JP6248476B2

JP6248476B2 - Excitation device

Info

Publication number: JP6248476B2
Application number: JP2013178222A
Authority: JP
Inventors: 智紀赤井; 将慶籠田; 琢磨馬塲; 奥村　幸一郎; 幸一郎奥村; あつみ木村
Original assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Current assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2017-12-20
Anticipated expiration: 2033-08-29
Also published as: JP2015043751A

Description

本発明は、加振装置に関し、例えば受精卵などの細胞を培養するための培養容器を加振する際に使用される加振装置に関するものである。 The present invention relates to a vibration device, for example, a vibration device used when vibrating a culture container for culturing cells such as a fertilized egg.

従来から、家畜領域のみならずヒトの不妊医療などにおいて、培養系で***と卵子とを体外受精させて受精卵（接合子）を作製し、さらに受精卵を卵割、桑実胚、胚盤胞の段階を経て、透明帯から孵化した脱出胚盤胞の段階まで培養することが可能となり、この卵割から胚盤胞の段階にある受精卵を子宮に移植して産子を得る補助的生殖技術（ＡＲＴ）が確立されている。 Conventionally, fertilized eggs (zygotes) are produced by in vitro fertilization of sperm and ova in a culture system, not only in the livestock field but also in human infertility medicine. It is possible to culture from the zona pellucida through the zona pellucida to the stage of the escaped blastocyst, and the fertilized egg at the blastocyst stage from this cleavage is transferred to the uterus to obtain a litter Reproductive technology (ART) has been established.

上記した受精卵の培養方法としては、培養容器上のウェル内に５００μＬ程度の培養液を入れ、該培養液中で受精卵を培養する方法、培養容器上のウェル内に２０μＬ程度の微小滴を載せ、該微小滴の表面をミネラルオイルで被覆し、その中に受精卵を入れる方法などが知られている。また、近年では、培養容器上に複数の窪みを設け、それぞれの窪みごとに受精卵を導入して培養することにより受精卵を個別に管理する方法なども適用されている。 As a method for culturing fertilized eggs as described above, a culture solution of about 500 μL is placed in a well on a culture vessel, and a fertilized egg is cultured in the culture solution. A microdrop of about 20 μL is placed in a well on the culture vessel. A method is known in which the surface of the microdroplet is coated with mineral oil, and a fertilized egg is placed therein. In recent years, a method of individually managing a fertilized egg by providing a plurality of depressions on a culture container and introducing and cultivating a fertilized egg for each depression has been applied.

ところで、培養容器上に複数の窪みを設け、それぞれの窪みごとに受精卵を導入して培養する場合、培養容器への培地の導入に際して前記窪みに気泡が残存する可能性があることが知られている。特に、培養容器がポリスチレン等の疎水性の高い材料から形成されている場合や表面張力が高い培地を使用する場合には、前記窪みに気泡が残存し易くなることが本発明者等により確認されている。培養容器への培地の導入に際して前記窪みに気泡が残存すると、培養環境の変化や、気泡との接触による細胞のダメージ、雑菌による汚染リスクなど細胞への影響が懸念されること、その窪みにおいて細胞を培養できなくなることから、前記窪みに存在する気泡を確実に除去し得る技術の開発が望まれている。 By the way, when a plurality of depressions are provided on a culture container and a fertilized egg is introduced and cultured for each depression, it is known that bubbles may remain in the depression when the medium is introduced into the culture container. ing. In particular, when the culture vessel is formed of a highly hydrophobic material such as polystyrene or when a medium having a high surface tension is used, it has been confirmed by the present inventors that bubbles easily remain in the depression. ing. If air bubbles remain in the depression when introducing the culture medium into the culture vessel, there are concerns about changes in the culture environment, cell damage due to contact with the bubbles, contamination risk due to various bacteria, etc. Therefore, it is desired to develop a technique capable of reliably removing bubbles present in the depression.

このような要請に対し、特許文献１には、プレートを振る方法、プレートの一方の面から真空に引く方法、静電気の力を利用する方法、浮力によって空気が置き換えられるようにプレートを傾ける方法などが開示されている。また、特許文献２には、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射等を用いる方法、細胞の接着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法が開示されている。 In response to such a request, Patent Document 1 discloses a method of shaking a plate, a method of drawing a vacuum from one surface of the plate, a method of using electrostatic force, a method of tilting a plate so that air can be replaced by buoyancy, and the like. Is disclosed. Patent Document 2 discloses a method using low-temperature plasma treatment, corona discharge treatment, ultraviolet irradiation, and the like, and a method of applying collagen, which is a protein that promotes cell adhesion.

特開２００９−９６９９２号公報JP 2009-96992 A 特開２００７−２２８８１８号公報JP 2007-228818 A

特許文献１に開示されている技術によれば、内面が親水性になるように化学的な処理が施された貫通穴の中にある空気を液体で置き換えることできる。しかしながら、特許文献１に開示されている技術においては、各方法について具体的な内容が開示されておらず、気泡の除去がより難しいと考えられる凹状の窪みに残存する気泡を確実に除去し得るか否かは不明である。 According to the technique disclosed in Patent Document 1, air in a through hole that has been chemically treated so that the inner surface becomes hydrophilic can be replaced with liquid. However, in the technique disclosed in Patent Document 1, specific contents are not disclosed for each method, and it is possible to reliably remove bubbles remaining in a concave depression that is considered to be more difficult to remove bubbles. Whether or not is unknown.

また、特許文献２に開示されている技術によれば、マイクロウェルの微細な突起への気泡の付着を防止できるものの、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射等を施したり、コラーゲン等を塗布して細胞培養容器に有機膜や無機膜を形成する必要があり、細胞培養容器自体の製造コストが高騰するといった課題が生じ得る。また、特許文献２に開示されている技術においては、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射等を施したり、有機膜や無機膜を形成した細胞培養容器の表面特性が経年変化等により変化し、時間の経過とともにマイクロウェル内に気泡が残存し易くなるといった課題も生じ得る。 Further, according to the technique disclosed in Patent Document 2, although it is possible to prevent bubbles from adhering to the fine protrusions of the microwell, low temperature plasma treatment, corona discharge treatment, ultraviolet irradiation or the like is applied, or collagen is applied. Thus, it is necessary to form an organic film or an inorganic film in the cell culture container, which may cause a problem that the manufacturing cost of the cell culture container itself increases. Further, in the technique disclosed in Patent Document 2, the surface characteristics of a cell culture vessel subjected to low-temperature plasma treatment, corona discharge treatment, ultraviolet irradiation, or the like, or formed with an organic film or an inorganic film change due to secular change or the like. The problem that air bubbles easily remain in the microwell with the passage of time may also arise.

本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、例えば細胞培養容器に表面処理等を施すことなく、培養容器上に設けられた凹状の窪みに残存する気泡を簡単にかつ確実に除去することのできる加振装置を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-described problems, and the object thereof is, for example, without remaining a surface treatment or the like on a cell culture container, and bubbles remaining in a concave depression provided on the culture container It is an object of the present invention to provide a vibration apparatus that can easily and reliably remove the vibration.

本発明の加振装置は、培地が導入された培養容器を特定の方向へ加振することにより、極めて容易に凹状の窪みに残存する気泡を除去し得るという本発明者等による実験から得られた知見に基づくものである。 The vibration device of the present invention is obtained from an experiment by the present inventors that it is very easy to remove bubbles remaining in a concave depression by vibrating a culture container into which a culture medium has been introduced in a specific direction. Based on the findings.

すなわち、本発明の加振装置は、細胞を培養するための培養領域を画成する底面と側面とを有する培養容器を加振する加振装置であって、前記培養容器を設置する設置部と、前記設置部に設置された前記培養容器を前記底面と直交する方向へ加振する加振部と、を備えているものである。 That is, the vibration device of the present invention is a vibration device that vibrates a culture container having a bottom surface and a side surface that define a culture region for culturing cells, and an installation unit for installing the culture container; And a vibration unit that vibrates the culture vessel installed in the installation unit in a direction orthogonal to the bottom surface.

また、上記した加振装置の好ましい形態は、前記加振部が、前記設置部に設置された前記培養容器の一部と接触して前記培養容器を加振するようになっているものである。上記した加振装置の更に好ましい形態は、前記加振部が前記設置部に埋設されており、加振時に前記加振部の一部が前記設置部から延出し、前記培養容器の下面に接触して前記培養容器を加振するようになっているものである。 Moreover, the preferable form of an above-described vibration apparatus is that the said vibration part contacts the part of the said culture container installed in the said installation part, and vibrates the said culture container. . In a more preferable form of the above-described vibration device, the vibration part is embedded in the installation part, and at the time of vibration, a part of the vibration part extends from the installation part and contacts the lower surface of the culture vessel. Thus, the culture vessel is vibrated.

また、上記した加振装置の好ましい形態は、前記設置部には、前記培養容器を前記底面と直交する方向かつ前記設置部へ向かう方向へ付勢する付勢部が設けられているものである。上記した加振装置の更に好ましい形態は、前記設置部が、前記培養容器の設置位置を規定する規定部を有しているものである。上記した加振装置の更なる好ましい形態は、前記培養容器の設置位置が、前記加振部と前記培養容器とが前記培養容器の中心から離間する位置で接触する位置であるものである。 Moreover, the preferable form of an above-described vibration apparatus is provided with the urging | biasing part which urges | biases the said culture container to the direction orthogonal to the said bottom face and the direction which goes to the said installation part in the said installation part. . In a further preferred form of the above-described vibration apparatus, the installation part has a defining part that defines the installation position of the culture vessel. In a further preferred form of the above-described vibration device, the culture container is installed at a position where the vibration unit and the culture container are in contact with each other at a position away from the center of the culture container.

また、上記した加振装置の好ましい形態は、前記加振部が金属からなるものである。上記した加振装置の更に好ましい形態は、前記加振部の前記培養容器との接触部が弾性部材で覆われているものである。また、上記した加振装置の更なる好ましい形態は、前記加振装置が、前記加振部の出力を調整する調整部を有しているものである。 In a preferred embodiment of the above-described vibration device, the vibration unit is made of metal. In a further preferred form of the above-described vibration device, a contact portion of the vibration portion with the culture container is covered with an elastic member. Moreover, the further preferable form of an above-described vibration apparatus has the adjustment part in which the said vibration apparatus adjusts the output of the said vibration part.

本発明の加振装置によれば、加振部によって設置部に設置された培養容器をその底面と直交する方向へ加振することにより、例えば底面に凹状の窪みが形成された培養容器を用いて細胞を培養する場合であっても、その凹状の窪みに残存する気泡を簡単にかつ確実に除去することができる。 According to the vibration device of the present invention, a culture container in which a concave depression is formed on the bottom surface is used, for example, by exciting the culture container installed on the installation portion in a direction perpendicular to the bottom surface by the vibration unit. Thus, even when cells are cultured, bubbles remaining in the concave depression can be easily and reliably removed.

本発明に係る加振装置の実施形態の基本構成を示す図であって、（ａ）はその斜視図であり、（ｂ）はその本体部の上面図であり、（ｃ）はその本体部の側面図であり、（ｄ）はその本体部の一部を拡大して示す拡大断面図である。It is a figure which shows the basic composition of embodiment of the vibration apparatus which concerns on this invention, Comprising: (a) is the perspective view, (b) is the top view of the main-body part, (c) is the main-body part (D) is an enlarged cross-sectional view showing a part of the main body in an enlarged manner. 本発明に係る加振装置で使用される培養容器の一例を示す図であって、（ａ）はその斜視図であり、（ｂ）は図２ａの培養容器の細胞収容部を拡大して示す拡大平面図であり、（ｃ）は図２ｂのＢ−Ｂ矢視図であり、（ｄ）はその縦断面図である。It is a figure which shows an example of the culture container used with the vibration apparatus which concerns on this invention, Comprising: (a) is the perspective view, (b) expands and shows the cell accommodating part of the culture container of FIG. It is an enlarged plan view, (c) is a BB arrow view of FIG. 2b, (d) is the longitudinal cross-sectional view. 図２で示す培養容器の蓋の一例を示す斜視図である。It is a perspective view which shows an example of the lid | cover of the culture container shown in FIG. 培養容器内で細胞を培養する方法を説明するフロー図である。It is a flowchart explaining the method to culture | cultivate a cell in a culture container. 実施例１の検査用試料による細胞収容部の凹部を撮像した撮像画像である。2 is a captured image obtained by capturing an image of a concave portion of a cell storage portion using a test sample of Example 1. FIG. 実施例２の検査用試料による細胞収容部の凹部を撮像した撮像画像である。It is the picked-up image which imaged the recessed part of the cell accommodating part by the test sample of Example 2. FIG. 加振周波数と気泡除去率の関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between an excitation frequency and a bubble removal rate.

以下、本発明に係る加振装置の実施形態を図面を参照して説明する。 Hereinafter, embodiments of a vibration device according to the present invention will be described with reference to the drawings.

図１は、本発明に係る加振装置の実施形態の基本構成を示す図であって、図１ａは、その斜視図であり、図１ｂは、図１ａで示す加振装置の本体部の上面図であり、図１ｃは、図１ａで示す加振装置の本体部の側面図であり、図１ｄは、図１ａで示す加振装置の本体部の一部を拡大して示す拡大断面図である。 FIG. 1 is a diagram showing a basic configuration of an embodiment of a vibration device according to the present invention, FIG. 1a is a perspective view thereof, and FIG. 1b is an upper surface of a main body portion of the vibration device shown in FIG. 1a. 1c is a side view of the main body of the vibration device shown in FIG. 1a, and FIG. 1d is an enlarged cross-sectional view showing a part of the main body of the vibration device shown in FIG. 1a. is there.

本実施形態の加振装置５０は、図１ａで示すように、主に、培養容器１０を設置するための設置部２０と該設置部２０に設置された培養容器１０を鉛直方向（培養容器１０の底部１の上面（底面）１ａ（図２ａ参照）と直交する方向）へ加振する加振部２１とを有する本体部３０と、該本体部３０の加振部２１の出力（振幅）を調整する調整部４０とを備え、本体部３０と調整部４０とは通信ケーブル３９を介して電気的に接続されている。なお、本体部３０と調整部４０とは通信ケーブル３９を介さず一体に構成してもよい。 As shown in FIG. 1a, the vibration device 50 of the present embodiment mainly includes an installation unit 20 for installing the culture vessel 10 and a culture vessel 10 installed in the installation unit 20 in the vertical direction (the culture vessel 10). A main body 30 having a vibration portion 21 that vibrates in the direction perpendicular to the upper surface (bottom surface) 1a (see FIG. 2a) of the bottom portion 1 and the output (amplitude) of the vibration portion 21 of the main body portion 30. An adjustment unit 40 for adjustment is provided, and the main body unit 30 and the adjustment unit 40 are electrically connected via a communication cable 39. The main body 30 and the adjustment unit 40 may be configured integrally without using the communication cable 39.

本体部３０の設置部２０は、略円筒状の筺体２０ａと該筺体２０ａの上端に設けられた上板２０ｂと筺体２０ａの下端に設けられた底板２０ｃとからなり、上板２０ｂの略中心に開口部２０ｅが形成されている（図１ｂ参照）。本体部３０の加振部２１は、剛性を保持するべく例えば金属製の振動子からなり、設置部２０の筺体２０ａ内に埋設され、その先端部（培養容器１０との接触部）２１ａが上板２０ｂの開口部２０ｅに摺動可能に配置され、加振時において加振部２１の先端部２１ａが上板２０ｂの上面２０ｄから延出して培養容器１０の底部１の下面と接触するようになっている。 The installation portion 20 of the main body 30 includes a substantially cylindrical casing 20a, an upper plate 20b provided at the upper end of the casing 20a, and a bottom plate 20c provided at the lower end of the casing 20a. An opening 20e is formed (see FIG. 1b). The vibration unit 21 of the main body 30 is made of, for example, a metal vibrator so as to maintain rigidity. The vibration unit 21 is embedded in the housing 20a of the installation unit 20, and the tip (contact portion with the culture vessel 10) 21a is located on the upper side. It is slidably disposed in the opening 20e of the plate 20b so that the tip 21a of the vibrating unit 21 extends from the upper surface 20d of the upper plate 20b and contacts the lower surface of the bottom 1 of the culture vessel 10 during vibration. It has become.

なお、加振部２１の先端部２１ａは、加振時において培養容器１０の底部１への衝撃を緩和するために例えば弾性部材２１ｂで覆われている（図１ｄ参照）。この弾性部材２１ｂの材質は特に限定されず、具体的には、天然ゴムの他にニトリルゴム、シリコーンゴム、ウレタンゴム、アクリルゴム、ブタジエンゴム、スチレンブタジエンゴム、フッ素ゴム、エチレンプロピレンゴム等が挙げられる。また、加振部２１の先端部２１ａの上面、特に加振部２１の先端部２１ａに設けられた弾性部材２１ｂの上面（培養容器１０との接触面）の形状は特に限定されず、例えば平面状であってもよいし、上方に向かって凸となる形状であってもよい。 In addition, in order to relieve the impact to the bottom part 1 of the culture container 10 at the time of vibration, the front-end | tip part 21a of the vibration part 21 is covered with the elastic member 21b, for example (refer FIG. 1d). The material of the elastic member 21b is not particularly limited, and specific examples include nitrile rubber, silicone rubber, urethane rubber, acrylic rubber, butadiene rubber, styrene butadiene rubber, fluorine rubber, and ethylene propylene rubber in addition to natural rubber. It is done. Further, the shape of the upper surface of the distal end portion 21a of the vibrating portion 21, particularly the upper surface of the elastic member 21b provided on the distal end portion 21a of the vibrating portion 21 (contact surface with the culture vessel 10) is not particularly limited. It may be a shape, or a shape that is convex upward.

設置部２０の上板２０ｂには、棒状の支持部２０ｆが立設され、該支持部２０ｆに板ばね等からなる付勢部２０ｇが取付けられている。この付勢部２０ｇにより、設置部２０の上板２０ｂ上に設置された培養容器１０は上板２０ｂ方向（鉛直下方）へ付勢された姿勢で、当該培養容器１０が、設置部２０の上板２０ｂと付勢部２０ｇにより挟持されるようになっている（図１ｃ参照）。 On the upper plate 20b of the installation portion 20, a rod-like support portion 20f is erected, and an urging portion 20g made of a leaf spring or the like is attached to the support portion 20f. The culture vessel 10 installed on the upper plate 20b of the installation unit 20 is biased in the direction of the upper plate 20b (vertically downward) by the urging unit 20g, and the culture vessel 10 is placed on the installation unit 20. It is sandwiched between the plate 20b and the urging portion 20g (see FIG. 1c).

また、設置部２０の上板２０ｂには、培養容器１０を設置する位置を規定する規定部（不図示）が設けられている。この規定部は、視覚的に培養容器１０の設置位置を規定するマークであってもよいし、物理的に培養容器１０の設置位置を規定する突起などであってもよい。この規定部により、設置部２０の上板２０ｂ上に設置された培養容器１０は、加振部２１の先端部２１ａと培養容器１０の底部１とが培養容器１０の中心から離間する位置、特に加振部２１の先端部２１ａと培養容器１０の底部１とが後述する培養容器１の細胞収容部３以外の位置で接触するように設置される。 The upper plate 20b of the installation unit 20 is provided with a defining unit (not shown) that defines the position where the culture vessel 10 is installed. The defining portion may be a mark that visually defines the installation position of the culture vessel 10, or a protrusion that physically defines the installation location of the culture vessel 10. The culture vessel 10 installed on the upper plate 20b of the installation unit 20 by this defining unit is located at a position where the tip 21a of the vibration unit 21 and the bottom 1 of the culture vessel 10 are separated from the center of the culture vessel 10, in particular. The tip 21a of the vibration unit 21 and the bottom 1 of the culture vessel 10 are installed so as to contact at a position other than the cell storage unit 3 of the culture vessel 1 described later.

また、調整部４０の前面には、加振部２１の出力（振幅）を所定の出力に設定するための調整ダイヤル４０ａが配設されている。 In addition, an adjustment dial 40a for setting the output (amplitude) of the excitation unit 21 to a predetermined output is disposed on the front surface of the adjustment unit 40.

