagenen Fasern. Im gesunden Knorpel findet
ein ständiger
Umsatz von Matrixkomponenten statt, der wichtig für die gleichbleibende
Elastizität
des Knorpels ist (Mankin et al., 69 und 78).
Eine wichtige Funktion für den Stoffwechsel der
EZM haben Enzyme und ihre Inhibitoren (Vincenti et al., 94). Als
Enzyme im Knorpel wirksam sind Metalloproteinasen (MMPs), die einen
Abbau von Kollagenen und Proteoglykanen katalysieren (Cawston 95 und
98). Die Aktivität
dieser Enzyme wird über
Inhibitoren (Tissue inhibitors of Metalloproteinases: TIMPs) reguliert
(Cawston 95 und 98), die ebenfalls im Knorpel synthetisiert werden
(Su et al., 99, Zafarulla et al., 96). Ein Gleichgewicht zwischen
MMPs und TIMPs ist entscheidend für den Erhalt der Knorpelmatrix
(Dean et al., 89, Martel Pelletier et al., 94).
Cytokine und Wachstumsfaktoren beeinflussen
die Synthese von Strukturkomponenten der Knorpelmatrix und von degradierenden
Enzymen sowie deren Inhibitoren (Pelletier et al., 93, Westacott
et al., 96). Im gesunden Knorpel herrscht ein Gleichgewicht zwischen
Abbau und Neusynthese von Matrixkomponenten und damit auch zwischen
der Expression von Cytokinen und Wachstumsfaktoren, das entscheidend
für den
Erhalt der Elastizität
des Knorpels ist und eine ständige
Erneuerung der „verbrauchten" Strukturkomponenten
gewährleistet.
Eine verstärkte Präsenz von
Wachstumsfaktoren im Gelenk kann die Regenerationsfähigkeit
von Knorpel in vivo unterstützen
(Glansbeek et al., 1998, van Breuningen et al. 1998) .
Die wichtigsten für den Knorpel bekannten anabolen
Wachstumsfaktoren stellen Transforming-Growth-Factor β (TGFβ) (Lafeber
et al., 93), Platelet-Derived-Growth-Factor (PDGF) (Guerne et al.,
94), Fibroblast-Growth-Factor 2 (FGF2; früher basic (b) FGF) (Guerne
et al., 94), Insulin-Like-Growth-Factor
(IGF) (Schalkwijk et al., 89) und die Bone-Morphogenetic-Proteins (BMPs) (Lietman
et al., 97, Klein-Nulend
et al., 98) dar. TGFβ,
IGF I und BMP-2 werden als wichtigste Faktoren für eine Förderung der Knorpelreifung
angesehen (van Susante et al. 2000, Martin et al. 1999, Valcourt
et al. 1999, van Osch et al. 1998, Sailor et al. 1996).
Sowohl PDGF, als auch IGF stimulieren
das Wachstum von humanen Chondrozyten (Guerne et al., 94, Kieswetter
et al., 97). IGF I ist der dominante Wachstumsfaktor im adulten
Gewebe (Vetter et al., 86) und fördert
die PG-Synthese und hemmt den Abbau von Knorpelmatrix (Schalkwijk
et al., 89, Hardingham et al., 92, Schäfer et al., 93), selbst nach
ei ner Stimulation mit dem Knorpel-degradierenden Zytokin IL-1β (Neidel et al., 94).
TGFβ1 hat
im Knorpelstoffwechsel eine anabole Wirkung, da er die Expression
von TIMP (Günther
et al., 94, Zafarulla et al., 96), die PG-(Hardingham et al., 92,
Lotz et al., 95) und Kollagen-Synthese (Redini et al., 88) stimuliert
und das Wachstum von Chondrozyten fördert (Battegay et al., 90,
Frazer et al., 94, Guerne et al., 95). Zusätzlich verstärkt TGFβ1 die
Knorpel-regenerierende Wirkung von PDGF und IGF (Mankin et al.,
91).
FGF 2 stimuliert die Proliferation
von kultivierten Chondrozyten und hat in Kombination mit TGFβ eine synergistische
Wirkung (Okazaki et al. 1996), eine Stimulierung der Matrixsynthese
durch FGF ist ebenfalls nachzuweisen (Sah et al., 1995).
