JP6225162B2 - 組換えタンパク質の改良された収集操作 - Google Patents
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Description
本出願は、出典明示によりその全体が本明細書に援用される2012年3月27日に出願された米国仮特許出願第61/616297号の優先権の利益を主張する。
別段の定めがない限り、本明細書で使用される下記の用語及び語句は、下記の意味を有するものとする。
本発明は原核細胞系における組換えタンパク質の改良された作製方法に関する。本発明は、組換えタンパク質の製造中に発見される、産物の一部のロットが仕様を満たしていないことの原因になる褐色付加体の形成を防ぐことに基づいている。本明細書で提供する実施例に示すように、褐色の付加体の問題は、収集操作中の不定の酸化還元電位に起因していた。驚くべきことに、収集作業中に溶存酸素環境をゼロより高く維持することにより、又は代替的には、目的の組換えタンパク質の組換え作製で使用する原核宿主細胞ゲノムのmenE遺伝子を遺伝子学的に欠損させることにより、褐色の付加体の形成を防ぐことができるということが発見されている。
上記プロセスの最初の工程では、目的の組換えタンパク質を作製するために使用される異種核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)が、細菌内での発現のために好適な細菌用プロモーターの制御下で、複製可能なベクター内に適切に挿入される。多くのベクターがこの目的のために利用可能であり、適切なベクターの選択は、挿入されるべき核酸の大きさと、ベクターで形質転換されるべき特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能(DNAの増幅又はDNAの発現)及び自身と適合性のある特定の宿主細胞に依存する様々な構成要素を含んでいる。細菌形質転換用ベクターの構成要素は、異種ポリペプチドのためのシグナル配列を含んでもよく、シグナル配列を含むであろうし、また、異種ポリペプチドのための誘導性プロモーターも含むであろう。細菌形質転換用ベクターの構成要素はまた、通常、本明細書に記載の複製起点及び一つ以上のマーカー遺伝子も含む。
分析方法/アッセイ
Clarity,Opalescence and Coloration(COC)アッセイ
乳白度は、乳白溶液及び懸濁液の均一性における超顕微鏡的光学密度のために吸収され又は散乱された光の計器測定によっても判定することができる。そのような技術は、比ろう法及び比濁法である。着色試料の濁度計測のため、選択を伴うレシオ比濁比ろう法を用いる。懸濁粒子の光散乱効果は、透過光(比濁法)又は散乱光(比ろう法)のいずれかを観察することにより測定可能である。レシオ比濁法は、比ろう法と比濁法の両方の原理が組み合わさったものである。比濁法及び比ろう法は、微乳白色の懸濁液の測定に有用である。明確に定められた条件下で作製された参照懸濁液を使用しなければならない。適切な色の割り当てを確認するためには、米国薬局方2012(USPモノグラフ631,Color and Achromicity)や欧州薬局方5.0(EP Method 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids)に記載の標準色溶液(を参照)。懸濁液の光学的特性と分散相の濃度との関係が良くても半経験的であるため、定量的測定のためには検量線の作成が必須である。色は入射光と分散光の両方を減衰させ、濁度値を下げ、負の干渉を与えるため、着色液体の乳白色の判定はレシオ選択を伴うレシオ比濁計又は比ろう計でなされる。色の濃くない着色試料でさえもその効果は大きく、従来の比濁計は使うことができない。透明度と乳白度の機器による評価は、分析者の視力に依存しない、より識別力の高い試験を可能にする。数値結果は、特に安定性試験において、品質モニタリング及びプロセス制御のためにより有用である。例えば、安定性に関する先の数値データは、投薬製剤又は原薬の所与のロットが使用期限の前に保存期限を超えてしまうかどうかの判定に利用され得る。
高圧液体クロマトグラフィーとしても知られており、HPLCと略される高性能液体クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィーの特殊な形態であり、生化学及び分析化学において今日頻繁に使用されている。分析物を高圧で液体(移動相)中の固定相のカラムに通し、分離された成分が固定相に残る時間を短縮するので、成分がカラム中に拡散するのに必要な時間が短縮される。このことは得られるクロマトグラム中により狭いピークを生じるので、LCと比較してより良好な分解能及び感度をもたらす。試料溶質の溶解を確実にするように移動相を選択する。固定相について、微粒子シリカの大きな表面積が溶質−固定相の相互作用の差を強調するので、好ましくは微粒子シリカ(もとのままもしくは化学的に修飾された)を使用する。溶質移動相相互作用と比べて、溶質と強力に相互作用する固定相の使用は、非常に長い保持時間、すなわち分析に有用ではない状態を生じる。そのために、固定相は、移動相の相互作用に比べて弱〜中程度の溶質相互作用を提供するように選択されなければならない。結果的に、溶質の性質により、選択されるLCの種類が決まる。移動相でより強い相互作用が生じて試料の溶解及び迅速な溶出を確実にするはずであるが、一方、固定相は溶質間の微妙な差に対して応答性が高いはずである。例えば、極性の中性化合物は、極性移動相を溶質の分散的な特性の微妙な差を識別する非極性固定相と共に使用すると、通常、より良好に分析される。HPLCの強力な側面の一つは、移動相が変化して保持の機構を改変することができるということである。保持を調整するために、移動相に改質剤を加えることができる。例えば、水性移動相においてpHは重要な変数である。
核酸磁気共鳴(NMR)検出は、Hや13Cなど奇数の質量を有する所定の核がランダムに軸の周囲を回転することに基づく。しかし、強力な磁石の極の間に置かれた場合、スピンは磁場に対してパラレルかアンチパラレルのいずれかに整列されるが、エネルギーがわずかに低いためパラレル方向が好まれる。次いで、核を電磁放射線で照射し、電磁放射線は吸収されてパラレル核を高エネルギー状態にし、その結果として、核は放射線と「共鳴」するようになる。分子中の全ての核は、包含する磁場を変化させる電子雲に取り巻かれており、そのために吸収周波数が変わるので、H又はCのいずれも、その配置及び隣接する分子、又は化合物の元素に依存して異なるスペクトルを生じる。
質量分析法はイオンの質量対電荷比(m/z又はm/q)を測定するために用いられる分析手法である。これは、最も一般的には、試料成分の質量を表すマススペクトルを作成することによって物理的試料の組成分析を行うために使用される。この手法にはいくつかの応用例があり、例えば、化合物及び/又はそのフラグメントの質量による未知化合物の同定、化合物中の一つ以上の元素の同位体組成の判定、化合物のフラグメンテーションを観察することによる化合物の構造決定、慎重に設計された方法を用いた試料中の化合物の量の定量化(質量分析法は本質的には定量的ではない)、気相イオン化学の基盤研究(減圧におけるイオン及び中性粒子の化学)、様々な他のアプローチを用いた化合物の他の物理的、化学的又は生物学的特性の判定を含む。
紫外・可視分光法又は紫外可視吸光度測定法(UV−Vis又はUV/Vis)は、紫外可視スペクトル領域での吸光分光法又は反射分光法を指す。これは、可視領域とその隣接領域の光(近紫外及び近赤外(NIR))を使用することを意味する。可視領域の吸収率又は反射率が対象化学物質の観測される色に直接影響を与える。電磁スペクトルのこの領域で、分子は電子遷移を受ける。この手法は、蛍光が励起状態から基底状態への遷移に関わる一方、吸収が基底状態から励起状態への遷移を示すという意味で、蛍光分光法を補完するものである。UV分光計は、可視光及び/又は紫外線源(赤色)からの光線を使用する機器であり、(光源は)プリズム又は回折格子によってその成分波長に分離される。各単色(単一波長)光線は順番に、ハーフミラーを備えた装置により等しい強度をもつ二つの光線に分光される。一方の光線、すなわち試料光線(マゼンタ色)は、溶媒が透明である研究対象化合物の溶液を容れた小さな透明容器(キュベット)を通過する。他方の光線、すなわち参照光線(青色)は、溶媒のみを容れた同一のキュベットを通過する。次いで、これらの光線の強度が電子検出器により測定され、比較される。参照光線は殆ど又は全く光吸収を受けないはずだが、その強度をI0と定義する。試料光線の強度はIと定義する。分光計は短時間で自動的に、全ての成分波長を記載されている方法でスキャンする。スキャンされる紫外線(UV)領域は、通常、200から400nmであり、可視部分は400から800nmである。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上掲の一般的記述を所与として、他の様々な実施態様が実施され得る。
特定の組換えタンパク質製造中に、7つの保存用濾過バルク(FBS)が生産され、製品外観基準に反する典型的な結果が、7つのバルク中5つで得られた。製造仕様書ごとに、産物固有の試験指導書がCOCアッセイ(透明度/乳白色度、着色度、及び外観を判定する方法)による産物サンプル評価でイエロー(Y)系の使用を義務付けている。しかし、二つのバルク(実験2及び実験3)に褐色が現れ、COCアッセイで期待されるイエロー系の色基準でY7以下を満たさなかった。実験1−3のCOCの結果比較は図1に示されている。この相違を更に調べるため、7つのFBS試料を濃縮して色の純度を高めた。適切な色割り当て確認のために、濃縮サンプルは、米国薬局方2012(USP Monograph 631, Color and Achromicity)又は欧州薬局方5.0(EP Method 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids)に挙げられている全ての標準色溶液と比較された。試料は、参照試料を調製した5分後、黒い背景に対して垂直に見ながら、拡散昼光下で比較された。光線の拡散は、参照試料Iが容易に水と識別可能であり、参照懸濁液IIが容易に参照懸濁液Iと識別可能であるようなものでなければならない。液体は、その透明度が、水Rもしくは上記条件下での試験時に使用した溶媒の透明度と同じであれば、又は、その乳白色が参照試料Iのそれよりも顕著でなければ、透明と見なした。
この付加体を更に解明するために、実験3を分画用に選び(IECアッセイからの小さなピーク(図3)は回収した)、更に二次元LC−MSで分析、及びMS検出と合わせたトリプシンペプチドマップによる質量同定を行った。
産物の遊離チオールの生成及びその後のDHNAー産物付加体形成を防止するために、抑制手法が開発された。実験2と実験3が最高の力価及び細胞密度を示した為、発色の原因は収集操作中の低レドックス環境の結果であると判定された。実験2も実験3も、希釈ホモジネートをより長い保持時間に供し、15℃未満の目標温度を達成するためにより長時間ホモジネートを持続させ、次善のホモジネート混合時間及び速度を有していた(データは示していない)。これらの要因は、産物のジスルフィド結合の還元を促進し、DHNAがタンパク質産物の遊離チオールに結合する機会を与えるような低酸素環境を作ることに貢献した。
褐色付加体の形成抑制のために、本発明のHi−dO収集工程に加え、もう一つのアプローチが採られた。このアプローチはmenE遺伝子をゲノムから欠失させる、原核宿主細胞の遺伝子操作を伴い、それによって組換え産物と結合する可能性のあるメナキノン生合成経路からのDHNA中間体の生成を阻害する。
menE遺伝子欠失大腸菌宿主細胞の、DHNA結合タンパク質付加体を作らない組換えタンパク質作製能が試験された。簡単に述べると、menE遺伝子欠失大腸菌細胞は、二つの組換えタンパク質、PROT1及びPROT2、並びに二つの組換え抗体、AB1及びAB2をコードするプラスミド構築物で、当業者に周知の標準的な技術(例えば、Simmons 等, Expression of full-length immunoglobulins in E. coli: rapid and efficient production of aglycosylated antibodies, J of Immunol Methods 263 p. 133-147 (2002)を参照)により形質転換されているものだった。この4つの組換えタンパク質/抗体の発酵は、本明細書に記載の通りに進められた(本明細書において出典明示により援用される米国特許第6979556号も参照)。
Claims (15)
- 組換えタンパク質の製造方法であって、
(a)前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された原核宿主細胞を発酵させること、
(b)溶存酸素(dO2)が、工程(b)の収集操作の間、一貫して0%より高い濃度に維持されている条件下で前記組換えタンパク質を収集することであって、収集操作がホモジナイズ工程を含み、
1)前記dO 2 がホモジナイズ前に30%〜75%或いは75%より高い濃度に維持されているか、及び/又は
2)ホモジナイズ後に50%か又は50%より高い濃度に維持されており、
(c)前記組換えタンパク質を保存用濾過バルク(FBS)へと精製することとを含み、前記濾過バルクが、310nmでのイオン交換クロマトグラフィー(IEC)アッセイにより測定して、検出可能な1,4−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸(DHNA)−リコンビナントタンパク質付加体を含まない、組換えタンパク質の製造方法。 - 工程(c)の保存用濾過バルクが、HPLC、RP−HPLC、HIC−HPLC、NMR、質量分析法、又はUV分光法により分析される、請求項1に記載の方法。
- 前記dO2が1.5時間以上の間維持される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記dO2が2時間以上の間維持される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記dO2がオーバーレイエアーもしくはスパージドエアー、背圧の上昇、又は撹拌で維持される、請求項1〜4の何れか一項に記載の方法。
- オーバーレイエアーが0.4vvmから0.8vvmである、請求項5に記載の方法。
- オーバーレイエアーのターゲットが0.6vvmである、請求項6に記載の方法。
- 背圧の上昇が1.0〜30psiである、請求項5に記載の方法。
- 背圧の上昇のターゲットが19psiである、請求項8に記載の方法。
- 撹拌速度が6ワット/リットルから8ワット/リットルである、請求項5に記載の方法。
- 撹拌速度のターゲットが6ワット/リットルである、請求項10に記載の方法。
- 組換えタンパク質の製造方法であって、(a)前記組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換された、menE遺伝子を欠損した原核宿主細胞を発酵させることであって、前記原核宿主細胞は、大腸菌(E.coli)、エンテロバクター属、バシラス属、シュードモナス属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌、又は根粒菌である、発酵させること、(b)前記組換えタンパク質を収集すること、(c)前記組換えタンパク質をFBSへと精製することとを含み、前記濾過バルクが、310nmでのイオン交換クロマトグラフィー(IEC)アッセイにより測定して、検出可能な1,4−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸(DHNA)−リコンビナントタンパク質付加体を含まない、組換えタンパク質の製造方法。
- 組換えタンパク質の収率が、menE遺伝子を有する対照原核宿主細胞使用時の収率と比較して20%以上増、30%以上増、40%以上増、50%以上増である、請求項12に記載の方法。
- 発酵がスケール非依存的である、請求項1〜13の何れか一項に記載の方法。
- 前記組換えタンパク質が組換えポリペプチド又は単離された抗体である、請求項1〜14の何れか一項に記載の方法。
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