JP6318130B2 - 心筋毒性検査および心筋細胞評価のための方法および装置 - Google Patents
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Description
(1)基板、
該基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞あるいは該心筋細胞を含む細胞集団、
上記基板上に上記細胞集団の周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた領域内に供給しおよび/または排出する培養液供給/排出チャネル、
上記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御/記録手段
を備えた細胞品質評価装置であって、
上記微小電極へ送る上記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
1)上記心筋細胞あるいは上記細胞集団が上記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して上記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
2)上記電気刺激による強制拍動刺激インターバル(RR)に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、強制拍動刺激に対するFPDの変化が、FPD/(RR)1/3からFPD/(RR)1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を可能にする、細胞品質評価装置。
(2)基板、
該基板上に配置された、安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞を保持するための複数の細胞保持部を含む心筋細胞集団保持領域、
上記基板表面と、上記心筋細胞集団保持領域の周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための空間領域、
上記細胞培養液を上記空間領域内に供給しおよび/または排出するための培養液供給/排出チャネル、
上記透明基板上に設けられ、上記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部の一つまたは一部の細胞保持部において心筋細胞を載置するための微小電極、
上記細胞培養液を満たすための上記空間領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御/記録手段
を備えた細胞品質評価装置であって、
上記微小電極へ送る上記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
1)上記心筋細胞あるいは上記細胞集団が上記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して上記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
2)上記電気刺激による強制拍動刺激インターバル(RR)に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、強制拍動刺激に対するFPDの変化が、FPD/(RR)1/3からFPD/(RR)1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を可能にする、心筋品質評価装置。
(3)基板、
該基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞あるいは該心筋細胞を含む細胞集団、
上記基板上に上記細胞集団の周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた領域内に供給しおよび/または排出する培養液供給/排出チャネル、
上記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御/記録手段
を備えた細胞品質評価装置を用いて、
上記微小電極へ送る上記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
1)上記心筋細胞あるいは上記細胞集団が上記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して上記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
2)上記電気刺激による強制拍動刺激インターバル(RR)に対して上記細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、上記強制拍動刺激に対するフィールド・ポテンシャル・デュレーション(FPD)の変化が、FPD/(RR)1/3からFPD/(RR)1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を含む、細胞品質評価方法。
(4)基板、
該基板上に配置された、安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞を保持するための複数の細胞保持部を含む心筋細胞集団保持領域、
上記基板表面と、上記心筋細胞集団保持領域の周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための空間領域、
上記細胞培養液を上記空間領域内に供給しおよび/または排出するための培養液供給/排出チャネル、
上記透明基板上に設けられ、上記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部の一つまたは一部の細胞保持部において心筋細胞を載置するための微小電極、
上記細胞培養液を満たすための上記空間領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御/記録手段
を備えた細胞品質評価装置を用いて、
上記微小電極へ送る上記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
1)上記心筋細胞あるいは上記細胞集団が上記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して上記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
2)上記電気刺激による強制拍動刺激インターバル(RR)に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、強制拍動刺激に対するFPDの変化が、FPD/(RR)1/3からFPD/(RR)1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を含む、心筋品質評価方法。
[1]透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団、
該透明基板上に配置され、該細胞集団と連携して上記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞および線維芽細胞を含む細胞ネットワーク、
上記透明基板上に上記細胞集団および上記細胞ネットワークの周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた領域内に供給しおよび/または排出する培養液供給/排出チャネル、
上記細胞に作用する薬剤を上記細胞培養液に加えるための薬剤供給チャネル、
上記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記細胞ネットワークの個々の細胞をそれぞれ載置している微小電極、
上記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御/記録手段
を備える、心筋毒性検査装置。
[2]透明基板、
該透明基板上に配置された、安定した拍動を行う心筋細胞を保持するための複数の細胞保持部(CHG)を含む心筋細胞集団保持領域、
上記細胞保持部の1細胞と連携して上記心筋細胞集団の拍動を伝える細胞を保持するための、直列配列された複数の細胞保持部(CHn)を含む細胞ネットワーク領域であって、該細胞保持部(CHn)が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞ネットワーク領域、
上記透明基板表面と、上記心筋細胞集団保持領域および上記細胞ネットワーク領域の周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための空間領域、
上記細胞培養液を上記空間領域内に供給しおよび/または排出するための培養液供給/排出チャネル、
上記細胞に作用する薬剤を上記細胞培養液に加えるための薬剤供給チャネル、
上記透明基板上に設けられ、上記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部(CHG)の一つまたは一部の細胞保持部において心筋細胞を載置するための微小電極、
上記透明基板上に設けられ、上記細胞ネットワーク領域の複数の細胞保持部(CHn)において個々の細胞を載置するための複数の微小電極、
上記細胞培養液を満たすための上記空間領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御/記録手段
を備える、心筋毒性検査装置。
[3]上記細胞ネットワークの上記細胞を載置するための少なくとも1つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与えることができるように構成されている、上記[1]または[2]記載の心筋毒性検査装置。
[4]上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測するように構成されている、上記[1]〜[3]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[5]フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間(フィールドポテンシャルデュレーション)のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測するように構成されている、上記[1]〜[3]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[6]上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、上記細胞ネットワークの上記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測するように構成されている、上記[1]〜[3]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[7]上記細胞が載った各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形の各々について微分することによって細胞電位を計測するように構成されている、上記[1]〜[3]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[8]上記細胞が載置された各電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形を重ね合わせて合成フィールド・ポテンシャル波形を合成し、心電図データと比較可能な細胞集団全体としての拍動伝達の乱れ具合を計測するように構成されている、上記[1]〜[3]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[9]上記細胞の配置された微小電極の電位を一定に保つフィードバック電位制御機構を備え、該電位制御機構が供給する電流量を解析するように構成されている、上記[1]〜[3]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[10]上記細胞への周期的強制拍動刺激開始後、30秒以上経過してから計測を開始するように構成されている、上記[1]〜[3]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[11]上記透明基板上に配置した上記細胞の状態を光学的に計測するための光学系および光学カメラをさらに備え、
上記光学カメラで取得された画像のデータが上記制御/記録手段に記録される、上記[1]〜[10]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[12]上記細胞保持部(CHG,CHn)の各々が、上記透明基板上に設けられた細胞非接着性の壁で囲まれた空間として規定され、該壁が上記細胞が通り抜けることの出来ない1以上の間隙を有する、上記[2]〜[11]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[13]上記心筋細胞集団保持領域と上記細胞ネットワーク領域との間に、上記細胞培養液の流れを阻害するとともに上記心筋細胞集団保持領域の複数の細胞保持部(CHG)のうち一つに収容された細胞と上記細胞ネットワーク領域の端部の細胞保持部(CHn)の細胞とが連携するための開口部を有する障壁が設けられた、上記[2]〜[12]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[14]透明基板、
該透明基板上に配置された複数個の細胞保持部(CHG)を含む心筋細胞集団保持領域、
該心筋細胞集団保持領域の細胞保持部(CHG)の1細胞と連携して上記心筋細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された細胞保持部(CHn)を含む細胞ネットワーク領域であって、該細胞保持部(CHn)が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞ネットワーク領域、
上記透明基板表面と、上記心筋細胞集団保持領域および上記細胞ネットワーク領域の周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための空間領域、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた空間領域内に供給しおよび/または排出するための培養液供給/排出手段、
上記細胞に作用する薬剤を上記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、
上記透明基板上に設けられ、上記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部(CHG)の一つにおいて心筋を載置している微小電極、
上記透明基板上に設けられ、上記細胞ネットワーク領域の複数の細胞保持部(CHn)において上記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
上記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、
X−Y方向に駆動されるとともに上記透明基板を載置するステージ、ならびに
上記ステージ上に載置された上記透明基板上の細胞の状態を光学的に計測する手段、
を備える、心筋毒性検査装置。
[15]透明基板、
該透明基板上に配置された、心筋細胞を保持するための複数個の細胞保持部(CHG)を含む心筋細胞集団保持領域、
該細胞集団の1細胞と連携して上記心筋細胞集団の拍動を伝えるための、直列配列された複数個の細胞保持部(CHn)を含む細胞ネットワーク領域であって、該細胞保持部(CHn)が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞ネットワーク領域、
上記透明基板表面と、上記心筋細胞集団保持領域および上記細胞ネットワーク領域の周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
上記透明基板上に設けられ、上記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部(CHG)の一つにおいて心筋細胞を載置している微小電極、
上記透明基板上に設けられ、上記細胞ネットワーク領域の複数の細胞保持部(CHn)において上記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
上記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、および
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線、
を備える、心筋毒性検査チップ。
[16]上記[1]〜[14]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置または上記[15]に記載の心筋毒性検査チップを使用して、上記細胞に作用する薬剤が上記細胞培養液に加えられたときに、上記心筋細胞集団の発生する拍動が上記細胞ネットワーク領域の上記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して上記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
[17]上記[1]または[2]記載の心筋毒性検査装置を用いて前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞ネットワーク領域の前記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する方法であって、下記のうちの少なくとも1つの工程を含む方法:
(i)上記細胞ネットワークの上記細胞を載置するための少なくとも1つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与える工程;
(ii)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程;
(iii)フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間(フィールドポテンシャルデュレーション)のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程;
(iv)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、上記細胞ネットワークの上記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測する工程;
(v)上記細胞が載った各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形の各々について微分することによって細胞電位を計測する工程;
(vi)上記細胞が載置された各電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形を重ね合わせて合成フィールド・ポテンシャル波形を合成し、心電図データと比較可能な細胞集団全体としての拍動伝達の乱れ具合を計測する工程;
(vii)上記細胞の配置された微小電極の電位を一定に保つフィードバック電位制御機構を用いて、該電位制御機構が供給する電流量を解析する工程;および
(viii)上記細胞への周期的強制拍動刺激開始後、30秒以上経過してから計測を開始する工程。
[18]上記微小電極の近傍に配置された、細胞電位計測におけるノイズ除去のための差分用の参照電極をさらに備える、上記[1]〜[14]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[19]上記微小電極が、刺激電極および計測電極からなる、上記[18]記載の心筋毒性検査装置。
[20]心筋細胞が培養されている心筋細胞培養計測領域に、薬剤を連続して底面から導入して上方の液面から排出する機構と、その導入する薬剤の温度をモニターして適切な温度に維持する機構と、導入される薬液の濃度を計測するために光学的に透明な領域を持つ管と、波長280ナノメートルから800ナノメートルの範囲で吸光分光定量計測が可能である上記[19]記載の心毒性検査装置。
[21]上記微小電極が透明である、上記[1]〜[14]、[18]〜[20]のいずれか一項に記載の心筋毒性検査装置。
[22]上記微小電極の抵抗値を減少させるために、光学系により観察する領域以外の領域に配された透明電極配線上に金属レイヤーを付加してある、上記[21]記載の心毒性検査装置[23]培養されている上記複数の心筋細胞が上記基板上に直線状に配置されて心筋細胞ネットワークを形成しており、
上記直線状心筋細胞ネットワークの端点に局所に刺激を与えるための電極が配置されている、上記[1]〜[14]、[18]〜[22]のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
[24]さらに、上記直線状心筋細胞ネットワークの過半数の心筋細胞が載ることができる1つの直線状の計測電極を備える、上記[23]記載の心毒性検査装置。
[25]培養されている上記複数の心筋細胞が上記基板上にリング状に配置されて心筋細胞ネットワークを形成しており、
上記リング状心筋細胞ネットワークのリングの一部を欠損させて、その点に局所に刺激を与える電極が配置されている、上記[1]〜[14]、[18]〜[22]のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
[26]さらに、上記リング状心筋細胞ネットワークの過半数の心筋細胞が載ることができる1つのリング状の計測電極を備える、上記[25]記載の心毒性検査装置。
[27]上記[1]〜[26]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を使用して、上記細胞に作用する薬剤が上記細胞培養液に加えられたときに、上記心筋細胞集団の発生する拍動が上記細胞ネットワーク領域の上記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して上記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
[28]上記[1]〜[14]、[18]〜[26]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を用いて上記細胞に作用する薬剤が上記細胞培養液に加えられたときに、上記心筋細胞集団の発生する拍動が上記細胞ネットワーク領域の上記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して上記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する方法であって、下記のうちの少なくとも1つの工程を含む方法:
(i)上記細胞ネットワークの上記細胞を載置するための少なくとも1つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与える工程;
(ii)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程;
(iii)フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間(フィールドポテンシャルデュレーション)のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程;
(iv)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、上記細胞ネットワークの上記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測する工程;
(v)上記細胞が載った各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形の各々について微分することによって細胞電位を計測する工程;
(vi)上記細胞が載置された各電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形を重ね合わせて合成フィールド・ポテンシャル波形を合成し、心電図データと比較可能な細胞集団全体としての拍動伝達の乱れ具合を計測する工程;
(vii)上記細胞の配置された微小電極の電位を一定に保つフィードバック電位制御機構を用いて、該電位制御機構が供給する電流量を解析する工程;および
(viii)上記細胞への周期的強制拍動刺激開始後、30秒以上経過してから計測を開始する工程。
[29]心毒性評価のために、評価したい薬剤を添加した後に、上記[1]〜[14]、[18]〜[26]のいずれか一項記載の装置で得られた細胞外電位信号のFPD値の延長の平均値をX軸に、FPD値のゆらぎであるSTV値をY軸にプロットして、その相対位置から評価する、上記[27]または[28]記載の心筋毒性検査方法。
[30]透明基板、
上記透明基板上に形成された壁で囲まれた領域であって、細胞培養液で満たされている領域、
上記細胞培養液で満たされている領域内に配置された複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団、
上記細胞培養液で満たされている領域内に設けられた、上記細胞集団の一つの心筋細胞あるいは上記細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記細胞培養液で満たされている領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている上記心筋細胞の電位を計測する電位計測手段、
上記電位計測手段で計測した被検薬物加入前後における上記心筋細胞の電位データを記録する記録手段、ならびに
上記電位データから、フィールド・ポテンシャル(FP)波形のうちナトリウムイオンの細胞への流入ピークからカリウムイオンの細胞からの流出ピークまでの経過時間(細胞外電位持続時間)(FPD)および該FPDのゆらぎの大きさを算出し、該算出したFPDおよびSTVを指標として用いて上記被検薬物の心筋毒性を評価する解析手段
を備える、心筋毒性検査装置。
[31]透明基板、
上記透明基板表面に形成された壁で囲まれた領域であって、細胞培養液を満たすための領域、
該透明基板上の上記壁で囲まれた領域内の、複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団を保持するための心筋細胞集団保持領域、
上記透明基板上の上記心筋細胞集団保持領域に設けられた心筋細胞を載置するための微小電極、
上記透明基板上の上記細胞培養液を満たすための上記領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている上記心筋細胞の電位を計測する電位計測手段、
上記電位計測手段で計測した被検薬物適用前後における上記心筋細胞の電位データを記録する記録手段、ならびに
上記電位データからフィールド・ポテンシャル(FP)波形のうちナトリウムイオンの細胞への流入ピークからカリウムイオンの細胞からの流出ピークまでの経過時間(細胞外電位持続時間)(FPD)および該FPDのゆらぎの大きさを算出し、該算出したFPDおよびSTVを指標として用いて上記被検薬物の心筋毒性を評価する解析手段
を備える、心筋毒性検査装置。
[32]上記FPDのゆらぎの大きさが該FPDの短期変動(STV)である、上記[30]または[31]記載の心筋毒性検査装置
[33]上記心筋細胞の載置された上記微小電極の電位を一定に保つフィードバック電位制御機構をさらに備える、上記[30]または[31]記載の心筋毒性検査装置。
[34]上記透明基板上に配置した上記心筋細胞の状態を光学的に計測するための光学系および光学カメラをさらに備え、上記光学カメラで取得された画像のデータが上記記録手段に記録される、上記[30]〜[33]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[35]上記心筋細胞を適切な温度に維持する温度制御機構を有する上記[30]〜[34]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置
[36]上記解析手段において、FPDのゆらぎの大きさを、隣接するフィールド・ポテンシャル(FP)信号波形の比較によって計測するように構成されている、上記[30]〜[33]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[37]上記解析手段において、上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、上記細胞ネットワークの上記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測するように構成されている、上記[30]〜[33]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[38]上記解析手段において、上記細胞が載った各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形の各々について微分することによって細胞電位を計測するように構成されている、上記[30]〜[33]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[39]上記解析手段において、上記細胞が載置された各電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形を重ね合わせて合成フィールド・ポテンシャル波形を合成し、心電図データと比較可能な細胞集団全体としての拍動伝達の乱れ具合を計測するように構成されている、上記[30]〜[33]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[40]上記微小電極が、複数の微小電極からなる多電極アレイを構成している、上記[30]〜[34]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[41]上記細胞への周期的強制拍動刺激開始後、30秒以上経過してから計測を開始するように構成されている、上記[30]〜[35]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[42]上記微小電極の近傍に配置された、細胞電位計測におけるノイズ除去のための差分用の参照電極をさらに備える、上記[30]〜[37]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[43]上記微小電極が、刺激電極および計測電極からなる、上記[42]記載の心筋毒性検査装置。
[44]上記細胞培養液を上記壁で囲まれた領域内に供給し、および/または排出する培養液供給/排出チャネルを備える、上記[30]〜[39]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
[45]上記壁で囲まれた上記心筋細胞が培養されている領域内に被検薬物を連続して底面から導入して上方の液面から排出するための薬物導入/排出チャネルと、該導入する薬物の温度をモニターして適切な温度に維持する温度制御機構とを備え、上記チャネルの一部が、導入される該薬液の濃度を計測可能なように光学的に透明であり、波長280ナノメートルから800ナノメートルの範囲で吸光分光定量計測を可能とする、上記[30]〜[39]のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
[46]上記微小電極が透明である、上記[30]〜[31]のいずれか一項に記載の心筋毒性検査装置。
[47]上記微小電極の抵抗値を減少させるために、光学系により観察する領域以外の領域に配された透明電極配線上に金属レイヤーを付加してある、上記[43]記載の心毒性検査装置。
[48]培養されている上記複数の心筋細胞が上記基板上に直線状に配置されて心筋細胞ネットワークを形成しており、
上記直線状心筋細胞ネットワークの端点に局所に刺激を与えるための電極が配置されている、上記[30]〜[44]のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
[49]さらに、上記直線状心筋細胞ネットワークの過半数の心筋細胞が載ることができる1つの直線状の計測電極を備える、上記[45]記載の心毒性検査装置。
[50]培養されている上記複数の心筋細胞が上記基板上にリング状に配置されて心筋細胞ネットワークを形成しており、
上記リング状心筋細胞ネットワークのリングの一部を欠損させて、その点に局所に刺激を与える電極が配置されている、上記[30]〜[44]のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
[51]さらに、上記リング状心筋細胞ネットワークの過半数の心筋細胞が載ることができる1つのリング状の計測電極を備える、上記[47]記載の心毒性検査装置。
[52]上記[30]〜[48]のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を用いて心筋細胞に作用する薬物の毒性を検査する方法であって、
細胞培養液中で培養されている複数の安定した拍動を行う心筋細胞を含む心筋細胞集団に被検薬物を添加する工程、および
上記薬物の上記細胞培養液への添加の前後における、上記心筋細胞集団の発生する拍動の変化を評価する工程
を含み、
上記拍動の変化を評価する際に、FPD波形の延長と該FPDのゆらぎの大きさの増加を指標とすることを特徴とする、方法。
[53]複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団を準備する工程、
培養容器内の底面に多電極アレイが配された該培養容器中で上記細胞集団を培養する工程、
上記培養している上記細胞集団へ被検薬物を添加し、上記多電極アレイを用いて上記培養細胞集団の細胞電位を測定する工程であって、上記薬物の添加の前後において、上記培養細胞集団の細胞電位を測定し、該細胞電位のデータを取得する工程、ならびに
上記取得した細胞電位のデータから、フィールド・ポテンシャル(FP)波形のうちナトリウムイオンの細胞への流入ピークからカリウムイオンの細胞からの流出ピークまでの経過時間(細胞外電位持続時間)(FPD)および該FPDのゆらぎの大きさを算出し、該算出したFPDおよび該FPDのゆらぎの大きさの組み合わせを指標として用いて上記薬物の心筋毒性を評価する工程、
を含む、薬物の心筋毒性検査方法。
[54]上記FPDのゆらぎの大きさが該FPDの短期変動(STV)である、上記[19]または[53]に記載の方法。
[55]上記薬物の心筋毒性を評価する工程において、上記薬物の添加後のFPD波形の延長とSTVの増加を指標として該薬物の心筋毒性を評価する、上記[53]に記載の方法。
[56]上記FPD波形の延長が所定の閾値を超えるFPD頻度とSTVの増加が所定の閾値を超えるSTV頻度とを用いて二次元プロットを作成し、該二次元プロットに基づいて上記薬物の心筋毒性の評価を行う、上記[55]に記載の方法。
[57]上記二次元プロットにおいて、複数の薬物のプロットの相対位置から該薬物の心筋毒性を評価する、上記[56]に記載の方法。
(1)基板、
該基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞あるいは該心筋細胞を含む細胞集団、
上記基板上に上記細胞集団の周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた領域内に供給しおよび/または排出する培養液供給/排出チャネル、
上記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御/記録手段
を備えた細胞品質評価装置であって、
上記微小電極へ送る上記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
1)上記心筋細胞あるいは上記細胞集団が上記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して上記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
2)上記電気刺激による強制拍動刺激インターバル(RR)に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、強制拍動刺激に対するFPDの変化が、FPD/(RR)1/3からFPD/(RR)1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を可能にする、細胞品質評価装置。
(2)基板、
該基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞あるいは該心筋細胞を含む細胞集団、
上記基板上に上記細胞集団の周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた領域内に供給しおよび/または排出する培養液供給/排出チャネル、
上記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御/記録手段
を備えた細胞品質評価装置を用いて、
上記微小電極へ送る上記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
1)上記心筋細胞あるいは上記細胞集団が上記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して上記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
2)上記電気刺激による強制拍動刺激インターバル(RR)に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、上記強制拍動刺激に対するフィールド・ポテンシャル・デュレーション(FPD)の変化が、FPD/(RR)1/3からFPD/(RR)1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を含む、細胞品質評価方法。
(3)心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測するように構成されている、心筋毒性検査装置。
(4)フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間(フィールドポテンシャルデュレーション:FPD)のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測するように構成されている、上記(3)に記載の心筋毒性検査装置。
(5)FPDおよび該FPDのゆらぎの大きさを算出し、該算出したFPDおよび該FPDのゆらぎの大きさの組み合わせを指標とするように構成されている、上記(3)または(4)に記載の心筋毒性検査装置。
(6)上記FPDのゆらぎの大きさが該FPDの短期変動(STV)である、上記(3)〜(5)のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
(7)透明基板、
上記透明基板上に形成された壁で囲まれた領域であって、細胞培養液で満たされている領域、
上記細胞培養液で満たされている領域内に配置された複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団、
上記細胞培養液で満たされている領域内に設けられた、上記細胞集団の一つの心筋細胞あるいは上記細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記細胞培養液で満たされている領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている上記心筋細胞の電位を計測する電位計測手段、
上記電位計測手段で計測した被検薬物加入前後における上記心筋細胞の電位データを記録する記録手段
を備える、上記(3)〜(6)のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
(8)上記安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団が、拍動を伝えることが可能な複数個の心筋細胞および線維芽細胞を含む細胞ネットワークである、上記(3)〜(7)のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
(9)透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団からなるペースメーカー領域、
該透明基板上に配置され、該細胞集団と連携して上記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞および線維芽細胞を含む細胞ネットワーク、
上記透明基板上に上記細胞集団および上記細胞ネットワークの周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた領域内に供給しおよび/または排出する培養液供給/排出チャネル、
上記細胞に作用する薬剤を上記細胞培養液に加えるための薬剤供給チャネル、
上記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記細胞ネットワークの個々の細胞をそれぞれ載置している微小電極、
上記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御/記録手段
を備える、上記(3)〜(8)のいずれか一項に記載の心筋毒性検査装置。
(10)上記安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞を載置するための少なくとも1つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与えることができるように構成されている、上記(3)〜(9)のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
(11)上記直列配列された細胞ネットワークの端点に局所に刺激を与えるための電極が配置されている、上記(8)〜(10)のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
(12)上記細胞ネットワークが、リング状に配置されて形成されており、
該リングの一部を欠損させて、その点に局所に刺激を与える電極が配置されている、上記(8)〜(11)のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
(13)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、上記細胞ネットワークの上記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測するように構成されている、上記(8)〜(12)のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
(14)上記心筋細胞を適切な温度に維持する温度制御機構を有する上記(1)〜(13)のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
(15)上記微小電極が、複数の微小電極からなる多電極アレイを構成している、上記(1)〜(14)のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
(16)心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測することを特徴とする心筋毒性検査方法。
(17)複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団を準備する工程、
培養容器内の底面に多電極アレイが配された該培養容器中で上記細胞集団を培養する工程、
上記培養している上記細胞集団へ被検薬物を添加し、上記多電極アレイを用いて上記培養細胞集団の細胞電位を測定する工程であって、上記薬物の添加の前後において、上記培養細胞集団の細胞電位を測定し、該細胞電位のデータを取得する工程、ならびに
上記取得した細胞電位のデータから、フィールド・ポテンシャル(FP)波形のうちナトリウムイオンの細胞への流入ピークからカリウムイオンの細胞からの流出ピークまでの経過時間(細胞外電位持続時間)(FPD)および該FPDのゆらぎの大きさを算出し、該算出したFPDおよび該FPDのゆらぎの大きさの組み合わせを指標として用いて上記薬物の心筋毒性を評価する工程、
を含む、上記(16)に記載の薬物の心筋毒性検査方法。
(18)上記(8)〜(15)のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を使用して、上記細胞に作用する薬剤が上記細胞培養液に加えられたときに、上記心筋細胞集団の発生する拍動が上記細胞ネットワーク領域の上記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して上記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する上記(16)または(17)に記載の心筋毒性検査方法。
(19)上記(8)〜(15)のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を用いて上記細胞に作用する薬剤が上記細胞培養液に加えられたときに、上記心筋細胞集団の発生する拍動が上記細胞ネットワーク領域の上記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して上記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する方法であって、下記のうちの少なくとも1つの工程を含む上記(16)〜(18)のいずれか一項記載の方法:
(i)上記細胞ネットワークの上記細胞を載置するための少なくとも1つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与える工程;
(ii)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程;
(iii)フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間(フィールドポテンシャルデュレーション)のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程;
(iv)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、上記細胞ネットワークの上記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測する工程;
(v)上記細胞が載った各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形の各々について微分することによって細胞電位を計測する工程;
(vi)上記細胞が載置された各電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形を重ね合わせて合成フィールド・ポテンシャル波形を合成し、心電図データと比較可能な細胞集団全体としての拍動伝達の乱れ具合を計測する工程;
(vii)上記細胞の配置された微小電極の電位を一定に保つフィードバック電位制御機構を用いて、該電位制御機構が供給する電流量を解析する工程;および
(viii)上記細胞への周期的強制拍動刺激開始後、30秒以上経過してから計測を開始する工程。
(20)上記FPDのゆらぎの大きさが該FPDの短期変動(STV)である、上記(16)〜(19)のいずれか一項記載の方法。
なお、観察に使用する微小電極を観察電極と言う場合がある。
関係について、既知のヒト心臓においてのQTインターバルの長さと心拍との関係の研究(Patrick Davey, How to correct the QT interval for the effects of heart rate in clinical studies. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 48 (2002) 3 - 9)からFredericiaの補正、すなわち拍動の速さの違いによってQTの長さが変化してしまい相対比較できないことから、拍動周期が毎分60拍の心筋拍動時のQTの長さ(QTC)に補正するためにQTC=QT/(RR)1/3として換算するもの、あるいは、Bazettが提唱したQTC=QT/(RR)1/2として換算するものに一致するかどうかが重要となる。これは、上に説明したようにin vivoでのQTの長さは、本システムで計測する細胞ネットワーク全体で計測したFPDの長さの重ね合わせに相当し、それは、すなわち各細胞のFPD自体が、上記、FredericiaあるいはBazettの補正の範疇に入るべきであることを示唆しているが、実際に、図34(b)の結果は、QTC=QT/(RR)1/2.5となっており、FredericiaあるいはBazettの補正の間にあることがわかる。また、図35は図33および図34のグラフに示したデータを表にしたものである。
1)心筋細胞あるいは心筋細胞集団に対して強制拍動刺激を与え、細胞あるいは細胞集団がその強制拍動刺激に応答して強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、あるいはさらに具体的に、この応答の追従がたとえば少なくても1.8Hzまで追従することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること。
2)上記、強制拍動刺激インターバル(RR)に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、強制拍動刺激に対するFPDの変化が、FPD/(RR)1/3からFPD/(RR)1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること。
これらの心筋細胞は、心筋毒性検査に使用することができる。
材料と方法
1.細胞培養
ヒトES細胞由来心筋クラスターはセラーティス社から購入した。生状態で受け取り、ガラスキャピラリー(Vitrolife社)を使って回収し、DMEMに20%非動化FBS、1%非必須アミノ酸、1%ペニシリンストレプトマイシン、0.2%ベータメルカプトエタノールを加えた培地中で培養した(全てInvitrogen社より購入)。
次に、回収したクラスターを多電極チップ(アルファメッドサイエンティフィック社)に配置した。配置した日をDay 0とした。Day3に200 mV以上の細胞外電位(FP)の1stピークが得られたクラスターをデータ取得に使用した。データ取得には多電極細胞電位計測システム(日京テクノス社)を使用した。
薬剤適用前に対象データ(’Before’と呼ぶ)を10分間取得した。薬剤は脱イオン化蒸留水(DDW)、またはDMSOに溶解し、PBSで希釈して適用した。最終濃度はE-4031は0.1 μM 及び 1μM、DL-sotalolは0.1 mM 及び 1 mM、Diltiazemは0.1 mM 及び 1 mMで適用した。取得したデータから細胞外電位持続時間(FPD)とFPDのSTV(short term variability)を算出した。
FPの下向きの急峻なピークはNa+流入に相当する。上向きの緩やかなピークはK+の流出に相当する。Na+とK+ピーク間の時間をFPDとした。さらに、FPDの拍動間のバラツキをFPDのSTVとして評価した。STVは以下の式で求めた。
FPD間のばらつきの増加はSTVの値の増加として評価できる。拍動レートのばらつきによるFPDへの影響を抑えるため、下のFredericiaの補正式を用いて、FPDとFPDのSTVを補正し、cFPD、cSTVを得た。
(RR は FPの直前のNa+ピーク間の時間)
薬物の心毒性リスクを評価するため、QT延長やAPDの延長、及びこれらのSTVが単独で利用されている。FPD延長とSTV増加を統合して評価するため、我々は「2次元プロット」を開発した。X軸はFPDがBeforeより10%以上延長したクラスターの頻度(FPDスコア)を表す。Y軸はSTVがBeforeより100%以上増加したクラスターの頻度(STVスコア)を表す。それぞれのクラスターで適用2濃度のうち、いずれかで上記の増加が認められた場合、「延長した(FPD)」「増加した(STV)」とした。このプロットでは、薬物の心毒性の強度に依存した領域に薬物がプロットされる。
2次元プロット
図39は評価した薬物の2次元プロットである。E-4031とDL-sotalolは図の右上にプロットされた。Diltiazemは左上に、DDWは右下にプロットされた。E-4031及びDL-sotalolはIKr阻害剤で、APDとSTVを増加させることがin vivo、in vitro両方で知られている。E-4031は心毒性のリスクが高い理由で開発が中断した薬物であり、心毒性が高い薬物である。DL-sotalolは抗不整脈薬だが、致死性不整脈のリスクが無視できないことから心毒性は高いと考えられる。DiltiazemはCa2+チャネル阻害剤で、APDはin vivoで減少することが知られており、心毒性リスクは低いと考えられている。DDWは心毒性無し、と考えられた。従って、我々の得たプロットでは、図中右上は「心毒性が高い」領域であり、左上および右下は「心毒性が低い」領域と判断した。未知の薬物を本評価法で評価したときに2次元プロットのどの領域にプロットされたかにより、心毒性の高低を評価できる。
Claims (13)
- 透明基板、
前記透明基板上に形成された壁で囲まれた領域であって、前記領域内に細胞培養液を満たし、複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団を配置するための領域、
前記透明基板上の前記領域内に設けられた、前記細胞集団の一つの心筋細胞あるいは前記細胞集団の局所部分を載置するための微小電極、
前記透明基板上の前記領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置された前記心筋細胞の電位を計測するための電位計測手段、
前記電位計測手段で計測した被検薬物加入前後における前記心筋細胞の電位データを記録するための記録手段を備え、
心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測するように構成され、
前記フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間(フィールドポテンシャルデュレーション:FPD)のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測するように構成されており、
前記FPDのゆらぎの大きさが該FPDの短期変動(STV)である、心筋毒性検査装置。 - 前記FPDおよび該FPDのゆらぎの大きさを算出し、該算出したFPDおよび該FPDのゆらぎの大きさの組み合わせを指標とするように構成されている、請求項1に記載の心筋毒性検査装置。
- 前記安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団が、拍動を伝えることが可能な複数個の心筋細胞および線維芽細胞を含む細胞ネットワークである、請求項1または2のいずれか一項に記載の心筋毒性検査装置。
- 透明基板、
該透明基板上に配置された、複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団を載置するためのペースメーカー領域、
該透明基板上に配置された、該細胞集団と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞および線維芽細胞を含む細胞ネットワークを載置するための領域、
前記透明基板上に前記細胞集団および前記細胞ネットワークの周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給しおよび/または排出する培養液供給/排出チャネル、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加えるための薬剤供給チャネル、
前記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置するための微小電極、
前記細胞ネットワークの個々の細胞をそれぞれ載置するための微小電極、
前記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
前記微小電極へ送る電気刺激を制御し、前記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御/記録手段を備える、請求項1〜3のいずれか一項に記載の心筋毒性検査装置。 - 前記安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団の1つの細胞または前記細胞集団の局所部分を載置するための少なくとも1つの微小電極から該微小電極上に載置される前記細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与えることができるように構成されている、請求項1〜4のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
- 前記直列配列された細胞ネットワークの端点に局所に刺激を与えるための電極が配置されている、請求項4に記載の心筋毒性検査装置。
- 前記細胞ネットワークが、リング状に配置されて形成されており、
該リングの一部を欠損させて、その点に局所に刺激を与える電極が配置されている、請求項3〜6のいずれか一項に記載の心筋毒性検査装置。 - 前記微小電極のそれぞれから取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、前記細胞ネットワークの前記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測するように構成されている、請求項1〜7のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
- 前記心筋細胞を適切な温度に維持する温度制御機構を有する請求項1〜8のいずれか一項に記載の心筋毒性検査装置。
- 前記微小電極が、複数の微小電極からなる多電極アレイを構成している、請求項1〜9のいずれか一項に記載の心筋毒性検査装置。
- 心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測することを特徴とする心筋毒性検査方法であって、
複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団を準備する工程、
培養容器内の底面に多電極アレイが配された該培養容器中で前記細胞集団を培養する工程、
前記培養している前記細胞集団へ被検薬物を添加し、前記多電極アレイを用いて前記培養細胞集団の細胞電位を測定する工程であって、前記薬物の添加の前後において、前記培養細胞集団の細胞電位を測定し、該細胞電位のデータを取得する工程、ならびに
前記取得した細胞電位のデータから、フィールド・ポテンシャル(FP)波形のうちナトリウムイオンの細胞への流入ピークからカリウムイオンの細胞からの流出ピークまでの経過時間(細胞外電位持続時間)(FPD)および該FPDのゆらぎの大きさを算出し、該算出したFPDおよび該FPDのゆらぎの大きさの組み合わせを指標として用いて前記薬物の心筋毒性を評価する工程、を含み、
前記FPDのゆらぎの大きさが該FPDの短期変動(STV)である、心筋毒性検査方法。 - 請求項1〜10のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を使用して、細胞に作用する薬剤が細胞培養液に加えられたときに、心筋細胞集団の発生する拍動が細胞ネットワーク領域の細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する請求項11に記載の心筋毒性検査方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を用いて前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞ネットワーク領域の前記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する方法であって、下記のうちの少なくとも1つの工程を含む請求項11または12に記載の方法:
(i)前記細胞ネットワークの前記細胞を載置するための少なくとも1つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与える工程;
(ii)前記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程;
(iii)フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間(フィールドポテンシャルデュレーション)のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程;
(iv)前記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、前記細胞ネットワークの前記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測する工程;
(v)前記細胞が載った各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形の各々について微分することによって細胞電位を計測する工程;
(vi)前記細胞が載置された各電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形を重ね合わせて合成フィールド・ポテンシャル波形を合成し、心電図データと比較可能な細胞集団全体としての拍動伝達の乱れ具合を計測する工程;
(vii)前記細胞の配置された微小電極の電位を一定に保つフィードバック電位制御機構を用いて、該電位制御機構が供給する電流量を解析する工程;および
(viii)前記細胞への周期的強制拍動刺激開始後、30秒以上経過してから計測を開始する工程。
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