BMPs regen die Proteoglykansynthese
in Chondrozyten an (Huch et al. 1997) und unterstützen die
Differenzierung von Vorläufer
Zellen (z. B. aus dem Periost oder Knochenmark) zu reifen Chondrozyten
(Denker et al. 1999, Klein-Nulend et al. 1998). Insgesamt treiben
sie die Differenzierung von Chondrozyten voran und unterstützen damit
die Knorpelheilung (Leboy et al., 1997)
Der Wirkmechanismus der von Brittberg
und Peterson entwickelten klassischen ACT-Technik beruht auf der
Fähigkeit
autologer, in Monolayer vermehrter Chondrozyten in vivo ein hyalines
bzw. hyalinähnliches
Regenerat zu bilden, das dem umgebenden hyalinen Gelenkknorpel gleicht
und damit eine funktionelle Regeneration von Knorpel-Läsionen darstellt
(Brittberg et al. 1994).
Zur Behandlung der Patienten ist
es notwendig, eine geringe Anzahl an Chondrozyten, die aus einer
kleinen Biopsie gewonnen werden, in Monolayer-Kultur zu vermehren.
Dabei nehmen die Chondrozyten die typische Form mesenchymaler Zellen an und ändern im
Vergleich zur in situ-Situation ihr Expressionsmuster (Schnabel
et al. 2002, Stokes et al. 2002, Velikonja et al. 2002, Robinson
et al. 2001). Die Fähigkeit
von Chondrozyten, nach einer Vermehrung in Monolayer und anschließender Überführung in 3D-Kultur
erneut die Marker hyalinen Knorpels zu exprimieren, wurde jedoch
in vitro bereits in zahlreichen Studien nachgewiesen (Benya et al.
1982, Lemare et al. 1998, Binette et al. 1998, Hendrickson et al.
1994, Robinson et al. 2001). An einem speziell entwickelten Zellkultur-System
konnte auch gezeigt werden, dass rein autolog in Monolayer vermehrte
Chondrozyten – ohne
den Zusatz von Periost oder Wachstumsfaktoren – nach einer Überführung in
eine 3D-Kultur ohne Träger
Kollagen II und S-100 als Knorpelmarker reexprimieren (Anderer et
al. 2002, Schlegel et al. 2002). Die Injektion von Wachstumsfaktoren
fördert und
verstärkt
in verschiedenen Zellkultursystemen die Synthese von spezifischen
Knorpelmarkern (Martin et al. 1999, van Osch et al. 2001, Worster
et al. 2001, 2zzo et al. 2002, Jakob et al. 2001) und beschleunigt
eine Heilung von Knorpeldefekten in Tiermodellen (Weisser et al.
2002, Lee et al. 2001, Hunziker et al. 2001, Perka et al. 2000).
Daher kann man davon ausgehen, dass in vivo nach der Durchführung einer
ACT die selben Mechanismen wirksam werden (Dell'Accio et al. 2001). Nach Applikation
in den durch Periost oder Kollagenmaterial geschaffenen dreidimensionalen
Raum im Gelenk zeigen die Chondrozyten wieder ihr in vivo Expressionsmuster
und regenerieren hyalinen Knorpel mit einer deutlichen Expression
von Kollagen Typ II (Schlegel et al. 2002). Dies wurde anhand von
Biopsien, die Patienten nach Durchführung einer RCT entnommen wurden,
bestätigt
(Peterson et al. 2002A und B, Philippou et al. 2002, Brittberg et
al. 2001, Roberts et al. 2001, Peterson et al. 2000B, Richardson
et al. 1999, Minas et al. 1999). In vitro konnte bereits nachgewiesen
werden, dass durch kultiviertes Periost Wachstumsfaktoren wie TGFβ, IGF I und
BMP-2 sekre tiert werden (O'Driscoll
et al. 2001A, Raab-Cullen et al. 1994), und somit die Regeneration
des hyalinen Knorpels durch die im Rahmen der ACT injizierten Chondrozyten
fördern
können.
In weiteren in vitro Experimenten
mit Gelenkknorpel verschiedener Spezies wurde gezeigt, dass sich
Chondrozyten, die in einer Zellsuspension auf die Knorpeloberfläche aufgebracht
werden, stabil mit dem nativen Gewebe verbinden (Doherty et al. 2000).
So kommt es zu einer stabilen und langfristigen Integration des
nach ACT neugebildeten Knorpels in den nativen Umgebungsknorpel.
Beim normalen Gebrauch der Gelenke
ist der sie überziehende
hyaline Gelenkknorpel enorm hohen Druckbelastungen ausgesetzt und
Schädigungen
seiner Struktur oder Verletzungen haben große Auswirkungen auf die gesamte
Funktionalität
des Systems.
