JP6228211B2 - 認知及び美容を目的とする組成物並びに作用薬を調製するための同組成物の使用 - Google Patents
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Description
別の好ましい実施形態では、組成物は、ケルセチン−3−グルクロニド及びケルシトリンから選択されたアクティブ(actives)を含んでなるポリゴナム・ミナスの抽出物を含有する。
得られた抽出物は、以下のアッセイのようにアクティブ(actives)のケルセチン−3−グルクロニド及びケルシトリンを含むことが分かる:
〔HPLCアッセイ:HPLC分析用の試料溶液の調製〕
1.100.0mgの試料抽出物を5.0mLのメスフラスコ中に正確に量り取り、DMSOを容積まで添加する。
〔移動相の準備〕
1.チャネルA − 1.0mLのFAを1000mLの脱イオン水に加える。該溶液を濾過及び脱気する。
〔クロマトグラフシステム(アジレント1290インフィニティ(Agilent 1290 Infinity))〕
カラム:PhenomenexKinetex(2.1×150mm、1.7ミクロン(1.7μm))
温度:60.0℃
移動相:溶媒A − 0.1%FA含有水
溶媒B − 0.1%FA含有CAN
流速:0.400mL/分(グラジエント)
グラジエントシステム
時間(分) 溶媒A(%) 溶媒B(%)
0.00 89.0 11.0
18.00 89.0 11.0
20.00 5.0 95.0
23.00 5.0 95.0
25.00 89.0 95.0
波長:UV(360nm)、参照450nm
実行時間:25分(実行後の5.0分を含む)
注入体積:2.0μL
データ収集:25分
図2(a)を参照すると、強調された領域は左から、HPLCヒストグラムにおけるケルセチン−3−グルクロニド及びケルシトリンそれぞれの存在を示している。さらに、ケルセチン−3−グルクロニド及びケルシチン(quercitin)は、以下の表1において、ポリゴナム(Polygum)・ミナスから得られた前記最終抽出物の%アッセイによって定量される。
試料抽出物の含水量は湿度分析計の使用により決定されたが、該分析計では約0.5〜0.6gの粉末試料がアルミニウム皿の上に移されて105℃にて一定重量が得られるまで加熱される。乾燥減量(LOD)は、当初重量に対する加熱の間の重量損失の比率(%)によって決定される。
ポリゴナム・ミナス抽出物の抽出物は、活性酸素吸収能力(Oxygen Radical Absorbance Capacity)を使用して抗酸化活性に関して試験され(ORAC法)、ORAC値が非常に高いことが示されている(以下の表を参照されたい)。実施された試験に基づくと、ポリゴナム・ミナスの抽出物は11,000マイクロモルTE/グラム〜36,000マイクロモルTE/グラムの好ましい活性酸素吸収能力(ORAC)値を有しており、好ましいORAC値は少なくとも16000マイクロモルTE/グラムである。ポリゴナム・ミナスにおいて生じた高いORAC値は、e−CAPアッセイを使用して試験して、酸化障害から生細胞を保護する能力についてさらに試験された。
赤血球を使用する細胞の抗酸化保護アッセイとしてのCAP−eアッセイ(21)は、複雑な天然物中の抗酸化剤は細胞質ゾルに侵入して細胞内の酸化障害の低減に寄与するかという疑問に取り組むために開発された。該アッセイは細胞質ゾル中での効果のみを測定する、というのも、本発明者らが試験で使用するレポーター色素は細胞内空間(すなわち細胞質ゾル)に入り込んだ後でのみ機能性であって、細胞内空間において該色素は化学修飾を受ける結果として細胞内に停留するからである。該アッセイは、生細胞に入り込むことができる抗酸化剤の特異的な半定量化を可能にする(ホンゼル(Honzel)ら、「食品及び天然物の評価のための化学的及び細胞系の抗酸化方法の比較:赤血球及び多形核細胞を使用する並行試験による多面的データの生成。(Comparison of Chemical and Cell−Based AntioxidantMethods for Evaluation of Foods and NaturalProducts:Generating Multifaceted Data by ParallelTesting Using Erythrocytes and PolymorphonuclearCells.)」、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー(Journal of Agricultural and Food Chemistry)、2008年)。
抽出物は、抗コラゲナーゼ試験並びにMMP−1及びMMP−13を使用して、皺発生防止効果に関してin vitroで試験された。
コラーゲンは脊椎動物において最も豊富なタンパク質であり、事実上すべての組織に存在する。コラーゲン細線維は、結合組織、硬骨軟骨、歯、並びに皮膚及び血管の細胞外マトリックスといった支持組織の主成分である。あらゆる年齢の男性において皮膚の厚さ及びコラーゲン含量の間には関係がある。同様の関係は60歳を超える女性には存在するが、より若い女性ではそれほど明白ではない。成人の皮膚では、老化の特性は総コラーゲン含量と密接に関係しており、総コラーゲン含量は男女とも加齢に伴って減少する。コラーゲンはコラゲナーゼによって分解され、その結果として皮膚の低コラーゲン含量がもたらされる。よって、皮膚のコラゲナーゼ活性が高いと皮膚の皺発生に結びつく可能性がある。コラーゲンの阻害剤は皮膚における皺形成の制御において有用なはずである。特に興味深いのは、活発なコラゲナーゼと慢性関節リウマチの病理との関係である。関節構造体において通常は抑制されているコラゲナーゼが活性化され、それにより(therevy)関節において特有の組織破壊がもたらされる可能性があることが示唆されている。
阻害率(%)=〔(AFU(対照)−AFU(試験))/(AFU(対照))×100〕×100%
のように計算され、上記式中、AFUは任意の蛍光単位(arbitrary fluorescence unit)であり、IC50はログ−プロビット解析を使用して計算された。
〔アセチルコリンエステラーゼ及びモノアミンオキシダーゼ−Aに対するポリゴナム・ミナス抽出物のin vitro阻害作用〕
アセチルコリンエステラーゼ(AChE)は動物の神経系の重要な酵素であり、認知機能の調節に関与する最も重要な神経伝達物質であると考えられている。AChE阻害剤は、アルツハイマー病(AD)の治療処置についてFDAに承認された重要な薬物の1つである。脳コリンエステラーゼ活性の減少と記憶の改善とを結びつける数多くの研究が存在する。抽出物は、in vitroでアセチルコリンエステラーゼ酵素の阻害に関して試験された。
動物は、高所の覆いのない円形のプラットフォーム上に置かれる。動物は、強烈な光に、又は大きな騒音に曝露される。この強烈な刺激に応答して動物は隠れ場を求め、プラットフォームの周りの穴のうちの1つに入る。該デバイスは元来はラットと共に使用されるように設計されたが、すぐにマウスと共に同様に使用されるように改変された。実際、該デバイスは、この生物が小さな穴を見つけてその穴を通って逃げる能力から、該生物に適切であると考えられてきた。
〔総経路長(cm)〕:課題を完了する前に被験動物が移動した距離。課題の完了は被験動物が逃避箱の中に入ることとして定義される。これで試行が終了する。
〔合計潜時(秒)〕:被験動物が課題を完了するまでの潜時。課題の完了は被験動物が逃避箱の中に入ることとして定義され、これで試行が終了する。
試験品目、適当なポリゴナム・ミナス抽出物及び市販のイチョウ抽出物(比較対象(comparator)抽出物)が本研究において使用された。これらの抽出物は、供給者の仕様書に従ってプロジェクト用に調製及び保管された。研究用に選ばれた抽出物の用量は供給者によって同定された。30×ストック懸濁物が各品目について毎週調製された。これは等分されてバッチとなり、該バッチはその後その週を通じて4℃で保管された。該ストック懸濁物は、毎日超純水で作業濃度に希釈されてから投薬され、投薬後には廃棄された。強制経口投与用のニードルは必要量の懸濁物で充填された。個々のシリンジ中に準備する前に懸濁物を渦流混合することにより、かつさらに希釈された試験品目をシリンジで混合することにより、粒子の均一な分布が確実になるよう注意が払われた。スコポラミン投与の用量及び時間は、げっ歯動物の空間ナビゲーション課題において障害を生じることが事前に示されている。該用量は当初報告された0.3mg/kgから0.5mg/kgに増量されたが、高用量のほうがより確実な障害を生じるであろうからである。
ビヒクル対照は下記の表11及び12のプロトコールのようにして使用された。
2〜6月齢のオスのC57BL/6マウス(20〜25g)(n=12〜14)は、バイオラスコ(BioLASCO)(台湾)により供給された。該マウスは12/12hの明/暗(200〜300ルクス)サイクル(07:00時に点灯)のIVCシステム(米国のアレンタウン(Allentown))に収容され、餌(ラボダイエット(Labdiet)、調合飼料)及び水は自由摂食で湿度は50%〜70%に維持された。各処理に使用された合計動物数は、以下の表13に示されている(実験の各アームに使用された被験動物)。
バーンズ迷路での評価には各被験動物について5日間、すなわち1日4回の試行を4日間(習得期間)及び最後の習得試行の24時間後に行われたプローブ試行、を要した。事前試行(適応期間)は、第1日及び第2日の試行の開始前に行われた。被験動物は27Gのニードルで試験化合物をi.p.で投与され、該動物の居たケージに30分間戻された。バーンズ迷路試験は、3つの時期、すなわち適応期間、習得期間及びプローブ試行から構成されるものとした。詳細な手順は以下の節で説明される。
〔適応期間〕:チャンバが取り除かれて被験動物は迷路を30秒間探検することを許され、次いで穏やかに逃避穴へ誘導された。その後、被験動物が逃避穴に入らなかった場合、その被験動物は中に入れられた。次いで穴にカバーがかけられ、被験動物はその場に3分間留められた。被験動物はその後該動物の居たケージに戻され、プラットフォームは70%エタノールで清浄化された。
〔セグメント内の滞在時間(秒)〕:穴は、プローブ試行の間は迷路上に同一の白色ディスクを置くことにより閉鎖される。被験動物には迷路を探検するために90秒が与えられる。実験の場は(図6に示されるように)8個の完全に等しいセグメントに分割され、各セグメント中の被験動物の滞在時間がプローブ試験の間Ethovisionビデオ・トラッキング・ソフトウェアを使用して測定された。該バーンズ試験においてパラメータが示されて以下に議論されている。
〔速度〕:図7(a)及び図7(b)を参照すると、二元配置反復測定分散分析から、処理による速度に対する有意な効果は明らかにならず、したがって、学習及び記憶の測定値の解釈は試験化合物の覚醒効果又は鎮静効果によって混乱せしめられることはない。
Claims (9)
- 有効な量のポリゴナム・ミナス(Polygonum minus)の抽出物を、他の作用薬と組み合わせて又は他の作用薬と組み合わせることなく、含んでなる組成物であって、前記他の作用薬は薬剤または化粧品であり、かつ前記抽出物はケルセチン−3−グルクロニド及びケルシトリンを含んでなり、治療目的の作用薬を調製するために、前記ケルセチン−3−グルクロニドは重量比で0.2〜1.0%の量でポリゴナム・ミナスの抽出物として供給され、かつ前記ケルシトリンは重量比で0.1〜0.5%の量でポリゴナム・ミナスの抽出物として供給される組成物。
- ポリゴナム・ミナスの抽出物は11,000マイクロモルTE/グラム〜36,000マイクロモルTE/グラムの活性酸素吸収能力(ORAC)値を有している、請求項1に記載の組成物。
- ポリゴナム・ミナスの抽出物は少なくとも16000マイクロモルTE/グラムの活性酸素吸収能力(ORAC)値を有している、請求項2に記載の組成物。
- ケルセチン−3−グルクロニドの好ましい量は重量比で0.5%にてポリゴナム・ミナスの抽出物として供給される、請求項1に記載の組成物。
- ケルシトリンの好ましい量は重量比で0.2%にてポリゴナム・ミナスの抽出物として供給される、請求項1に記載の組成物。
- 認知増強のための作用薬を調製するための請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- スキンケアの目的のための作用薬を調製するための請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 前記組成物は皺発生防止の目的のための作用薬を調製するためのものである、請求項7に記載の組成物の使用。
- 酸化的細胞障害からの保護のための作用薬を調製するための請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物の使用。
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