ここで、本実施形態の加振装置５０で使用される培養容器１０の一例について概説する。この培養容器１０で培養される細胞は、例えば、個別管理が必要とされる細胞であり、培養中及び培養後において個々の細胞を特定する必要があるもの、すなわち複数の細胞を培養している培養容器において互いに混同してしまうことが望ましくない細胞である。個別管理が必要とされる細胞としては、例えば、受精卵、卵細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）及びｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）等が挙げられる。卵細胞は、未受精の卵細胞をさし、未成熟卵母細胞及び成熟卵母細胞が含まれる。受精卵は、受精後、卵割により２細胞期、４細胞期、８細胞期と細胞数が増えていき、桑実胚を経て、胚盤胞へと発生する。受精卵には、２細胞胚、４細胞胚及び８細胞胚などの初期胚、桑実胚、胚盤胞（初期胚盤胞、拡張胚盤胞及び脱出胚盤胞を含む）が含まれる。胚盤胞は、胎盤を形成する潜在能力がある外部細胞と胚を形成する潜在能力がある内部細胞塊からなる胚を意味する。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から得られる未分化な多能性又は全能性細胞をさす。ｉＰＳ細胞は、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の遺伝子（転写因子）を導入することにより、ＥＳ細胞に似た分化万能性を持たせた細胞をさす。すなわち、本発明において培養対象となる細胞には、受精卵や胚盤胞のように複数の細胞の集合体も包含される。本発明の加振装置は、好ましくは哺乳動物及び鳥類の細胞、特に哺乳動物の細胞の培養に好適である。哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒト及びサルなどの霊長類、マウス、ラット及びウサギなどの齧歯類、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマ及びブタなどの家畜等が挙げられる。 Here, an example of the culture vessel 10 used in the vibration device 50 of the present embodiment will be outlined. The cells cultured in the culture vessel 10 are, for example, cells that need to be individually managed, and need to specify individual cells during and after culture, that is, a plurality of cells are cultured. Cells that are undesirable to be confused with each other in the culture vessel. Examples of cells that require individual management include fertilized eggs, egg cells, ES cells (embryonic stem cells), iPS cells (artificial pluripotent stem cells), and the like. An egg cell refers to an unfertilized egg cell, and includes an immature oocyte and a mature oocyte. After fertilization, the fertilized egg increases in number of cells from the 2 cell stage, the 4 cell stage, and the 8 cell stage by cleavage, and develops into a blastocyst through a morula. Fertilized eggs include early embryos such as 2-cell embryos, 4-cell embryos and 8-cell embryos, morulas, blastocysts (including early blastocysts, expanded blastocysts and escaped blastocysts). A blastocyst means an embryo composed of external cells with the potential to form the placenta and internal cell masses with the potential to form embryos. ES cells refer to undifferentiated pluripotent or totipotent cells obtained from the inner cell mass of a blastocyst. An iPS cell refers to a cell having a pluripotency similar to that of an ES cell by introducing several types of genes (transcription factors) into somatic cells (mainly fibroblasts). That is, the cells to be cultured in the present invention include a collection of a plurality of cells such as fertilized eggs and blastocysts. The vibratory apparatus of the present invention is preferably suitable for culturing mammalian and avian cells, particularly mammalian cells. Mammals refer to warm-blooded vertebrates, for example, primates such as humans and monkeys, rodents such as mice, rats and rabbits, pets such as dogs and cats, and domestic animals such as cattle, horses and pigs. Etc.

培養容器１０は、図２ａで示すように、略円板状の底部１と該底部１の外縁から立設する側壁２とを有し、底部１の上面（底面）１ａと側壁２の内周面（側面）２ａとから細胞を培養するための培養領域が画成されている。底部１の略中心には、細胞を収容するための凹部（マイクロウェルとも言う）４を有する細胞収容部３が設けられ、その細胞収容部３の周囲に内壁５が立設されている。なお、細胞収容部３の凹部４は、図２ｂで示すように、底部１の上面１ａに沿って５×５の正方格子状に２５個近接して設けられ、各凹部４は、略円形状の開口を有し、図２ｃで示すように、底部１の上面１ａに略垂直な側面４ａと上面１ａに略平行な底面４ｂとから形成されている。また、内壁５は、図２ｄで示すように、側壁２より高さが低く形成され、底部１に設けられた細胞収容部３と内壁５の内周面５ａとから培地を導入するための培地領域が画成されている。 As shown in FIG. 2 a, the culture vessel 10 has a substantially disk-shaped bottom 1 and a side wall 2 standing from the outer edge of the bottom 1, and an upper surface (bottom surface) 1 a of the bottom 1 and the inner periphery of the side wall 2. A culture region for culturing cells is defined from the surface (side surface) 2a. A cell accommodating portion 3 having a recess (also referred to as a microwell) 4 for accommodating cells is provided at substantially the center of the bottom portion 1, and an inner wall 5 is erected around the cell accommodating portion 3. In addition, as shown in FIG. 2 b, 25 concave portions 4 of the cell containing portion 3 are provided close to each other in a 5 × 5 square lattice shape along the upper surface 1 a of the bottom portion 1. As shown in FIG. 2c, the opening 4 is formed of a side surface 4a substantially perpendicular to the upper surface 1a of the bottom 1 and a bottom surface 4b substantially parallel to the upper surface 1a. Further, as shown in FIG. 2d, the inner wall 5 is formed with a height lower than that of the side wall 2, and a medium for introducing the medium from the cell accommodating portion 3 provided in the bottom 1 and the inner peripheral surface 5a of the inner wall 5 is provided. An area is defined.

なお、培養容器１０を構成する底部１の形状は特に制限されず、三角形及び四角形等の多角形状や楕円形状であってもよい。また、細胞収容部３の凹部４は、培養容器１０の底部１の表面に直接窪みとして形成してもよいし、底部１から突出した部材により細胞収容部３を形成して該細胞収容部３の表面に窪みとして形成してもよい。また、培養容器１０に細胞収容部３を複数設けてもよいし、細胞収容部３の凹部４の基数や配列、各凹部４の開口部や側面４ａや底面４ｂの形状や寸法等は、収容する細胞の種類に応じて適宜に変更してもよい。 In addition, the shape in particular of the bottom part 1 which comprises the culture container 10 is not restrict | limited, Polygon shapes, such as a triangle and a quadrangle | tetragon, and elliptical shape may be sufficient. In addition, the concave portion 4 of the cell storage portion 3 may be formed as a depression directly on the surface of the bottom portion 1 of the culture vessel 10, or the cell storage portion 3 is formed by forming the cell storage portion 3 with a member protruding from the bottom portion 1. You may form as a hollow in the surface of. Moreover, the cell container 3 may be provided with a plurality of cell accommodating portions 3, and the number and arrangement of the recesses 4 of the cell accommodating portion 3 and the shapes and dimensions of the openings, the side surfaces 4 a and the bottom surface 4 b of each recess 4 are accommodated. You may change suitably according to the kind of cell to do.

例えば、受精卵を培養する場合、胚盤胞の段階まで培養することが望ましいため、凹部４の円形状の開口部の直径（開口幅）は、胚盤胞の段階の細胞の最大寸法より大きいことが望ましい。胚盤胞の段階の細胞の最大寸法は通常１００μｍ〜２８０μｍであることから、円形状の開口部の直径は通常１００μｍ以上である。また、例えば、凹部４の側面４ａが、凹部４の最も低い位置から凹部４の外縁へ向かってその高さが高くなるように円錐状又は円錐台状に傾斜している場合には、細胞を配置したい場所（凹部４の最深部）へ移動させ易くなる。また、例えば、細胞を凹部４内に保持するために、凹部４の深さは細胞の最大径の１／３以上であることが好ましく、１／２以上であることがさらに好ましい。また、例えば、凹部４内への培養液の導入を容易にするために、凹部４の深さは凹部直径の１倍以下であることが好ましく、１／２以下であることが特に好ましい。また、凹部４の直径が小さく、その深さが深いほど対流が起き難くなるため、細胞の呼吸や代謝に伴って、周辺の培養液の組成変化が起き易くなる可能性がある。細胞は、周辺の培養液の組成の影響を受けて成長し易さが変化するため、細胞の成長を促すように生物学的な影響を考慮して直径と深さを設定することが好ましい。一般に、細胞の種類に応じて異なるが、凹部４の深さは５０μｍ〜２００μｍ程度であることが好ましい。 For example, when fertilized eggs are cultured, it is desirable to culture to the blastocyst stage, so the diameter (opening width) of the circular opening of the recess 4 is larger than the maximum dimension of the cells in the blastocyst stage. It is desirable. Since the maximum size of cells in the blastocyst stage is usually 100 μm to 280 μm, the diameter of the circular opening is usually 100 μm or more. Further, for example, when the side surface 4a of the recess 4 is inclined in a conical shape or a truncated cone shape so that its height increases from the lowest position of the recess 4 toward the outer edge of the recess 4, It becomes easy to move to the place (the deepest part of the recessed part 4) to arrange. Further, for example, in order to hold the cell in the recess 4, the depth of the recess 4 is preferably not less than 1/3 of the maximum diameter of the cell, and more preferably not less than 1/2. Further, for example, in order to facilitate the introduction of the culture medium into the recess 4, the depth of the recess 4 is preferably not more than 1 times the recess diameter, and particularly preferably not more than 1/2. Moreover, since the convection is less likely to occur as the diameter of the recess 4 is smaller and the depth thereof is deeper, there is a possibility that a change in the composition of the surrounding culture solution is likely to occur with cell respiration and metabolism. Since the ease of growth of cells changes under the influence of the composition of the surrounding culture medium, it is preferable to set the diameter and depth in consideration of biological effects so as to promote cell growth. In general, the depth of the recess 4 is preferably about 50 μm to 200 μm, although it depends on the type of cell.

また、培養容器１０の材質は特に制限されず、具体的には、金属、ガラス、及びシリコン等の無機材料、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。また、培養容器１０は、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、プラスチック材料からなる培養容器を製造する場合には、慣用の成形法、例えば射出成形により製造することができる。さらに、培養容器１０は、受精卵の発育を促進するような表面処理又は表面コートがなされていてもよい。特に、受精卵の発育を促進するために、他の器官の細胞（例えば、子宮内膜細胞や卵管上皮細胞）と共培養をする場合、これらの細胞を予め培養容器に接着させる必要がある。このような場合に、培養容器の表面に細胞接着性の材料をコートすると有利である。 In addition, the material of the culture vessel 10 is not particularly limited, and specifically, inorganic materials such as metal, glass and silicon, plastic (for example, polystyrene resin, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, An acrylic resin, a fluororesin, a polycarbonate resin, a polyurethane resin, a methylpentene resin, a phenol resin, a melamine resin, an epoxy resin, and a vinyl chloride resin). The culture vessel 10 can be manufactured by a method known to those skilled in the art. For example, when a culture container made of a plastic material is manufactured, it can be manufactured by a conventional molding method such as injection molding. Furthermore, the culture vessel 10 may be subjected to a surface treatment or a surface coat that promotes the development of a fertilized egg. In particular, in order to promote the development of a fertilized egg, when co-culturing with cells of other organs (for example, endometrial cells or fallopian tube epithelial cells), these cells need to be adhered to a culture vessel in advance. . In such a case, it is advantageous to coat the surface of the culture vessel with a cell adhesive material.

なお、培養容器１０は必要に応じて例えば図３で示す蓋１１を有することができ、培養容器１０は、例えば蓋１１を装着した姿勢で加振装置５０により加振される。 The culture vessel 10 can have a lid 11 shown in FIG. 3, for example, as needed. The culture vessel 10 is vibrated by the vibration device 50 in a posture with the lid 11 attached, for example.

次に、上記した加振装置５０を利用して培養容器１０に培地を充填し、当該培養容器１０内で細胞を培養する方法について概説する。この方法は、図４で示すように、主に、準備工程（Ｓ１１）と培地導入工程（Ｓ１２）とオイル導入工程（Ｓ１３）と加振工程（Ｓ１４）と保温工程（Ｓ１５）とから構成されている。 Next, an outline of a method for filling the culture vessel 10 with a medium using the above-described vibration device 50 and culturing cells in the culture vessel 10 will be described. As shown in FIG. 4, this method mainly comprises a preparation step (S11), a medium introduction step (S12), an oil introduction step (S13), a vibration step (S14), and a heat retention step (S15). ing.

［準備工程］
まず、細胞を培養するに当たり、例えば図２で示す培養容器１０を用意する（Ｓ１１）。 [Preparation process]
First, for culturing cells, for example, the culture vessel 10 shown in FIG. 2 is prepared (S11).

［培地導入工程］
次いで、培養容器１０の細胞収容部３、特に細胞収容部３の周囲に立設された内壁５の内部に画成される培地領域に例えばピペットやガラスキャピラリー等を用いて受精卵等を含む培地を導入する（Ｓ１２）。なお、培地は、内壁５の高さまで導入され、当該培地の表面張力により内壁５の外側へ漏出しないように保持されている。培養のための培地は、細胞を培養する能力を有するものであれば特に制限されず、例えば受精卵培養用の培養液としてはＭ１６やＣＲ１ａａ等が挙げられる。 [Medium introduction process]
Next, a medium containing a fertilized egg or the like using a pipette, a glass capillary, or the like in a medium region defined in the cell container 3 of the culture vessel 10, particularly the inner wall 5 standing around the cell container 3. Is introduced (S12). The medium is introduced up to the height of the inner wall 5 and is held so as not to leak out of the inner wall 5 due to the surface tension of the medium. The culture medium is not particularly limited as long as it has the ability to culture cells. Examples of the culture medium for fertilized egg culture include M16 and CR1aa.

［オイル導入工程］
次いで、培養容器１０の側壁２の内側、すなわち培養容器１０の底部１の上面１ａと側壁２の内周面２ａとから画成される培養領域にミネラルオイルを導入する（Ｓ１３）。ミネラルオイルは、培養容器１０に導入された培地を覆う高さまで導入され、これにより培地の乾燥が防止される。 [Oil introduction process]
Next, mineral oil is introduced into the culture region defined by the inside of the side wall 2 of the culture vessel 10, that is, the upper surface 1a of the bottom 1 of the culture vessel 10 and the inner peripheral surface 2a of the side wall 2 (S13). Mineral oil is introduced to a height that covers the medium introduced into the culture vessel 10, thereby preventing the medium from drying.

［加振工程］
上記したように細胞収容部３の凹部４は極めて小さいため、Ｓ１２の培地導入工程に際して、細胞収容部３の凹部４には気泡が残存する可能性がある。特に、培養容器１０がポリスチレン等の疎水性の高い材料から形成されている場合や表面張力が高い培地を使用する場合には、その可能性が高くなる。そこで、培地およびミネラルオイルが収容された培養容器１０に例えば蓋１１を装着した後、その培養容器１０を加振装置５０により加振して細胞収容部３の凹部４に存在する気泡を除去する（Ｓ１４）。 [Excitation process]
As described above, since the concave portion 4 of the cell accommodating portion 3 is extremely small, bubbles may remain in the concave portion 4 of the cell accommodating portion 3 during the culture medium introducing step of S12. In particular, when the culture vessel 10 is formed of a highly hydrophobic material such as polystyrene, or when a medium with high surface tension is used, the possibility increases. Therefore, for example, after the lid 11 is attached to the culture container 10 in which the medium and mineral oil are stored, the culture container 10 is vibrated by the vibration device 50 to remove bubbles present in the recess 4 of the cell storage unit 3. (S14).

具体的には、加振装置５０の設置部２０の上板２０ｂ上に設けられた規定部により、培養容器１０を上板２０ｂ上の所定の位置に設置し、培養容器１０の蓋１１の上側に支持部２０ｆに取付けられた付勢部２０ｇを当接配置し、その付勢部２０ｇにより培養容器１０を上板２０ｂ方向（鉛直下方）へ向かって付勢した姿勢で、設置部２０の上板２０ｂと付勢部２０ｇにより培養容器１０を挟持して固定する（図１ｃ参照）。この状態で加振部２１を駆動させ、加振部２１の先端部２１ａを設置部２０に設置された培養容器１０の底部１の下面、特に培養容器１の細胞収容部３以外の位置の下面と接触させ、培養容器１０を底部１の上面（底面）１ａと直交する方向へ加振する（図１ｄ参照）。なお、その際、付勢部２０ｇのうち培養容器１０の蓋１１と接触する部分も培養容器１０の底部１の上面（底面）１ａと直交する方向（鉛直下方）へ振動する。 Specifically, the culture vessel 10 is installed at a predetermined position on the upper plate 20b by the defining portion provided on the upper plate 20b of the installation unit 20 of the vibration device 50, and the upper side of the lid 11 of the culture vessel 10 is placed. The urging portion 20g attached to the support portion 20f is disposed in contact with the urging portion 20g, and the culture vessel 10 is urged toward the upper plate 20b (vertically downward) by the urging portion 20g. The culture vessel 10 is sandwiched and fixed by the plate 20b and the urging portion 20g (see FIG. 1c). In this state, the vibration unit 21 is driven, and the tip 21a of the vibration unit 21 is the lower surface of the bottom 1 of the culture vessel 10 installed in the installation unit 20, particularly the lower surface of the culture vessel 1 at a position other than the cell storage unit 3. The culture vessel 10 is vibrated in a direction orthogonal to the upper surface (bottom surface) 1a of the bottom 1 (see FIG. 1d). At that time, the portion of the urging portion 20g that contacts the lid 11 of the culture vessel 10 also vibrates in a direction (vertically downward) perpendicular to the upper surface (bottom surface) 1a of the bottom 1 of the culture vessel 10.

なお、加振部２１の先端部２１ａの上面、特に加振部２１の先端部２１ａに取付けられた弾性部材２１ｂの上面は、加振開始時において、設置部２０の上板２０ｂの上面と面一に設定されてもよいし、上板２０ｂの上面よりも僅かに突出して設定されてもよい。また、支持部２０ｆ及び支持部２０ｆに取付けられた付勢部２０ｇを省略し、培養容器１０の加振時に例えば使用者自身が培養容器１０を設置部２０の上板２０ｂ上で保持してもよい。また、培養容器１０を加振する際には、培養容器１０の底部１の下面以外に、培養容器１０の側壁２の外周面や培養容器１０の蓋１１の上面から培養容器１０に対して振動を付与するようにしてもよい。さらに、加振部２１の先端部２１ａと培養容器１０の底部１とが接触する位置は特に限定されず、培養容器１０の底部１の略中心で加振部２１の先端部２１ａと培養容器１０の底部１を接触させてもよい。 The top surface of the tip portion 21a of the vibration portion 21, particularly the top surface of the elastic member 21b attached to the tip portion 21a of the vibration portion 21, is the same as the top surface of the upper plate 20b of the installation portion 20 at the start of vibration. It may be set to one, or may be set slightly protruding from the upper surface of the upper plate 20b. Further, the supporting portion 20f and the urging portion 20g attached to the supporting portion 20f are omitted, and the user can hold the culture vessel 10 on the upper plate 20b of the installation portion 20 when the culture vessel 10 is vibrated. Good. When the culture vessel 10 is vibrated, the culture vessel 10 vibrates from the outer peripheral surface of the side wall 2 of the culture vessel 10 or the upper surface of the lid 11 of the culture vessel 10 in addition to the lower surface of the bottom 1 of the culture vessel 10. May be given. Furthermore, the position at which the tip 21a of the vibration unit 21 and the bottom 1 of the culture vessel 10 are in contact with each other is not particularly limited, and the tip 21a of the vibration unit 21 and the culture vessel 10 are approximately at the center of the bottom 1 of the culture vessel 10. The bottom 1 may be brought into contact.

この加振工程Ｓ１４における培養容器１０の振幅等は、各凹部４の開口部や側面４ａや底面４ｂの形状や寸法、培養容器１０自体の固有振動数、収容する細胞の種類等に応じて、調整部４０の前面に設けられた調整ダイヤル４０ａ等を用いて調整することができる。ただし、細胞収容部３の周囲に立設された内壁５の内部の培地領域にはより多くの培地を導入することが有利であるため、培養容器１０の加振周波数や振幅は、内壁５の高さまで導入された培地が当該培地の表面張力により内壁５の外側へ漏出しない値であって細胞収容部３の凹部４内の気泡が当該凹部４から離脱し得る値に設定されることが望ましい。そのような培養容器１０の加振周波数は、以下の実施例に基づき説明するように例えば５ｋＨｚ〜１ＭＨｚ程度である。また、その鉛直方向の振幅は、上記したように凹部４の深さが５０μｍ〜２００μｍ程度であることから凹部４の深さと同等の約５０μｍ以上であり、かつ、培地の表面張力を考慮すると例えば１ｍｍ程度以下であることが好ましい。また、凹部４内の気泡サイズが５０μｍ程度であることから、その鉛直方向の振幅は、凹部４内で気泡を滑動させられればよく、例えば気泡サイズの約１／１０以上、すなわち約５μｍ以上であってもよい。 The amplitude or the like of the culture vessel 10 in this vibration step S14 depends on the shape and size of the opening of each recess 4 and the side surface 4a and the bottom surface 4b, the natural frequency of the culture vessel 10 itself, the type of cells to be accommodated, etc. Adjustment can be performed using an adjustment dial 40 a provided on the front surface of the adjustment unit 40. However, since it is advantageous to introduce a larger amount of medium into the medium region inside the inner wall 5 erected around the cell accommodating portion 3, the excitation frequency and amplitude of the culture vessel 10 are different from those of the inner wall 5. It is desirable that the medium introduced up to the height is set to a value that does not leak to the outside of the inner wall 5 due to the surface tension of the medium, and that the bubbles in the recesses 4 of the cell accommodating part 3 can be detached from the recesses 4. . The excitation frequency of such a culture vessel 10 is, for example, about 5 kHz to 1 MHz as will be described based on the following examples. Further, the amplitude in the vertical direction is about 50 μm or more equivalent to the depth of the recess 4 since the depth of the recess 4 is about 50 μm to 200 μm as described above, and considering the surface tension of the culture medium, for example, It is preferable that it is about 1 mm or less. Further, since the bubble size in the recess 4 is about 50 μm, the vertical amplitude is sufficient if the bubble can be slid in the recess 4, for example, about 1/10 or more of the bubble size, that is, about 5 μm or more. There may be.

［保温工程］
そして、上記したように加振装置５０を用いて培養容器１０を加振して細胞収容部３の凹部４に存在する気泡を除去した後、その培養容器１０を培養細胞の発育及び維持に必要なガスを含む環境雰囲気及び一定の環境温度をもたらすインキュベータに投入する（Ｓ１５）。必要なガスには、水蒸気、遊離酸素（Ｏ_２）及び二酸化炭素（ＣＯ_２）が含まれる。環境温度とＣＯ_２含有量を調節することにより、培地のｐＨを一定時間内に安定させることができる。安定なＣＯ_２含有量と安定な温度により安定なｐＨが得られる。なお、例えば画像比較プログラムにより、培養中の細胞の画像を予め撮像して保存しておいた画像と比較することにより、培養の際の温度、ガス及び培地などの培養条件を調節することもできる。例えば、ラット受精卵を培養する際のインキュベータの培養条件は、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２、９０％空気、３７℃、湿度飽和である。 [Heat retention process]
Then, as described above, the culture container 10 is vibrated using the vibration device 50 to remove bubbles present in the concave portion 4 of the cell container 3, and then the culture container 10 is necessary for the growth and maintenance of the cultured cells. Is introduced into an incubator that provides an environmental atmosphere containing a certain gas and a constant environmental temperature (S15). Necessary gases include water vapor, free oxygen (O ₂ ) and carbon dioxide (CO ₂ ). By adjusting the environmental temperature and the CO ₂ content, the pH of the medium can be stabilized within a certain time. A stable pH is obtained by a stable CO ₂ content and a stable temperature. Note that the culture conditions such as temperature, gas, and culture medium can be adjusted by, for example, comparing an image of a cell in culture with an image that has been captured and stored in advance using an image comparison program. . For example, the culture conditions of the incubator when cultivating rat fertilized eggs are 5% CO ₂ , 5% O ₂ , 90% air, 37 ° C., and humidity saturation.

このように、本実施形態の加振装置５０によれば、培地が導入された培養容器１０を鉛直方向、すなわち培養容器１０の底部１の上面（底面）１ａと直交する方向であって凹部４の開口方向へ向かって加振することによって、例えば底部１の上面（底面）１ａに凹部４が形成された培養容器１０を用いて細胞を培養する場合であっても、その凹部１０に存在する気泡を簡単にかつ確実に除去することができる。なお、加振装置５０による加振後の培養容器１０を一定の環境温度をもたらすインキュベータに投入することによって、加振装置５０による加振後において凹部４に残存する気泡を膨張もしくは活性化させて前記凹部４から離脱させることができるため、細胞収容部３の凹部４に存在する気泡をより確実に除去することができる。 Thus, according to the vibration device 50 of the present embodiment, the culture vessel 10 into which the culture medium has been introduced is in the vertical direction, that is, in the direction perpendicular to the upper surface (bottom surface) 1a of the bottom 1 of the culture vessel 10 and the recess 4 For example, even when cells are cultured using the culture vessel 10 in which the concave portion 4 is formed on the upper surface (bottom surface) 1a of the bottom portion 1 by being vibrated toward the opening direction of the bottom portion 1, it exists in the concave portion 10. Air bubbles can be easily and reliably removed. In addition, by introducing the culture vessel 10 after being shaken by the shaker 50 into an incubator that provides a constant environmental temperature, the bubbles remaining in the recess 4 after being shaken by the shaker 50 are expanded or activated. Since it can be made to detach | leave from the said recessed part 4, the bubble which exists in the recessed part 4 of the cell accommodating part 3 can be removed more reliably.

なお、上記する方法では、オイル導入工程の後に加振工程を実施したが、加振装置５０を用いた加振工程は培地導入工程の後に実施してもよいし、培養容器１０に導入された培地の蒸発を許容し得る場合にはオイル導入工程自体を省略してもよい。培養領域にミネラルオイルを導入する前に培養容器を加振する場合には、培地が内壁５の外側へ漏出し易くなるため、それに応じて調整部４０の調整ダイヤル４０ａ等を用いて培養容器１０の加振周波数や振幅等を調整する必要がある。 In the method described above, the vibration step was performed after the oil introduction step, but the vibration step using the vibration device 50 may be performed after the medium introduction step or introduced into the culture vessel 10. If the medium can be allowed to evaporate, the oil introduction step itself may be omitted. When the culture container is vibrated before the mineral oil is introduced into the culture region, the culture medium is easily leaked to the outside of the inner wall 5, and accordingly, the culture container 10 is adjusted using the adjustment dial 40a of the adjustment unit 40 or the like. It is necessary to adjust the excitation frequency, amplitude, and the like.

＜実施例の検査用試料による凹部の気泡除去率を測定した実験とその結果＞
本発明者等は、上記した形態の加振装置を使用して異なる加振周波数で加振した複数の培養容器（実施例１、２、比較例１）において細胞収容部の凹部の画像を撮像し、その撮像画像から凹部の気泡除去率を測定した。 <Experiment and result of measuring bubble removal rate of recesses by test sample of example>
The present inventors have taken images of the recesses of the cell storage portion in a plurality of culture vessels (Examples 1 and 2 and Comparative Example 1) that are vibrated at different vibration frequencies using the vibration device of the above-described form. And the bubble removal rate of a recessed part was measured from the captured image.

気泡除去率の測定方法を概説すると、培養容器として図２で示す形態の培養容器１０を用意した。なお、培養容器はポリスチレン樹脂製であり、その底部の厚さは約１ｍｍ、内壁の厚さは約０．５ｍｍ、内壁の内周は約φ７ｍｍ、内壁の高さは約２ｍｍであった。また、細胞収容部の凹部の開口部の直径は約２８０μｍ、凹部の深さは約１６０μｍ、隣接する凹部の中心同士の間隔は約４００μｍであった。その培養容器の培地領域にＣＲ１ａａを７０μＬ導入し、培養容器の培養領域にミネラルオイルを導入した後、細胞収容部の凹部の画像を撮像用カメラにより撮像した（この撮像画像を画像１とする）。そして、その培養容器を図１で示す形態の加振装置に設置し、鉛直方向すなわち培養容器の底部の上面と直交する方向へ向かって１ＭＨｚ（実施例１）、４０ｋＨｚ（実施例２）、１ｋＨｚ（比較例１）で加振した後、細胞収容部の凹部の画像を撮像用カメラにより撮像し（この撮像画像を画像２とする）、双方の撮像画像１、２を比較して以下の数式１により凹部内の気泡の除去率を算出した。 An outline of a method for measuring the bubble removal rate is as follows. A culture vessel 10 having the form shown in FIG. The culture vessel was made of polystyrene resin, and the bottom portion had a thickness of about 1 mm, the inner wall had a thickness of about 0.5 mm, the inner wall had an inner circumference of about φ7 mm, and the inner wall had a height of about 2 mm. Moreover, the diameter of the opening part of the recessed part of a cell accommodating part was about 280 micrometers, the depth of the recessed part was about 160 micrometers, and the space | interval between the centers of adjacent recessed parts was about 400 micrometers. After introducing 70 μL of CR1aa into the culture region of the culture vessel and introducing mineral oil into the culture region of the culture vessel, an image of the concave portion of the cell storage portion was taken with an imaging camera (this captured image is referred to as image 1). . And the culture container is installed in the vibration apparatus of the form shown in FIG. 1, and it is 1 MHz (Example 1), 40 kHz (Example 2), 1 kHz toward the orthogonal | vertical direction, ie, the direction orthogonal to the upper surface of the bottom part of a culture container. After shaking in (Comparative Example 1), an image of the concave portion of the cell storage portion is taken by an imaging camera (this captured image is referred to as image 2), and both the captured images 1 and 2 are compared, and the following formula 1, the removal rate of bubbles in the recess was calculated.

（数１）
１−（画像２中の気泡が存在する凹部の数）/（画像１中の気泡が存在する凹部の数） (Equation 1)
1- (number of recesses where bubbles exist in image 2) / (number of recesses where bubbles exist in image 1)

実施例１の検査用試料では、図５で示すように、凹部内の気泡除去率が約３２％（１−１７/２５）であった。また、実施例２の検査用試料では、図６で示すように、凹部内の気泡除去率が約１００％であった。また、比較例１の検査用試料では、凹部内の気泡がほとんど除去されなかった。 In the test sample of Example 1, as shown in FIG. 5, the bubble removal rate in the recess was about 32% (1-17 / 25). Moreover, in the test sample of Example 2, as shown in FIG. 6, the bubble removal rate in the recess was about 100%. Further, in the test sample of Comparative Example 1, the bubbles in the recesses were hardly removed.

この実験結果より、加振装置を使用して培養容器を鉛直方向、すなわち底部の上面と直交する方向であって凹部が開口する方向へ向かって加振することにより、培養容器の細胞収容部の凹部に存在する気泡を除去し得ることが実証された。特に、図７で示すように、加振装置の加振時の加振周波数が５ｋＨｚ以上かつ１ＭＨｚより小さければ、細胞収容部の凹部内に存在する気泡の約１／３以上を除去し得ることが確認された。 From this experimental result, by using the vibration device, the culture container is vibrated in the vertical direction, that is, in the direction orthogonal to the top surface of the bottom part and in the direction in which the concave part is opened. It has been demonstrated that bubbles present in the recess can be removed. In particular, as shown in FIG. 7, if the excitation frequency at the time of excitation of the vibration apparatus is 5 kHz or more and less than 1 MHz, about 1/3 or more of the bubbles present in the recesses of the cell storage part can be removed. Was confirmed.

１：底部、１ａ：底部の上面（底面）、２：側壁、２：側壁の内周面（側面）、３：細胞収容部、４：細胞収容部の凹部、４ａ：凹部の側面、４ｂ：凹部の底面、５：内壁、１０：培養容器、１１：蓋、２０：設置部、２０ｅ：開口部、２０ｇ：付勢部、２１：加振部、２１ａ：加振部の先端部、２１ｂ：弾性部材、３０：本体部、３９：通信ケーブル、４０：調整部、４０ａ：調整ダイヤル、５０：加振装置 1: bottom portion, 1a: top surface (bottom surface) of bottom portion, 2: side wall, 2: inner peripheral surface (side surface) of side wall, 3: cell accommodating portion, 4: concave portion of cell accommodating portion, 4a: side surface of concave portion, 4b: Bottom of recess, 5: inner wall, 10: culture vessel, 11: lid, 20: installation part, 20e: opening, 20g: biasing part, 21: vibration part, 21a: tip part of vibration part, 21b: Elastic member, 30: body part, 39: communication cable, 40: adjustment part, 40a: adjustment dial, 50: vibration device

Claims

細胞を培養するための培養領域を画成する底面と側面とを有し、前記底面に、前記細胞を収容するための凹部を有する細胞収容部が設けられた培養容器を加振する加振装置であって、
前記培養容器を設置する設置部と、
前記設置部に設置された前記培養容器の下面と接触して前記培養容器を前記底面と直交する方向へ加振する加振部と、
前記加振部と前記培養容器とが前記培養容器の前記細胞収容部以外の位置の下面で接触するように前記培養容器の設置位置を規定する規定部と、を備えている加振装置。 A vibration apparatus that vibrates a culture container that has a bottom surface and a side surface that define a culture region for culturing cells, and is provided with a cell container having a recess for accommodating the cells on the bottom surface. Because
An installation part for installing the culture vessel;
An excitation unit that vibrates the culture vessel in a direction perpendicular to the bottom surface in contact with the lower surface of the culture vessel installed in the installation unit;
An exciting device comprising: a defining part that defines an installation position of the culture container so that the vibration part and the culture container are in contact with a lower surface of the culture container at a position other than the cell storage part.

前記細胞収容部の周囲に内壁が立設されている、請求項１に記載の加振装置。 The vibration device according to claim 1, wherein an inner wall is erected around the cell storage portion.

前記加振部は前記設置部に埋設されており、加振時に前記加振部の一部が前記設置部から延出し、前記培養容器の下面に接触して前記培養容器を加振するようになっている、請求項１又は２に記載の加振装置。 The vibration unit is embedded in the installation unit, and at the time of vibration, a part of the vibration unit extends from the installation unit and contacts the lower surface of the culture vessel to vibrate the culture vessel The vibration exciter according to claim 1 or 2.

前記設置部には、前記培養容器を前記底面と直交する方向かつ前記設置部へ向かう方向へ付勢する付勢部が設けられている、請求項１から３のいずれか一項に記載の加振装置。 The urging unit according to any one of claims 1 to 3, wherein the installation unit is provided with an urging unit that urges the culture vessel in a direction orthogonal to the bottom surface and in a direction toward the installation unit. Shaker.

前記培養容器の設置位置は、前記加振部と前記培養容器とが前記培養容器の中心から離間する位置で接触する位置である、請求項１から４のいずれか一項に記載の加振装置。 The vibration apparatus according to any one of claims 1 to 4, wherein the culture container is installed at a position where the vibration unit and the culture container are in contact with each other at a position away from the center of the culture container. .

前記加振部が金属からなる、請求項１から５のいずれか一項に記載の加振装置。 The excitation device according to any one of claims 1 to 5, wherein the excitation unit is made of metal.

前記加振部の前記培養容器との接触部が弾性部材で覆われている、請求項１から６のいずれか一項に記載の加振装置。 The excitation device according to any one of claims 1 to 6, wherein a contact portion of the excitation unit with the culture vessel is covered with an elastic member.

前記加振装置は、前記加振部の出力を調整する調整部を有している、請求項１から７のいずれか一項に記載の加振装置。 The said vibration apparatus is an vibration apparatus as described in any one of Claim 1 to 7 which has an adjustment part which adjusts the output of the said vibration part.