JP6226545B2 - ヒアルロン酸を利用したスフェロイド培養法 - Google Patents
ヒアルロン酸を利用したスフェロイド培養法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6226545B2 JP6226545B2 JP2013082671A JP2013082671A JP6226545B2 JP 6226545 B2 JP6226545 B2 JP 6226545B2 JP 2013082671 A JP2013082671 A JP 2013082671A JP 2013082671 A JP2013082671 A JP 2013082671A JP 6226545 B2 JP6226545 B2 JP 6226545B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- culture
- hyaluronic acid
- medium
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
項1. CD44発現細胞をヒアルロン酸を含む培地で非接着系培養してスフェロイドを形成することを特徴とする、CD44発現細胞の培養法。
項2. CD44発現細胞ががん細胞及び/又はがん幹細胞である、項1に記載の培養法。
項3. ヒアルロン酸として低分子ヒアルロン酸をさらに使用し、低分子ヒアルロン酸と競合的にCD44と結合させることでCD44高発現細胞を得る、項1又は2に記載の培養法。
項4. 微生物が生成した酸化鉄を培地中に添加する、項1〜3のいずれか1項に記載の培養法。
微生物が生成した酸化鉄およびその製造方法は、WO2010/110435およびWO2011/074587に記載されており、これらの文献全体を本明細書に援用する。微生物が生成した酸化鉄は、様々な微生物が菌体外に生産する酸化鉄であり、種々の形状のものが知られている。微生物が生成した酸化鉄は、「バイオジナス酸化鉄」とも称される。
1)概略
ヒトグリオーマ由来U251MG細胞を用いた場合の概略を図1に示した。
ヒトグリオーマ由来A172細胞およびU251MG細胞、U251MG-P1細胞をそれぞれ非接着ディッシュ上でHAを添加した培地(100 μg/ml ヒアルロン酸ナトリウム(和光純薬社製 ヒアルロン酸ナトリウム,鶏冠製)、10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEM)上と添加していない通常の培地(10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEM)上で2〜5日間培養した。HAを添加しない場合には殆ど細胞が増殖しなかったが(図2にはU251MG-P1の結果のみを示した)、HAを添加した場合には細胞の密度が濃い部分が形成され、一部では細胞塊が形成された(図2.各右端)。またこれらの細胞は通常の接着系ディッシュ上では増殖が認められたので用いた細胞の状態は良好であると考えられた(図2.各左端)。
HA添加培地で作製したA172およびU251MG、U251MG-P1の細胞塊をAccutase溶液(Sigma-Aldrich社製)で懸濁して細胞を分散させた後、それぞれを再びHA添加培地、非接着系ディッシュ上で2週間培養した(図5)。いずれの細胞も再び細胞塊を形成し、細胞塊の周辺にはディッシュ表面に接着した細胞が観察され、細胞塊の自己複製能があることが示された。
A172細胞およびU251MG細胞、U251MG-P1細胞を接着系ディッシュ、通常培地上と非接着系ディッシュ、HA添加培地上でそれぞれ培養した細胞からRNAを抽出し、CD44遺伝子発現量をqPCR法によって解析した(図6)。U251MG細胞とU251MG-P1細胞は非接着系ディッシュ、通常培地上で培養した細胞からもRNA抽出と比較を行った。
HA添加培地で5日間培養した後、スフェロイド培養(100 μg/ml ヒアルロン酸ナトリウムおよびITS(Sigma-Aldrich社製)を添加した培地での培養)を2週間、非接着系ディッシュ(直径10 mm, 培地量10 ml)で行い、U251MG細胞をヌードマウスBalb/c-nu/nu、メス、4週齢に移植して4週間観察した(図8)。1〜3枚のディッシュから集めた細胞をそれぞれマウスの左腹部に移植した。右腹部には通常培養したU251MG細胞を107個、それぞれ移植した。ディッシュ2枚以上から集めた細胞の移植によって担がんが形成された。
A172細胞およびU251MG細胞それぞれを接着系ディッシュ上の通常培地(A)、非接着系ディッシュ上の通常培地(N)およびHA添加培地での培養(H)を行い、CD44タンパク質発現量をウエスタンブロッティング法によって比較した(図9)。細胞から抽出した総タンパク質を10 μgずつ泳動し、1次抗体は抗CD44マウスモノクローナル抗体(片山化学社製)及びHRP標識抗マウスIgG抗体(CSTジャパン社製)を用いた。また、抗β−アクチン抗体(CSTジャパン社製)とHRP標識抗ラビットIgG抗体(CSTジャパン社製)を用いて、構成的に発現しているタンパク質の内部指標として、β−アクチンを検出した。
U251MG−P1細胞がグリオーマ由来の細胞であることを確認するため、接着系ディッシュ上、通常培地でU251MG細胞およびU251MG−P1細胞、U251MG−P2細胞を培養して、アストロサイトのマーカータンパク質であるGFAPタンパク質をウエスタンブロッティング法で検出した(図10)。なお、U251MG−P1細胞をヌードマウスに移植して、担がんを摘出して初代培養した細胞をU251MG−P2とした。また、GFAPを発現していない細胞(ヒト卵巣がん由来SkOv-3細胞)から抽出したタンパク質をネガティブコントロールとして用いた。それぞれの細胞から抽出した総タンパク質を10 μgずつ泳動して、抗GFAP抗体(Santa Cruz Biotechnology社製)とHRP標識抗マウスIgG抗体(CSTジャパン社製)を用いて検出した。構成的に発現しているタンパク質の内部指標として、β−アクチンを検出した。
SkOv−3細胞、SkOv−3−P1細胞(SkOv−3細胞をマウスに接種後に担がんを摘出して初代培養した細胞)それぞれをU251MG細胞と同様に非接着ディッシュ上でHAを添加した培地(100 μg/ml ヒアルロン酸ナトリウム(和光純薬社製 ヒアルロン酸ナトリウム,鶏冠製)、10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むRPMI1640)上と添加していない通常の培地(10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むRPMI1640)上で4日間培養した(図11)。
Claims (4)
- CD44発現細胞をヒアルロン酸を含む培地で非接着系培養してスフェロイドを形成することを特徴とする、CD44発現細胞の培養法。
- CD44発現細胞ががん細胞及び/又はがん幹細胞である、請求項1に記載の培養法。
- ヒアルロン酸として低分子ヒアルロン酸をさらに使用し、低分子ヒアルロン酸と競合的にCD44と結合させることでCD44高発現細胞を得る、請求項1又は2に記載の培養法。
- 微生物が生成した酸化鉄を培地中に添加する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の培養法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013082671A JP6226545B2 (ja) | 2013-04-11 | 2013-04-11 | ヒアルロン酸を利用したスフェロイド培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013082671A JP6226545B2 (ja) | 2013-04-11 | 2013-04-11 | ヒアルロン酸を利用したスフェロイド培養法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014204674A JP2014204674A (ja) | 2014-10-30 |
