JP6224015B2 - 二重特異性アダプター - Google Patents
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Description
MCF7細胞でのラマ・グラマの免疫化
ヒト卵巣癌細胞の細胞表面タンパク質に対する体液性免疫応答を誘導するために、MCF7細胞(注射当たり約108個の細胞)の無傷ヒト細胞調製物をラマに注射した。各動物は7用量の皮下投与抗原の投与を1週間間隔で受けた。第0日(免疫化前)ならびに免疫化の4および6週間後に、免疫前血清および免疫血清を集めた。最後の抗原注射の4日後に、血液を集め、末梢血リンパ球(PBL)をFicoll−Paque(商標)PLUS勾配(Amersham Biosciences,Little Chalfont,UK)上の密度勾配遠心分離により精製して、約108個のPBLを単離した。
全RNAを、記載されているとおりに(50)、これらのPLBから抽出し、オリゴ−dTプライマーおよびSuperScript III First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を該製造業者のプロトコールに従い使用して、cDNAへと転写した。次に、cDNAをRNAアーゼHで処理して、残留RNAを枯渇させた後、QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen,Venlo,The Netherlands)を使用して精製を行った。ついで、精製されたcDNAを鋳型として使用し、2つのフォワードフレームワーク1(FR1)特異的プライマー:5’−GGCTGAGCTGGGTGGTCCTGG−3’および5’−GGCTGAGTTTGGTGGTCCTGG−3’を4:1の比で、そしてリバースCH2フラグメントプライマー:5’−GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC−3’を使用して、Ig重鎖コード化遺伝子セグメントのレパトワを増幅した。この増幅操作は約700bp(FR1からCH2までの重鎖のみの抗体に相当する)のPCR断片を与えた。ついで、それらの2つのクラスの重鎖コード化遺伝子をアガロースゲル上でサイズ分離し、重鎖のみのIgGをコードする遺伝子をQIAquick PCR精製キット(Qiagen,Venlo,The Netherlands)で精製した。次の工程において、精製されたDNAをネスティッドPCRにおいて鋳型として使用した。該PCRにおいては、フォワードFR1特異的プライマー:5’−CATTTGAGTTGGCCTAGCCGGCCATGGCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGG−3’により、重鎖のみの抗体フラグメントの5’末端にSfi部位を導入した。BstEII制限部位はVHH遺伝子のFR4の約90%において天然に存在するため、PCR増幅遺伝子のレパトワをSfiIおよびBstEIIで切断し、生じた400bpのcDNA断片をゲル電気泳動により精製した。最後に、cDNA断片を、繊維状バクテリオファージ上の提示のためにファジミドベクターpUR8100内に連結し(52)、大腸菌(Escherichia coli)TG1(K12,Δ(lac−pro),supE,thi,hsdD5/F’traD36,proA+B+,lacIq,lacZΔM15)内に電気形質転換(electo−transform)した。これはそれぞれ約106個の形質転換体の「免疫」VHHレパトワを与えた。
ヒトHER2受容体に結合する抗体を選択するために、幾つかのファージ提示選択を行った。第1のアプローチにおいては、捕捉組換え精製HER2外部ドメイン(ECD)(R&D Systems,Oxon,UK)上で抗HER2ファージを選択した。Maxisorpプレート(Nunc,Rochester,MN,USA)を1/500の希釈度のポリクローナルウサギ抗ヒトIgG抗体(DakoCytomation,Glostrup,Denmark)で4℃で一晩コートし、ついで該プレートをPBSで3回洗浄し、PBS中の漸減量の組換え精製HER2−ECD(0,5μg/ウェル;0,1μg/ウェル;0,05μg/ウェル;0,01μg/ウェル)と共に室温で2時間インキュベートした。未結合HER2−ECDをPBSで洗い落とし、該コート化ウェルをPBS中の4% 乳粉末で室温で1時間ブロッキングした。該「免疫」ライブラリーから調製され4% 乳粉末で室温で30分間にわたってヘッド・オーバー・ヘッド(head−over−head)で予備ブロッキングされたファージを次いで、固定化HER2−ECDへの結合のためにパンニングした。PBS/0.05% Tween−20での徹底的な洗浄の後、PBS中の1mg/ml トリプシン(Sigma−Aldrich)でファージを30分間溶出し、ついでMilliQ(Sigma−Aldrich)中の2mg/ml トリプシンインヒビターの添加によりトリプシンを中和した。追い出されたファージを使用して、指数関数的に増殖している大腸菌(E.coli)TG1に37℃で30分間にわたって感染させた。2%(w/v)グルコースおよび100μg/ml アンピシリンを含有するLB寒天プレート上で細菌をプレーティングした。この設定においては、VHH−ファージ1C8を、HER2−ECD外部ドメインに高いアフィニティで結合するその能力に基づいて選択した。
mCEACAM1a受容体のアミノ末端D1ドメイン(soR)をコードする遺伝子の構築は既に記載されている(20)。簡潔に説明すると、フォワードプライマー:5’−CATGGGCCCAGCCGGCCGAGCTGGCCTCAGCACAT−3’およびリバースプライマー:5’−CATGGCGGCCGCGGGGTGTACATGAAATCG−3’を使用して、プラスミドpCEP4:sMHVR−Ig(T.Gallagherにより快く提供されたもの)上でPCRを行った。得られたDNA断片soRは、5’SfiIおよび3’NotI部位(該プライマーにおいて下線で示されている)を含有していた。ついで、これらの制限酵素を使用して、該断片を発現ベクターpSecTag2内にクローニングして、soR−VHH発現カセットの生成を可能にする発現ベクターpSTsoR−x−mychisを得た(20)。発現カセットVHH−soRを得るために、まず、NotI部位の下流に追加的なHpaI部位を含有するリンカーを発現ベクターpSecTag2に含有させた。該soR遺伝子を、その天然シグナル配列を欠く、より小さなsoR[これは、それぞれNotIおよびHpaI制限部位(下線部)を有するフォワードプライマー:5’−CAGTGCGGCCGCCGAAGTCACCATTGAGGCTGT−3’および5’−ACTGGTTAACGGGGTGTACATGAAATCGC−3’を使用するPCRにより得られた]で置換した。これは発現ベクターpST−x−soRmychisを与えた。
soRに基づくアダプタータンパク質の製造のために、Ost7−1細胞のサブコンフルエント単層にT7ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス(vTF7−3)を5の感染多重度で感染させ(t=0時間)、それを、リポフェクチン(Lipofectin)(Life Technologies,Ltd.,Paisley,United Kingdom)を使用して、pST−soR、pST−soR−VHHまたはpST−VHH−soRでトランスフェクトした。培地をt=4.5時間において新鮮なものにし、t=20時間において回収し、3,000rpmで10分間遠心分離して、それを細胞残渣から取り出した。soRタンパク質を含有する上清を20% スクロースクッション上にローディングし、13,000rpmで90分間遠心分離して、vTF7−3ウイルスを除去した。該タンパク質バッチを−20℃で貯蔵した。
マウスOst7−1細胞(53)(B.Mossから入手)、ハムスターCHO−His.scFv(54)(T.Nakamuraから入手)、ヒト卵巣癌細胞系SKOV3(ATCC HTB−77)およびMCF7(ATCC HTB−22)を全て、10% ウシ胎児血清(FCS)、100IU/ml ペニシリンおよび100μg/ml ゲンタマイシン(全て、Life Technologies,Ltd.,Paisley,United Kingdomからのもの)を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM;Cambrex Bio Science,Verviers,Belgium)中で維持した。MHV−A59のストックを増殖させ、力価測定した(既に記載されているとおりに行った(51))。
アダプタータンパク質の存在下または非存在下にMHVが接種された細胞を、接種後20時間の時点で、3.7% パラホルムアルデヒドを含有するPBSで固定した。該細胞を、1% Triton X−100を含有するPBSで透過性亢進させ、ついで、1:300に希釈されたk134抗MHV血清と共に、ついで、1:300に希釈されたブタ抗ウサギペルオキシダーゼ(DAKO,Glostrup,Denmark)と共に(どちらも、5% ウシ胎児血清を含有するPBS中)、インキュベートした。該細胞を、AEC(Brunschwig,Amsterdam,The Netherlands)を該製造業者のプロトコールに従い使用して染色し、光学顕微鏡法により分析した。
アダプタータンパク質の機能性
該soR−VHHアダプタータンパク質の標的化能を調べるために、まず、対照細胞系CHO−scFv.His細胞(人工His受容体を構成的に発現する)に感染するその能力を試験することにより、これらのタンパク質が適切に産生されるかどうかを試験した。MHV−A59をsoR−1C8、soR−11A4、1C8−soR、11A4−soRと共に、または標的化装置を伴わないsoRを含有する対照上清と共にプレインキュベートし、これらの混合物を、並行して、これらの細胞上へ2時間接種した。接種後20時間の時点で、該細胞を固定し、MHVに対するポリクローナル抗体を使用して免疫染色を行った。全ての場合において染色が観察されたため、全てのアダプタータンパク質がMHVをCHO−His.scFv細胞に向け直すことが可能であったことを、データは示している(図3A)。また、コロナウイルス感染の目印であるシンシチウム形成が観察できた。模擬トランスフェクト化細胞からの細胞培養上清が接種された細胞は、予想どおり、陰性のままであった(示されていない)。興味深いことに、soR−VHHおよびVHH−soRは共に、MHVを向け直すことが可能であった。このことは、VHHのN末端およびC末端の両方の伸長が許容され、その標的化能に有害でなかったことを示している。
次に、類似した標的化実験を行った。この場合、HER2発現ヒト卵巣癌細胞にMHV−アダプタータンパク質混合物を接種した。この目的には、それぞれ高い及び低いHER2発現を示すMCF7細胞およびSKOV3細胞の両方を使用した。感染後20時間の時点で、該接種細胞の免疫染色は、両方の細胞系が、VHH含有アダプタータンパク質で向け直されたMHVには感染しうるが、対照タンパク質には感染し得ないことを示した(図3Bおよび3C)。感染MCF7細胞の数は陽性SKOV3細胞の数より相当に少なかったが、これはこれらの細胞によるHER2受容体発現における相違によるものだと考えられうる。また、明らかなシンシチウム形成がSKOV3では観察できたが、MCF7細胞では観察できなかった。結論としては、該感染は、特異的VHHにより代表される標的化部分とHER2受容体発現の両方に依存的であった。
標的化組換えのためのベクターの構築
MHV−A59のウイルスゲノムにおける追加的な発現カセットからの該アダプタータンパク質の発現を可能にするために、上流転写調節配列(TRS)(20)を含む、VHH−soRmychisおよびsoR−VHH−mychisをコードする遺伝子を、まず、MHV−A59のS遺伝子に融合したレプリカーゼ遺伝子1bの約1,200bpの3’末端を含有するpXH1802(48)内にクローニングする。この目的のために、該インサートを、該ベクターをEcoRVおよびPmeIで消化することにより得、該精製断片をpXH1802のクレノウ処理HindIII部位内にクローニングする。ついで、得られたプラスミドをRsrIIおよびAvrIIで消化し、得られた断片を、同じ酵素で処理されたpMH54(16)内にクローニングする。これは、標的化組換えに適した転写ベクターpMH−soR−VHH−myHisおよびpMH−VHH−soR−mycHisを与えた。
アダプター遺伝子VHH−soR−myHisおよびsoR−VHH−mycHisを追加的な発現カセットとして、既に記載されているとおりに(48,16,49,20)、標的化RNA組換えにより、MHVゲノム内に導入する。簡潔に説明すると、PacIで線状化されたプラスミドpMH−VHH−soR−myHisおよびpMH−soR−VHH−mycHisからインビトロで転写されたドナーRNAを、4時間前に0.5の感染多重度(MOI)でfMHVに感染したネコFCWF−4細胞内にエレクトロポレーションによりトランスフェクトする。ついで、これらの細胞を培養フラスコ内でプレーティングし、24時間後に培養上清を集める。後代ウイルスをプラーク精製し、ウイルスストックをLR7細胞上で増殖させる。これらのウイルスストックからの精製ウイルスRNAでの逆転写(RT)−PCRによる該追加的発現カセットの存在の確認の後、該ストックのウイルス力価をLR7細胞上の終点希釈により決定する。ついで、これらの継代2ウイルスストックを該実験において使用する。各ウイルスに関して、該ウイルスゲノムの他の部分における意図されない突然変異により引き起こされる作用に関する対照としての、2つの独立した組換え体を作製する。
まず、QIAGENウイルスRNA単離キット(製造業者に従う)を使用して、140μlのウイルス含有培養上清からウイルスRNAを単離する。ついで、MHVゲノム(GenBankアクセッション番号NC 001846)のnt 24,110〜24,128に位置するリバースプライマー1127(5’−CCAGTAAGCAATAATGTGG−3’)を使用して、該単離RNAでの逆転写を行う。挿入された発現カセットを含有する領域を重複しているプライマー1173 (5’−GACTTAGTCCTCTCCTTGATTG−3’,nt 21650〜21671)および1260(5’−CTTCAACGGTCTCAGTGC−3’,nt 24,041〜24,058)を使用して、PCRを行う。ついで、該インサートの配列を確認するために、得られた断片を配列決定する。
1×105個の量のCHO−His.scFv、SKOV3およびMCF7細胞に0.5×105 TICD50を接種する。接種後16時間の時点で、該細胞を固定し、MHV抗血清(前記のとおり)を使用するイムノペルオキシダーゼ染色を行って、該細胞がウイルスタンパク質を発現したかどうか、したがって組換えMHVに感染したかどうかを分析する。
Claims (6)
- 二重特異性アダプターをコードするヌクレオチド配列を含むRNAまたはDNA分子を含む発現カセットを組換えコロナウイルスが含むことを特徴とする組換えコロナウイルスであって、該二重特異性アダプターが、コロナウイルススパイク−タンパク質受容体部分の可溶性部分とラクダVHH抗体部分とを含むタンパク質であり、二重特異性アダプターをコードするヌクレオチド配列が転写調節配列(TRS)の制御下にある、組換えコロナウイルス。
- 該コロナウイルススパイク−タンパク質受容体が、マウス肝炎ウイルス(MHV)スパイク−タンパク質受容体、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス(FIPV)スパイク−タンパク質受容体および伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)スパイク−タンパク質受容体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の組換えコロナウイルス。
- 該ラクダVHH抗体部分が腫瘍特異的抗原に対するものであることを特徴とする、請求項1〜2いずれか1項に記載の組換えコロナウイルス。
- 医薬としての使用のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換えコロナウイルス。
- 腫瘍の治療における使用のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換えコロナウイルス。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換えコロナウイルスを含む医薬組成物。
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