JP6232373B2 - ワクチンから抗原を単離し定量する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2011年4月21日に出願された米国仮特許出願第61/477,835号の利益を主張するものであり、その出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
他に断りがない限り、本明細書で用いられる技術・科学用語は全て、本開示が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同様の意味を持つ。
AA アミノ酸
AAA アミノ酸分析
DNA デオキシリボ核酸
EDTA エチレンジアミン四酢酸
HA 赤血球凝集素
HA1〜16 赤血球凝集素サブタイプ1〜16
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
HIC 疎水性相互作用クロマトグラフィー
IEX−HPLC イオン交換−HPLC
kDa キロダルトン
LC−MS/MS 液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法
MALDI/TOF マトリックス支援レーザー脱離イオン化/飛行時間型質量分析法
MVB 単価バルク
RSD 相対標準偏差
RP−HPLC 逆相HPLC
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SDS−PAGE ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
SEC サイズ排除クロマトグラフィー
SRD 一元放射免疫拡散法
UV 紫外線
本開示は、それに限定するものではないが、HA抗原を含む抗原をワクチン組成物から単離する方法を含む。例示的な実施形態では、インフルエンザウイルスワクチンは、卵由来原料または細胞培養物由来のウイルス性原料のいずれかの上流、中流、または下流工程から得られる。次いで、抗原は界面活性剤を使用せずにワクチン組成物から可溶化させる。
還元および酸性化の後、抗原を分画により単離する。例示的な態様では、分画をクロマトグラフィーで行う。当該分野で公知のクロマトグラフィーの、任意の好適なタイプを使用する。例えば、クロマトグラフィーのそのような好適なタイプとしては、それらに限定されるものではないが、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、逆相HPLC(RP−HPLC)、イオン交換−HPLC(IEX−HPLC)、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、またはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)が挙げられる。
国際標準を使用せずに分画により単離した後、抗原または抗原サブタイプを定量する方法が本開示に含まれる。分画した抗原を定量する好適な方法としては、それらに限定されるものではないが、アミノ酸分析(AAA)、窒素定量法(Kjeldahl)、質量分析法、同位体希釈質量分析法が挙げられる。
nHA1=nAA/xAA
nHA1…赤血球凝集素HA1のモル量[μmol]
nAA…各アミノ酸のモル量(アミノ酸分析の結果)[μmol]
xAA…赤血球凝集素HA1の分子当たりの各アミノ酸数
nHA1=nHA
nHA…赤血球凝集素のモル量[μmol]
mHA=nHA*MHA
nHA…赤血球凝集素のモル量[μmol]
mHA…HAの質量[μg]
MHA…(計算または測定した)赤血球凝集素の分子量[μg*μmol−1]
cHA=mHA*DF/Vi
cHA…赤血球凝集素の濃度[μg/mL]
DF…希釈係数
Vi…注入量[mL]
ワクチン中のHAを単離・定量するための方法の開発および最適化
本明細書に記載する実験の目的は、WHOまたは他の機関からの標準試薬が利用できない場合に、HA(すなわちHA1)の測定に基づき、インフルエンザA/カリフォルニア/07/2009(H1N1)のワクチン調製物の総HA含有量を測定するための新規のHPLCの方法を開発することである。
試料調製条件を以下の通り最適化した。未希釈試料または脱イオン水で希釈した試料を、同量の還元緩衝液(6M塩酸グアニジン、266mMトリス/HCl、1mMEDTA、pH8.3、40mMジチオスレイトール)と混合した。試料を85℃で1時間インキュベートした後、10%(v/v)8.5%リン酸を添加して反応を止め、逆反応の遊離のシステインによるジスルフィド結合の形成を防いだ。試料を18,407gで10分間遠心分離し、粒子状物質を除去した。同一のHPLC条件を用いた。
溶出液A:0.1%トリフルオロ酢酸水溶液
溶出液B:0.085%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
溶出液C:メタノール
タンパク質の酸加水分解を、ガラスアンプル内で行った。2nmolの2−L−アミノ酪酸を内部標準として各アンプルに添加し、HPLC画分をアンプル内に直接回収した。回収した画分を真空下で乾燥した(SpeedVac, Savant, SVC100H)。試料を300μLの6N塩酸/0.2%フェノールに溶解し、窒素で覆い、アンプルをヒートシールした。酸加水分解を115℃で18時間行った。アンプルを開け、500μLの脱イオン水を加えた。その溶液をろ過し(0.2μ)、エッペンドルフ(登録商標)バイアルに移し、真空下で乾燥した(SpeedVac, Savant, SVC100H)。AccQ Tagキット(Waters, No WAT052880)を用い、製造業者の指示に従ってアミノ酸分析を行った。簡潔に説明すると、試料を0.1N塩酸に溶解し、AccQ Fluor試薬を用いてアミノ酸を標識した。内部標識(α−アミノ酪酸)およびアミノ酸標準(Agilent, No.5061-3330)を同様に処理した。
溶出液A:脱イオン水
溶出液B:アセトニトリル、グラディエントグレード品質
溶出液C:希釈したAccQ−Tag緩衝液濃縮物(Waters, No. WAT052890)
脱イオン水1:10希釈
試料をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)にかけた後、クマシー・ブルー染色を行った。単価バルク試料を還元および非還元条件で分析し、HPLCにより単離した還元HA1と比較した。電気泳動の後、ゲルを既製のクマシー溶液(GelCode(登録商標)Blue Stain Reagent, Pierce, cat. # 24590)で2時間染色した。脱イオン水を2〜3回換えてゲルを脱染し、画像スキャンをする前に一晩脱イオン水中に保管した。SDSゲルを、濃度計イメージスキャナーIII(GE Healthcare)の製造業者が提供するゲルデータプログラムでスキャンした。Image Quant TL ソフトフェア(Amersham Bioscience)を使用してバンドを同定し、吸収の吸光度the optical density of the absorptionを得た。バンドの境界は手作業で決めた。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化/飛行時間型質量分析法(MALD
I/TOF)分析のために、タンパク質を上述の方法によるHPLCを用いて精製した。凍結乾燥したHPLC画分を5μLの50%アセトニトリル、0.5%ギ酸の水溶液に溶解し、マトリックス溶液(10mg/mLシナピン酸の50%アセトニトリル溶液および0.5%ギ酸の水溶液)と混合した。1μLをMALDI/TOF標的上にのせ、室温で乾燥した。標準多チャンネルプレート検出器またはCovalX HM1高質量検出器のいずれかを用いて、Applied Biosystems 4800 MALDI TOF/TOFでスペクトルを得た。
HPLCピークを手作業で回収し、SpeedVacで凍結乾燥した。凍結乾燥物を再構成緩衝液(8Mウレア、100mM重炭酸アンモニウム、pH8.4)に溶解し、100mM重炭酸アンモニウム、pH8.4を添加して、0.9Mウレアの最終濃度になるように希釈し、トリプシンを用いて消化した。
他のインフルエンザワクチン中のHAを定量するための既定のHPLCの方法を用いて、H1N1に関する最初の実験を行った。簡潔に説明すると、試料の調製は、37℃で1時間のウイルス破壊工程と、それに続く4−ビニルピリジンによるアルキル化を含んだ。この試料調製方法を用いて、試料2のHPLCピークの分画によりHA1を単離し、アミノ酸分析を用いて定量した。6回のアミノ酸分析の平均として、試料1では62.2μg/mLHAという値が得られた。SDS−PAGEを用いて試料からのHA1の回収率を予測した。ゲルをクマシー染色し、比重走査により評価した。結果から、53kDaの位置に移動する単離されたHA1は、試料1の対応するバンドの約13%の強度しかなかったことが分かった。LC−MS/MS分析を用いて、試料1のこのバンドの純度を調べた。これらの分析により、このバンドのHA1含有量、約25%(n=6)が得られたが、主に含まれているのは核タンパク質だった。総合的に考えると、HA1の回収率は約50%に過ぎないことが結果から分かった。HA1の回収率が低いため、試料調製方法のさらなる最適化を行った。
配列アラインメント
以下の受託番号を持つ配列をGenbankから取得した:(1)HA、インフルエンザAウイルス(A/カリフォルニア/07/2009(H1N1)):ACQ55359.1および(2)HA、インフルエンザAウイルス(A/ソロモン諸島/03/2006(H1N1))、ABU50586.1。タンパク質の配列を、ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)のデフォルト設定を用いてアラインメントした。
アミノ酸配列(受託番号:HA、インフルエンザAウイルス(A/カリフォルニア/07/2009(H1N1)):ACQ55359.1)に基づくインフルエンザAウイルス(A/カリフォルニア/07/2009(H1N1))HAの理論分子量は、61424(HA0、ジスルフィド結合は還元され、タンパク質加水分解で開裂していないHA1およびHA2からなる)、還元されたHA1は36312、還元されたHA2は25130である。しかし、これにはグリコシル化等の翻訳後修飾、特に糖タンパク質の質量に大きく関わるN−グリコシル化(HA1ドメインには、5つのN−グリコシル化可能部位がみられた)が含まれていない。還元後に単離したHA1の分子量を、MALDI/TOFを用いて測定したところ、試料2についての測定では45268 ±119(n=15)であった。試料3については、45229±101(n=20)というHA1分子量が測定された。本方法の誤差範囲内であり、2つのロット間でHA1の分子量に差はなかった。MALDI/TOFデータをLC−MSペプチドマッピングのデータによりさらに裏付けし、ここでは、糖ペプチドをウイルスタンパク質のトリプシン消化後に分析した。
試料調製の最適化後に、(1)4−ビニルピリジンを用いたアルキル化工程を含む、または(2)リン酸を用いた酸性化工程を含む試料調製の二つの選択肢について並行してアミノ酸分析を行った。試料2をHPLC分析の校正のための対照試料として用いた。
表8に、新規の試料調製方法を開発するために調べた主なパラメーターをまとめている。どの方法を使用するかは、主にLC−MSMSを用いた選択性に基づいて最終的に決定し、ここで4−ビニルピリジンを用いたアルキル化を含む方法が著しく低い選択性を示した。修飾によりわずかに親水性が増加するため、この観察結果は、ほぼ確実に溶出位置の変化によるものだった。溶出位置が変化したことにより、共溶出するタンパク質が変わったのである。アルキル化を行って、または行わずに調製した試料調製物のHA1の溶出プロフィールを調べた。4−ビニルピリジンを用いたアルキル化を行って調製した試料中のHA含有量は、おそらくより高濃度の汚染タンパク質のために、わずかに多かった。
直線性
分析方法の重要な基準の一つは直線性、すなわち(ある範囲内で)試料中の分析物の濃度(量)に正比例する試験結果を得る能力である。濃度依存的なHPLC応答の直線性を証明するため、試料2を脱イオン水で異なる濃度に希釈し、異なる濃度の試料をRP−HPLCで分析した。対照試料の濃度は、上述の通りアミノ酸分析により求めた。