JP6226545B2 true JP6226545B2 (ja) | 2017-11-08 |
Family
ID=52118840
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013082671A Expired - Fee Related JP6226545B2 (ja) | 2013-04-11 | 2013-04-11 | ヒアルロン酸を利用したスフェロイド培養法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6226545B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6792777B2 (ja) * | 2016-02-22 | 2020-12-02 | 凸版印刷株式会社 | スフェロイド形成促進方法 |
EP3835417A4 (en) * | 2018-08-08 | 2022-05-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | METHOD FOR CULTURE OF CANCER TISSUE OR TISSUE LIKE CANCER TISSUE |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007202506A (ja) * | 2006-02-03 | 2007-08-16 | Toshiba Ceramics Co Ltd | ヒト造血幹細胞または造血前駆細胞の培養方法 |
EP2412677A4 (en) * | 2009-03-27 | 2013-01-16 | Univ Okayama Nat Univ Corp | ORGANIC-INORGANIC COMPOSITE MATERIAL AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME |
-
2013
- 2013-04-11 JP JP2013082671A patent/JP6226545B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2014204674A (ja) | 2014-10-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10752879B2 (en) | Culture method and cell cluster | |
WO2014148562A1 (ja) | がん幹細胞を含む細胞集団を得る方法 | |
Cook et al. | Micromarrows—three-dimensional coculture of hematopoietic stem cells and mesenchymal stromal cells | |
CN102618491A (zh) | 诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及诱导方法和用途 | |
US20230407266A1 (en) | Primary culture method | |
Souza et al. | Advances in cell culture: more than a century after cultivating cells | |
AU2013298450B2 (en) | Method for culturing a subpopulation of circulating epithelial tumour cells from a body fluid | |
CN106834223B (zh) | 诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法 | |
JP2014132830A (ja) | 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞 | |
JP6226545B2 (ja) | ヒアルロン酸を利用したスフェロイド培養法 | |
KR101389851B1 (ko) | 신경능선줄기세포의 배양방법 및 그 용도 | |
JP5833126B2 (ja) | ウマ科動物の羊水由来の多分化能幹細胞及びそれを製造する方法 | |
CN108486039B (zh) | 小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法 | |
CN104630135B (zh) | 大规模制备肝干细胞的方法与用途 | |
US8969079B2 (en) | Method for inducing human blood-born hematospheres through aggregate culture and expanding blood adult stem cells and progenitor cells, and stem cell prepared by the same | |
KR102075035B1 (ko) | 나노패턴시트와 3차원 세포공배양분화용기를 이용한 연골세포 펠렛의 제조방법 | |
CN108998441A (zh) | 一种三维肿瘤球培养基添加剂、培养基以及三维肿瘤球培养方法 | |
JP6854879B2 (ja) | 巨核球と血小板とを分離する方法および巨核球と血小板とを分離するための器具 | |
Gautrot et al. | Biomimetic Artificial Bone Marrow Niches for the Scale Up of Hematopoietic Stem Cells | |
WO2024010053A1 (ja) | 胚葉体細胞組成物、分化細胞組成物及び分化細胞組成物の製造方法 | |
JP2017131213A (ja) | 分離および培養方法 | |
Bosch-Fortea et al. | Biomimetic Artificial Bone Marrow Niches for the Scale Up of Hematopoietic Stem Cells | |
CN113373111A (zh) | 一种培养脂肪间充质干细胞球状体的方法 | |
Heo | Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells on a patterned polymer surface | |
WO2014030641A1 (ja) | 細胞を培養する担体及び培養細胞を用いたタンパク質又はペプチドの生産方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160205 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170104 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170224 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170919 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20171010 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6226545 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |