CN101293924A

CN101293924A - 骨桥蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其在制备抗肿瘤转移药物中的用途

Info

Publication number: CN101293924A
Application number: CNA2007100398733A
Authority: CN
Inventors: 郭亚军; 戴建新; 王皓; 寇庚; 侯盛; 钱卫珠; 彭玲
Original assignee: SHANGHAI GUOJIAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY INSTITUTE
Current assignee: SHANGHAI GUOJIAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY INSTITUTE
Priority date: 2007-04-24
Filing date: 2007-04-24
Publication date: 2008-10-29
Also published as: CN101679485B; WO2008128455A1; JP2010525795A; BRPI0810826A2; CN101679485A; EP2149582A1; CA2685182A1; EP2149582A4; US20100151486A1

Abstract

本发明公开了一种骨桥蛋白的功能表位NAPS，与这个表位特异性结合的单克隆抗体1A12，本发明还公开了单克隆抗体1A12的重链可变区氨基酸序列SEQID NO.4和轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.6，本发明进一步公开了此抗体在制备抗肿瘤转移药物中的用途。

Description

骨桥蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其在制备抗肿瘤转移药物中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种蛋白的功能表位、与这个表位特异性结合的单克隆抗体及其在制备抗肿瘤转移药物中的用途。

背景技术

肿瘤是严重危害我国人民生命健康的重大疾病，肿瘤手术切除后5年，生存率可达40％左右，但仍有一半左右的病人手术后出现转移复发。如何控制肿瘤切除后很高的转移复发率以提高肿瘤患者的疗效，是国际医学研究的重点攻关课题。深入研究肿瘤细胞转移的机理有助于阐明肿瘤转移复发的分子机制，了解促进转移的信号传导通路，寻找抑制转移的有效作用环节，为新药研制和临床治疗提供更有效的阻断靶点，提高肿瘤病人的生存率。

肿瘤转移分子机理研究提示多种因素与肿瘤细胞转移密切相关，如：p16突变、p53突变，p21、c-erbB-2、mdm-2、转移生长因子α(TGFα)、表皮生长因子受体(EGF-R)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体与纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍化内皮生长因子(PD-ECGF)等为肝癌侵袭性正相关因子(Yamaguchi H，Wyckoff J，Condeelis J.Cell migration intumors.Curr Opin Cell Biol.2005；17(5)：559-64.Huber MA，Kraut N，BeugH.Molecular requirements for epithelial-mesenchymal transition duringtumor progression.Curr Opin Cell Biol.2005 Oct；17(5)：548-58.)。

近年来的研究发现骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)在肿瘤细胞转移过程中发挥了至关重要的作用(Rangaswami H，Bulbule A，Kundu GC.Osteopontin：role in cell signaling and cancer progression.Trends Cell Biol.2006Feb；16(2)：79-87.)，在各国研究小组共同努力下，OPN促转移信号通路领域不断有新的报道，从不同的角度对其促肿瘤细胞转移功能的主要方面进行了解释，OPN信号通路在促进肿瘤细胞转移方面的重要调控作用已经成为国际肿瘤转移研究领域的研究热点。

