JP6298649B2 - 洗浄血小板の製造方法 - Google Patents
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Description
(1) (a)血小板浮遊液を希釈する希釈工程;(b)中空糸膜を透過していない液体が流れる流入側空間と、中空糸膜を透過した液体が流れる濾過側空間とが中空糸膜により隔てられた中空糸膜モジュールの流入側空間に、流入側空間と連通する洗浄血小板流出口を閉止し、かつ、濾過側空間に連通する濾液排出口を開放した状態で、前記希釈工程(a)で希釈された血小板浮遊液を導入して全量濾過方式で濾過を行い、濾過側空間にタンパク質分子を透過させることにより、血小板浮遊液中のタンパク質分子を除去する濾過工程;(c)前記洗浄血小板流出口を閉止し、かつ、前記濾液排出口を開放した状態で、前記流入側空間に洗浄液を導入し、流入側空間内に残存するタンパク質分子を除去する洗浄工程;及び(d)前記洗浄血小板流出口を開放し、かつ、前記濾液排出口を閉止した状態で、流入側空間に保存液を導入し、流入側空間内に存在する血小板を回収する回収工程を含む、洗浄血小板の製造方法であって、前記希釈工程(a)は、血小板浮遊液中のタンパク質濃度を55mg/mL以下に希釈することを含み、前記濾過工程(b)における最大流量/中空糸膜モジュールの透水性能の値が、0.15kPa以下である、方法。
(2) 前記濾過工程(b)における血小板の濃縮比率が、1.1倍以上、6倍以下である、(1)に記載の方法。
(3) 前記濾過工程(b)における、濾過処理に付す総血小板数/膜面積が、6×1011個/m2以下である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 前記濾過工程(b)における中空糸膜モジュールの入口の線速度が、2cm/min以上、150cm/min以下である、(1)から(3)のいずれか1つに記載の方法。
(5) 前記濾過工程(b)は、内圧式濾過により行われる、(1)から(4)のいずれか1つに記載の方法。
(6) 前記濾過工程(b)における最大濾過圧力が、30kPa以下である、(1)から(5)のいずれか1つに記載の方法。
(a)血小板浮遊液を希釈する希釈工程;
(b)中空糸膜を透過していない液体が流れる流入側空間と、中空糸膜を透過した液体が流れる濾過側空間とが中空糸膜により隔てられた中空糸膜モジュールの流入側空間に、前記希釈工程(a)で希釈された血小板浮遊液を導入して全量濾過方式で濾過を行い、濾過側空間にタンパク質分子を透過させることにより、血小板浮遊液中のタンパク質分子を除去する濾過工程;
(c)前記流入側空間に洗浄液を導入し、流入側空間内に残存するタンパク質分子を除去する洗浄工程;及び
(d)流入側空間に保存液を導入し、流入側空間内に存在する血小板を回収する回収工程
を含む方法であり、上記希釈工程(a)は、血小板浮遊液中のタンパク質濃度を55mg/mL以下に希釈することを含み、上記濾過工程(b)における最大流量/中空糸膜モジュールの透水性能の値が、0.15kPa以下であることを特徴とする。
(a)血小板浮遊液を希釈する希釈工程;
(b)中空糸膜を透過していない液体が流れる流入側空間と、中空糸膜を透過した液体が流れる濾過側空間とが中空糸膜により隔てられた中空糸膜モジュールの流入側空間に、前記希釈工程(a)で希釈された血小板浮遊液を導入して全量濾過方式で濾過を行い、濾過側空間にタンパク質分子を透過させることにより、血小板浮遊液中のタンパク質分子を除去する濾過工程;
(c)前記流入側空間に洗浄液を導入し、流入側空間内に残存するタンパク質分子を除去する洗浄工程;及び
(d)流入側空間に保存液を導入し、流入側空間内に存在する血小板を回収する回収工程
を含む。
中空糸膜モジュールの透水性能は、中空糸膜モジュールから切り出した中空糸膜の膜面積あたりの透水性能を測定し、中空糸膜モジュールに内蔵される中空糸膜の膜面積を乗することで算出される。まず、膜面積あたりの透水性は以下の方法により測定することができる。中空糸膜モジュールに内蔵される中空糸膜を切り出し、プラスチック管に中空糸膜を挿入し、中空糸膜の両端をプラスチック管両端部の内壁にポッティングして、有効長10cmのミニモジュールを作製した。「有効長」とは、分離膜として有効に機能する部分の長さのことであり、ポッティング剤などで膜の細孔が埋められている部分を除いた、濾過時に有効に機能する部分の中空糸膜の長さである。図5及び図6では、有効長をLとして示した。中空糸膜の本数は、ミニモジュールの膜面積が0.003m2になるように調整した。膜面積は、中空糸膜モジュールが内圧式で用いられる場合には、内径ベースの膜面積であり、中空糸膜モジュールが外圧式で用いられる場合には、外径ベースの膜面積である。ミニモジュールの膜面積を、以下の式1により算出した。
Amini : ミニモジュールの膜面積(m2)
D : 中空糸直径(m)(内圧式の場合は内径、外圧式の場合は外径)
π : 円周率
L : 有効長(m)
n : 中空糸膜の本数
FM : 中空糸膜の透水性能(mL/hr/Pa/m2)
Q : 流出した水の量(mL)
T : 水圧をかけた時間(hr)
P : 水圧(Pa)
Amini : ミニモジュールの膜面積(m2)
AMD : 中空糸膜モジュールの膜面積(m2)
D : 中空糸直径(m)(内圧式の場合は内径。外圧式の場合は外径)
π : 円周率
L : 有効長(m)
n : 中空糸膜の本数
FMD : 中空糸膜モジュールの透水性能(mL/Pa/hr)
FM : 中空糸膜の透水性能(mL/hr/Pa/m2)
AMD : 中空糸膜モジュールの膜面積(m2)
タンパク質濃度測定は、BCA法にて、BCA PROTEIN ASSAY KIT(THERMO SCIENTIFIC製)を用いて行った。測定サンプルには、血小板浮遊液又は洗浄血小板を10000×g、20分間の条件で遠心分離し、その上澄みを用いた。測定については、初めにBCA試薬と検量線用のサンプルを調製した。サンプルの希釈には、洗浄血小板の製造に用いた保存液であるM-solを用いた。キットの仕様に従い、検量線用サンプル又は測定サンプルに対してBCA試薬を加え、室温で30秒間ミクロミキサーを用いて撹拌した。その後、37℃で30分間インキュベートした。サンプルを室温まで下げた後、波長562nmにおけるサンプルの吸光度を測定した。吸光度を測定する波長は、厳密に同じでなくても、その近辺の波長±20nm程度の範囲内であればよい。検量線サンプルから、タンパク質濃度と吸光度の検量線を引き、検量線の式に測定サンプルの吸光度を代入することで、測定サンプルのタンパク質濃度を求めた。
15部のユーデル(登録商標)ポリスルホン(P3500;ソルベイ社)、8部のポリビニルピロリドン(PVP)(K90;ISP社)、75部のジメチルアセトアミド(DMAC)及び2部の水からなる混合物を、90℃で混合溶解した後に、50℃に保温したものを製膜原液とした。また、80部のDMAC及び20部の水からなる混合溶液に、30部のPVP(K30;ISP社)を加え混合溶解したものを芯液とした。
ケース内径を19mm、ヘッダーの容積を1.2mLとし、挿入する糸本数を1000本にした以外は作製例1と同様にして、有効長255mmの中空糸膜モジュールの作製例2を作製した。
作製例1に対し、10単位の血小板浮遊液を流して洗浄血小板を製造した。10単位の血小板浮遊液は、2.0×1011個以上3.0×1011個未満の血小板を含有しており、液量は約200mLであった。血小板浮遊液中の血小板の個数は、多項目自動血球計数装置XT1800i(シスメック社製)で測定した。また、(2)の方法により、血小板浮遊液のタンパク質濃度を測定した。
Co1:洗浄血小板のタンパク質濃度(mg/mL)
Ci1:血小板浮遊液のタンパク質濃度(mg/mL)
Vo:洗浄血小板の液量(mL)
Vi:血小板浮遊液の液量(mL)
Co2:洗浄血小板の血小板濃度(個/mL)
Ci2:血小板浮遊液の血小板濃度(個/mL)
Vo:洗浄血小板の液量(mL)
Vi:血小板浮遊液の液量(mL)
濾過工程(b)の流量を150mL/minとした以外は、実施例1と同様の実験を行った。希釈後のタンパク質濃度は19mg/mLだった。処理した血小板浮遊液の総血小板数は2.6×1011個だった。濾過工程(b)における、流量/モジュールの透水性能は0.099kPa、血小板の濃縮比率は1.98倍であり、総血小板数/膜面積は2.2×1011個/m2であり、入口の線速度は42cm/minであり、最大濾過圧力は5kPaだった。血小板回収率は84.0%で、タンパク質除去率は97.5%だった。上記の結果を実施例2として表1に示した。
希釈工程(a)の希釈倍率を1.5倍とした以外は、実施例1と同様の実験を行った。希釈後のタンパク質濃度は40mg/mLだった。処理した血小板浮遊液の総血小板数は2.5×1011個だった。濾過工程(b)における、流量/モジュールの透水性能は0.033kPa、血小板の濃縮比率は1.98倍であり、総血小板数/膜面積は2.1×1011個/m2であり、入口の線速度は14cm/minであり、最大濾過圧力は4.0kPaだった。血小板回収率は94.1%で、タンパク質除去率は98.2%だった。上記の結果を実施例3として表1に示した。
希釈工程(a)を行わない以外は実施例1と同様の実験を行った。血小板浮遊液中のタンパク質濃度は56mg/mLだった。処理した血小板浮遊液の総血小板数は2.5×1011個だった。濾過工程(b)における、流量/モジュールの透水性能は0.033kPa、血小板の濃縮比率は1.98倍であり、総血小板数/膜面積は2.1×1011個/m2であり、入口の線速度は14cm/minであり、最大濾過圧力は4.0kPaだった。血小板回収率は78.1%、タンパク質除去率は97.7%だった。タンパク質濃度が高かったため、血小板の凝集がおこり、血小板回収率が低くなった。上記の結果を比較例1として表1に示した。
濾過工程(b)の流量を580mL/minとした以外は、実施例1と同様の実験を行った。希釈後のタンパク質濃度は18mg/mLだった。処理した血小板浮遊液の総血小板数は2.6×1011個だった。濾過工程(b)における、流量/モジュールの透水性能は0.38kPa、血小板の濃縮比率は1.98倍であり、総血小板数/膜面積は2.2×1011個/m2であり、入口の線速度は166cm/minであり、最大濾過圧力は25kPaだった。血小板回収率は60.8%で、タンパク質除去率は98.1%だった。モジュール透水性能に対する流量が大きいため、血小板回収率が低かった。上記の結果を比較例2として表1に示した。
中空糸膜モジュールの作製例2で得られた中空糸膜モジュールを用いた以外は、実施例1と同様の実験を行った。希釈後のタンパク質濃度は18mg/mLだった。処理した血小板浮遊液の総血小板数は2.2×1011個だった。濾過工程(b)における、流量/モジュールの透水性能は0.17kPa、血小板の濃縮比率は8.7倍であり、総血小板数/膜面積は9.2×1011個/m2であり、入口の線速度は71cm/minであり、最大濾過圧力は32kPaだった。血小板回収率は32.0%で、タンパク質除去率は98.2%だった。
上記の結果を比較例3として表1に示した。
2 筒状部材
3 ヘッダー
4 ヘッダー
5 中空糸膜
6 血小板浮遊液流入口
7 洗浄血小板流出口
8 濾液排出口
9 隔壁
10 隔壁
11 流入側空間
12 濾過側空間
13 中空糸膜中空部
14 外圧式用の中空糸膜モジュール
15 エアーチャンバー
16 ローラーポンプ
17 チューブクランプ
Claims (6)
- (a)血小板浮遊液を希釈する希釈工程;
(b)中空糸膜を透過していない液体が流れる流入側空間と、中空糸膜を透過した液体が流れる濾過側空間とが中空糸膜により隔てられた中空糸膜モジュールの流入側空間に、流入側空間と連通する洗浄血小板流出口を閉止し、かつ、濾過側空間に連通する濾液排出口を開放した状態で、前記希釈工程(a)で希釈された血小板浮遊液を導入して全量濾過方式で濾過を行い、濾過側空間にタンパク質分子を透過させることにより、血小板浮遊液中のタンパク質分子を除去する濾過工程;
(c)前記洗浄血小板流出口を閉止し、かつ、前記濾液排出口を開放した状態で、前記流入側空間に洗浄液を導入し、流入側空間内に残存するタンパク質分子を除去する洗浄工程;及び
(d)前記洗浄血小板流出口を開放し、かつ、前記濾液排出口を閉止した状態で、流入側空間に保存液を導入し、流入側空間内に存在する血小板を回収する回収工程
を含む、洗浄血小板の製造方法であって、
前記希釈工程(a)は、血小板浮遊液中のタンパク質濃度を55mg/mL以下に希釈することを含み、
前記濾過工程(b)における最大流量/中空糸膜モジュールの透水性能の値が、0.15kPa以下である、方法。 - 前記濾過工程(b)における血小板の濃縮比率が、1.1倍以上、6倍以下である、請求項1に記載の方法。
- 前記濾過工程(b)における、濾過処理に付す総血小板数/膜面積が、6×1011個/m2以下である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記濾過工程(b)における中空糸膜モジュールの入口の線速度が、2cm/min以上、150cm/min以下である、請求項1から3のいずれか一項記載の方法。
- 前記濾過工程(b)は、内圧式濾過により行われる、請求項1から4のいずれか一項記載の方法。
- 前記濾過工程(b)における最大濾過圧力が、30kPa以下である、請求項1から5のいずれか一項記載の方法。
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