Die natürliche Regenerationskapazität des Gelenkknorpels
ist sehr gering (Hunter et al. 1743, Buckwalter et al. 1990, Steinwachs
et al. 1999, Brittberg et al. 1999, Martinek et al. 2001). Im gesunden erwachsenen
Knorpel teilen sich die Chondrozyten normalerweise nicht mehr (Mankin
64). Lediglich Gelenkknorpeldefekte, bei denen die subchondrale Knochenplatte
beschädigt
wird, besitzen aufgrund des Einwanderns von Stammzellen aus dem
Markraum eine gewisse Kapazität
zur Reparatur (O'Driscoll
et al. 1998). Dagegen haben oberflächliche chondrale Defekte mit
intakter subchondraler Knochenplatte praktisch keine Kapazität zur Selbstregeneration
(Hunter et al. 1743, Mueller & Kohn
2000, Buckwalter 2000).
Ist der Knorpel einmal geschädigt, weitet
sich die Degeneration aufgrund einer Stimulierung von knorpeldegradierenden
Einflüssen
kontinuierlich aus (Lohmander et al. 1994a, Lohmander et al. 1994b, Lohmander
et al. 1996, Kuhne et al. 1998, Lohmander et al. 1999). Daher besteht
nach einer Verletzung des Knorpels für die betroffenen Patienten
ein deutlich erhöhtes
Arthroserisiko, was letztendlich häufig den Einsatz einer Gelenkendoprothese
nötig macht. Dies
wurde bereits durch verschiedene prospektive und retrospektiven
Studien nachgewiesen (Gelber et al. 2000, Roos et al. 1998, Maletius
et al. 1996, Messner et al. 1996, Kohatsu et al. 1990, Hunter et
al. 2002).
Bisher konnte durch die Behandlung
von Knorpeldefekten durch die Methode der klassischen ACT eine Wiederherstellung
der verschiedenen mechanischen Eigenschaften, wie Elastizität, Stabilität und Gleitfähigkeit
des Knorpels, sowie dessen hyaline bzw. hyalinähnliche Regeneration (Peterson
et al. 1998, Buckwalter et al. 1996) erreicht werden. Vor allem
die Gewährleistung
von langfristiger Schmerzfreiheit und Gelenkbeweglichkeit durch
den neugebildeten Gelenkknorpel (Johnstone & Yoo 1999) ist durch die ACT gegeben.
Das entstehende Knorpelregenerat besitzt die gleichen mechanischen
Eigenschaften wie gesunder Gelenkknorpel (Peterson et al. 2002A
und 1998), der durch knorpelspezifische Kollagen-II-Expression charakterisiert ist (Minas
et al. 1999, Roberts et al. 2001, Peterson et al. 2000A, Peterson
et al. 2002A, Mahroof et al. 2002). Somit wird durch das neugebildete
Gewebe das Risiko einer Arthroseentstehung verringert und der Patient vor
einer Endoprothetik bewahrt.
Aufgabe der Erfindung war es daher,
eine Gewebeersatzstruktur, insbesondere eine Knorpelersatzstruktur,
und ein Verfahren zur Behandlung bzw. Modifikation von Gewebeläsionen bereitzustellen, das
eine einfache, sichere und effiziente Behandlung von Gewebedefekten
ermöglicht.
Die Erfindung löst dieses technische Problem
durch die Bereitstellung einer Gewebeersatzstruktur, die
- (a) eine autologe Gewebezellsuspension hergestellt
aus körpereigenen
Zellen unter Zusatz von körpereigenem
Serum und ohne Zusatz von wachstumsfördernden Verbindungen und
- (b) ein vorgeformtes dreidimensionales Gewebe herstellbar dadurch,
dass aus einem menschlichen oder tierischen Organismus Zellen gewonnen
werden und diese in Zellkulturgefäßen mit hydrophober Oberfläche und
sich verjüngendem
Boden als Suspensionskultur stationär so lange kultiviert werden
bis ein Zellaggregat entsteht, in welche differenzierte Zellen eingebettet
sind, und das einen äußeren Bereich
aufweist, in welchem proliferations- und migrationsfähige Zellen
vorhanden sind,
umfasst.
Weiterhin betrifft die Erfindung
in einer bevorzugten Ausführungsform
die Bereitstellung einer Knorpelersatzstruktur, wobei diese
- (a) eine autologe Knorpelzellsuspension hergestellt
aus körpereigenen
Zellen unter Zusatz von körpereigenem
Serum und ohne Verwendung von wachstumsfördernden Verbindungen und
- (b) ein vorgeformtes dreidimensionales Knorpelgewebe herstellbar
dadurch, dass aus einem menschlichen oder tierischen Organismus
Knorpelzellen, Knochenzellen, oder mesenchymale Stammzellen gewonnen
werden und diese in Zellkulturgefäßen mit hydrophober Oberfläche und sich
verjüngendem
Boden als Suspensionskultur stationär so lange kultiviert werden
bis ein Zellaggregat entsteht, das zu mindestens 40 Vol.% extrazelluläre Matrix
beinhaltet, in welche differenzierte Zellen eingebettet sind, und
das einen äußeren Bereich
aufweist, in welchem proliferations- und migrationsfähige Zellen
vorhanden sind,
umfasst.
Bevorzugt ist, dass die Gewebeersatzstruktur
eine Muskelersatzstruktur, insbesondere eine glatte Herzmuskelersatzstruktur
oder eine Knochenersatzstruktur ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren
zur Modifikation einer Gewebeläsion,
bei dem in die Gewebeläsion
- (a) eine autologe Zellsuspension hergestellt
aus körpereigenen
Zellen unter Zusatz von körpereigenem
Serum und ohne Zusatz von wachstumsfördernden Verbindungen und
- (b) ein vorgeformtes dreidimensionales Gewebe herstellbar dadurch,
dass aus einem menschlichen oder tierischen Organismus Zellen gewonnen
werden und diese in Zellkulturgefäßen mit hydrophober Oberfläche und
sich verjüngendem
Boden als Suspensionskultur stationär so lange kultiviert werden
bis ein Zellaggregat entsteht, in welche differenzierte Zellen eingebettet
sind, und das einen äußeren Bereich
aufweist, in welchem proliferations- und migrationsfähige Zellen
vorhanden sind,
eingebracht werden.
Die Erfindung betrifft in einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform
ein Verfahren zur Modifikation einer Knorpelläsion, bei dem in die Knorpelläsion
- (a) eine autologe Knorpelzellsuspension hergestellt
aus körpereigenen
Zellen unter Zusatz von körpereigenem
Serum und ohne Zusatz vom wachstumsfördernden Verbindungen und
- (b) ein vorgeformtes dreidimensionales Knorpelgewebe herstellbar
dadurch, dass aus einem menschlichen oder tierischen Organismus
Knorpelzellen, Knochenzellen, oder mesenchymale Stammzellen gewonnen
werden und diese in Zellkulturgefäßen mit hydrophober Oberfläche und sich
verjüngendem
Boden als Suspensionskultur stationär so lange kultiviert werden
bis ein Zellaggregat entsteht, das zu mindestens 40 Vol.% extrazelluläre Matrix
beinhaltet, in welche differenzierte Zellen eingebettet sind, und
das einen äußeren Bereich
aufweist, in welchem proliferations- und migrationsfähige Zellen
vorhanden sind,
eingebracht werden.
Bevorzugt ist die Gewebeläsion eine
Knochen-, Knorpel- und/oder
Muskelläsion.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren
wird die natürliche
Wirkung von Wachstumsfaktoren, die eine Regeneration von Knorpel
unterstützen,
genutzt, um die Behandlung des Defektes, insbesondere gegenüber der
klassischen Therapie zu beschleunigen. Mit Hilfe des dreidimensionalen
Gewebes, insbesondere Knorpelgewebes, ist es möglich, eine Expression von
völlig
natürlichen
autologen Wachstumsfaktoren direkt im behandelten Defekt zu erreichen
und damit die Bildung eines funktionsfähigen Regenerates zu beschleunigen.
Im Rahmen einer Behandlung der Modifikation
einer Gewebeläsion,
insbesondere einer Knorpelläsion,
werden demgemäß neben
einer autologen Knorpelzellsuspension auch ein vorgeformtes dreidimensionales
Knorpelgewebe appliziert, wobei das dreidimensionale Knorpelgewebe
die für
die Stimulation der Matrixsynthese notwendigen Wachstumsfaktoren
synthetisiert, wodurch die Heilung bzw. Modifikation des behandelten
Gewebeschadens, wie z.B. des Knorpelschadens, unter stützt wird.
Die gemeinsam mit dem dreidimensionalen Knorpelgewebe, welche auch
als 3D Konstrukte bezeichnet werden können, eingebrachten Zellen
der Knorpelsuspension garantieren, dass eine optimale Integration
des entstehenden Regenerates, insbesondere in den Umgebungsknorpel
erfolgt. Durch die von dem dreidimensionalen Gewebe synthetisierten
Wachstumsfaktoren wird z.B. die Matrixbildung der Suspensionszellen
verstärkt
angeregt und damit die Heilung des Defektes beschleunigt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere
deshalb vorteilhaft, da unter völlig
autologen Bedingungen, d.h., ohne den Zusatz von Stoffen, die nicht
vom Patienten selbst stammen, bereits in vitro ein dreidimensionales
Knorpelgewebe vorgeformt wurde, das in seinen Eigenschaften nativem
Knorpel sehr ähnlich
ist und damit sofort nach der Operation die Grundlage für den weiteren
Aufbau von Knorpelsubstanz schafft.
Ein weiterer Vorteil ist, dass die
aufwendige Applikation des Periostlappens gemäß den bekannten Verfahren damit
umgangen werden kann, da die durch das Periost sezernierten Wachstumsfakatoren, die
in dem bekannten Verfahren essentiell für den Wirkmechanismus sind,
in dem erfindungsgemäßen Verfahren
durch das vorgeformte dreidimensionale Knorpelgewebe bereitgestellt
werden. Es konnte erfindungsgemäß nachgewiesen
werden, dass die vorgeformten dreidimensionalen Knorpelgewebe in
der Lage sind, bereits in vitro eine hyaline Knorpelmatrix zu bilden.
Insbesondere Kollagen II, als das charakteristische Protein hyalinen
Gelenkknorpels, wird durch die vorgeformtes dreidimensionalen Knorpelgewebe
in großen
Mengen gebildet und vor allem werden die Wachstumsfaktoren zu diesem
Zeitpunkt der Transplantation bereits aktiv hergestellt.
In einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung wird nach dem Einbringen der Knorpelzellsuspension
und des Knorpelgewebes die Läsion
mit einer Membran abgedeckt.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von
aus einem menschlichen oder tierischen Organismus gewonnenen Knorpelzellen,
Muskelzellen, Knochenzellen, oder mesenchymale Stammzellen, die
in Zellkulturgefäßen mit
hydrophober Oberfläche und
sich verjüngendem
Boden als Suspensionskultur stationär so lange kultiviert werden
bis ein Zellaggregat entsteht, das insbesondere zu mindestens 40 Vol.%
extrazelluläre
Matrix beinhaltet, in welche differenzierte Zellen eingebettet sind,
und das einen äußeren Bereich
aufweist, in welchem proliferations- und migrationsfähige Zellen
vorhanden sind, als Lieferant von Botenstoffen, Struktur-, Gerüst- und/oder Matrixbausteinen,
insbesondere Wachstumsfaktoren und/oder Cytokinen.
Durch die Verwendung von gewonnenen Knorpelzellen
als Quelle von regenerationsfördernden
Wachstumsfaktoren und bereits vorgeformter hyaliner Knorpelmatrix
kann eine bedeutend schnellere Heilung von Knorpeldefekten erreicht
werden als dies mit bisher bekannten Methoden möglich ist. Ein wesentlicher
Vorteil, den die Verwendung – in
vivo oder in vitro – neben
der schnellen Wirksamkeit bietet, ist die Tatsache, das der Patient
rein autolog behandelt werden kann und so das Risiko einer Abwehrreaktion
auf das eingebrachte Transplantat ausgeschlossen werden kann.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform
der Erfindung erfolgt die Verwendung in vivo oder in vitro.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Verwendung zur Behandlung einer Gewebeläsion, bevorzugt
einer Knorpel-, Knochen- und/oder Muskelläsion.
Die Erfindung betrifft also eine
Gewebeersatzstruktur und ein Verfahren zur Modifikation bzw. Behandlung
von Gewebe läsionen,
beispielsweise von Knorpelläsionen,
mit ausschließlich
körpereigenem
dreidimensionalen gezüchteten
Knorpel in Form sogenannter Spheroide; hiermit ist beispielsweise
die Wiederherstellung von degenerierten Arthroseknorpel möglich. Mit
Hilfe dieser Spheroidtechnologie bzw. der Spheroide wird eine Plattformtechnologie für weitreichende
weitere Produktinnovationen bereitgestellt, womit die körpereigene
Zellregeneration von traumatisch bedingten Gelenk-Knorpelschäden möglich ist.
Dieser Einsatz von patienteneigenen, durch Spheroide produzierten
Wachstumsfaktoren führt
zu einer wesentlich schnelleren Ausbildung von druckstabilem Gelenkknorpel.
Erreicht wird dies insbesondere durch gezieltes monospezifisches
Heranwachsen von Knorpel, wodurch eine minimal invasive, arthroskopische
autologe Condrozytentransplantationsbehandlung möglich ist. Insbesondere werden hierdurch
die Krankenhaus- und Rehabilitationszeiten signifikant vermindert.
Ebenfalls vermindert werden die Kosten und es wird eine schnellere
Wiederherstellung des behandelten Patienten erreicht. Diese Spheroidtechnologie
ist selbstverständlich
nicht auf Knorpel beschränkt,
sondern kann zur Regeneration von allen menschlichen Geweben eingesetzt werden.