骨桥蛋白作为一种重要的促肿瘤转移糖蛋白信号分子在骨骼组织、肾脏组织、大脑组织、腺体表皮细胞、血管平滑肌细胞、活化的巨噬细胞、淋巴细胞和肿瘤细胞中均有表达(Weber GF，Ashkar S，Glimcher MJ，Cantor H.Receptor-ligand interaction between CD44 and osteopontin(Eta-1).Science(Washington，DC)1996；271：509-12.)。OPN在肿瘤组织细胞外基质中，能够通过激活肿瘤细胞表面的CD44(Miyauchi A，Alvarez J，Greenfield EM，et al.Recognition of osteopontin and related peptides by an αvβ3integrin stimulates immediate cell signals in osteoclasts.J Biol Chem1991；266：20369-7)和Integrin(Teramoto H，Castellone MD，Malek RL，Letwin N，Frank B，Gutkind JS，Lee NH.Autocrine activation of anosteopontin-CD44-Rac pathway enhances invasion and transformation byH-RasV12.Oncogene.2005 Jan 13；24(3)：489-501.)两大受体下游的信号通路，促进肿瘤细胞对细胞外基质的降解、细胞迁移和细胞的抗凋亡能力，包括以下几个方面：OPN信号被受体CD44识别引起肿瘤细胞Rho家族小G蛋白如Rac的活化(Teramoto H，Castellone MD，Malek RL，Letwin N，Frank B，Gutkind JS，Lee NH.Autocrine activation of an osteopontin-CD44-Rac pathway enhancesinvasion and transformation by H-RasV12.Oncogene.2005 Jan13；24(3)：489-501.)，小G蛋白传达细胞外化学趋化信号至下游的效应蛋白如Wiskott-Aldrich syndrome protein(WASP)家族成员，WASP蛋白结合并活化Actin相关蛋白(Arp2/3)复合物，后者催化肌动蛋白Actin的聚合反应，从而诱导肿瘤细胞骨架重构以及细胞膜突起的形成，增强细胞的迁移能力(Wolf K，Mazo I，Leung H et al.Compensation mechanism in tumor cell migration：mesenchymal amoeboid transition after blocking of pericellularproteolysis.J Cell Biol 2003；160：267-77.)；在迁移细胞被拉伸的前缘，活化的WASP蛋白促使突出的细胞膜形成Integrin依赖的细胞粘附，诱导基质金属蛋白酶在局部的积累促进细胞外基质的降解(Nicholson，K.M.andAnderson，N.G.(2002)The protein kinase B/Akt signaling pathway inhuman malignancy.Cell.Signal.14，381-395)；此外OPN-CD44下游通路可以激活PI-3K，而PI-3K的靶分子之一就是Akt激酶，Akt激酶调控细胞周期的进行，促进细胞存活，细胞锚定非依赖性生长以及细胞迁移等过程，介导了OPN促进肿瘤抗凋亡和细胞迁移功能(Lin，Y.H.and Yang-Yen，H.F.(2001)Theosteopontin CD44 survival signal involves activation of thephosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway.J.Biol.Chem.276，46024-46030。Philip，S.and Kundu，G.C.(2003)Osteopontin inducesnuclear factorkB mediated promatrix metalloproteinase-2 activationthrough 1 kappa B alpha/IKK signaling pathways and curcumin(diferulolylmethane)downregulates these pathways.J.Biol.Chem.278，14487-14497)。OPN被受体αvβ3识别后激活NIK和MEKK1分别引起下游NF-κB和AP-1的活化入核诱导效应基因uPA和MMPs表达的上调，促进了对细胞外基质的降解(Rangaswami，H.et al.(2004)Nuclear factor inducing kinaseplays a crucial role in osteopontin induced MAPK/l κBa kinase dependentnuclear factor κB mediated promatrixmetalloproteinase-9 activation.J.Biol.Chem.279，38921-38935，Rangaswami，H.et al.(2005)JNK1differentially regulates osteopontin induced nuclear factor inducingkinase/MEKK1 dependent activating protein 1-mediated promatrixmetalloproteinase-9 activation.J.Biol.Chem.280，19381-19392)。综上所述，OPN信号通路功能的发挥为肿瘤转移细胞完成对细胞外基质的侵润、通过血液或者淋巴循环向外周组织器官扩散和形成转移灶的各个阶段中表现出多方面的重要调控功能。

通过抗OPN抗体阻断OPN的促转移信号传导通路，就有可能有效阻断肿瘤细胞的黏附和迁移过程，防止肿瘤细胞向细胞基质的侵润，从而防止肿瘤的转移。

发明内容

本发明的目的之一是公开了骨桥蛋白的功能表位NAPS。

本发明的另外一个目的是公开了与上述功能表位特异性结合的抗骨桥蛋白的单克隆抗体。

本发明还公开了上述单抗的重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.4，轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.6。

更具体地，本发明公开了抗骨桥蛋白的单克隆抗体1A12，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.6，恒定区为小鼠IgG。

本发明还公开了一种DNA分子，编码上述的抗骨桥蛋白的单克隆抗体。

本发明更进一步公开了上述编码抗骨桥蛋白单克隆抗体的DNA分子其包含编码重链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO.3和编码轻链可变区的核苷酸序列SEQID NO.5。

本发明的另外一个目的是公开了上述抗骨桥蛋白的单克隆抗体在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

本发明所述的与本发明中公开的上述骨桥蛋白功能表位特异性结合的抗骨桥蛋白的单克隆抗体，包括但不限于利用重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.4与轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.6通过现有的分子生物学技术得到的单克隆抗体，还包括与本发明中公开的上述骨桥蛋白功能表位特异性结合的利用现有的分子生物学技术可以得到的嵌合的单克隆抗体、人源化及全人源的单克隆抗体。

本发明所称的肿瘤，包括但不限于腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，肿瘤组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、***、***、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可用于中枢神经***的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等，此外眼部的肿瘤包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内分泌***肿瘤、胃肠道胰腺内分泌***肿瘤，生殖***肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再一一列举。

本发明所称的抗肿瘤转移药物，包括但不限于预防和/或***转移的药物。

具体地，本发明的申请人首先利用分子生物技术克隆人和鼠OPN基因，利用真核细胞表达了人和鼠的OPN蛋白，并通过细胞融合杂交瘤的方法制备了鼠抗人的OPN单克隆抗体1A12，还对此单克隆抗体的基因进行了克隆并测定了其序列。

本发明的申请人利用乳腺癌细胞株MDA-MB-435s进行了一系列实验，来验证本发明公开的鼠抗人OPN单克隆抗体1A12对肿瘤转移的抑制作用。细胞贴壁实验结果显示抗OPN抗体1A12可以有效阻断MDA MB-435s细胞和hOPN的结合，细胞侵袭实验结果表明抗OPN抗体1A12可有效阻断MDA-MB 435s于hOPN存在时进行的基底膜侵袭，损伤划痕实验结果显示抗OPN抗体1A12可以有效抑制细胞损伤划痕的修复，软琼脂克隆形成实验结果显示抗OPN抗体1A12可以抑制MDA-MB-435s细胞在软琼脂上克隆形成的大小，相应地，作为对照的无关抗体则没有上述作用，从而说明了本发明公开的上述抗hOPN抗体1A12可有效抑制转移肿瘤灶的形成的作用。

本发明的申请人还利用噬菌体展示技术鉴定了抗hOPN抗体1A12作用的OPN的功能表位，这个功能表位为NAPS，进一步阐明了OPN分子的作用靶点。更具体地，本发明的申请人通过单克隆抗体抗原表位的淘选、phage clones ELISA和western blot鉴定测序及序列分析推测出OPN的功能表位，进一步通过Phage克隆与抗体结合能力分析选择结合力最强的克隆合成了系列短肽，通过这些短肽与特异性抗体的结合实验对此表位进行了鉴定。

附图说明

图1.人、鼠OPN真核表达纯化后的SDS-PAGE电泳图；M代表蛋白质标准分子量；

图2.抗hOPN单抗1A12的Western blotting结果；

图3.抗hOPN单抗1A12阻断肿瘤细胞黏附的结果；

图4.抗hOPN单抗1A12抑制肿瘤细胞对基底膜侵袭的结果；

图5.抗OPN单抗1A12抑制肿瘤细胞对损伤划痕的修复；

图6.抗OPN单抗1A12抑制肿瘤细胞在软琼脂上克隆形成的结果；

图7.抗OPN单抗1A12淘选三轮后的产出效率比较图；

图8.抗OPN单抗1A12阳性噬菌体ELISA和WESTERN鉴定图，图8-1为phageELISA鉴定图，图82为1A12阳性噬菌体ELISA和WESTERN鉴定图；

图9.Align X软件序列分析抗OPN单抗1A12的结合表位结果；

图10.各种序列表位与抗OPN单抗1A12结合力的比较；

图11抗OPN单抗1A12特异识别表位在OPN分子上的相对部位。

具体实施方式

以下结合实施例、实验例进一步对本发明进行说明，这些实施例、实验例不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因***到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和单克隆抗体筛选及纯化的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press.

实施例抗OPN单克隆抗体的制备

实施例1.人OPN cDNA片段的克隆

参照GENEBANK提供的人OPN的资料及序列，合成引物：OPN引物有义(引物1)：GGG|AAGCTT|ACCATGAGAATTGCAGTGATTTG(Hind III)(SEQ ID NO.8)和OPN反义(引物2)：GCC|GGTACC|ATTGACCTCAGAAGATGCAC(Kpn I)(SEQ IDNO.9)。扩增人肝癌细胞株LM3(购自上海中山医院)，用TRISOL试剂盒(INVITROGEN)提取RNA，通过RT-PCR(PROMEGA)94℃ 5分钟；94℃ 45秒，58℃ 30秒，72℃ 45秒，30个循环；72℃ 10分钟，获得963bp的DNA片段。通过凝胶回收试剂盒(上海生工)回收片段后，用限制型内切酶Hind III和Kpn I酶切，凝胶电泳回收后，与经Hind[]i和Kpn I双酶切的质粒载体连接，转化大肠杆菌DH10B后，筛选获得有***片段的阳性克隆。DNA序列测定确认，OPN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2.鼠OPN cDNA片段的克隆

参照GENEBANK提供的鼠OPN的资料及序列，合成引物：鼠OPN引物有义(引物3)：AT

GGATGACGACGACAAGATGAGAATTGCAGTGATT(Hind III)(SEQ IDNO.10)和鼠OPN反义(引物4)：AT

TTAATTGACCTCAGAAGA(KpnI)(SEQ ID NO.11)。分离鼠脾脏T淋巴细胞，用ConA激活30小时后，用TRISOL试剂盒(INVITROGEN)提取RNA，通过RT-PCR(PROMEGA)PCR反应采用热启动，反应条件：94℃分钟；94℃ 45秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒，30个循环；72℃ 10分钟。获得963bp的DNA片段。通过凝胶回收试剂盒(上海生工)回收片段后，用限制型内切酶IIind III和Kpn I酶切，凝胶电泳回收后，与经Hind III和Kpn I双酶切的质粒载体连接，转化大肠杆菌DH10B后，筛选获得有***片段的阳性克隆。DNA序列测定确认。鼠OPN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3.人、鼠OPN的真核细胞表达纯化

将实施例2所得的序列正确的人、鼠OPN基因片段用相应的限制性内切酶酶切回收后，装入pPICZα质粒中。转染毕式酵母细胞，挑取单个克隆酵母，诱导表达出人、鼠OPN蛋白，收集酵母细胞表达上清，经阴离子交换、分子筛纯化，SDS PAGE证实得到人、鼠OPN纯蛋白。纯化后经SDS-PAGE电泳，结果见附图1。

实施例4.鼠抗人OPN单克隆抗体的筛选与制备

100ug人OPN和等体积弗氏佐剂乳化后，腹腔注射BALB/C小鼠免疫接种，每二周后加强免疫一次，剂量均同第一次免疫，共免疫3次后，选取血清中抗OPN抗体滴度较高小鼠，分离其脾脏淋巴细胞，利用经典的PEG法，将小鼠脾脏淋巴细胞与NS-1细胞进行细胞融合。用10ug/ml OPN包被96孔板，采用ELISA法反复筛选获得可稳定表达抗人OPN抗体的杂交瘤细胞株——1A12。大量扩增单克隆细胞株1A12，腹腔注射BALB/C小鼠5×10⁶/只，10天左右开始收集小鼠腹水，利用Protein A柱，亲和层析纯化抗人OPN的单克隆抗体。Western blotting试验结果显示，小鼠抗人OPN单克隆抗体1A12不但与人OPN蛋白特异结合，同时与鼠OPN蛋白也有交叉反应。结果见附图2。

实施例5.鼠抗人OPN无关对照单克隆抗体23C3D3的筛选与制备

100ug人OPN和等体积弗氏佐剂乳化后，腹腔注射BALB/C小鼠免疫接种，每二周后加强免疫一次，剂量均同第一次免疫，共免疫3次后，选取血清中抗OPN抗体滴度较高小鼠，分离其脾脏淋巴细胞，利用经典的PEG法，将小鼠脾脏淋巴细胞与NS 1细胞进行细胞融合。用10ug/ml KLH-WLVPDP(上海业力公司合成)包被96孔板，采用ELISA法反复筛选获得可稳定表达抗人OPN特异表位抗体的杂交瘤细胞株-23C3D3。大量扩增该单克隆细胞株，腹腔注射BALB/C小鼠5×10⁶/只，10天左右开始收集小鼠腹水，利用Protein A柱，亲和层析纯化抗人OPN特异表位的无关对照单克隆抗体23C3D3。通过测序确定其序列，其重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.19，轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.20和SEQ IDNO.21，恒定区为小鼠1gG恒定区。23C3D3单抗也可以利用上述序列通过分子生物学技术得到。

实验例鼠抗人OPN单克隆抗体1A12作用效果实验

MDA-MB-435s(购自中国科学院上海细胞学研究所)无关抗体(23C3D3，制备方法见实施例5)

