JP6301946B2 - 天然牛肉風味調味素材の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、天然牛肉風味調味素材の製造方法に関するもので、より具体的には、第１発酵工程であるカビ発酵及び第２発酵工程である細菌発酵を含む２段階の発酵過程により製造されたイノシン−５’−一リン酸（ｉｎｏｓｉｎｅ−５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＩＭＰ）発酵液又はグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）発酵液を用いて天然牛肉風味調味素材を製造する方法、前記方法により製造された天然牛肉風味調味素材、及び前記天然牛肉風味調味素材を含む食品組成物に関するものである。

アミノ酸及びペプチドは、調味素材の成分として用いられており、最近では、大豆、小麦又はトウモロコシなどの植物性タンパク質原料を、カビ、バチルス、乳酸菌又は酵母などの微生物で発酵させ、前記発酵産物を加水分解することにより抽出されるアミノ酸とペプチドを含む天然調味素材が、様々な方法によって開発されている。

一般的に、前記植物性タンパク質原料の加水分解率（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）を高めることで遊離される呈味成分（アミノ酸及びペプチド）を改善したり、量の観点から収率を高めることで価格競争率を増進させる技術が開発されている。しかし、植物性タンパク質原料のみを用いる場合、最終的な調味素材中に核酸成分が存在しないため、調味素材中の旨味の強度が弱いという欠点がある。さらに、調味素材は、その商業的価値を高めるために、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）又はグアノシン一リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧＭＰ）などの核酸と共にグルタミン酸を含むことが求められている。

最近では、前述した植物性タンパク質加水分解物の欠点を克服するために、酵母抽出物などの天然の核酸含有素材が一般的に用いられている。しかし、前記酵母抽出物は、特有の発酵臭に起因する異味と異臭が加工食品の持つ固有の風味に悪影響を与えるため、該核酸の含量が制限される（最大の核酸含量：２０％）。さらに、天然の加工食品に使用するための植物性タンパク質素材と酵母抽出物の混合は、グルタミン酸ナトリウム（ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ、ＭＳＧ）、核酸ＩＧ又は植物性タンパク質加水分解物（Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＨＶＰ）などの既存の調味素材に比べ、価格競争力が低いという欠点がある。

一方、ＩＭＰは、ＧＭＰと共に食品調味料の添加剤として広く使用されている物質である。特に、ＩＭＰは、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）と一緒に使用する場合、味における相乗効果が大きいことから、核酸系調味料の成分として脚光を浴びている。

調味素材として使用するためのＩＭＰ及びＧＭＰを発酵させる方法としては、酵母のＲＮＡを分解する方法と、イノシン及びグアノシンの製造後に２段階（発酵と化学的手法によるリン酸化）によりＩＭＰとＧＭＰを製造する方法を含む。しかし、最近では、ヨーロッパを含む様々な国で、天然調味料に対する基準が強化され、規制がより厳しくなるにつれ、調味素材を天然成分だけで製造せずに、化学的手法による工程、或いは追加成分を添加して製造することは、天然調味素材として認めなくなった。このような理由から、天然の核酸成分は、細菌で糖を直接発酵させる方法を用いて製造しなければならない。

このような状況下で、本発明者らは、任意の化学工程を行うことなく、追加成分を含まない天然牛肉風味調味素材を製造するために広範な努力をした結果、第１発酵工程であるカビ発酵及び第２発酵工程である細菌発酵を含む２段階の発酵過程により生産されたＩＭＰ又はグルタミン酸発酵液を使用する場合、後続反応のために発酵液だけを使用しても様々な種類の調味素材を効果的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

韓国特許公報第１０−１１９１０１０号 韓国特許公報第１０−２００７−０００５０７号 韓国特許公報第１０−２０００−００２９１７４号 韓国特許公報第１０−０３９７３２１号 韓国特許公報第１０−０２６４７４０号

本発明の１つの目的は、第１発酵工程であるカビ発酵、及び第２発酵工程である細菌発酵により製造されたイノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）発酵液又はグルタミン酸発酵液を用いて、任意の化学工程を行うことなく、追加成分を含まない天然牛肉風味調味素材を製造する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、前記方法によって製造された天然牛肉風味調味素材を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記天然牛肉風味調味素材を含む食品組成物を提供することである。

前記目的を達成するための一態様として、本発明は、（ａ）カビで植物性タンパク質原料を発酵させて穀物発酵液を得る工程；（ｂ）細菌で前記穀物発酵液を発酵させてイノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）発酵液を製造する工程；及び（ｃ）工程（ａ）の穀物発酵液と、工程（ｂ）のＩＭＰ発酵液を混合する工程を含む天然牛肉風味調味素材の製造方法を提供する。

さらに、本発明は、工程（ｂ）において細菌で穀物発酵液をさらに発酵させてグルタミン酸発酵液を製造し、工程（ｃ）でグルタミン酸発酵液をさらに混合する工程を含む天然牛肉風味調味素材を製造する方法を提供する。

図１に本発明による天然調味素材の製造方法を概略的に示す。

具体的には、グルタミン酸発酵液、ＩＭＰ発酵液及び穀物発酵液は、第１発酵工程であるカビ発酵及び第２発酵工程である細菌発酵により製造され、それぞれの調味素材に適した反応又は処理工程である第３工程に供されることによって、それぞれの天然調味素材を製造することができる。

従って、本発明は、天然調味素材を製造するために、天然ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を原料として使用し、第１発酵工程であるカビ発酵及び第２発酵工程である細菌発酵を含む２段階の発酵過程により製造されることを特徴とする。

前記第１発酵工程であるカビ発酵は、タンパク質原料を用いてペプチド及びアミノ酸を製造する工程である。第１発酵工程であるカビ発酵のみを行う場合、多量のペプチド及びアミノ酸を製造することができるため、調味素材として使用され得るグルタミン酸の生産が可能である。しかし、旨味（ｕｍａｍｉ ｔａｓｔｅ）を出し得るＩＭＰ又はグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）などの核酸物質は生産できないという欠点がある。さらに、植物性タンパク質原料を使用する場合、単にタンパク質を分解する工程のみを経るため、生産できるペプチド及びアミノ酸がタンパク質自体の濃度又は含量に依存するという問題がある。例えば、豆を使用する場合、生産される発酵液中のグルタミン酸含量が１０％未満であり、小麦グルテンを使用する場合、生産される発酵液中のグルタミン酸含量が１５％未満である。

一方、前記第２発酵工程である細菌発酵は、核酸及びグルタミン酸発酵液を製造する工程である。第２発酵工程である細菌発酵のみを行う場合、核酸及びグルタミン酸を効果的に生産することはできるが、他のアミノ酸及びペプチドの含量が１％未満の濃度で生産されるため、細菌発酵液は、旨味には優れているものの、調味素材として使用できないという欠点がある。言い換えれば、細菌発酵だけで得られた発酵液を調味素材として使用するためには、発酵液を食品に適用できるように発酵液に追加成分を添加しなければならないという欠点がある。

従って、本発明者らは、前記カビ発酵過程及び前記細菌発酵過程の欠点を克服すると共に、任意の追加成分を添加することなく、製造された発酵液だけを用いることで、任意の化学工程を行わずに天然調味素材を製造する方法を開発した。

前記２段階の発酵過程を用いて、核酸及びグルタミン酸発酵液を製造するためには、炭素源及び窒素源と共に様々な無機塩、アミノ酸及びビタミン類が必要である。特に、既存の技術では、酵母抽出物又は植物性タンパク質加水分解物（ＨＶＰ）が窒素源として使用されたが、この場合、最終発酵液は異味と異臭があり、収率が多少低いという欠点があった。さらに、細菌発酵で使用される様々な物質に依存して全体的な風味だけでなく、最終培養液の調味成分の含量に大きな差が生じる。従って、本発明では、カビ発酵（第１発酵工程）により得られ、窒素源としての役割を果たしながら、多様なアミノ酸及びペプチドを含むことができる穀物発酵液（穀物タンパク質加水分解物）を、第２発酵工程である細菌発酵の基質として用いた。

細菌を用いて核酸又はＭＳＧを製造する既存の工程では、培養液中の核酸及びＭＳＧの濃度、並びに収率を増加させることだけが主に重要視されていた。このような増加は、旨味を向上させるには効果的であるが、場合によっては、最終調味素材の風味に悪影響を与える場合がある。しかし、本発明の３段階を用いて製造した様々な天然調味素材は、様々なアミノ酸、糖類、有機酸及び無機イオン等だけでなく、旨味成分であるＩＭＰ及びグルタミン酸の濃度を調節することによって風味を向上させることができるという利点がある。

以下、本発明の方法における天然調味素材の製造方法に関する各工程について説明する。

本発明における工程（ａ）の方法は、カビで植物性タンパク質原料を発酵させて穀物発酵液を得る工程である。

工程（ａ）では、カビ発酵が植物性タンパク質原料を用いて行われるため、様々なアミノ酸及びペプチドを含み、また、第２発酵工程である細菌発酵において窒素源として使用され得るグルタミンなどの成分を含む、穀物発酵液を得ることができる。具体的には、穀物原料を基質にしてカビを培養することで、タンパク質分解酵素を含有する細胞培養液を製造し、その後、これを植物性タンパク質原料に添加し、次いで加水分解することによって、穀物タンパク質加水分解物を製造することができる。その後、穀物タンパク質加水分解物を濾過し細胞を除去することで、穀物発酵液を製造することができる。前記穀物タンパク質加水分解物は、第２発酵工程である細菌発酵に窒素源を供給するために、全窒素含量が２％（ｗ／ｖ）以上であってもよい。

前記植物性タンパク質原料として、カビで発酵させることのできるものであれば、本発明において当業界に公知の任意の原料を使用してもよい。前記植物性タンパク質原料の例としては、これらに限定されるものではないが、大豆、トウモロコシ、米、小麦、小麦グルテンなどを含む。一方、小麦グルテンを使用する場合、多量のグルタミンを含有しているため、細菌発酵の収率を向上させることができるという利点がある。従って、好ましくは、前記植物性タンパク質原料として小麦グルテンを使用してもよい。

前記カビとして、植物性タンパク質原料を発酵させて本発明の穀物発酵液を製造できるものであれば、本発明において使用され得る任意のカビを使用してもよい。本発明で使用されるカビは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の微生物を使用するのが好ましく、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）の微生物を使用するのがより好ましいが、これらに限定されるものではない。

本発明の一実施例では、特許文献１（ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１１−０４６２４９号に対応）に記載されているように、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、ＣＪＣＣ＿０８０１２４Ｐ（ＫＣＣＭ１１０２６Ｐ）を使用して第１発酵工程であるカビ発酵を行った。

本発明における用語「穀物発酵液」とは、カビで植物性タンパク質原料（穀物）を発酵させることによって得られる産物を意味する。前記穀物発酵液は、第２発酵工程である細菌発酵の基質として利用することができ、また、発酵後に濾過及び細胞除去過程により穀物発酵液を得て調味材料を製造する最終工程にも利用することができる。従って、前述のように穀物発酵液は、２つの目的のために用いることができる。

工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた前記穀物発酵液を細菌で発酵させてＩＭＰ発酵液を製造する工程である。工程（ｂ）では、細菌で穀物発酵液を発酵させてグルタミン酸発酵液を製造する工程をさらに含んでもよい。具体的には、第１発酵工程であるカビ発酵により得られた穀物発酵液は、細菌発酵の基質として用いられ、ＩＭＰ発酵液及び／又はグルタミン酸発酵液は、炭素源を補給した培地で穀物発酵液を細菌発酵に供することによって製造され得る。

前記細菌発酵は、当業界に公知の一般的な細菌培養法により行うことができ、好ましくは、フラスコ培養、スケールアップ培養及び本（ｍａｉｎ）培養の３段階から構成され得る。具体的には、スケールアップを達成するために、１次培養培地及び２次培養培地を用いてフラスコ培養及び拡大培養を行い、その後、持続的に追加糖を供給しながら、本培養培地で工程（ａ）の穀物発酵液を基質として用いて細菌発酵を行うことで、ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を得た。

前記細菌発酵用培地には、グルコース、フルクトースなどの炭素源を含んでもよく、特に、グルタミン酸発酵液を製造するための培地には、炭素源として原糖を含んでもよい。前記培地には、様々な無機塩、ビタミン類、アミノ酸などを含んでもよく、ＩＭＰ発酵液若しくはグルタミン酸発酵液を製造しようとする目的の発酵産物に合うように前記培地組成を変えてもよい。

例えば、前記ＩＭＰ発酵液を製造する場合、本培養培地には、グルコース、フルクトース、硫酸マグネシウム、リン酸、水酸化カリウム及び穀物発酵液が含まれてもよく、好ましくは、本培養培地には、培地の総体積に対して、４．４〜５．２ｗｔ％のグルコース、３．７〜４．３ｗｔ％のフルクトース、１．３〜１．７ｗｔ％の硫酸マグネシウム、２．０〜２．４ｗｔ％のリン酸、１．４〜１．８ｗｔ％の水酸化カリウム、及び０．５〜０．９ｗｔ％の穀物発酵液を含んでもよい。さらに、グルタミン酸発酵液を製造する場合、本培養培地には、グルコース、フルクトース、原糖、ベタイン、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム及びリン酸を含んでもよく、好ましくは、培地の総体積に対して、０．５〜０．７ｗｔ％のグルコース、０．９〜１．１ｗｔ％のフルクトース、４．５〜５．５ｗｔ％の原糖、０．００５〜０．０１５ｗｔ％のベタイン、０．３〜０．５ｗｔ％の硫酸マグネシウム、０．８〜１．０ｗｔ％のリン酸カリウム、及び０．２〜０．４ｗｔ％のリン酸を含んでもよい。

さらに、前記培地には、必要に応じて少量の他の成分を含んでもよく、例えば、硫酸鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、ＣＡＰＡ、ニコチンアミド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ、ＮＣＡ）、ビオチン、塩化カルシウム、チアミン、ビタミンＣなどを含んでもよい。これらの成分を含む各培地の代表的な例を、表５〜８及び表９〜１２に示した。

工程（ａ）におけるカビ発酵の結果として、前記植物性タンパク質原料は、アミノ酸及びペプチドに分解され、カルシウム、マグネシウム及びリン酸などの無機イオンと、ビタミン類などはタンパク質原料から溶出される。前記カビ発酵により生成されるアミノ酸は、グルタミン、システイン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシンなどを含み、工程（ｂ）における細菌発酵の窒素源として利用され得る。特に、高濃度のグルタミンは、プリン生合成に必須の成分であり、高含量のＩＭＰ及びグルタミン酸生成のための主要なプロモーターとして作用し得る。さらに、前記溶出された無機イオン及びビタミン類は、細菌発酵における細菌菌体の成長にも役に立てる。本発明の実施例において、前記カビ発酵により得られた産物を栄養源として使用する場合、細菌菌体の増殖及び成長がより速くなることが確認された（図４）。この結果は、本発明の２段階過程の利点をさらに証明する。

本発明における用語「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」とは、工程（ａ）で得られた穀物発酵液を発酵させて、ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を製造することのできる任意の細菌を意味する。本発明により天然調味素材を製造するために、ｎｏｎ−ＧＭＯ菌株を使用してもよい。本発明で使用される前記細菌は、発酵によりＩＭＰ及びグルタミン酸を生産できる当業者に公知の任意の細菌を使用してもよい。例えば、ＩＭＰ発酵液を製造する場合は、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）又はエシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）の微生物を使用してもよく、グルタミン酸発酵液を製造する場合は、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、バシラス属、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、カンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．）又はエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）の微生物を使用してもよい。より好ましくは、本発明で使用される前記細菌は、コリネバクテリウム属の微生物を使用してもよく、最も好ましくは、ＩＭＰ発酵液を製造するためには、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）を使用してもよく、グルタミン酸発酵液を製造するためには、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を使用してもよい。さらに、細菌として、先行特許文献に記載されており、ＩＭＰ及びグルタミン酸を製造する能力を有することが知られている、多様な細菌を使用してもよい。例えば、前記ＩＭＰ発酵液は、特許文献２（ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００５−０９５６２７号に対応）に記載された細菌であるバシラス属又はエシェリヒア属により製造され、前記グルタミン酸発酵液は、特許文献３（米国特許ＵＳ７２４７４５９号に対応）に記載されたエンテロバクター属又はクレブシエラ属を使用して製造され得るが、これらに限定されるものではない。

本発明の一実施例では、ＩＭＰ発酵液を製造するために、特許文献４（ＷＯ国際公開ＷＯ２００２−０５１９８４号に対応）に記載されているように、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）を使用しており、グルタミン酸発酵液を製造するために、特許文献５に記載されているように、コリネバクテリウム・グルタミクム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）、ＣＪ９７１０１０（ＫＦＣＣ１１０３９）を使用した。

工程（ｂ）における細菌発酵により得られた前記発酵液には、約１５０ｇ／Ｌの固形分を有する。本発明では、前記細菌発酵により得られたＩＭＰ及び／又はグルタミン酸発酵液が、任意の追加成分を添加することなく、天然調味素材の製造工程に使用されることを特徴とするので、前記発酵液には、所望の成分であるＩＭＰ及びグルタミン酸が多量に含まれていなければならない。

従って、第１発酵工程であるカビ発酵及び第２発酵工程である細菌発酵により製造されたＩＭＰ発酵液における固形分中に、好ましくは、ＩＭＰ含量を３０％以上有してもよく、より好ましくは、５０％以上であってもよいが、これらに限定されるものではない。従って、ＩＭＰ発酵液中のＩＭＰ濃度が、好ましくは、５０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌであってもよく、より好ましくは、７０ｇ／Ｌ〜１３０ｇ／Ｌであってもよい。

さらに、第１発酵工程であるカビ発酵により生産される産物にアミノ酸を含むので、ＩＭＰに比べ、高濃度及び高収率でグルタミン酸を得ることができる。製造されたグルタミン酸発酵液における固形分中に、グルタミン酸含量を、好ましくは、５０％以上、より好ましくは、６０％以上有してもよいが、これらに限定されるものではない。従って、グルタミン酸発酵液中のグルタミン酸濃度が、好ましくは、７５ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌであってもよく、より好ましくは、９０ｇ／Ｌ〜１３０ｇ／Ｌであってもよい。

前述のように、発酵液中にＩＭＰ及びグルタミン酸を高含量で含むため、前記発酵液を乾燥などの過程により粉末化した場合に食品に適宜添加することができる。

本発明における用語「調味素材（ｆｌａｖｏｒ）」とは、食品の風味を向上させるために添加する物質を意味する。前記調味素材は、味成分によって様々な調味素材に分類することができる。調味素材の具体的例としては、中性風味（ｎｅｕｔｒａｌ）調味素材、牛肉風味調味素材、鶏肉調味素材、豚肉調味素材及びコク味（ｋｏｋｕｍｉ）調味素材を含む。それぞれの調味素材は、本発明の２段階の発酵過程により製造されたＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を用いて製造することができる。その中で、本発明における用語「牛肉風味調味素材（ｂｅｅｆ ｆｌａｖｏｒ）」とは、動物性原料を含まずとも、焼いた牛肉風味／香味を提供する調味素材を意味する。本発明者らは、本発明の方法により製造された牛肉風味の調味素材が適用される場合、牛肉と大根のスープ及びトマトミートソースにおける牛肉の風味及び嗜好度が向上することを確認した。

本発明の発酵液は、任意の追加成分を添加せず、精製などの追加的な化学工程を経ることなく、天然調味素材の製造過程に利用されることを特徴とするので、発酵液を食品、例えば、加工食品に直接含ませるためには、全ての培地成分が食品原料でなければならない。従って、発酵の間に添加される全ての培地成分は、食品原料であることが好ましい。本発明の一実施例では、培地成分を食品原料として使用するために、β−アラニンをカルシウム−パントテネート（ＣＡ−ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ； ＣＡＰＡ）に代替しても、７０ｇ／Ｌ以上のＩＭＰ濃度を有するＩＭＰ発酵液が製造できることを確認した。従って、本発明による細菌発酵用培地は、カルシウム−パントテネートを含むのが好ましい。

それぞれのＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液は、工程（ａ）及び工程（ｂ）を含む２段階の発酵過程により製造することができ、前記製造された発酵液は、最終的に３段階の反応を経て、様々な調味素材を製造する過程に使用することができる。前記ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を基に、発酵液を混合する過程、又は反応若しくは電気透析工程において、異なる原料を使用したり、培地組成を多少変更したり、又は温度、圧力及び時間を含む工程の条件を調節することによって様々な天然調味素材、例えば、中性風味調味素材、及び牛肉、鶏肉、豚肉、コク味などの調味素材を製造することができる。前記製造された天然調味素材の中から、それぞれの食品の目的に適した調味素材を食品に添加して最適の味を出すことができる。

工程（ｃ）は、天然牛肉風味調味素材を製造するために、前記工程により得られた穀物発酵液及びＩＭＰ発酵液を混合する工程である。さらに、前記工程（ｃ）には、グルタミン酸発酵液を混合する工程をさらに含んでもよい。

工程（ｃ）において、発酵液に追加成分を添加せず、前記発酵液に、追加的な化学工程を経ることなく、そのまま混合した後、所望の調味素材の用途に応じた温度、圧力、時間を含む適切な条件下で反応させることで、天然牛肉風味調味素材を製造することができる。

工程（ｃ）において、本発明の製造方法により穀物発酵液及びＩＭＰ発酵液を混合することによって最終的に天然牛肉風味調味素材を製造することができる。この際、前記穀物発酵液及び前記ＩＭＰ発酵液の混合比率は、好ましくは、１：１〜１：１０であってもよく、より好ましくは、１：２〜１：８であってもよく、最も好ましくは、１：４であるが、これらに限定されるものではない。さらに、前記混合した発酵液にグルタミン酸発酵液をさらに混合することができる。

前記のようにそれぞれの発酵液を混合した後、８０〜１２０℃、好ましくは、９０〜１１０℃、及び０．８〜１．５ｂａｒ、好ましくは、０．９〜１．３ｂａｒで、０．５〜２４時間、好ましくは、０．５〜５時間、及びより好ましくは、１〜３時間反応させることによって、最適の牛肉風味調味素材を製造することができる。前記の条件下で、高温によりメイラード反応（ｍａｉｌｌａｒｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）が起き、２，６−ジメチルピラジン（２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）、２，３−ジメチルピラジン（２，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）及びジメチルピラジン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）などの化合物を生成させ、前記化合物により牛肉風味調味素材が形成され得る。

一方、前記発酵液は、濾過工程の後に使用することができる。従って、本発明の方法では、工程（ｃ）の前に前記発酵液に活性炭を処理する工程を含んでもよい。さらに、本発明の方法では、前記発酵液と活性炭の処理工程の後に、前記発酵液を遠心分離又は濾過する工程を含んでもよい。前記発酵液に活性炭素を処理した後に、濾過助剤として珪藻土でさらに処理してもよい。さらに、以後に行う濾過の収率を高めるために、発酵液に活性炭を処理する前に、発酵液を加熱する前処理過程を通じて細胞溶解を誘導する。前記加熱工程は、７０〜９０℃で行うのが好ましく、加熱時間は、１５分以上であるのが好ましく、１５〜６０分間であるのがより好ましい。

本発明の前記混合工程は、発酵液を濃縮し、前記濃縮産物を乾燥して粉末に製造する工程をさらに含んでもよい。前記発酵液を粉末に製造する工程は、発酵液を混合する前又は後に行ってもよく、好ましくは、前記発酵液を混合する前に行うことができる。前記乾燥は、好ましくは、噴霧乾燥又は真空乾燥によって達成することができる。前記発酵液は、最終的に、食品に適切に添加できる粉末化又はペースト化にして製造することができる。

他の一態様として、本発明は、本発明の製造方法により製造された天然牛肉風味調味素材を提供する。さらに他の一態様として、本発明は、前記天然牛肉風味調味素材を含む食品組成物もまた提供する。

本発明の前記製造方法により製造された天然牛肉風味調味素材は、牛肉の味及び風味を有することから、食品の味を最大化するために適切な食品に添加してもよく、動物の飼料に適用してもよい。例えば、前記天然牛肉風味調味素材は、ハム、ソーセージなどに添加して牛肉風味を出すのに使用してもよい。

本発明の方法により製造された天然牛肉風味調味素材は、天然原料を使用して製造されるため、人体に害がなく、安全に使用できると共に食品に添加して牛肉の味を出すことで食品の風味を向上させることができる。

天然調味素材を製造する全体的な過程を示す概略図である。 本発明のアデニンを天然食品原料に代替するためにＡＭＰを酸加水分解する過程を示す。 β−アラニンを天然食品原料に代替するためにＣＡＰＡを導出する代謝経路を示す。 本発明のカビ発酵により分解された植物性タンパク質が栄養源として添加される場合と、植物性タンパク質が添加されない場合の細菌菌体の増殖程度を示す。

以下、実施例を参考にして本発明をより詳しく説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものではないことは、当業界に通常の知識を有するものにとって自明であろう。

実施例１：植物性タンパク質原料を用いたカビ発酵
第１カビ発酵のために、カビ菌株としてアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の微生物を使用し、大豆、トウモロコシ、米又は小麦などの穀物原料を含む基質を、２０〜３５℃で２４〜７２時間培養することで、高濃度のタンパク質加水分解酵素を含むカビ培養液を製造した。その後、大豆、トウモロコシ、米又は小麦などの植物性タンパク質原料を２５〜３５％の高濃度になるように水と混ぜて滅菌し、高濃度のタンパク質加水分解酵素を含む前記製造されたカビ培養液を無塩状態の滅菌された植物性タンパク質原料に添加し、該植物性タンパク質原料を加水分解した。この際、カビ培養液は、前記滅菌した基質液に対して、１０〜１００％の量を添加し、該基質を４０〜５０℃で４８〜９６時間分解して穀物タンパク質加水分解物を製造した。

具体的には、特許文献１（ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１１−０４６２４９号に対応）に記載されているように、アスペルギルス・ソーヤ、ＣＪＣＣ＿０８０１２４Ｐ（ＫＣＣＭ１１０２６Ｐ）を使用してフラスコ培養と拡大培養を行った後、脱脂大豆を用いてカビ培養液を製造し、小麦グルテンを基質として加水分解することによって、穀物タンパク質加水分解物を製造した。より具体的には、１Ｌのフラスコに１次培地２００ｍＬを分注して滅菌し、カビ細胞２００ｍＬを１．７×１０^１０カビ細胞／４００ｍＬの密度でフラスコに接種して３０℃、１００ｒｐｍで７時間培養した。その後、２次培地を２５０Ｌの発酵機に添加して滅菌し、１次培養液６００ｍＬを接種し、３０℃、７０ｒｐｍで２４時間培養した。次に、本培養培地を５トンの予備タンクに添加して９０℃で３０分間加熱し、８トンの発酵機に移した後、水１００Ｌ及び消泡剤２Ｌを添加した。その後、２次培養液１４４Ｌを本培養培地に接種した後、３０℃、７００ｒｍｐで４８時間培養することで、カビ培養液を製造した。最後に、基質を加水分解するための原料を５トンの予備タンクに添加して５５℃で１時間加熱し、２０トンの発酵機に移した後、水１００Ｌ及び消泡剤２Ｌを添加した後、滅菌した。その後、前記カビ発酵液５７６０Ｌを基質に接種して４５℃、３０ｒｐｍで９６時間培養することで、穀物タンパク質加水分解物を製造した。前記穀物タンパク質加水分解物の製造に使用された培地組成を、下記表１〜４に示した。

前述のように製造した穀物タンパク質加水分解物をフィルタープレス（ｆｉｌｔｅｒ ｐｒｅｓｓ）により濾過してカビ細胞を除去することによって、全窒素（ｔｏｔａｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）含量を２％（ｗ／ｖ）以上有し、加水分解率５０％以上の穀物発酵液を製造した。一方、前記穀物発酵液を、２次細菌発酵用培地として準備した。

実施例２：細菌発酵
前記穀物発酵液を用いてＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を製造するために、実施例１で製造された穀物発酵液にグルコース又はフルクトースなどの炭素源と、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ及びＺｎなどの無機塩、及びビタミン類を添加した後滅菌することで、細菌発酵用培地を製造した。ＩＭＰ発酵液及びグルタミン酸発酵液を製造するための培地を製造し、各発酵液に対して、フラスコ培養（１次培地）、拡大培養（２次培地）及び本培養のための培地が製造された。

２−１：ＩＭＰ発酵液の製造
特許文献４（ＷＯ国際公開ＷＯ２００２−０５１９８４号に対応）に記載されているように、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）を使用して、ＩＭＰ濃度を７０ｇ／Ｌ以上有するＩＭＰ発酵液を製造した。

具体的には、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．２に調整した１次培地５０ｍＬを５００ｍＬのフラスコに分注して１２１℃で１５分間滅菌して該細菌菌株を培地に接種した後、３２℃、２００ｒｐｍで２２〜２８時間培養した。その後、ｐＨを７．２に調整しながら、２次培地２．１Ｌを５Ｌのジャー（ｊａｒ）に分注して滅菌し、冷却した後、１次培養液３００ｍＬを接種し、２Ｌの空気下、３２℃、９００ｒｍｐで２７〜３０時間培養した。次に、本培養培地８．５Ｌを３０Ｌのジャーに分注して滅菌し、冷却した後、ｐＨ７．２に調整しながら、２次培養液１５００ｍＬを接種し、５Ｌの空気下、３２℃、４００ｒｐｍで５〜６日間、グルコースとフルクトースの混合物を含む糖を追加して随時供給しながら培養した。最後の追加糖を供給した後、該培地を７時間以上培養して糖が完全に消失できるようにした。前記ＩＭＰ発酵液の製造に使用される培地組成を、下記表５〜８に示した。

２−２：グルタミン酸発酵液の製造
特許文献５に記載されているように、コリネバクテリウム・グルタミクム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）、ＣＪ９７１０１０（ＫＦＣＣ１１０３９）を使用して、グルタミン酸濃度を９０ｇ／Ｌ以上有するグルタミン酸発酵液を製造した。

具体的には、２５０ｍＬのフラスコに、１次培地３０ｍＬを分注して滅菌し、該細菌菌株を培地に接種して５〜８時間培養した。その後、５Ｌのジャーに２次培地１．４Ｌを分注して滅菌し、冷却した後、１次培養液２０ｍＬを接種して２０〜２８時間培養した。その後、３０Ｌのジャーに本培養培地９．２Ｌを分注して滅菌し、冷却した後、２次培養液８００ｍＬを接種して３６〜４５時間、追加糖を随時供給しながら培養した。

最後の追加糖を供給した後、該培地を７時間以上培養して糖が完全に消失できるようにした。前記グルタミン酸発酵液の製造に使用される培地組成は、下記表９〜１２に示した。

前記ＩＭＰ発酵液の製造用培地を用いてＩＭＰ発酵液を製造し、食品に添加するための調味素材として使用するためには、食品添加物の要求を満たすために、いくつかの培地成分は食品原料に代替しなければならない。従って、細胞成長に必須であるアデニン及びβ−アラニンは、食品原料に代替した。

まず、アデニンは、ＡＭＰを酸加水分解することによってリボース（ｒｉｂｏｓｅ）とのβ−Ｎ−グリコシド結合（β−Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｂｏｎｄ）を開裂させ、アデニンを遊離させることにより製造した。前述のように製造されたアデニンを使用して培養する場合、ＩＭＰ濃度を７０ｇ／Ｌ以上有するＩＭＰ発酵液を製造できることを確認した（図２）。

その後、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスの代謝経路を確認した結果、β−アラニンを、カルシウム−パントテネート（ＣＡＰＡ）に代替可能であることが予測された。従って、β−アラニンに代わりに、ＣＡＰＡを使用して培養した結果、ＩＭＰ濃度を７０ｇ／Ｌ以上有するＩＭＰ発酵液を製造できることを確認した（図３）。

実施例３：カビ発酵による産物を細菌発酵に用いる場合における細菌菌体の成長速度の確認
第１発酵工程であるカビ発酵と第２発酵工程である細菌発酵が連続的に行われる場合の利点を確認するために、前記第１カビ発酵工程により分解される植物性タンパク質が栄養源として添加される場合と、植物性タンパク質が添加されない場合の細菌菌体の成長速度及び増殖程度を確認した。

その結果、図４に示したように、第１カビ発酵工程により分解された植物性タンパク質を栄養源として添加する場合、植物性タンパク質を添加してない場合に比べ、細菌菌体の増殖がより速く、多量であることが確認された（図４）。

実施例４：炭素源の種類によるグルタミン酸発酵液の風味特性変化の確認
グルタミン酸発酵に使用され得る炭素源は、グルコース、フルクトース、糖蜜（ｃａｎｅ ｍｏｌａｓｓｅｓ）、原糖などを含む。炭素源の種類によってその他の培地成分が多少異なるが、最終発酵液中のグルタミン酸濃度は、炭素源の種類に大して依存しない。しかし、発酵液の風味は、炭素源の種類に依存して大きく変化し、天然調味素材を開発するためには、最終発酵液がクリーンな風味を有するのが好ましい。糖蜜は、その中に含まれた様々な無機イオンにより微生物の発酵の観点からすると、優れた培地成分であるが、培地自体の色が非常に濃く、キャラメル反応による香味が最終培養液に残るため、天然調味素材としてのその使用価値が低いという欠点がある。

従って、天然調味素材を製造するためのグルタミン酸発酵液の製造において、糖蜜の代わりに原糖を使用することによる最終培養液の風味特性の変化を確認した。この際、糖蜜を原糖に代替しながら、糖蜜に含まれる主要な無機イオン及びビタミン類を培地にさらに添加した。その結果、糖蜜を原糖に代替した場合、異臭が除去され、天然調味素材を製造するための好適な風味特性が生み出されることが確認された（表１３）。さらに、原糖を使用して製造したグルタミン酸発酵液の場合も高濃度のグルタミン酸（９６ｇ／Ｌ以上）を含むため、天然調味素材を製造するのに適切であることが確認された。

実施例５：牛肉風味調味素材の製造
実施例１で製造された穀物発酵液と、実施例２で製造されたグルタミン酸発酵液を使用して牛肉風味調味素材を製造した。

具体的には、以後に行われる濾過工程の収率を高めるために、各発酵液を７０〜９０℃で１５分以上加熱して細胞溶解を誘導した。このような前処理過程は、濾過収率を８５％以上に高めることができる。その後、該グルタミン酸発酵液及びＩＭＰ発酵液から発生する異味及び異臭を除去するために、発酵液の量に対して、１〜３％（ｗ／ｖ）の活性炭を添加した後、５０〜７０℃で２〜２４時間活性炭と処理した。活性炭の処理後、発酵液に濾過助剤として１〜３％（ｗ／ｖ）の珪藻土を添加した後、フィルタープレスにより濾過した。その後、前記過程によって濾過された発酵液を使用した。

一方、植物性タンパク質のカビ発酵と細菌発酵により得られた発酵液には、植物性タンパク質に由来し、細菌の代謝経路により生成されたシステイン及びメチオニンなどの硫含有のアミノ酸と有機酸、残糖などが含まれる。

前記穀物発酵液と前記ＩＭＰ発酵液を、１：４の割合で混合し、８０〜１２０℃、０．８〜１．５ｂａｒで０．５〜２４時間メイラード反応に供した。この際、細菌発酵により生成されたＩＭＰ中の１０％においては、高温によりリン酸基と５炭糖の結合が開裂して５炭糖が生成され、そして、前記生成された５炭糖はメイラード反応の前駆体として利用することができるため、追加糖を添加しなくても、牛肉風味調味素材を形成させることができる。メイラード反応は、アマドリ（ａｍａｄｏｒｉ）転位化合物、２，６−ジメチルピラジン、２，３−ジメチルピラジン及びジメチルピラジンを生成させ、これらの化合物により牛肉風味調味素材が形成された。

他の反応ルートにおいて、細菌発酵の終了後、ｐＨを５〜７に調整するために反応の後半にアンモニアの供給を止め、培養液中における成分の高温／高圧反応により３，４−ジデオキシグリコースロース−３−エン（３，４−ｄｉｄｅｏｘｙ ｇｌｙｃｏｓｕｌｏｓ−３−ｅｎｅ）が生成され、その後、フラン化合物が生成されることによって牛肉風味調味素材が形成された。

前述の反応により製造された反応液を、噴霧乾燥又は真空乾燥して牛肉風味調味素材に製造した。具体的には、固形分が３５〜５０％になるように精製塩及びデキストリンを反応液に添加し、前記混合物を噴霧乾燥又は真空乾燥して粉末化し、或いは固形分が７０％になるように濃縮してペースト化した。前記牛肉風味調味素材は、動物性原料を含まないにも関わらず、微生物発酵液の反応により牛肉を添加したような効果を期待することができる。

実施例６：牛肉風味調味素材の適用による官能特性評価
本発明における牛肉風味調味素材の適用が、牛肉風味を有する既存の調味料の使用に比べ、牛肉の風味を向上させるか否かを確認するために官能特性評価を行った。

６−１：牛肉と大根のスープ
既存の牛肉風味調味料を添加した牛肉と大根のスープを作り、本発明の牛肉風味調味素材を追加して添加した。本発明の牛肉風味調味素材の添加前と後の牛肉の風味に関する官能特性を評価した。官能評価は、調味料を使用する主婦８４名を対象に行った。

嗜好度と強度などの官能特性は、５点基準で評価された。その結果、下記の表１４に示したように、牛肉風味調味素材を適用した群において、全般的な味の嗜好度が、牛肉風味調味素材の適用前の群より、０．２点以上高く、特に、牛肉風味調味素材の適用後の牛肉風味調味素材に対する強度と嗜好度が、牛肉風味調味素材の適用前に比べ、著しく高かった。

６−２：トマトミートソース
トマトと肉を同量含むトマトミートソースに、粉末化した牛肉風味調味素材を添加して、牛肉風味調味素材を添加する前と後のトマトミートソースに対する官能特性を８０名の主婦に評価してもらった。嗜好度と強度などの官能特性は、５点基準で評価された。

その結果、下記表１５に示したように、牛肉風味調味素材を適用した群において、全般的な味の嗜好度が、牛肉風味調味素材を適用する前の群より、０．２点以上高く、牛肉風味調味素材を適用した後のミート香味に対する強度と嗜好度が、牛肉風味調味素材の適用前に比べ、著しく高かった。このような結果は、ミート香味に基づく製品に牛肉風味調味素材を適用する場合でも、製品のミート香味を増加させることができ、製品の全般的な味質を向上させることを示す。

Claims (22)

1. （ａ）カビで植物性タンパク質原料を発酵させて穀物発酵液を得る工程；
   （ｂ）コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物で前記穀物発酵液を発酵させてイノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）発酵液を製造する工程；及び
   （ｃ）工程（ａ）の前記穀物発酵液と工程（ｂ）の前記ＩＭＰ発酵液を混合し、８０〜１２０℃及び０．８〜１．５ｂａｒで、０．５〜２４時間反応させる工程を含む、天然牛肉風味調味素材の製造方法。
2. 工程（ｂ）が、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物で穀物発酵液を発酵させてグルタミン酸発酵液を製造することをさらに含み、工程（ｃ）が、前記グルタミン酸発酵液を混合する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記天然牛肉風味調味素材は、追加的な化学工程を発酵液に加えることなく、前記発酵液を用いて製造される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記植物性タンパク質原料が、大豆、トウモロコシ、米、小麦及び小麦グルテンからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
5. 前記カビが、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の微生物である、請求項１又は２に記載の方法。
6. 前記アスペルギルス属の微生物が、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）である、請求項５に記載の方法。
7. 前記コリネバクテリウム属の微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）である、請求項１又は２に記載の方法。
8. 前記コリネバクテリウム属の微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項２に記載の方法。
9. 前記穀物発酵液とＩＭＰ発酵液が、１：１〜１：１０の割合で混合される、請求項１又は２に記載の方法。
10. 前記ＩＭＰ発酵液又はグルタミン酸発酵液を製造するための細菌発酵用培地組成が、食品原料を含む、請求項１又は２に記載の方法。
11. 前記細菌発酵用培地組成が、カルシウム−パントテネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ、ＣＡＰＡ）を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＩＭＰ発酵液を製造するための細菌発酵用培地が、グルコース、フルクトース、硫酸マグネシウム、リン酸、水酸化カリウム及び穀物発酵液を含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記グルタミン酸発酵液を製造するための細菌発酵用培地が、グルコース、フルクトース、原糖（ｒａｗ ｓｕｇａｒ）、ベタイン、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム及びリン酸を含む、請求項２に記載の方法。
14. 前記グルタミン酸発酵液を製造するための細菌発酵用培地の炭素源が、原糖である、請求項２に記載の方法。
15. 工程（ｂ）で製造されたＩＭＰ発酵液中のＩＭＰ濃度が、５０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
16. 工程（ｂ）で製造されたＩＭＰ発酵液における固形分中のＩＭＰ含量が、３０ｗｔ％以上である、請求項１に記載の方法。
17. 工程（ｂ）で製造されたグルタミン酸発酵液中のグルタミン酸濃度が、７５ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌである、請求項２に記載の方法。
18. 工程（ｂ）で製造されたグルタミン酸発酵液における固形分中のグルタミン酸含量が、５０ｗｔ％以上である、請求項２に記載の方法。
19. 工程（ｃ）の前に、前記ＩＭＰ発酵液に活性炭を処理する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
20. 前記発酵液を活性炭で処理した後に、処理した発酵液を遠心分離又は濾過する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記発酵液を活性炭で処理する前に、発酵液を７０〜９０℃の温度で１５〜６０分間加熱して細胞溶解を誘導する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
22. 工程（ｃ）で発酵液を濃縮し、前記濃縮産物を乾燥して粉末に製造する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。

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