JP6306583B2 - 代謝経路の生成物の製造方法 - Google Patents
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Description
(i)フィトエン脱水素酵素(crtI)および第1の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(ii)β−リコピンシクラーゼ(lcy−B)および第2の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(iii)β−カロテンケトラーゼ(crtW)および第3の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
第1、第2および第3の調節配列は、Icy−BおよびcrtWの発現が、crtIの発現のレベルよりも大きいよう選択される、複数の単離ポリヌクレオチド配列が提供される。
(i)フィトエン脱水素酵素(crtI)および第1の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(ii)β−リコピンシクラーゼ(lcy−B)および第2の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(iii)β−カロテンケトラーゼ(crtW)および第3の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
第1、第2および第3の調節配列は、lcy−BおよびcrtWの発現が、crtIの発現のレベルよりも大きいよう選択される、方法が提供される。
(i)イソペンテニルピロリン酸(idi)および第1の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(ii)ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(crtE)および第2の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(iii)プレフィトエンピロリン酸シンターゼ(crtB)および第3の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(iv)フィトエン脱水素酵素(crtI)および第4の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(v)β−リコピンシクラーゼ(lcy−B)および第5の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(vi)β−カロテンケトラーゼ(crtW)および第6の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(vii)β−カロテンヒドロキシラーゼ(crtZ)および第7の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
第4、第5および第6の調節配列は、lcy−BおよびcrtWの発現が、crtIの発現のレベルよりも大きいよう選択される、方法が提供される。
(i)イソペンテニルピロリン酸(idi)および第1の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(ii)ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(crtE)および第2の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(iii)プレフィトエンピロリン酸シンターゼ(crtB)および第3の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(iv)フィトエン脱水素酵素(crtI)および第4の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(v)β−リコピンシクラーゼ(lcy−B)および第5の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(vi)β−カロテンケトラーゼ(crtW)および第6の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(vii)β−カロテンヒドロキシラーゼ(crtZ)および第7の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
第4、第5および第6の調節配列は、Icy−BおよびcrtWの発現が、crtIの発現のレベルよりも大きいよう選択される、複数の単離ポリヌクレオチド配列が提供される。
(iv)イソペンテニルピロリン酸(idi)および第4の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドまたは
(v)ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(crtE)および第5の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドまたは
(vi)プレフィトエンピロリン酸シンターゼ(crtB)および第6の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドまたは
(vii)β−カロテンヒドロキシラーゼ(crtZ)および第7の転写調節配列をコードするポリヌクレオチド
のうち少なくとも1つをさらに含む。
ここで、(ii)のRBSの配列は、配列番号2または3に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、lcy−Bの発現を引き起こすよう選択され、
(iii)のRBSの配列は、配列番号2または3に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtWの発現を引き起こすよう選択される。
ここで、(v)のRBSの配列は、配列番号2または3に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、lcy−Bの発現を引き起こすよう選択され、
(vi)のRBSの配列は、配列番号2または3に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtWの発現を引き起こすよう選択される。
ここで、(ii)のRBSの配列は、配列番号5に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtEの発現を引き起こすよう選択され、
(iii)のRBSの配列は、配列番号3に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtBの発現を引き起こすよう選択され、
(iv)のRBSの配列は、配列番号7に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtIの発現を引き起こすよう選択され、
(v)のRBSの配列は、配列番号2に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、lcy−Bの発現を引き起こすよう選択され、
(v)のRBSの配列は、配列番号3に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtWの発現を引き起こすよう選択され、
(vi)のRBSの配列は、配列番号6に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtZの発現を引き起こすよう選択される。
(ii)のRBSの配列は、配列番号3に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtEの発現を引き起こすよう選択され、
(iii)のRBSの配列は、配列番号7に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtBの発現を引き起こすよう選択され、
(iv)のRBSの配列は、配列番号5に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtIの発現を引き起こすよう選択され、
(v)のRBSの配列は、配列番号2に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、lcy−Bの発現を引き起こすよう選択され、
(v)のRBSの配列は、配列番号2に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtWの発現を引き起こすよう選択され、
(vi)のRBSの配列は、配列番号2に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtZの発現を引き起こすよう選択される。
(viii)デオキシキシルロース−5−リン酸シンターゼ(DXS)および第8の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
(v)のRBSの配列は、配列番号2または3に示されるような配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、lcy−Bの発現を引き起こすよう選択され、
(vi)のRBSの配列は、配列番号2または3に示されるような配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtWの発現を引き起こすよう選択される。
ここで、(ii)のRBSの配列は、配列番号5に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtEの発現を引き起こすよう選択され、
(iii)のRBSの配列は、配列番号3に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtBの発現を引き起こすよう選択され、
(iv)のRBSの配列は、配列番号7に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtIの発現を引き起こすよう選択され、
(v)のRBSの配列は、配列番号2に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、lcy−Bの発現を引き起こすよう選択され、
(vi)のRBSの配列は、配列番号3に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtWの発現を引き起こすよう選択され、
(vii)のRBSの配列は、配列番号6に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtZの発現を引き起こすよう選択される。
ここで、(ii)のRBSの配列は、配列番号3に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtEの発現を引き起こすよう選択され、
(iii)のRBSの配列は、配列番号7に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtBの発現を引き起こすよう選択され、
(iv)のRBSの配列は、配列番号5に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtIの発現を引き起こすよう選択され、
(v)のRBSの配列は、配列番号2に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、lcy−Bの発現を引き起こすよう選択され、
(vi)のRBSの配列は、配列番号2に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtWの発現を引き起こすよう選択され、
(vii)のRBSの配列は、配列番号2に示されるような配列を有するRBSの程度の少なくとも80%に、crtZの発現を引き起こすよう選択される。
(i)第1の酵素コード配列と作動可能に連結している第1のRBSと、
(ii)第2の酵素コード配列と作動可能に連結している第2のRBSと、
(iii)第3の酵素コード配列と作動可能に連結している第3のRBSと
を含む単離ポリヌクレオチドであって、
第2のRBSは、第2の酵素コード配列の発現のレベルが、第1の酵素コード配列の発現のレベルよりも大きいよう選択され、
第3のRBSは、第3の酵素コード配列の発現のレベルが、第2の酵素コード配列の発現のレベルよりも大きいよう選択され、
第1の酵素、第2の酵素および第3の酵素は、同一ではない酵素であり、対象の同一生成物の生合成経路の各部分である、単離ポリヌクレオチドが提供される。
(iv)第4の酵素コード配列と作動可能に連結している第4のRBS
をさらに含む。
(v)第5の酵素コード配列と作動可能に連結している第5のRBS
をさらに含む。
(vi)第6の酵素コード配列と作動可能に連結している第6のRBS
をさらに含む。
(a)細胞における対象の生成物の合成を可能にする条件下で本明細書に記載されたポリヌクレオチドを細胞中に導入することと、
(b)対象の生成物の量を測定することと
を含み、対象の生成物の量は、選択されるポリヌクレオチド配列を示す、方法が提供される。
同一の意味を有する。本発明の実施形態の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料が使用され得るが、例示的方法および/または材料が以下に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて本特許明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、単に例示的なものであって、必ずしも制限であるよう意図されない。
(i)第1の酵素コード配列と作動可能に連結している第1のRBSと、
(ii)第2の酵素コード配列と作動可能に連結している第2のRBSと、
(iii)第3の酵素コード配列と作動可能に連結している第3のRBSと
を含む単離ポリヌクレオチドであって、
第2のRBSは、第2の酵素の発現のレベルが、第1の酵素の発現のレベルよりも大きいよう選択され、
第3のRBSは、第3の酵素の発現のレベルが、第2の酵素の発現のレベルよりも大きいよう選択され、
第1の酵素、第2の酵素および第3の酵素は、同一ではない酵素であり、同一生成物の生合成経路の各部分である、単離ポリヌクレオチドが提供される。
(RBS−A):AGGAGGTTTGGA(配列番号2)
(RBS−B):AACAAAATGAGGAGGTACTGAG(配列番号3)
(RBS−C):AAGTTAAGAGGCAAGA(配列番号4)
(RBS−D):TTCGCAGGGGGAAG(配列番号5)
(RBS−E):TAAGCAGGACCGGCGGCG(配列番号6)
(RBS−F):CACCATACACTG(配列番号7)
が挙げられる。
AGGAAA、(配列番号70)、AGAAAA(配列番号71)、AGAAGA(配列番号72)、AGGAGA(配列番号73)、AAGAAGGAAA(配列番号74)、AAGGAAAA(配列番号75)、AAGGAAAG(配列番号76)、AAGGAAAU(配列番号77)、AAGGAAAAA(配列番号78)、AAGGAAAAG(配列番号79)、AAGGAAAAU(配列番号80)、AAGGAAAAAA(配列番号81)、AAGGAAAAAG(配列番号82)、AAGGAAAAAU(配列番号83)、AAGGAAAAAAA(配列番号84)、AAGGAAAAAAG(配列番号85)、AAGGAAAAAAU(配列番号86)、AAGGAAAAAAAA(配列番号87)、AAGGAAAAAAAG(配列番号88)、AAGGAAAAAAAU(配列番号89)、AAGGAAAAAAAAA(配列番号90)、AAGGAAAAAAAAG(配列番号91)、AAGGAAAAAAAAU(配列番号92)、AAGGAAAAAAAAAA(配列番号93)、AAGGAAAAAAAAAG(配列番号94)、AAGGAGGAAA(配列番号95)およびAAGGAAAAAAAAAU(配列番号96)。
GGTCGAGTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG、(配列番号97);GGTGGACTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG、(配列番号98);CCTCGAGTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG、(配列番号99);GCTCGAGTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG、(配列番号100);CGTCGAGTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG、(配列番号101);GGTGGAGTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG、(配列番号102)およびGCTGGACTTATCTCGAGTGAGATATTGTTGACG、(配列番号103)
が挙げられる。
a)抗生物質;例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、リファマイシン、クロラムフェニコール、カルバペネム、テトラサイクリン、リンコマイシン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、シクロヘキサミド、ピューロマイシン、サイクロセリン、バシトラシン、ペニシリン、セファロスポリン、バンコマイシン、ポリミキシンおよびグラミシジン;
b)生物界面活性剤;例えば、ラムノリピド、ソホロ脂質、糖脂質およびリポペプチド;
c)生物燃料;例えば、バイオエタノール、バイオディーゼルおよびバイオブタノール;
d)アミノ酸;例えば、L−グルタミン酸、L−リシン、L−フェニルアラニン、L−アスパラギン酸、L−イソロイシン、L−バリン、L−トリプトファン、L−プロリン(ヒドロキシプロリン)、L−トレオニン、L−メチオニン、L−チロシンおよびD−p−ヒドロキシフェニルグリシン;
e)有機酸;例えば、クエン酸、乳酸、グルコン酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、フマル酸およびイタコン酸;
f)脂肪酸;例えば、アラキドン酸、ポリ不飽和脂肪酸(PUBA)およびα−リノール酸;
g)アルコールおよびポリオール;例えば、グリセロール、マンニトール、エリトリトール、キシリトール、ポリ−3−ヒドロキシ酪酸、イソブタノールおよび1−ブタノール;
h)香味料および香料;例えば、バニリン、ベンズアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、4−(R)−デカノリドおよび2−アクチル−1−ピロリン;
i)ヌクレオチド;例えば、5’−グアニル酸および5’−イノシン酸;
j)ビタミン;例えば、ビタミンC、ビタミンF、ビタミンB2、プロビタミンD2、ビタミンB12、葉酸、ニコチンアミド、ビオチン、2−ケト−L−グロン酸およびプロビタミンQ10;
k)色素;例えば、アスタキサンチン、β−カロテン、ロイコペン(leucopene)、モナスコルブリン(monascorubrin)およびルブロプンクタチン(rubropunctatin);
l)糖類およびポリ糖類;例えば、リボース、ソルボース、キサンタン、ゲラン(gellan)およびデキストラン;ならびに[0066]m)生体高分子およびプラスチック;例えば、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)、ポリ−γグルタミン酸および1,3−プロパンジオールを含めた種々の化合物および材料の合成を包含する。
(EC1)オキシドレダクターゼ;例えば、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、オキシドレダクターゼ、シンターゼ、オキシゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、エポキシダーゼ、ヒドロキシラーゼ、デメチラーゼ、不飽和化酵素、ジムスターゼ、ヒドロキシルトランスフェラーゼ、デハロゲナーゼおよびデヨードナーゼ;
(EC2)トランスフェラーゼ;例えば、トランスアミナーゼ、キナーゼ、ジキナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼ、ホルムイミノトランスフェラーゼ、カルボキシトランスフェラーゼ、カルバモイルトランスフェラーゼ、アミジノトランスフェラーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼパルミトイルトランスフェラーゼ、スクシニルトランスフェラーゼ、マロニルトランスフェラーゼ、ガロイルトランスフェラーゼ、シナポイルトランスフェラーゼ、チグロイルトランスフェラーゼ、テトラデカノイルトランスフェラーゼ、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、フェルロイルトランスフェラーゼ、ミコリルトランスフェラーゼ、ベンゾイルトランスフェラーゼ、ピペロイルトランスフェラーゼ、トリメチルトリデカノイルトランスフェラーゼ、ミリストイルトランスフェラーゼ、クマロイルトランスフェラーゼ、チオラーゼ、アミノアシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ヘキソシルトランスフェラーゼ、ペントシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ピリジニラーゼ、ジホスホリラーゼ、シクロトランスフェラーゼ、スルフリラーゼ、アデノシルトランスフェラーゼ、カルボキシビニルトランスフェラーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、アミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼ、ジメチルアリルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランストランスフェラーゼ、ヘキサプレニルトランストランスフェラーゼ、デカプレニルシストランスフェラーゼ、ペンタプレニルトランストランスフェラーゼ、ノナプレニルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、アミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼ、オキシイミノトランスフェラーゼ、プリントランスフェラーゼ、ホスホジムスターゼ、ホスホトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、コリンホスホトランスフェラーゼ、ホスホリルムターゼ、硫黄トランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼおよびCoA−トランスフェラーゼ;
(EC3)ヒドロラーゼ;例えば、リパーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、ラクトナーゼ、デアシラーゼ、デアセチラーゼ、フェオホルビダーゼ、デポリメラーゼ、チオールエステラーゼ、ホスファターゼ、ジホスファターゼ、トリホスファターゼ、ヌクレオチダーゼ、フィターゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ、シクラーゼ、オリゴヌクレオチダーゼ、リボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレオシダーゼ、グリコシラーゼ、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、ω−ペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、トレオニンエンドペプチダーゼ、アミナーゼ、アミダーゼ、デスクシニラーゼ、デホルミラーゼ、アシラーゼ、デイミナーゼ、デアミナーゼ、ジヒドロラーゼ、シクロヒドロラーゼ、ニトリラーゼ、ATPアーゼ、GTPアーゼ、ハライダーゼ(halidase)、デハロゲナーゼおよびスルホヒドロラーゼ;
(EC4)リアーゼ;例えば、デカルボキシラーゼ、カルボキシラーゼ、カルボキシキナーゼ、アルドラーゼ、エポキシリアーゼ(epoxylyase)、オキソ酸リアーゼ、炭素−炭素リアーゼ、デヒドラターゼ、ヒドラターゼ、シンターゼ、エンドリアーゼ、エキソリアーゼ、アンモニア−リアーゼ、アミジン−リアーゼ、アミン−リアーゼ、炭素−硫黄リアーゼ、炭素−ハライドリアーゼ(carbon-halide lyase)、リン−酸素リアーゼおよびデヒドロクロリナーゼ;
(EC5)イソメラーゼ;例えば、イソメラーゼ、ラセマーゼ、ムターゼ、トートメラーゼ、ホスホムターゼ、ホスホグルコムターゼ、アミノムターゼ、シクロイソメラーゼ、シクラーゼ、トポイソメラーゼ;および
(EC6)リガーゼ;例えば、シンセターゼ、tNRA−リガーゼ、酸−チオールリガーゼ、アミドシンターゼ、ペプチドシンターゼ、シクロリガーゼ、カルボキシラーゼ、DNA−リガーゼ、RNA−リガーゼおよびシクラーゼ
が挙げられる。
(EC1.1)ドナーおよびアクセプターのCH−−OH基に作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.2)ドナーおよびアクセプターのアルデヒドまたはオキソ基に作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.3)ドナーおよびアクセプターのCH−−CH基に作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.4)ドナーおよびアクセプターのCH−−NH2基に作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.5)ドナーおよびアクセプターのCH−−NH基に作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.6)NADHまたはNADPHおよびアクセプターに作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.7)ドナーおよびアクセプターとしての他の窒素性化合物に作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.8)ドナーおよびアクセプターの硫黄基に作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.9)ドナーおよびアクセプターのヘム基に作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.1)ドナーおよびアクセプターとしてのジフェノールおよび関連物質に作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.11)アクセプターとして過酸化物に作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.12)ドナーおよびアクセプターとしての水素に作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.13)分子酸素を組み込んで単一ドナーに作用し、1個または2個の酸素原子を組み込むオキシドレダクターゼ、
(EC1.14)分子酸素の組込みまたは還元を伴って対を形成するドナーに作用し、ドナーが、2−オキソグルタル酸、NADH、NADPH、還元型フラビン、フラボタンパク質、プテリジン、鉄−硫黄タンパク質、アスコルビン酸であるオキシドレダクターゼ、
(EC1.15)アクセプターとしてのスーパーオキシドラジカルに作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.16)金属イオンおよびアクセプターを酸化するオキシドレダクターゼ、
(EC1.17)CHまたはCH2基およびアクセプターに作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.18)ドナーおよびアクセプターとしての鉄−硫黄タンパク質に作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.19)ドナーおよびアクセプターとしての還元型フラボドキシンに作用するオキシドレダクターゼ、
(EC1.2)ドナーおよびアクセプター中のリンまたはヒ素に作用するオキシドレダクターゼならびに
(EC1.21)X−−HおよびY−−Hに作用して、X−−Y結合を形成し、アクセプターに作用し、各ドナーカテゴリーのアクセプターが、制限されるものではないが、NAD、NADP、ヘムタンパク質、酸素、ジスルフィド、キノン、鉄−硫黄タンパク質、フラビン、窒素性基、シトクロム、二窒素およびH+を含み得る、オキシドレダクターゼ
が挙げられる。
(EC2.1)1炭素基を転移するトランスフェラーゼ、
(EC2.2)アルデヒドまたはケトン化合物基を転移するトランスフェラーゼ、
(EC2.3)アシルトランスフェラーゼ;
(EC2.4)グリコシルトランスフェラーゼ;
(EC2.5)メチル基以外のアルキルまたはアリール基を転移するトランスフェラーゼ、
(EC2.6)窒素性基を転移するトランスフェラーゼ、
(EC2.7)リン含有基を転移するトランスフェラーゼ、
(EC2.8)硫黄含有基を転移するトランスフェラーゼ、ならびに
(EC2.9)セレン含有基を転移するトランスフェラーゼ
が挙げられる。
(EC3.1)エステル結合に作用するヒドロラーゼ、
(EC3.2)グリコシラーゼ、
(EC3.3)エーテル結合に作用するヒドロラーゼ、
(EC3.4)ペプチド結合作用するヒドロラーゼ(ペプチダーゼ)、
(EC3.5)ペプチド結合以外の炭素−窒素結合に作用するヒドロラーゼ、
(EC3.6)酸無水物に作用するヒドロラーゼ、
(EC3.7)炭素−炭素結合に作用するヒドロラーゼ、
(EC3.8)ハロゲン化物結合に作用するヒドロラーゼ、
(EC3.9)リン−窒素結合に作用するヒドロラーゼ、
(EC3.1)硫黄−窒素結合に作用するヒドロラーゼ、
(EC3.11)炭素−リン結合に作用するヒドロラーゼ、
(EC3.12)硫黄−硫黄結合に作用するヒドロラーゼおよび(EC3.13)炭素−硫黄結合に作用するヒドロラーゼ
が挙げられる。
(EC4.1)炭素−炭素リアーゼ、
(EC4.2)炭素−酸素リアーゼ、
(EC4.3)炭素−窒素リアーゼ、
(EC4.4)炭素−硫黄リアーゼ、
(EC4.5)炭素−ハロゲン化物リアーゼおよび
(EC4.6)リン−酸素リアーゼ
が挙げられる。
(EC5.1)ラセマーゼおよびエピメラーゼ、
(EC5.2)シス−トランス−イソメラーゼ、
(EC5.3)分子内イソメラーゼ
(EC5.4)分子内トランスフェラーゼ(ムターゼ)および
(EC5.5)分子内リアーゼ
が挙げられる。
(EC6.1)炭素−酸素結合を形成するリガーゼ、
(EC6.2)炭素−硫黄結合を形成するリガーゼ、
(EC6.3)炭素−窒素結合を形成するリガーゼ、
(EC6.4)炭素−炭素結合を形成するリガーゼ、
(EC6.5)リン酸エステル結合を形成するリガーゼおよび
(EC6.6)窒素−金属結合を形成するリガーゼ
が挙げられる。
(i)フィトエン脱水素酵素(crtI)および第1の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(ii)β−リコピンシクラーゼ(lcy−B)および第2の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(iii)β−カロテンケトラーゼ(crtW)および第3の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
第1、第2および第3の調節配列は、lcy−BおよびcrtWの発現が、crtIの発現のレベルよりも大きいよう選択される、方法が提供される。
(iv)イソペンテニルピロリン酸(idi)および第4の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(v)ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(crtE)および第5の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(vi)プレフィトエンピロリン酸シンターゼ(crtB)および第6の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、
(vii)β−カロテンヒドロキシラーゼ(crtZ)および第7の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと
を含む。
idiをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたRBSは、同一実験および転写条件下(すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど)で、同一核酸配列について配列番号5に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
idiをコードするポリヌクレオチド配列に連結されたRBSは、同一転写条件下(すなわち、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど)で、同一核酸配列について配列番号6に示される配列を有するRBSの程度の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%に、核酸配列の発現を引き起こすものである。
株、培地および試薬:クローニングおよび構築物アセンブリーに使用した細菌株は、別に明記しない限り、大腸菌DH5αであった。プラスミドDNAの精製のために、細胞を、37℃で適した抗生物質を含むLB培地で培養し、DNAを標準キット(Qiagen、Germany)を使用して培養物から精製した。すべてのプライマーをSigma Aldrich、Israelによって合成した。プライマーの詳細な説明は、本明細書において以下の表2に見出され得る。
#8 (RBS−A):AGGAGGTTTGGA(配列番号2)
#1 (RBS−B):AACAAAATGAGGAGGTACTGAG(配列番号3)
#17(RBS−C):AAGTTAAGAGGCAAGA(配列番号4)
#27(RBS−D):TTCGCAGGGGGAAG(配列番号5)
#20(RBS−E):TAAGCAGGACCGGCGGCG(配列番号6)
「Dead−RBS」(RBS−F):CACCATACACTG(配列番号7)
「インスレーター」配列が隣接する:RBSに隣接する配列は、発現レベルに影響を及ぼし得るので、インスレーター配列、すなわち、−RBSの各々の上流および下流に位置する約20bpの一定の配列を使用した。このような単離配列は、プロモーターの場合には、隣接する配列の効果の低減において有効であるとこれまでに報告されている。上流インスレーター配列は、大腸菌では天然に見られない、19塩基対:TAATAGAAATAATTTTGTTTAACTTTA(配列番号8)であるようとり、一方で、下流インスレーター配列をATGCATCATCACCATCACCAC(配列番号9)、6His−タグをコードする配列であるようとった。
細菌株および増殖条件:クローニングおよび構築物アセンブリープロセスに使用される細菌株は、大腸菌DH5αとした。蛍光測定のために、プラスミドを大腸菌K12 MG1655に形質転換し、これを0.2%グルコースおよびクロラムフェニコール(34μg/ml)を含む最小培地で37℃で増殖させた。
自動化蛍光測定:細胞を、自動化ロボットプラットフォーム(Evoware II、Tecan)において、M9+0.2%グルコースを含有する96ウェルプレート中で増殖させた。15分毎に、プレートをロボットアームによってマルチウェル蛍光光度計(Infinite M200−pro、Tecan)に移した。各測定では、ODを600nmでサンプリングし、mCherryを587nmでの励起および620nmでの発光測定によってサンプリングし、YFPを、520nmでの励起および555nmでの発光測定によってサンプリングした。
得られた格子(図13)は、翻訳共役:第1の遺伝子(すなわち、YFP)発現レベルが、それを制御するRBSの強度に応じて変わり、使用されるRBSが強力であるほど、測定されるYFP蛍光は大きいことを明確に実証する。対照的に、第2の遺伝子(mCherry)発現レベルは、それを制御するRBSに、および第1の遺伝子を制御するRBSの両方に応じて変わる。すわなち、mCherryについて同一RBSを共有するクローンが、上流YFP発現レベルに依存して異なるmCherry蛍光レベルを示す。交差蛍光は、このような効果の原因として除外された:単一蛍光タンパク質(YFPまたはmCherryのいずれか)を含有するクローンは、高レベルの発現についても相互蛍光チャネルでシグナルをもたらさない。本系におけるYFP発現レベルによるmCherryの最大翻訳増強は、約6倍であるとわかった。YFPおよびmCherryレベル間の依存性は、対数空間で線形依存を示す(図13)。線形回帰は、約1/3の傾きをもたらす(95%信頼区間0.26〜0.36)。
細菌株および増殖条件:クローニングおよび構築物アセンブリープロセスに使用される細菌株は、大腸菌DH5αとした。カロテノイド発現のために、形質転換された細胞を、クロラムフェニコール(34μg/ml)を含むLB培地で37℃で増殖させた。
アスタキサンチン合成のために、以下の遺伝子を使用した:
・パントエア・アグロメラン由来のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(crtE)−GenBank:AAA21260.1(配列番号62)。
カロテノイド抽出:カロテノイド経路の生合成遺伝子を有するプラスミドを保持する大腸菌細胞を、100mlのLB培地を含有する振盪フラスコ中で懸濁培養で増殖させた。培養は、37℃で実施した。48時間後、20mlのサンプルを培養物から引き出し、遠心分離によって細胞を回収した。細胞ペレットを冷水で洗浄し、アセトン(20ml)とともに激しく振盪することによってカロテノイドを抽出した。抽出物の不溶性成分を遠心分離(15,000g)によって除去し、上清をガラス製丸底フラスコ中に移し、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発させた。乾燥抽出物を1.5mlのアセトンで再溶媒和させ、50μlのサンプルをHPLC分析のために採取した。
数桁規模のタンパク質発現に及ぶとこれまでに見出されている6種のRBS配列を選択した(9,14)(図15B)。まず、各配列をYFPリポーターの上流に置くことおよびフローサイトメトリーを使用して蛍光シグナルを測定することによって、発現レベルに対する種々のRBS配列の効果を定量化した(15)。6種のRBSを、発現レベルによって降順に「A」から「F」と示した。図15Cに示されるように、RBSの小さいセットは、数桁規模のタンパク質発現レベルに及び得る。次いで、本発明者らは、いくつかの遺伝子の発現空間に及ぶライブラリーを同時にアセンブルするためにRBS配列のこの小さいセットを使用することが可能かどうかを問うた。各メンバーが同一遺伝子を含有するが、異なるRBS配列の翻訳調節下にあるオペロンのライブラリーを作製した。これを達成するために、本発明者らは、対象の遺伝子の各々を、RBS配列のセットと組合せ的に対を形成させ、これらのRBS−遺伝子構築物をアセンブルして、合成オペロンのライブラリーを作製した(15)。
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配列番号2:リボソーム結合部位A(RBS−A)
配列番号3:リボソーム結合部位B(RBS−B)
配列番号4:リボソーム結合部位C(RBS−C)
配列番号5:リボソーム結合部位D(RBS−D)
配列番号6:リボソーム結合部位E(RBS−E)
配列番号7:デッド−RBS(RBS−F)
配列番号8:上流インスレーター配列
配列番号9:下流インスレーター配列
配列番号10:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号11:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号12:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号13:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号14:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号15:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号16:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号17:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号18:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号19:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号20:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号21:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号22:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号23:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号24:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号25:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号26:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号27:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号28:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号29:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号30:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号31:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号32:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号33:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号34:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号35:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号36:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号37:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号38:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号39:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号40:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号41:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号42:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号43:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号44:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号45:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号46:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号47:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号48:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号49:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号50:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号51:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号52:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号53:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号54:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号55:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号56:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号57:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号58:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号59:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号60:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号61:一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号70:例示のRBS配列
配列番号71:例示のRBS配列
配列番号72:例示のRBS配列
配列番号73:例示のRBS配列
配列番号74:例示のRBS配列
配列番号75:例示のRBS配列
配列番号76:例示のRBS配列
配列番号77:例示のRBS配列
配列番号78:例示のRBS配列
配列番号79:例示のRBS配列
配列番号80:例示のRBS配列
配列番号81:例示のRBS配列
配列番号82:例示のRBS配列
配列番号83:例示のRBS配列
配列番号84:例示のRBS配列
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配列番号86:例示のRBS配列
配列番号87:例示のRBS配列
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配列番号90:例示のRBS配列
配列番号91:例示のRBS配列
配列番号92:例示のRBS配列
配列番号93:例示のRBS配列
配列番号94:例示のRBS配列
配列番号95:例示のRBS配列
配列番号96:例示のRBS配列
配列番号97:好適なmRNA安定化配列
配列番号98:好適なmRNA安定化配列
配列番号99:好適なmRNA安定化配列
配列番号100:好適なmRNA安定化配列
配列番号101:好適なmRNA安定化配列
配列番号102:好適なmRNA安定化配列
配列番号103:好適なmRNA安定化配列
Claims (9)
- (i)配列番号7に示される配列を含むリボソーム結合部位(RBS)に作動可能に連結しているフィトエン脱水素酵素(crtI)をコードするポリヌクレオチドと、
(ii)配列番号2に示される配列を含むRBSに作動可能に連結しているβ−リコピンシクラーゼ(lcy−B)をコードするポリヌクレオチドと、
(iii)配列番号3に示される配列を含むRBSに作動可能に連結しているβ−カロテンケトラーゼ(crtW)をコードするポリヌクレオチドと、
(iv)配列番号5に示される配列を含むRBSに作動可能に連結しているイソペンテニルピロリン酸(idi)をコードするポリヌクレオチドと、
(v)配列番号5に示される配列を含むRBSに作動可能に連結しているゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(crtE)をコードするポリヌクレオチドと、
(vi)配列番号3に示される配列を含むRBSに作動可能に連結しているプレフィトエンピロリン酸シンターゼ(crtB)をコードするポリヌクレオチドと、
(vii)配列番号6に示される配列を含むRBSに作動可能に連結しているβ−カロテンヒドロキシラーゼ(crtZ)をコードするポリヌクレオチドと
を含む、アスタキサンチン経路の酵素をコードする複数の単離ポリヌクレオチド。 - (i)配列番号5に示される配列を含むリボソーム結合部位(RBS)に作動可能に連結しているフィトエン脱水素酵素(crtI)をコードするポリヌクレオチドと、
(ii)配列番号2に示される配列を含むRBSに作動可能に連結しているβ−リコピンシクラーゼ(lcy−B)をコードするポリヌクレオチドと、
(iii)配列番号2に示される配列を含むRBSに作動可能に連結しているβ−カロテンケトラーゼ(crtW)をコードするポリヌクレオチドと、
(iv)配列番号6に示される配列を含むRBSに作動可能に連結しているイソペンテニルピロリン酸(idi)をコードするポリヌクレオチドと、
(v)配列番号3に示される配列を含むRBSに作動可能に連結しているゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(crtE)をコードするポリヌクレオチドと、
(vi)配列番号7に示される配列を含むRBSに作動可能に連結しているプレフィトエンピロリン酸シンターゼ(crtB)をコードするポリヌクレオチドと、
(vii)配列番号2に示される配列を含むRBSに作動可能に連結しているβ−カロテンヒドロキシラーゼ(crtZ)をコードするポリヌクレオチドと
を含む、アスタキサンチン経路の酵素をコードする複数の単離ポリヌクレオチド。 - 単一発現ベクター中に含まれる、請求項1または2に記載の複数のポリヌクレオチド。
- 複数の発現ベクター中に含まれる、請求項1または2に記載の複数のポリヌクレオチド。
- 前記RBSの各々に、スペーサー配列が隣接する、請求項1または2に記載の複数のポリヌクレオチド。
- 前記RBSの各々の上流の前記スペーサー配列が、配列番号8に示される配列と少なくとも80%相同である、請求項5に記載の複数のポリヌクレオチド。
- 前記RBSの各々の下流の前記スペーサーが、配列番号9に示される配列と少なくとも80%相同である、請求項5または6に記載の複数のポリヌクレオチド。
- 請求項1または2に記載のポリヌクレオチドを細菌細胞に発現させて、アスタキサンチンを産生させることを含む、アスタキサンチンを作製する方法。
- 前記発現後にアスタキサンチンを単離することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
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