实验例1细胞贴壁实验

将96孔板(Greiner)以10μg/ml的hOPN(来自实施例3)或BSA(SIGMA)包被，4℃过夜；用1％BSA/PBS于37℃封闭1小时，以阻断非特异性结合位点。MDA-MB-435s细胞用0.2％EDTA消化，重悬于0.25％BSA/DMEM中，调整细胞浓度为5×10⁶细胞/ml。每孔加入100μl细胞，处理组同时加入25μg/ml的1A12单抗，对照组加入25μg/ml的无关抗体。将细胞在37℃细胞培养箱中孵育2小时后，以PBS洗2遍，洗去未贴壁的细胞。每孔加入100μl 1％甲醛于4℃固定细胞10分钟。PBS洗涤之后，每孔加入100μl 0.5％的结晶紫室温30分钟将细胞染色。每孔加入50μl 2％Triton X 100裂解细胞，在OD 595nm处进行读数。

实验结果见图3，抗hOPN的1A12单抗在25μg/ml可以有效阻断MDA-MB-435s细胞和hOPN的结合，而无关对照抗体则无此作用。

实验例2细胞侵袭实验

细胞侵袋实验选用Transwell小室***(Corning)进行，膜孔径大小为8μm。小室的上层包被人工基底膜成分Matrigel，在通风橱内吹干，用DMEM于37℃，1小时对其进行水化。MDA-MB 435s细胞用0.2％EDTA进行消化，重悬于0.25％BSA/DMEM中，调整细胞浓度为5×10⁶细胞/ml。在小室的上层加入100μl细胞悬液(含或不含抗OPN单抗1A12)，在小室的下层加入0.25％BSA/DMEM(含或不含OPN)，于37℃细胞培养箱中孵育24小时。孵育结束，用棉拭子将小室上层的细胞刮除，穿过基底膜至下层的细胞用PBS洗涤之后，以1％甲醛固定之后，以0.5％的结晶紫进行染色，200倍显微镜下观察，计数每个视野下细胞的数量。

实验结果见图4，抗hOPN单抗1A12在25μg/ml即可有效阻断MDA-MB-435s于hOPN存在时进行的基底膜侵袭，而无关对照抗体则无此作用。

实验例3损伤划痕实验

将MDA MB 435s细胞在12孔板中培养至接近饱和(＞90％)，用PBS洗涤之后，以无血清DMEM对细胞进行过夜血清饥饿。用10μl移液器枪头对单层细胞进行划线，用PBS洗去漂起的细胞。加入抗OPN的1A12单抗，使之终浓度为25μg/ml，对照组采用无关抗体处理。将细胞在37℃细胞培养箱中孵育24小时后，进行拍照。结果以穿越基准线的细胞数表示。

实验结果见图5，抗OPN单抗1A12在25μg/ml可以有效抑制细胞损伤划痕的修复，而无关对照抗体则无此作用。

实验例4软琼脂克隆形成实验

软琼脂克隆形成实验使用双层软琼脂***进行。将2.5％融化的琼脂粉与37℃预温的DMEM培养基混合，配制0.5％的琼脂粉溶液，再用DMEM稀释成浓度为0.3％琼脂粉溶液。在24孔细胞培养板每孔加入500μl 0.5％琼脂粉溶液，置于4℃使其凝固后，转移至37℃细胞培养箱中保温。MDA-MB-435s细胞以0.2％EDTA消化后，用0.3％琼脂粉溶液重悬，调整细胞浓度为5×10³细胞/ml。在24孔板每孔中加入500μl细胞悬液，并使其凝固。从第二日起，每隔1日向细胞培养板的各孔中加入1A12或无关抗体(23C3D3)(25μg/ml)处理，3周后观察克隆形成的大小，以＞10个细胞聚集作为1个克隆。

实验结果见图6，抗OPN的1A12单抗可以抑制MDA MB-435s细胞在软琼脂上克隆形成的大小，而对照抗体则无此作用。说明该抗体可有效抑制转移肿瘤灶的形成。

实验例1A12单抗抗原表位的鉴定实验

实验例1 1A12单抗的可变区基因克隆和序列测定

收集1A12 5×10⁶～1×10⁷杂交瘤细胞；用TRIzol(InvitrogenCat.No.15596-026)抽提其总RNA，根据小鼠抗体恒定区序列，设计引物如下：

HGSP1：5’GATACTGTGATCTGTTTG 3’(SEQ ID NO.12)

HGSP2：5’TCGCAGATGAGTCTGGAC 3’(SEQ ID NO.13)

HGSP3：5’ATGAACACACTCACATTG 3’(SEQ ID NO.14)

LGSP1：5’GAGGTTATGACTTTCATAGTCAGC-3’(SEQ IDNO.15)

LGSP2：5’AACACTGTCCAGGACACCATCTCG-3’(SEQ IDNO.16)

LGSP3：5’TCTGGGATAGAAGTTGTTCATGAG-3’(SEQ IDNO.17)

采用Invitrogen 5’RACE kit(Cat.No.18374058)，分别以HGSP1，LGSP1为引物，合成第一链cDNA；在TdT和dCTP作用下，给第一链cDNA 3’端加polyC尾；分别以HGSP2，HGSP3、LGSP2，LGSP3为5’引物，通过巢式PCR得到VH、VL的PCR产物；将PCR产物装入pGEM T载体中；挑取克隆抽提质粒，限制性内切酶鉴定得到阳性克隆，通过测序确定其序列。1A12单抗的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.4，1A12单抗的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，氨基酸序列为SEQ ID NO.6

实验例2m anti hOPN(1A12)单克隆抗体抗原表位的淘选

采用随机肽库免疫淘选法，整个过程在96孔板上进行。100ug/ml，100ul/孔1A12抗体4℃包被过夜，10％脱脂奶粉(TBST稀释)封闭过夜，1×TBST(Tween 20 0.1％)洗涤6次；噬菌体随机肽库(购自NEB，Ph.D.-12^TM PhageDisplay Peptide Library Kit)4×10¹⁰pfu+100ul正常小鼠血清，室温轻摇1小时。1×TBST(Tween-200.1％)15次；用含1mg/ml BSA的Glycine-Cl PH 2.2洗脱，室温轻摇15min，15ul Tris Cl PH 9.1中和。10ul用于测滴度，其余扩增。扩增产物经PEG/NaCl沉淀，测滴度，同时进行第二轮淘选，相同过程进行第三轮淘选。每次input噬菌体数相同(4×10¹⁰pfu)，三轮淘选output噬菌体数分别为6.9×10²pfu、2.99×10⁶ pfu、1.69×10⁸pfu；淘选效率分别是第一轮的4333和240000倍，结果表明：淘选富集效果明显，见图7。

实验例3无关对照抗体23C3D3对应噬菌体克隆的淘选

采用随机肽库免疫淘选法，整个过程在96孔板上进行。100ug/ml，100ul/孔23C3D3抗体4℃包被过夜，10％脱脂奶粉(TBST稀释)封闭过夜，1×TBST(Tween 20 0.1％)洗涤6次；噬菌体随机肽库(购自NEB，Ph.D.-12^TM PhageDisplay Peptide Library Kit)4×10¹⁰pfu+100ul正常小鼠血清，室温轻摇1小时。1×TBST(Tween 200.1％)15次；用含1mg/ml BSA的Glycine-Cl PH 2.2洗脱，室温轻摇15min，15ul Tris Cl PH9.1中和。10ul用于测滴度，其余扩增。扩增产物经PEG/NaCl沉淀，测滴度，同时进行第二轮淘选，相同过程进行第三轮淘选。用23C3D3抗体包板，ELISA方法检测，选取阳性反应克隆——5F12，作为对照噬菌体。

实验例4phage elones ELISA和wcstern blot鉴定

ELISA过程在96孔板进行，100ug/ml，50ul/孔1A12单抗4℃包被过夜，10％脱脂奶粉(TBST稀释)37℃封闭2小时，1×TBST(Tween-20 0.1％)洗涤5次；各单克隆噬菌体扩增上清用1×TBS稀释后，均以5×10⁸pfu/50ul，对照抗体为鼠抗人OPN单克隆抗体(Santa Cruz)，阴性对照噬菌体为5F12(该克隆为23C3D3的阳性克隆)。室温结合1小时，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤5次后，每孔加入200ul1∶5000稀释的HRP标记的抗M13抗体(Pharmacia #27-9411-01)，室温震荡作用1小时，1×TBST(Tween-20 0.1％)洗涤5次，晶美公司ELISA检测试剂盒A∶B＝1∶1新鲜配置的反应底物50ul/孔，室温15分钟。2N H₂SO₁终止反应。每个克隆对1A12和对照抗体23C3D3均设3复孔平行检测。OD₄₅₀记录结果表明，阳性克隆与抗体的反应是特异的。如图8-1，

Western blot过程：扩增后的噬菌体单克隆上清经20％PEG/NaCl沉淀纯化后，1×10¹⁰pfu/lane 10％SDS PAGE电泳，360mA恒流1小时转至硝酸纤维素膜，10％脱脂奶粉4℃封闭过夜或者室温封闭2小时；1×TBST(Tween-20 0.1％)洗涤3次，每次10分钟；与10ug/ml一抗室温反应1小时，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤5次，每次10分钟；1∶1000稀释HRP标记的兔抗鼠IgG(北京中山公司)室温反应1小时，ECL kit(Tiangen公司)反应1-2分钟，医用X射线感蓝胶片压片曝光。左图为1A12单抗杂交，右图为无关抗体23C3D3杂交；箭头所示为目标条带；结果显示：阳性克隆与抗体的反应是特异的，如图8-2.实验例5抗体识别表位的测序及序列分析

单链DNA提取试剂盒(上海捷瑞公司)制备模版，96引物测序，Chromas读取序列，100个阳性克隆有4个独立序列；AlignX分析，结果有一致序列NXNNAP，又因为G与A均为非极性、芳香族氨基酸；S、T、N、P均为极性，不带电荷氨基酸；在抗原hOPN序列上，可以找到NAPS的同源motif，由此可见，1A12的可能抗原表位为：NAPS结果见图9

实验例6 Phage克隆与抗体结合能力分析

各个克隆均以5×10⁷pfu投入到包被有抗体的96孔板，经过相同条件的淘选(control antibody：23C3D3；irrelative control phage：5F12)，对洗脱后的噬菌体进行滴度测定(参见bloed 2006-04-014639)。结果显示：hOPN序列中表位NAPS，其中APS在介导1A12 hOPN的结合中起重要作用，单独的N或NN不能介导两者的结合，在表位motif的第二氨基酸位置A、G可以互换而不影响结合能力，两者均为非极性、脂肪族氨基酸；在表位motif的第四氨基酸位置，只要是极性、不带电荷的氨基酸(如：S、T、N、P)就不会影响结合能力。

该实验进一步证实：1A12的表位是NAPS。结果见图10

说明1A12抗体的特异识别表位位于OPN第七外显子处212-215aa处，是一个新的表位，表位的位置和序列如图11所示，序列也见SEQ ID NO.7。

SEQUENCE LISTING

<110>上海国健生物技术研究院

<120>骨桥蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其用途

<130>Rangaswami H，Bulbule A，Kundu GC Osteopontin：role in cell

signal ing and cancer progression.Trends Cell Biol. 2006

Feb：16(2)：79 87.

