JP6307500B2 - シーケンサ前処理装置およびその方法 - Google Patents
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Description
その他、所定の目的核酸もしくはその断片またはそれらの一部と相補性を有する塩基配列をもつ核酸若しくはその断片を磁性粒子に結合させる場合もある。これらの内の少なくとも2種類の磁性粒子が、組み合わされて用いられることもある。
前記ノズルまたはノズルに装着された分注チップは、前記移動機構によってこれらの容器に到達して、液体の吸引および吐出、または、チップの装着や脱着が可能である。なお、ノズルは、後述する吸引吐出機構と連通し、気体の吸引および吐出がなされる。該「吸引吐出機構」は、例えば、シリンダと、該シリンダ内を摺動するピストンと、該ピストンと連結したナット部と、該ナット部が螺合するボール螺子と、該ボール螺子を正逆両方向に回転駆動するモータとを有するものや、ポンプ機構である。
「キャピラリー型電気泳動用チップ」とは、ゲルが封入された透光性のある細管と、該細管と連通する太管と、該細管の下端に設けられた流体が進入可能な口部と、前記太管の上端に設けられた開口部とを有するものである。前記太管の開口部は、後述するノズルヘッドの電極支持部材によって装着等によって解除可能に支持可能であるとともに、該開口部から電気泳動溶液(バッファ液)を導入可能である。該太管内に電気泳動溶液を挿入した後に、該チップを該電極支持部材に支持された場合には、該電極支持部材に設けられた第1の電極が前記太管内に挿入されて太管内に収容される電気泳動溶液と接触可能である。一方、前記細管の口部は、第2の電極が設けられ収容される測定対象液と接触可能に設けられた電極付液収容部に挿入されると、前記測定対象液が口部から進入されることになる。第1の電極と第2の電極の間に所定の電圧を印加することによって前記キャピラリー型電気泳動用チップ内に電場を及ぼし、電荷を帯びた核酸または断片が電場から力を受けてゲル中を移動することができる。なお、細管は、例えば、0.05mm〜0.5mm、好ましくは0.1mm〜0.3mmの内径をもつ細径管であることが好ましい。キャピラリー型電気泳動用チップの支持または装着は、例えば、容器群に収容されたキャピラリー型電気泳動用チップに対して前記ノズルヘッドを下降することによって前記電極支持部材またはキャップを前記開口部に嵌合して装着することによって行なう。分注チップの装着についても同様にしてノズルヘッドを下降することによって前記ノズルを前記分注チップの装着用開口部に嵌合することで装着させる。脱着についても、前記分注チップと同様の形状をもつチップ脱着部を用いて脱着することも可能である。なお、前記第1の電極と第2の電極の間に電圧を印加する電源装置が必要である。
前記電極間に印加する電圧は、例えば数ボルトから数1000ボルト程度である。
制御部は、前記シーケンサ前処理装置に内蔵したコンピュータ(CPU)および該コンピュータを駆動するプログラムからなり、例えば、DA変換器およびAD変換器を通して信号を前記吸引吐出機構、前記移動機構、および前記磁力部、または必要ならば温度制御器に対して制御が行われる。
「各種チップ」とは、各種分注チップ(0.5mL〜50mLの通常容量の分注チップ、または前記小容量の分注チップ等を含む)または前述したようにキャピラリー型電気泳動用チップである。
なお、前記細管内の光学的状態を測定する光測定器があることが好ましい。また、前記電極支持部材は、ノズルヘッドにノズルとともに設けられることが好ましい。この発明によれば、キャピラリー型電極泳動チップを前記電極支持部材に対して使い捨てとして用いることができるので、操作が容易であって、クロスコンタミネーションを防止して信頼性が高い。
本実施の形態に係るシーケンサ前処理装置10は、気体の吸引および吐出を行なう吸引吐出機構43によって液体の吸引および吐出が可能な複数(本例では、6本)の分注チップ49をその装着用開口部に着脱可能に装着する複数(本例では、6個)のノズル411〜416を有するノズルヘッド40と、磁性粒子懸濁液53、63を含む各種液を収容する液収容部および反応容器を含有する収容部群90と、前記ノズルヘッド40に設けられたノズル411〜416と前記収容部群90との間を相対的に移動可能とするノズル移動機構80と、前記反応容器内の温度制御が可能な温度制御器91と、処理の結果得られた生成物の品質の評価を行なう品質評価エリア30と、前記ノズルヘッド40に設けられ、ノズル411〜416に装着された6本の分注チップ54に外部から磁場を及ぼしかつ除去することが可能な磁力部44と、前記吸引吐出機構、前記ノズル移動機構、および前記磁力部を外部信号によって制御するための情報処理を行うCPU及びプログラム20と、該CPU+プログラム20に対して指示を与え、データの入力を行なう操作部11とを有する。前記ノズル移動機構は、前記移動機構に相当する。また、前記収容部群90と品質評価エリア30とを合わせたものが容器群に相当する。
本実施の形態に係るシーケンサ前処理装置10は、例えば、長さが600mm(X軸方向)、奥行きが600mm(Y軸方向)、高さが500mm(Z軸方向)程度の前面が取り外し可能な扉13が取り付けられ上面が天板14で覆われた筐体12に囲まれている。該筐体12内には、前述したように、該天板14にノズル移動機構80を介して吊り下げられるように設けられた前記ノズルヘッド40、ステージ15には、前記容器群としての品質評価エリア30および収容部群90にそれぞれ属する吸光度測定エリア35、分子量評価エリア36、インターナルコントロール測定エリア37、および、前記収容部群90に属する前記抽出用エリア50、前記断片化作成エリア60および前記PCRエリア70が設けられている。なお、前記操作部11およびCPU+プログラム20についても、該筐体12の側壁及びその内部に組み込まれている。
電極支持部材421は、その先端部をキャップ421aが装着され、該キャップ421aの下端をピン状の第1の電極471が貫いている。該第1の電極471は、電極合体端子421bを介して前記電極支持部材421に着脱可能に取り付けられている。
右側のグラフは、蛍光で標識化された断片を、前記表に記載された10の濃度の場合について、電気泳動法により乖離した断片の量を測定した実験結果を示すものである(Series1では、結合促進剤濃度が10〜7.5%の場合の乖離液の量を順次変更して、乖離した断片を回収しながら順次得られた一連の実験結果であり、Series 2では、結合促進剤濃度が7.5〜5%となるように乖離液の量を順次変更して乖離した断片を回収しながら順次得られたSeries1とは異なる溶液を用いた一連の実験結果を表す) 。このグラフに示すように、前記表に記載された10の濃度の順(a〜j)に対応する、10個の正規分布のグラフが得られ、各ピークの位置(a〜j)が前記磁性粒子からの乖離によって得られる表に記載された各分子量に対応することが明瞭に示されている。なお、グラフの横軸は、泳動時間すなわち泳動距離を表すものであって、分子量の大きさに対応している。
前記操作部11より指示があると、前記ノズルヘッド40が前記抽出用エリア50の前記チップ等収容部541〜546から分注チップ54をノズル411〜416に装着し、前記反応容器551〜556にまで移動して、抽出された核酸を含有する溶液の一部を吸引して、前記吸光度測定エリア35の前記透光性のある液収容部331〜336に分注する。前記各液収容部331〜336に収容された溶液に対して特定の波長の光、例えば、260nm,280nm,または200nmから可視光の範囲の波長、さらには、190nm〜800nmの波長の光を照射してその吸光度を測定することで、断片の濃度を測定することができる。
20 CPU+プログラム
30 品質評価エリア
31、131 光測定器
321〜3212、1321〜13212 導光路
321b〜3212b、1321b〜13212b、
321c〜3212c、1321c〜13212c 導光路
35 吸光度測定エリア
36 分子量評価エリア
37 インターナルコントロール測定エリア
40、140 ノズルヘッド
41 ノズル配列基板
411〜416 ノズル
42 電極支持部材配列板
421〜426 電極支持部材
50、150 抽出用エリア
53、63 磁性粒子懸濁液
54 分注チップ
551〜556、671〜676、741〜746 反応容器
60 断片化作成エリア
61 断片化溶液
611〜616 断片化溶液収容部
64 キャピラリー型電気泳動用チップ
65 結合促進剤溶液
651〜656 結合促進剤溶液収容部
70 PCRエリア
73 小容量分注チップ
90 収容部群
Claims (18)
- 気体の吸引および吐出を行なう吸引吐出機構、該吸引吐出機構と連通し液体の吸引および吐出が可能な1または2以上の分注チップが着脱可能に装着されるノズルを有するノズルヘッド、磁性粒子懸濁液を含む各種液を収容する液収容部および反応容器を少なくとも有する容器群、前記ノズルと容器群との間で相対的に移動可能とする移動機構、および、前記ノズルに装着された分注チップ内に磁場を及ぼすことが可能な磁力部を有するシーケンサ前処理装置を用いて、前記容器群に収容された検体、抽出用試薬溶液および磁性粒子懸濁液を混合して、検体から核酸を抽出する抽出工程と、
該シーケンサ前処理装置を用いて、抽出した前記核酸を前記容器群に収容された断片化溶液と混合して断片化し、少なくとも断片化された前記核酸と、前記磁性粒子懸濁液と、前記容器群に収容された結合促進剤とを混合させ、磁性粒子に対して前記断片を結合させ、シーケンサに応じた所定範囲の塩基配列数をもつ断片またはそれ以外の断片を、電気泳動法で予め得られた結合促進剤の濃度と断片の塩基配列数との関係に基づいて、結合促進剤の該当する濃度が得られるように前記容器群に収容された乖離液を加えることで前記磁性粒子から乖離させることによって作成する断片化作成工程と、
前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記作成した断片を含有する溶液の所定量を、増幅用溶液とともに前記反応容器内に分注する増幅前処理工程と、を有するシーケンサ前処理方法。 - 前記反応容器内の温度制御が可能な温度制御器をさらに有する前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記シーケンサ前処理装置の該反応容器を温度制御することによって、前記作成した断片を増幅する増幅工程をさらに有する請求項1に記載のシーケンサ前処理方法。
- 各種チップ内または前記反応容器内の光学的状態を測定する光測定器をさらに有する前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記各工程の少なくとも1において得られた生成物の品質評価を行なう品質評価工程をさらに有する請求項1または請求項2に記載のシーケンサ前処理方法。
- 前記各工程の少なくとも1において、前記シーケンサ前処理装置を用いて前記工程の結果得られた前記生成物を所定の磁性粒子懸濁液と混合し、前記ノズルに装着した分注チップを介して前記混合液の吸引吐出を繰り返すことで前記磁性粒子に捕獲させ、前記磁力部を用いて分注チップの内壁に吸着させることで各工程の処理目的に合致するように核酸またはその断片を精製する工程をさらに有する請求項1乃至請求項2に記載のシーケンサ前処理方法。
- 前記品質評価工程として、前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記各工程の少なくとも1において、該工程の結果得られた生成物についてその分子量の評価を行う請求項3に記載のシーケンサ前処理方法。
- 前記品質評価工程として、前記各工程の少なくとも1において、前記シーケンサ前処理装置を用いて前記核酸またはその断片の濃度の評価を行なう請求項3または請求項5に記載のシーケンサ前処理方法。
- 前記品質評価工程は、前記容器群にゲルが封入された細管および該細管と連通する太管からなる1または2以上のキャピラリー型電気泳動用チップが収容され、前記ノズルヘッドには、前記キャピラリー型電気泳動用チップを前記太管側で支持可能であって前記太管に収容される電気泳動用溶液と接触可能な第1の電極が設けられ前記ノズル移動機構により前記容器群に対してノズルとともに相対的に移動可能な1または2以上の電極支持部材を有し、前記容器群には、収容した液と接触可能に設けられた第2の電極を有する1または2以上の電極付液収容部をさらに有する前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記容器群に設けられた電気泳動用溶液を収容する液収容部から電気泳動用溶液を前記太管内に分注し、該キャピラリー型電気泳動用チップを該太管側において前記電極支持部材に支持させて前記電気泳動用溶液と該電極とを接触させ、各工程の結果得られた生成物を抜き出して前記電極付液収容部に分注し、該生成物を標識化し、該電極付液収容部に前記細管の先端を挿入させ、前記電極を通して電場を前記チップ内に及ぼし、前記細管内を前記光測定器により測定することによって分子量の評価を行なう請求項5に記載のシーケンサ前処理方法。
- 前記品質評価工程として、前記増幅工程において、前記シーケンサ前処理装置を用いて前記核酸またはその断片に含有させた前記インターナルコントロール用核酸若しくはその断片を測定するインターナルコントロール測定工程を有する請求項3、請求項5乃至請求項7のいずれかに記載のシーケンサ前処理方法。
- 気体の吸引および吐出を行う吸引吐出機構と、該吸引吐出機構と連通し液体の吸引および吐出が可能な分注チップが着脱可能に装着される1または2以上のノズルを有するノズルヘッドと、磁性粒子懸濁液を含む各種液を収容する液収容部および反応容器を少なくとも有する容器群と、前記ノズルと前記容器群との間を相対的に移動可能とする移動機構と、前記ノズルに装着された分注チップに外部から磁場を及ぼしかつ除去することが可能な磁力部とを有するとともに、
少なくとも、前記吸引吐出機構、前記移動機構、および前記磁力部を外部信号に基づいて制御する制御部を有し、該制御部は、前記容器群に収容された検体、抽出用試薬溶液および磁性粒子懸濁液を混合攪拌して、核酸を抽出する抽出制御部と、抽出した前記核酸を前記容器群に収容された断片化溶液と混合して断片化し、断片化された前記核酸から磁性粒子懸濁液を用いてシーケンサに応じた所定範囲の塩基配列数を持つ断片を作成する断片化作成制御部と、前記作成された断片を含有する溶液の所定量を、増幅用溶液とともに前記反応容器内に所定の分注チップで分注して混合するように制御する増幅前処理制御部と、を有するとともに、
前記断片化作成制御部は、少なくとも断片化された前記核酸と少なくとも前記磁性粒子懸濁液と、前記容器群に収容された結合促進剤とを前記分注チップを用いて混合させ、磁性粒子に対して前記断片を結合させ、前記所定範囲の塩基配列数をもつ断片またはそれ以外の断片を、電気泳動法で予め得られた結合促進剤の濃度と断片の塩基配列数との関係に基づいて、結合促進剤の該当する濃度が得られるように前記容器群に収容された乖離液を加えることで前記磁性粒子から乖離させることによって、前記断片を作成するように制御するシーケンサ前処理装置。 - 前記反応容器内の温度制御が可能な温度制御器をさらに有するとともに、前記制御部には、該反応容器を温度制御することによって、前記作成した断片を増幅する増幅制御部をさらに有する請求項9に記載のシーケンサ前処理装置。
- 前記各種チップ内または前記反応容器内の光学的状態を測定する光測定器をさらに有するとともに、前記制御部は、該光測定器をも外部信号に基づいて制御するとともに、前記各制御部の少なくとも1について、前記制御部の制御の結果得られた生成物の品質の評価を行なう品質評価制御部をさらに有する請求項9又は請求項10に記載のシーケンサ前処理装置。
- 前記制御部は、前記核酸またはその断片を含む溶液を前記磁性粒子懸濁液と吸引吐出によって混合攪拌して、前記磁性粒子に目的とする核酸またはその断片を捕獲させ捕獲した磁性粒子を前記分注チップ内に磁場を及ぼして内壁に吸着させて前記核酸またはその断片を精製するように制御する精製制御部を有する請求項9又は請求項10に記載のシーケンサ前処理装置。
- 前記容器群に、ゲルが封入された透光性のある細管および該細管と連通する太管からなる1または2以上のキャピラリー型電気泳動用チップが収容され、前記ノズルヘッドには、前記キャピラリー型電気泳動用チップを前記太管側で支持可能であって前記太管に収容される電気泳動用溶液と接触可能な第1の電極が設けられ前記移動機構により前記容器群に対してノズルとともに相対的に移動可能な1または2以上の電極支持部材を有し、前記容器群には、収容した液と接触可能に設けられた第2の電極を有する1または2以上の電極付液収容部を有する請求項9又は請求項12に記載の核酸シーケンサ前処理装置。
- 前記光測定器は、前記容器群内に設けられ透光性を有する1または2以上の液収容部内の吸光度を測定可能に設けられ、前記品質評価制御部は、前記各制御部によって生成された生成物を含む溶液を前記各液収容部に収容して、前記光測定器によって、各液収容部の吸光度を測定する請求項11に記載の核酸シーケンサ前処理装置。
- 品質評価制御部は、前記容器群に設けられた電気泳動用溶液を収容する液収容部から電気泳動用溶液を前記太管内に分注し、該キャピラリー型電気泳動用チップを該太管側において前記電極支持部材に支持させて前記溶液と該電極とを接触させ、各工程の結果得られた生成物を抜き出して前記電極付液収容部に分注し、該生成物を標識化し、該電極付液収容部に前記細管の先端を挿入させ、前記電極を通して電場を前記チップ内に及ぼし、前記細管内を光測定器により測定することによって分子量の評価を行なうように制御する請求項13に記載のシーケンサ前処理装置。
- 前記第1の電極は、前記電極支持部材の電極取付部に電気伝導可能に取り付けられた請求項13又は請求項15に記載のシーケンサ前処理装置
- 前記電極支持部材には、該電極支持部材の先端を被覆するキャップを有し、該キャップには、前記電極支持部材の前記第1の電極が貫くように突出するとともに、前記キャピラリー型電気泳動用チップが取り付けられて該チップの開口部を閉塞する請求項13に記載のシーケンサ前処理装置。
- 1または2以上の前記キャピラリー型電気泳動用チップの前記細管に近接または接触しかつ該細管に沿って移動可能に設けられ、または、1または2以上の透光性を有する反応容器の側面に近接また接触して設けられた1または2以上の先端および後端を有する可撓性のある導光路と、該後端が所定経路に沿って配列された配列体と、該配列体の前記所定経路に沿って相対的に移動可能であって、前記後端と順次光学的に接続可能な光測定器とを有する請求項13、請求項15乃至請求項17のいずれかに記載のシーケンサ前処理装置。
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