選択性の重要な必須条件は、HA1のHPLCピークが十分な純度を示すことである。HA1の単離したピークをSDS−PAGEで調べた。SDS−PAGEをクマシー染色して用い、単離したHA1はシングルバンドとして移動する。このHA1バンドを、バンド内のタンパク質を同定するために、インゲル消化およびLC−MS/MS分析によりさらに分析した。このバンドは、HA1だけを含んでいた。HA1ピーク内のタンパク質を分析する、より感度の高い方法は、凍結乾燥後に回収した画分を直接消化することである。
試料2中のHA含有量を求める方法の精度を示すため、23.175μg/mLおよび92.7μg/mLの2つの濃度で、2日間(1日6回)、計12回HA含有量の測定を行った同日内の精度は、低濃度で2.96%および1.77%、高濃度試料で0.81%および0.89%であった。相対標準偏差(RSD)は低濃度試料で2.19%、高濃度試料で1.30%であった。
Claims (27)
- ワクチン組成物からHA1抗原またはHA1抗原サブタイプを単離する方法であって:
(a)界面活性剤を使用せず、かつ、アルキル化剤を使用せずに、還元によりワクチン組成物中のHA1抗原またはHA1抗原サブタイプを可溶化する工程であって、還元がカオトロピック試薬の存在下で70℃〜90℃のインキュベーション温度で行われる、工程;および
(b)得られたワクチン組成物から分画によりHA1抗原またはHA1抗原サブタイプを単離する工程を含む、前記方法。 - インキュベーション温度が70℃、75℃、80℃、85℃または90℃である、請求項1記載の方法。
- 前記還元は、ワクチン組成物をジチオスレイトールで処理することを含む、請求項1または2記載の方法。
- 前記可溶化工程は、カオトロピック試薬で変性させることをさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 抗原または抗原サブタイプの酸性化により還元をさらに行うことにより分離した抗原サブタイプ間でジスルフィド結合が形成されるのを防ぐ、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 抗原を含むワクチン組成物中の抗原または抗原サブタイプの含有量を定量する方法であって、抗原または抗原サブタイプを定量する工程をさらに含む請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法を含む、前記方法。
- 定量工程を抗原標準を用いずに行う、請求項6記載の方法。
- 定量工程を抗原標準を用いて行う、請求項6記載の方法。
- 定量工程は、アミノ酸分析による抗原の定量を含む、請求項7または8に記載の方法。
- 前記還元は5分から20時間のインキュベーション時間で行う、請求項3〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元は30分から2時間のインキュベーション時間で行う、請求項3〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元は1時間のインキュベーション時間で行う、請求項3〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元は85℃のインキュベーション温度で行う、請求項3〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カオトロピック試薬が、塩酸グアニジン、尿素、チオ尿素、リチウム、過塩素酸塩、またはチオシアネートである、請求項4〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 酸性化をリン酸、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ヘプタフルオロ酪酸、またはギ酸を用いて行う、請求項4〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分画をクロマトグラフィーで行う、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、逆相HPLC(RP−HPLC)、イオン交換−HPLC(IEX−HPLC)、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、またはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)である、請求項16記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが逆相(RP)−HPLCである、請求項17記載の方法。
- 前記HAが、インフルエンザウイルスワクチン組成物、麻疹ウイルスワクチン組成物、パラインフルエンザウイルスワクチン組成物、またはムンプスウイルスワクチン組成物由来である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ワクチン組成物がインフルエンザウイルスワクチン組成物である、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- インフルエンザウイルスワクチン組成物が、インフルエンザAおよびインフルエンザBからなる群から選択されるインフルエンザウイルスからの保護を提供する、請求項19または20に記載の方法。
- 前記抗原サブタイプが、インフルエンザA HA サブタイプ HA1、またはインフルエンザB HA1である、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗原サブタイプが、前記インフルエンザA HA サブタイプ HA1である、請求項22記載の方法。
- インフルエンザワクチン組成物が、インフルエンザA H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N7、およびインフルエンザBからなる群から選択されるインフルエンザ型からの保護を提供する、請求項22または23に記載の方法。
- 2.5%未満の相対標準偏差(RSD)で抗原含有量を定量する、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- RSDが2.2%である、請求項24記載の方法。
- RSDが1.3%である、請求項25または26に記載の方法。
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