<160>7

<170>Patentin version 3.4

<210>1

<211>935

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人OPN核苷酸序列

<400>1

atgagaattg cagtgatttg cttttgcctc ctaggcatca cctgtgccat accagttaaa 60

gccacatggc taaaccctga cccatctcag aagcagaatc tcctagcccc acagaatgct 180

gtgtcctctg aagaaaccaa tgactttaaa caagagaccc ttccaagtaa gtccaacgaa 240

agccatgacc acatggatga tatggatgat gaagatgatg atgaccatgt ggacagccag 300

gactccattg actcgaacga ctctgatgat gtagatgaca ctgatgattc tcaccagtct 360

ccagcaaccg aagttttcac tccagttgtc cccacagtag acacatatga tggccgaggt 480

gatagtgtgg tttatggact gaggtcaaaa tctaagaagt ttcgcagacc tgacatccag 540

taccctgatg ctacagacga ggacatcacc tcacacatgg aaagcgagga gttgaatggt 600

gcatacaagg ccatccccgt tgcccaggac ctgaacgcgc cttctgattg ggacagccgt 660

gggaaggaca gttatgaaaa gagtcagctg gatgaccaga gtgctgaaac ccacagccac 720

aagcagtcca gattatataa gcggaaagcc aatgatgaga gcaatgagca ttccgatgtg 780

attgatagtc aggaactttc caaagtcagc cgtgaattcc acagccatga atttcacagc 840

catgaagata tgctggttgt agaccccaaa agtaaggaag aagataaaca cctgaaattt 900

cgtatttctc atgaattaga tagtgcatct tctga 935

<210>2

<211>985

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>鼠OPN核苷酸序列

<400>2

atgagattgg cagtgatttg cttttgcctg tttggcattg cctcctccct cccggtgaaa 60

tcctctgaag aaaaggatga ctttaagcaa gaaactcttc caagcaattc caatgaaagc 240

catgaccaca tggacgacga tgatgacgat gatgatgacg atggagacca tgcagagagc 300

gaggattctg tggactcgga tgaatctgac gaatctcacc attcggatga gtctgatgag 360

gtttctgatg aacagtatcc tgatgccaca gatgaggncc tcacctctca catgaagagc 540

ggtgagtcta aggagtccct cgatgtcatc cctgttgccc agcttctgag catgccctct 600

gatcaggaca acaacggaaa gggcagccat gagtcaagtc agctggatga accaagtctg 660

atcgatagtc aagcaagttc caaagccagc ctggaacatc agagccacaa gtttcacagc 780

cacaaggaca agctagtcct agaccctaag agtaaggaag atgataggta tctgaaattc 840

cgaatttctc atgaattaga gagttcatct tctgaggtca actaaagaag aggcaaaaac 900

acagttcctt actttgcatt tagtaaaaac aagaaaaagt gttagtgagg gttaagcagg 960

aatactaact gctcatttct cagtt 985

<210>3

<211>357

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>重链可变区核苷酸序列

<400>3

aagtacaatg agaagttcaa aggcaaggcc acactgactt cagacaaatc ctccaacaca 240

gcctacatgg agctcagcag cctgacctct gaggactctg cggtctatta ctgtgcaagc 300

cactacggtg gtagccctgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcg 357

<210>4

<211>119

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>重链可变区氨基酸序列

<400>4

Met Ala Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

Thr Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Asn Glu

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ser His Tyr Gly Gly Ser Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210>5

<211>347

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>轻链可变区核苷酸序列

<400>5

gatattttga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa ataaaacgtg cggccgc 347

<210>6

<211>113

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>轻链可变区氨基酸序列

<400>6

Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phc Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210>7

<211>314

<212>PRT

<213>Artifial

<220>

<223>OPN氨基酸序列

<400>7

Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala

1 5 10 15

Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu

20 25 30

Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro

35 40 45

Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu

50 55 60

Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu

65 70 75 80

Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His

85 90 95

Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp

100 105 110

Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Gln

115 120 125

Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu

130 135 140

Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly

145 150 155 160

Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg

165 170 175

Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser His

180 185 190

Met Glu Ser Glu Gln Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala

195 200 205

Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser

210 215 220

Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser His

225 230 235 240

Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu

245 250 255

His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu

260 265 270

Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val Asp

275 280 285

Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser His

290 295 300

Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn

305 310

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>8

gggaagctta ccatgagaat tgcagtgatttg 32

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>9

gccggtacca ttgacctcag aagatgcac 29

<210>10

<211>42

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>10

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>11

atctcgagtt aattgacc tcagaaga 26

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>12

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>13

tcgcagatga gtctggac 18

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>14

atgaacacac tcacattg 18

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>15

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>16

aacactgtcc aggacaccat ctcg 24

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>17

tctgggatag aagttgttca tgag 24

<210>18

<211>354

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>重链可变区

<400>18

atggcccagc cggccatggc cgaggtgcag cgggtggagt tggtggagg attggtgcag 60

cctaaagggt cattgaaaat ttcatgtgca gcctctggat tcaccttcaa tatctacgcc 120

atgaactggg tccgccaggc tccaggaaag ggtttggaat gggttgctcg cataagaagt 180

agagatgatt cacaaagcat gctctatctg caaatgaaca acttgaaaac tgaggacaca 300

gccatgtatt actgtgtgag acaaatggga gactactggg gccaaggcac cact 354

<210>19

<211>118

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>重链可变区

<400>19

Met Ala Glu Val Gln Arg Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Lys Gly Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn

20 25 30

Ile Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Gln Ser Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln

65 70 75 80

Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Met Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Met Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210>20

<211>324

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>轻链可变区

<400>20

gacattgtga tgacccagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttttttag catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagctgatgg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 240

gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa acgt 324

<210>21

<211>108

<212>PRT

<213>Artifcial

<220>

<223>轻链可变区

<400>21

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

Claims

1.骨桥蛋白的功能表位NAPS。

2.与权利要求1所述的功能表位特异性结合的抗骨桥蛋白的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.6。

4.单克隆抗体1A12，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.6，恒定区为小鼠IgG。

5.一种DNA分子，编码权利要求1所述的单克隆抗体。

6.权利要求5所述的DNA分子，其包含编码重链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO.3和编码轻链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO.5。

7.权利要求24任一所述的抗骨桥蛋白的单克隆抗体在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

8.权利要求7所述的应用，其中肿瘤为腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤之一，肿瘤组织来自肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、***、***、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。

9.权利要求7所述的应用，其中肿瘤为中枢神经***的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤之一。

10.权利要求7所述的应用，其中肿瘤还可以为眼部肿瘤、内分泌腺肿瘤、神经内分泌***肿瘤、胃肠道胰腺内分泌***肿瘤，生殖***肿瘤及头颈部肿瘤之一，其中眼部肿瘤可以为基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤。