JP6223386B2 - ポリ(5hv)および5炭素化合物を製造するための環境に優しい方法および組成物 - Google Patents
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Description
5HV含有PHAバイオポリマー
5−ヒドロキシバレラート(5HV)単量体を含むポリヒドロキシアルカノアート(PHA)を製造するための組換え宿主、および再生可能な炭素基質から、5HV単量体を含むPHAを製造するための方法を提供する。5炭素化合物、例えば5−アミノペンタノアート(5AP)、5HV、グルタラートおよび1,5ペンタンジオール(PDO)を産生する或る組換え宿主も提供する。
もう1つの組換え宿主は、5−ヒドロキシバレラートCoAトランスフェラーゼ、CoA依存性プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを過剰発現して1,5ペンタンジオールを産生するよう遺伝的に操作される。1,5ペンタンジオールは、5−ヒドロキシバレラート、リシン、デンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトースおよびアラビノースを単独で又は組合せて供給原料として使用して製造される。好ましくは、該組換え宿主はadhE、ldhAおよびackA−ptaにおける欠失を有し、リシン2−モノオキシゲナーゼ、5−アミノペンタンアミダーゼ、5−アミノペンタノアートトランスアミナーゼおよび1以上のグルタラートまたはスクシナートセミアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子を発現する。特に好適な宿主は、リシンを過剰産生する能力を有し、S−(2−アミノエチル)システインのような毒性リシン類似体に抵抗性である。好ましくは、該生物は、低下したグルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するか、または該活性を有さない。
リシン、またはデンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトースおよびアラビノースまたはそれらの組合せから選択される1以上の再生可能な炭素基質からグルタラート(グルタル酸)を過剰産生させるための組換え宿主も提供する。典型的な宿主はリシン2−モノオキシゲナーゼ、5−アミノペンタンアミダーゼ、5−アミノペンタノアートトランスアミナーゼおよび1以上のグルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を発現する。特に好適な宿主は、リシンを過剰産生する能力を有し、S−(2−アミノエチル)システインのような毒性リシン類似体に抵抗性である。
I.定義
本明細書中で用いる幾つかの用語を以下の節において定義し明らかにする。
5−ヒドロキシバレラート含有ポリヒドロキシアルカノアート重合体、ならびに5炭素化合物、例えば5−アミノペンタノアート(5AP)、5−ヒドロキシバレラート(5HV)、グルタラートおよび1,5ペンタンジオール(PDO)を産生する生化学的経路のための酵素を有する組換え生物を提供する。原核生物または真核生物宿主は、再生可能な資源に基づく供給原料から5−ヒドロキシバレラート、その重合体または開示されている5炭素化合物を産生するのに必要な酵素を発現するよう、遺伝的に操作される。所望の産物を産生する酵素経路を以下に説明する。
5−アミノペンタノアート(5AP)は、5−アミノペンタンアミドを中間体として、α−アミノ酸であるL−リシンから2つの酵素段階で産生されうる(図2)。これらの酵素のうちの第1の酵素であるリシン2−モノオキシゲナーゼは種々のシュードモナス菌のリシン分解経路における第1の酵素段階である(TakedaおよびHayaishi,J.Biol.Chem.241:2733−2736;(1966);Hayaishi,Bacteriol.Rev.30:720−731(1966);ReitzおよびRodwell,J.Biol Chem.245:3091−3096(1970);FlashnerおよびMassey,J.Biol.Chem.249:2579−2586(1974))。リシン2−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子がシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)において特定され、davBと命名された(Revellesら,J.Bacteriol.187:7500−7510(2005))。第2の酵素段階は、5−アミノペンタンアミドを5APに変換し、5−アミノペンタンアミダーゼにより触媒され(Reitzら,Anal.Biochem.28:269−272(1969);ReitzおよびRodwell,J.Biol.Chem.245:3091−3096(1970))、これはシュードモナス・プチダ(P.putida)においてはdavAによりコードされる(Revellesら,J.Bacteriol.187:7500−7510(2005))。
もう1つの5炭素化合物である5HVの生合成は、図2に示されているとおり、2つの酵素段階で5APから生じうる。5APは5APトランスアミナーゼによりグルタラートセミアルデヒドに変換される(ReitzおよびRodwell,J.Biol.Chem.245:3091−3096(1970))。そのシュードモナス・プチダ(P.putida)由来遺伝子が特定され、davTと命名された(Espinosa−UrgelおよびRamos,Appl.Environ.Microbiol.67:5219−5224(2001))。実施例7に示されているとおり、どのコード化酵素がグルタラートセミアルデヒドを5HVに効率的に変換するのかを調べるために、幾つかの組換えセミアルデヒドレダクターゼ遺伝子をクローニングし、試験した。推定タンパク質ATEG 00539がこの反応を効率的に触媒することが見出され、したがって、glutarate semialdehyde reductase(グルタラート・セミアルデヒド・レダクターゼ)にちなんでgsaRと改名された。
5炭素化合物であるグルタラートの生合成は、図2に示されているとおり、デヒドロゲナーゼ反応によりグルタラートセミアルデヒドから進行する(Ischiharaら,J.Biochem.(Tokyo)49:154−157(1961);ReitzおよびRodwell,J.Biol.Chem.245:3091−3096(1970))。シュードモナス・プチダ(P.putida)においてはdavD遺伝子がそのようなグルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性をコードすることが確認された(Espinosa−UrgelおよびRamos,Appl.Environ.Microbiol.67:5219−5224(2001);Revellesら,J.Bacteriol.186:3439−3446(2004))。グルタラートはポリエステル、ポリエステルポリオールおよびポリアミドのような重合体の製造に有用である。奇数(すなわち、5)の炭素原子数は、例えば、重合体の弾性を減少させるのに有用である。また、1,5−ペンタンジオールは一般的な可塑剤であり、グルタラートおよびその誘導体の水素化により製造されるポリエステルの前駆体である(WerleおよびMorawietz,“Alcohols,Polyhydric” in: Ulhnann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry:2002,Wiley−VCH:Weinheim.DOI 10.1002/14356007.a01 305)。
ポリ(5−ヒドロキシバレラート)(別名:P(5HV))PHAよりなる同種重合体の生合成は5HVから5−ヒドロキシバレラート−CoAを経て進行しうる。2つの異なる酵素反応、すなわち、Huismanら(米国特許第7,229,804号)、SohlingおよびGottschalk(J.Bacteriol.178:871−880(1996))ならびにEikmannsおよびBuckel(Biol.Chem.Hoppe−Seyler 371:1077−1082(1990))により記載されているCoA−トランスフェラーゼによる酵素反応、またはvan Beilenら(Molec.Microbiol.6:3121−3136(1992))により記載されているCoA−シンテターゼによる酵素反応が、第1段階を触媒しうる。5−ヒドロキシバレラート−CoAの重合は、例えばラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)phaC1によりコードされるPHAポリメラーゼにより触媒されうる(PeoplesおよびSinskey,J.Biol.Chem.264:15298−15303(1989))。あるいは、Huismanら(米国特許第6,316,262号)により記載されているとおりに、PhaC3/C5シンターゼ融合タンパク質が使用されうる。
ポリ(3−ヒドロキシブチラート−コ−5−ヒドロキシバレラート)(別名:P(3HB−コ−5HV))を含む共重合体の生合成は、3−ヒドロキシブチリル−CoA(3HB−CoA)および5−HV−CoA単量体前駆体分子を供給することにより生じうる。図2に示されているとおり、3HB−CoAは、アセチル−CoAから、以下の2つの酵素段階を経て生合成されうる:(i)例えばラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)由来のbktB(Slaterら,J.Bacteriol.180(8):1979−1987(1998))(これらに限定されるものではない)のような適当な遺伝子を使用してアセチル−CoAをアセトアセチル−CoAに変換するβ−ケトアシル−CoAチオラーゼ反応(Nishimuraら,J.Biol.Chem.116:21−27(1978))、および(ii)バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)由来のphaB(McCoolおよびCannon,J.Bacteriol.181(2):585−592(1999))のような適当な遺伝子を使用してアセトアセチル−CoAを3HB−CoAに変換するアセトアセチル−CoAレダクターゼ反応(Fukuiら,Biochim.Biophys.Acta 917:365−371(1987))。前記のとおり、PHA共重合体は種々のPHA合成により合成されうる。
図6は大腸菌(E.coli)におけるリシン代謝の生合成経路を示す。図の中央部の点線および実線は、それぞれ、L−リシンによるアロステリックフィードバック阻害および転写抑制を示し、これらは、組換え宿主細胞(例えば、大腸菌(E.coli))におけるL−リシン産生を増加させるのに必要な遺伝的修飾の標的となる。
図7は5HVから1,5−ペンタンジオール(PDO)の産生の概要を示す。5HVは、Huismanら(米国特許第7,229,804号)、SohlingおよびGottschalk(J.Bacteriol.178:871−880(1996))ならびにEikmannsおよびBuckel(Biol.Chem.Hoppe−Seyler 371:1077−1082(1990))により記載されているCoA−トランスフェラーゼにより、またはvan Beilenら(Molec.Microbiol.6:3121−3136(1992))により記載されているCoA−シンテターゼにより、5HV−CoAに変換されうる。5HVは、プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)由来のpduP(Leal,Arch.Microbiol.180:353−361(2003))または大腸菌(E.coli)由来のeutE(Skraly,WO特許番号2004/024876)により、5−ヒドロキシペンテナールに変換されうる。5−ヒドロキシペンテナールは、1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ、例えばクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)由来のdhaT(Tongら,Appl.Environ.Microbiol.57(12):3541−3546(1991))により、PDOに変換されうる。
5−ヒドロキシバレラート−コ−ヒドロキシプロプリオナートを含有する共重合体は5HVから製造されうる。fadR+(脂肪酸分解(FAD))またはfadR−(構成的FAD)のいずれかである大腸菌(E.coli)K12株を、ポリヒドロキシアルカノアートおよび5−ヒドロキシバレラートCoAトランスフェラーゼを発現する核酸でトランスフェクトする。好ましい大腸菌(E.coli)株には、MG1655およびLS5218が含まれる(Sprattら,J.Bacteriol 146(3):1166−1169(1981))。表6に示すとおり、GC−FID分析は、LS5218[pMS93]が、52% 5HVおよび48% 3HPの重合体組成を有する6.4% dcwのPHAを産生することを示した。一方、MG1655[pMS93]は、5HVのみからなる63.1% dcwのPHAを与えた。さらに、LS5218[pM93]のGC−MS分析は該重合体サンプル中の3HPの存在を証明した。したがって、LS5218における活性FAD系はNa5HVから3HPを合成しうる。
ポリヒドロキシアルカノアートおよび5炭素化合物を産生するトランスジェニック生物は、当技術分野で公知の通常の技術を用いて製造される。
5HV含有PHAおよび5炭素化合物を産生する宿主系統に関して評価および/またはクローニングされた遺伝子を、適当な酵素委員会番号(EC番号)および参照事項と共に、以下の表1Aに示す。後記で更に詳しく説明するとおり、コドン最適化のために合成された遺伝子もあれば、天然または野生型生物のゲノムDNAからのPCRによりクローニングされた遺伝子もある。
1.修飾すべき生物または細胞
5HV含有PHA生体高分子、5−アミノペンタノアート(5AP)、5−ヒドロキシバレラート(5HV)、グルタラートおよび1,5−ペンタンジオール(PDO)を製造するために修飾されうる生物または細胞には、真核生物および原核生物が含まれる。適当な原核生物には、細菌が含まれる。多数の細菌が、ポリヒドロキシアルカノアートを産生するよう遺伝的に操作されうる。具体例には、大腸菌(E.coli)、アルカリゲネス・ラツス(Alcaligenes latus)、アルカリゲネス・ユートロフス(Alcaligenese eutrophus)、アゾトバクター(Azotobacter)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)、サルモネラ(Salmonella)、クレブシエラ(Klebsiella)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、ロドコッカス(Rhodoccocus)およびブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)が含まれる。追加的な原核生物には、真性細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えばエンテロバクテリアセエ(Enterobacteriaceae)、例えば大腸菌(E.coli)が含まれるが、これらに限定されるものではない。種々の大腸菌(E.coli)株、例えば大腸菌(E.coli)K12株MM294(ATCC 31,446);大腸菌(E.coli)X1776(ATCC 31,537);(ATCC 27,325)およびK5772(ATCC 53,635)が、公に入手可能である。
i.染色体外トランスフェクション
ベクターDNAは通常の形質転換またはトランスフェクション技術により原核または真核細胞内に導入されうる。本明細書中で用いる「形質転換」および「トランスフェクション」は、化学的形質転換、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む、宿主細胞内に外来核酸(例えば、DNA)を導入するための、当技術分野で認識されている種々の技術を意味する。通常の形質転換技術は、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001に記載されている。酵母内への形質転換は、典型的には、Van Solingenら,J Bact,130:946(1977)およびHsiaoら,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)の方法により行われる。
操作された遺伝子構築物をグラム陰性およびグラム陽性細菌細胞の染色体DNA内に組込むための方法は当業者によく知られている。典型的な組込みメカニズムは、recBCまたはrecD株における線状化DNAを使用する相同組換え、およびそれに続く、P1形質導入(Miller 1992,A Short Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual & Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria.Cold Spring Harbor laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)、特別なプラスミド(Hamiltonら,J Bacteriol.171:4617(1989);Metcalfら,Plasmid 35:1(1996);Mascarenhasら,米国特許第5,470,727号)、またはトランスポゾンに基づく系を使用するランダム挿入(Herreroら,J Bacteriol.172:6557(1990);Peredelchuk & Bennett,Gene 187:231(1997);Richaudら,米国特許第5,595,889号;Tuckerら,米国特許第5,102,797号)を含む。一般に、挿入を含有する微生物株は、該組込み構築物により供与される獲得抗生物質耐性遺伝子に基づいて選択される。しかし、栄養要求性突然変異体の相補も用いられうる。本明細書に記載されている種々の代謝経路をコードするトランスジーンのいずれかを導入するために、同じ方法が用いられうる。これらの方法の幾つかを、pha遺伝子に関して、以下に詳細に説明する。
PHA形成に関与する遺伝子の一般的参考文献としては、MadisonおよびHuisman,1999,Microbiology and Molecular Biology Reviews 63:21−53が挙げられる。該pha遺伝子は、異なる起源に由来して単一生物において合体されることが可能であり、あるいは同一起源に由来することが可能である。
レダクターゼをコードする遺伝子は、アルカリゲネス・ラツス(A.latus),ラルストニア・ユートロファ(R.eutropha)(Peoples & Sinskey,J Biol.Chem.264(26):15298−303(1989))、アシネトバクター属種(Acinetobacter sp.)(Schembriら,J Bacteriol.177(15):4501−7(1995))、シー・ビノスム(C.vinosum)(Liebergesell & Steinbuchel,Eur.J.Biochem.209(1):135−50(1992))、ピー・アシドフィラ(P.acidophila)、ピー・デニトリフィカンス(P.denitriflcans)(Yabutaniら,FEMS Microbiol.Lett.133(l−2):85−90(1995))、アール・メリロチ(R.meliloti)(Tomboliniら,Microbiology 141:2553−59(1995))、およびゼット・ラミゲラ(Z.ramigera)(Peoplesら,J.Biol.Chem.262(1):97−102(1987))から単離されている。米国特許第7,229,804号は、シー・クルイベリ(C.kluyveri)由来の4−ヒドロキシブチラートデヒドロゲナーゼをコードする4hbD遺伝子(SohlingおよびGottschalk,J Bacteriol 178,871 880(1996))を用いてP4HBを産生するトランスジェニック生物を開示している。4hbDはNADHを要する。好ましいレダクターゼには、NADHを要さないものが含まれるが、これらに限定されるものではない。典型的なレダクターゼには、ムス・ムスクルス(Mus musculus)由来のAKR7A5(Genlnfo識別番号:27659727)(Hinshelwood,A.ら,FEBS Letters 523:213−218(2002))、アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)由来のGHBDH(GI:145338934)(Breitkreuz,K.ら.J.Biol.Chem.278:41552−41556)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)由来のATEG 00539(GI:115491994)が含まれる。
適当なCoAトランスフェラーゼ(EC 2.8.3.n)には、シー・クルイベリ(C.kluyveri)由来のorfZが含まれるが、これに限定されるものではない。orfZの配列はHuismanらの米国特許第7,229,804号に記載されており、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。もう1つの適当なCoAトランスフェラーゼには、シー・アミノブチリカム(C.aminobutyricum)由来のabfT(Gerhardtら,Arch Microbiol 74:189−199(2000))が含まれる。アシル−CoAを産生しうる他の酵素には、CoAシンテターゼ(EC 6.2.1.3)が含まれる。これらの酵素は、カルボン酸へのCoAの共有結合性付加を触媒するためにATPおよび遊離CoAを利用し、van Beilenら(Molec Microbiol(1992)6:3121−3136)およびAquinら(WO 02/40690 A2)に記載されている。
PHAポリメラーゼをコードする遺伝子は、エロモナス・キャビエ(Fukui & Doi,J Bacteriol.179(15):4821−30(1997))、アルカリゲネス・ラツス(A.latus),ラルストニア・ユートロファ(R.eutropha)(Peoples & Sinskey,J.Biol.Chem.264(26):15298−303(1989))、アシネトバクター(Acinetobacter)(Schembriら,J.Bacteriol.177(15):4501−7(1995))、シー・ビノスム(C.vinosum)(Liebergesell & Steinbuchel,Eur.J.Biochem.209(1):135−50(1992))、メチロバクテリウム・エクストークエンス(Methylobacterium extorquens)(Valentin & Steinbuchel,Appl.Microbiol.Biotechnol 39(3):309−17(1993))、ノカルジア・コラリナ(Nocardia corallina)(GenBankアクセッション番号AF019964)、ノカルジア・サルモニコロル(Nocardia salmonicolor)、ピー・アシドフィラ(P. acidophila)、ピー・デニトリフィカンス(P.denitrificans)(Uedaら,J.Bacteriol 178(3):774−79(1996))、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)(Timm & Steinbuchel,Eur.J.Biochem.209(1):15−30(1992))、シュードモナス・オレオボランス(Pseudomonas oleovorans)(Huismanら,J.Biol.Chem.266:2191−98(1991))、リゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)(Cevallosら,J.Bacteriol.178(6):1646−54(1996))、アール・メリロティ(R.meliloti)(Tomboliniら,Microbiology 141(Pt 10):2553−59(1995))、ロドコッカス・ルベル(Rhodococcus ruber)(Pieper & Steinbuchel,FEMS Microbiol Lett.96(1):73−80(1992))、ロドスピリルム・ルブルム(Rhodospirrilum rubrum)(Hustedeら,FEMS Microbiol.Lett.93:285−90(1992))、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)(Steinbuchelら,FEMS Microbiol.Rev.9(2−4):217−30(1992);Hustedeら,Biotechnol Lett.15:709−14(1993))、シネコシスチス属種(Synechocystis sp.)(Kaneko,DNA Res.3(3):109−36(1996))、ティー・ビオラセエ(T.violaceae)(Liebergesell & Steinbuchel,Appl.Microbiol.Biotechnol.38(4:493−501(1993))およびゼット・ラミゲラ(Z.ramigera)(GenBankアクセッション番号U66242)から単離されている。
再生可能な炭素源を供給原料として使用するポリヒドロキシアルカノアートの製造方法を提供する。好ましい実施形態においては、再生可能な資源から5−アミノペンタノアート(5AP)、5−ヒドロキシバレラート(5HV)、グルタラートおよび1,5−ペンタンジオール(PDO)ならびにそれらの重合体を産生するのに必要な遺伝子をコードする1以上の核酸構築物で細菌を形質転換またはトランスフェクトする。
開示されているトランスジェニック生物は、C5化合物、例えば5−アミノペンタノアート(5AP)、5−ヒドロキシバレラート(5HV)、グルタラートおよび1,5−ペンタンジオール(PDO)、ならびに5HV単量体を含むPHA生体高分子を製造するために使用されうる。該C5化合物の製造の場合、適当なトランスジーンを発現する組換え生物(場合によっては、競合経路をコードする遺伝子が不活性化されている又は欠失している場合を含む)を、再生可能な発酵基質上で増殖させる。該基質は、炭水化物、リシン、プロリン、植物油、脂肪酸またはそれらの組合せから選択される。幾つかの実施形態に関する有用な組合せはグルコースとリシンとの混合物であろう。もう1つの適当な組合せはスクロースおよびリシンであろう。好ましくは、該供給原料は、主として、1つの基質、例えばグルコースまたはスクロースを含む。適当な炭水化物基質は、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、スクロース、ラクトースおよびマルトースから選択される1以上の糖を含む。C5化合物の製造のためには、所望の最終産物が増殖培地内に蓄積するまで、再生可能な基質上で該組換え生物を増殖させ、この時点でフロキュレーション、沈降、遠心分離または濾過により該細胞を除去し、該無細胞培地から該産物を標準的な方法により取り出す。そのような方法は、発酵製造された他の酸およびジオール、例えば乳酸、コハク酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、1,3−プロパンジオールおよび1,4−ブタンジオールの回収に関して当技術分野で公知である。
5HV含有PHAが合成可能であることの最初の実例として、ナトリウム5−ヒドロキシバレラート(Na5HV)を、CoAトランスフェラーゼまたはCoAシンテターゼとPHAシンターゼとの両方を発現する大腸菌(E.coli)株に供給して、供給された5HV単量体が許容され、P(5HV)同種重合体内に直接的に取り込まれるかどうかを確認した。Na5HVはδ−バレロラクトン(DVL)の塩基加水分解により合成された。この方法は、0.1molのNaOHを50mLのメタノールに、溶解されるまで攪拌しながら加えることを含むものであった。得られた沈殿物を乾燥させ、水に溶解し、8.5にpH調節し、0.2μM フィルターで濾過滅菌した。該DVLの全てがけん化されたことを確認するために、Waters Alliance HPLC上で該塩溶液の分析を行った。
pAET41(PeoplesおよびSinskey,J.Biol Chem.264(26):15298−15303(1989))をXmaIおよびStuIで消化して、アール・ユートロファ(R.eutropha)phaCおよびその天然プロモーター(PRe)を含有する断片を取り出すことにより、プラスミドpFS30を構築した。プラスミドpAET41は、phaC遺伝子を含むアール・ユートロファ(R.eutropha)H16からの染色体断片を含有するpUC18ベクター(アクセッション番号L08752)である。PTrcプロモーター下でシー・クルイベリ(C.kluyveri)からのorfZ遺伝子(表1A)を含有するpTrc99a(Pharmacia,Uppsala,Sweden)の誘導体であるプラスミドpFS16(SkralyおよびPeoples,米国特許第6,323,010号)をBamHIで消化し、T4ポリメラーゼで平滑末端化し、XmnIで再度消化した後、該PRe−phaC XmaI−StuI断片と連結した。得られたプラスミドをpFS30と命名した。これは構成発現PReプロモーター下でpha−orfZオペロン融合体を含有していた。
適当な抗生物質で補足された3mLのLB(SambrookおよびRussell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(2001))を含有する試験管内で各プラスミド含有MG1655株を37℃で250rpmの振とうで一晩増殖させた。各株に適した抗生物質は以下のとおりである:pFS92およびpMS96含有MG1655株の一晩培養に100μg/mL アンピシリンを加え、pMS93およびpMS102含有MG1655株の一晩培養に50μg/mL Kmを加えた。翌日、0.5mLの一晩培養を使用して、適当な抗生物質で補足された50mLの新鮮なLBを含有する振とうフラスコに接種し、37℃で250rpmの振とうで増殖させた。3.5時間の時点で0.1mM IPTGを該液体培養に加え、5時間の時点で該培養を4150rpm(Sorvall Legend RT卓上遠心機)で遠心沈殿させ、0.1mM IPTGおよび同じ抗生物質を含有する50mLの生産培地に再懸濁させた。該生産培地は、10g/L グルコース、2.5g/L LB、10g/L Na5HV、2mM MgSO4および1×微量塩溶液を含有する1×E2最少塩溶液からなる。50×E2ストック溶液は1.275M NaNH4HPO4・4H2O、1.643M K2HPO4および1.36M KH2PO4からなる。1000×ストック微量塩溶液は、1.5N HCL、50g FeSO4・7H2O、11g ZnSO4・7H2O、2.5g MnSO4・4H2O、5g CuSO4・5H2O、0.5g (NH4)6Mo7O24・4H2O、0.1g Na2B4O7および10g CaCl2・2H2Oを1L当たりに加えることにより調製される。
表2は、全ての構築物がP(5HV)を産生することが可能であったことを示している。しかし、MG1655[pMS93]は、その他の株のいずれよりも有意に大量のP(5HV)を産生した。このことは、P(5HV)を重合するための最適な遺伝子の組合せがphaCおよびorfZであることを示している。
次の実験は、3HB−CoAおよび5HV−CoA単量体を合成しそれらをPHA内に組込みうる大腸菌(E.coli)株におけるP(3HB−コ−5HV)共重合体の製造を示すためのものであった。
この実験で使用した株はMBX2641であった。これは、染色体内にランダムに組込まれるアール・ユートロファ(R.eutropha)H16 bktB−B.メガテリウム(megaterium)phaB−kanからなるオペロンを含有するMG1655誘導体である。該オペロン組込みを行うために、文献(De LorenzoおよびTimmis,Methods Enzymol 235:386−405(1994))から選ばれたプロトコールを用いて、pCJ022(後記)を含有する株S17−1λpir(MillerおよびMekalanos,J.Bacteriol.170(6):2575−2583(1988))を、MG1655のナリジクス酸耐性突然変異体であるMBX1987と接合させた。染色体内に該bktB−phaB−kanカセットを含有するMBX1987の誘導体を、30μg/mL ナリジクス酸(NI)および50μg/mL カナマイシン(Km)を含有するLBプレート上で選択した。NlRKmR表現型を示す1つのそのような組込み体をMBX2079として確保した。ついで、組込みベクターpUT−C16−cat(後記)を含有するS17−1λpir株との接合により、phaEC−catをMBX2079の染色体内にランダムに組込んだ。染色体内にphaEC−catカセットを含有するMBX2079の組込み体を、25μg/mL クロラムフェニコール(Cm)を含有するLBプレート上で選択した。NlRKmRCmR表現型を含有する幾つかの組込み体をプールし、100μg/mL Cmを含有するLBプレート上での選択を伴うニトロソグアニジン突然変異誘発(Miller,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory(1972))に付した。1つの突然変異体を単離し、MBX2114と命名した。最後に、Miller(Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory(1972))により記載されているとおり、KmRを選択因子として用いて、P1ライセートをMBX2114上で産生させ、MG1655内に形質導入することにより、MBX2641を作製した。1つのそのような形質導入体を確保し、MBX2641と命名した。これは、ゲノム内にランダムに組込まれたbktB−phaB−kan遺伝子カセットを含有するMG1655である。
kanマーカーの上流にbktB−phaBを含有する小型Tn5組込みベクターを作製することにより、プラスミドpCJ022を作製した。これを行うために、まず、pMON25765(Slaterら,J.Bacteriol.180(8):1979−1987(1998))からプライマーMS069およびMS070でbktBをPCR増幅することにより、bktB−phaBオペロンをpSE380(Invitrogen,Carlsbad,CA)上で合体させた。プライマーMS069の配列は(5’)−GGTGGATCCTTAAGAGGAGGTTTTTATGACGCGTGAAGTGGTAGTGG(配列番号13)であり、プライマーMS070の配列は(5’)−GGTGCTAGCTCAGATACGCTCGAAGATGGCG(配列番号14)である。得られたPCR断片をBamHIおよびNheIで消化し、同じ酵素で切断されたpSE380に連結した。得られたプラスミドをpSE380−bktBと命名した。次に、プライマーMS071およびMS072でphaBをpGM10(McCoolおよびCannon,J.Bacteriol.181(2):585−592(1999))からPCR増幅した。プライマーMS071の配列は(5’)−GGTCCTAGGTTAAGAGGAGGTTTTTATGACAACATTACAAGGTAAAG(配列番号15)Tであり、プライマーMS072の配列は(5’)−GGTGCGGCCGCTTACATGTATAAGCCGCCGTTAAT(配列番号16)である。得られたPCR断片をAvrIIおよびNotIで消化し、同じ酵素で処理されたpSE380−bktBに連結した。得られたプラスミドをpSE380−bktBphaB19と命名した。該オペロンを合体させた後、pSE380−bktBphaB19をEcoRIおよびSpeIで消化し、bktB−phaB含有断片を、EcoRIおよびXbaIで切断されたpTrcN−kanに連結することにより、該オペロンをpTrcN−kan(bla遺伝子がkan遺伝子で置換されているpTrcNの誘導体)に移した。得られたプラスミドをpMS115と命名した。ついでbktB−phaBオペロンをpMS115からpBSL118組込みベクター(Alexeyevら,Can.J.Microbiol.41:1053−1055(1995))に移した。これは、pMS115およびpBSL118をBamHIで消化し、互いに連結してプラスミドpCJ022を得ることにより行った。該プラスミドを使用して、bktB−phaBをMG1655の染色体内に組込んだ。
実施例1に記載されているとおりに、プラスミドpFS92(実施例1に記載されている)またはpJB84を含有するMBX2641株を増殖させ、GC−FID分析のために調製した。表3に示すとおり、MBX2641[pJB84]は、より大量の共重合体を産生し(69.5% dcw)、より大量の5HVを共重合体内に組込んだ(82.3% PHA)。
生産培地に加えるNa5HVおよびグルコースの量を変化させることにより、共重合体組成を調節した。これを達成するための代替方法は、(1)実施例6に示すとおり、L−リシンから5HVを産生しうる組換え細胞の増殖培地に種々の量のL−リシンを供給し、または(2)実施例9および10に示されているとおり、グルコースからL−リシンを経由して5HVを産生しうる組換え細胞におけるL−リシン経路の遺伝子を脱調節することを含む。
大腸菌(E.coli)の脂肪酸分解(FAD)系が5HVをアセチル−CoAおよび3−ヒドロキシプロピオニル−CoA(3HP−CoA)に分解しうるかどうかを判定するために、プラスミドpMS93(PtrcプロモーターからphaC−orfZを発現する;実施例1を参照されたい)を、fadR+,atoC+(抑制FAD)またはfadR−,atoCconst(脱抑制FAD)のいずれかである大腸菌(E.coli)K12株内に形質転換した。MG1655およびLS5218(Sprattら,J.Bacteriol.146(3):1166−1169(1981))を、それぞれfadR+,atoC+およびfadR−,atoCconst株として使用した。実施例1に記載されているとおりに振とうフラスコ内にNa5HVを供給することにより、MG1655[pMS93]およびLS5218[pMS93]を試験した。LS5218[pMS93]はP(5HV−コ−3HP)を産生するが、MG1655[pMS93]はそれを産生しないことを、GC−FIDおよびGC−質量分析(MS)分析は示した(表6)。これは、活性脂肪酸の分解が5HVから3HPを産生することを示している。
L−リシンをP(5HV)に変換するために案出された経路を図2Bに図示する。該経路は、以下の6つの異種遺伝子がクローニングされ大腸菌(E.coli)内で発現されることを要する:ピー・プチダ(P.putida)davB、ピー・プチダ(P.putida)davA、ピー・プチダ(P.putida)davT、エイ・サリアナ(A.thaliana)gsaRAt、シー・クルイベリ(C.kluyveri)orfZおよびアール・ユートロファ(R.eutropha)phaC(表1Aを参照されたい)。davBAT遺伝子がpACYC184(ChangおよびCohen,J.Bacteriol.134:1141−1156(1978))内にクローニングされ、gsaRAt、orfZおよびphaCがpSE380内にクローニングされるよう、クローニング法を計画した。これらのプラスミドは、それぞれpJB91およびpMZ28と称され、それらの構築を次節で説明する。
プライマーJB134(5’−TGAGCGGATAACAATTTCAC)(配列番号19)およびJB135(5’−AATAACACGTCAACGCAAAAAGGCCATCCGT)(配列番号20)でプラスミドpSE380のマルチクローニング部位をPCR増幅した。得られたPCR産物をBmgBIで消化し、EcoRVおよびNruIで消化されたプラスミドpACYC184内にクローニングしてpJB78を得た。
L−リシンからP(5HV)への不完全な経路を発現するMG1655[pMZ28]、およびL−リシンからP(5HV)への完全な経路を発現するMG1655[pMZ28、pJB91]を、適当な抗生物質(pJB91では25μg/mL クロラムフェニコール;pMZ28では100μg/mL アンピシリン)で補足された3mLのLBを含有する試験管内に接種し、250rpmで振とうしながら37℃で一晩増殖させた。翌日、0.5mLの各一晩培養物を使用して、適当な抗生物質で補足された50mLの新鮮なLBを含有する振とうフラスコに接種し、250rpmで振とうしながら37℃で増殖させた。3.5時間の時点で0.1mM IPTGを該液体培養に加え、5時間の時点で該培養を4150rpm(Sorvall Legend RT卓上遠心機)で遠心沈殿させ、10g/L グルコース、2.5g/L LB、10g/L L−リシン、2mM MgSO4、1×微量塩溶液および0.1mM IPTGを含有する1×E2最少塩溶液からなる50mLの生産培地に再懸濁させた。E2塩および微量塩溶液の調製法は実施例1に記載されている。
また、L−リシンから、そして結局はグルコースからP(3HB−コ−5HV)共重合体を産生させるために、L−リシンをP(5HV)に変換するために案出された経路を、bktBおよびphaBを発現する株MBX2641内に導入した。
この実施例における経路を含む遺伝子には、ピー・プチダ(P.putida)davB、ピー・プチダ(P.putida)davA、ピー・プチダ(P.putida)davT、シー・クルイベリ(C.kluyveri)orfZ、アール・ユートロファ(R.eutropha)phaC、およびエイ・サリアナ(A.thaliana)gsaRAtまたはエイ・テレウス(A terreus)gsaRAt2(表1Aを参照されたい)が含まれる。
L−リシンおよびグルコースからのP(3HB−コ−5HV)の産生を特徴づけるために、実施例1および2に記載されているとおりに、株MBX2641[pJB78、pJB84]、MBX2641[pJB91、pMZ28]およびMBX2641[pJB91、pJB90]を振とうフラスコ内で増殖させ、PHA含量および組成に関して分析した。MBX2641[pJB78、pJB84]、MBX2641[pJB91、pMZ28]およびMBX2641[pJB91、pJB90]を、25μg/mL クロラムフェニコールおよび100μg/mL アンピシリンで補足された3mLのLBを含有する試験管内に接種し、250rpmで振とうしながら37℃で一晩増殖させた。翌日、0.5mLの各一晩培養物を使用して、同じ抗生物質で補足された50mLの新鮮なLBを含有する振とうフラスコに接種し、250rpmで振とうしながら37℃で増殖させた。3.5時間の時点で0.1mM IPTGを該液体培養に加え、5時間の時点で該培養を4150rpm(Sorvall Legend RT卓上遠心機)で遠心沈殿させ、10g/L グルコース、2.5g/L LB、10g/L L−リシン、2mM MgSO4、1×微量塩溶液および0.1mM IPTGを含有する1×E2最少塩溶液からなる50mLの生産培地に再懸濁させた。E2塩および微量塩溶液の調製法は実施例1に記載されている。
5HVは意外に低レベルで組込まれたため、競合経路の存在に注目した。グルタラートがL−リシンから産生されうるかどうかを調べるために、該プラスミドからdavBAT遺伝子を発現するMG1655[pJB91]を、25mg/L クロラムフェニコールを含有するLB培地内で、振とうしながら30℃で6時間増殖させた。25μLの中期対数相の培養物のアリコートを475μLのE0最少培地に接種し、250rpmで振とうしながら30℃で48時間温置した。該E0最少培地は10g/L グルコース、4g/L リシン、58mM K2HPO4、27mM KH2PO4、2mM MgSO4、25μg/mL クロラムフェニコール、0.1mM IPTGおよび微量元素からなるものであった。上清中に存在するグルタラートを以下のとおりにGC−MSにより測定した。遠心分離により発酵ブロスからの上清を得、該サンプルの1μLを、1μLの1g/L 4−アミノブチラート(GABA)を内部標準として含有する新鮮なエッペンドルフ管にピペッティングした。サンプルをLabconcoセントリバプ(centrivap)において乾燥させ、100μLのアセトニトリル(ACN):N−(t−ブチルジメチルシリル)−N−メチルトリフルオロアセトアミド(MTBSTFA)1:1溶液に3時間にわたり音波処理により再懸濁させた。ついでサンプルを65℃で30分間誘導体化し、遠心分離して不溶性物質を除去し、以下の獲得パラメーターを用いて、HP−5msカラムを備えたAgilent 5975 GC−MS内に上清を注入した:キャリヤーガス ヘリウム流量2ml/分、走査モードm/z65〜700、溶媒遅延3.5分間、オーブンプログラム:150℃で2分間、ついで3℃/分で280℃まで上昇、イオン源温度230℃、四重極質量フィルター温度150℃。
3HB−コ−5HV共重合体を産生する株において内因性GSAデヒドロゲナーゼコード遺伝子gabDおよびyneIを欠失させることにより、L−リシンからの5HV流動の改善が達成された。
L−リシン経路においては、遺伝子lysCおよびdapAによりアロステリックフィードバック調節が生じる。したがって、グルコースからのL−リシン産生の増大を可能にするためには、この制御が排除される必要がある。これを行うための方法は十分に確立されており、両方に遺伝子に関して既に記載されている(Kojimaら,米国特許第6,040,160号)。脱調節lysCおよびdapAを有する大腸菌(E.coli)突然変異体は、まず、大腸菌(E.coli)からmetLおよびthrAを欠失させることにより得られうる。LysC、MetLおよびThrAは、全て同一アスパルタートキナーゼ反応を触媒するアイソザイムであるため、lysCにおける突然変異が陽性選択されうる前に後者の2つを除去することが必要であろう。ΔmetLΔthrA株が作製されたら、それはN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)で突然変異されうる。ついで、得られた突然変異体プールは、lysCおよびdpaAに対して圧をかけるためにL−リシンの非代謝可能類似体であるS−2−アミノエチルシステイン(AEC)を含有する最少培地内で増殖されるであろう。metLおよびthrAが欠失しているため、lysCおよびdpaAをL−リシン(またはそのAEC類似体)に対して脱感作する突然変異のみが、該細胞がL−リシン、トレオニンおよびメチオニンを合成して生存することを可能にするであろう。流動能を増加させ、転写調節を排除するために、脱調節lysC、脱調節dpaAおよび他の経路遺伝子を組換えプロモーターから過剰発現させることにより、更なる操作が行われうる。
5HV−CoA単量体をグルコースから合成しそれをPHA内に組込みうる大腸菌(E.coli)株において、唯一の炭素源としてのグルコースからP(5HV)を製造した。そのために、L−リシンからP(5HV)同種重合体を産生するのに要求される遺伝子を発現するばかりでなく、L−リシンフィードバック耐性ジヒドロジピコリナートシンターゼをコードするdapAfbrと称される突然変異dpaA遺伝子をも発現する株を構築した。この実施例の第1部では、この能力を示すのに必要なプラスミドの構築を説明することとする。
大腸菌(E.coli)においては、それぞれlysCおよびdpaA遺伝子によりコードされるアスパルタートキナーゼIIIおよびジヒドロジピコリナートシンターゼによりL−リシン経路においてアロステリック調節が生じる(図6)。グルコースからのL−リシンおよび最終的にはP(5HV)同種重合体の産生を増加させるためには、該アロステリック調節が低下または完全に排除される必要がある。これを行うための方法は十分に確立されており、両方の遺伝子に関して既に記載されている(Kojimaら,米国特許第6,040,160号)。第352ヌクレオチド残基がシトシンからチミンに変化したL−リシンフィードバック耐性dapAfbr遺伝子(dapAC352T)を構築した。これは、所望の塩基変化を導入するプライマーを使用する、2つのDNA断片を与える染色体大腸菌(E.coli)dpaA遺伝子のPCR増幅、およびそれに続く、それらの2つのDNA断片を融合する重複伸長PCR(SOE−PCR)スプライシングにより得た。SOE−PCR法は既に記載されている(Hoら,Gene 77(1):51−9(1989))。詳細には、一方のDNA断片は、プライマーDE081(5’−AAAAGAATTCTTAATTAATTCTAGAAGGAGGTTTCATATGTTCACGGGAAGTATTGTC)(配列番号33)およびDE082(5’−AGCGATGGCTTTGAAATACTGATACAAACCTTC)(配列番号34)で増幅された、dpaA遺伝子の第1〜第366ヌクレオチド対を含有し、もう一方のDNA断片は、プライマーDE083(5’−GAAGGTTTGTATCAGTATTTCAAAGCCATCGCT)(配列番号35)およびDE084(5’−CCCGAGCTCGTTTAAACTTAATTAAGACTAGTTTTACAGCAAACCGGCATGCTT)(配列番号36)で増幅された、dpaAの第337〜第879ヌクレオチド対を含有していた。プライマーDE082およびDE083は逆相補的であり、第352ヌクレオチド残基においてシトシンからチミンへの塩基変化を導入するように設計された。第1ラウンドのPCRからの2つのDNA断片を、プライマーDE081およびDE084を使用して、SOE−PCRにより融合させた。得られたPCR産物をXbaIおよびSacIで消化し、SpeIおよびSacIで消化されたpDE031に連結してプラスミドpDE035を得た。合成された63bpの二本鎖DNA断片(5’−TTTTTCTAGATTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCACTAGTGTTTAAACCCCC)(配列番号37)をXbaIおよびPmeIで消化し、これらの部位を含有するように予め操作されたpBluescriptII SK(+)プラスミド(Stratagene,La Jolla,CA)の同じ制限酵素部位内に連結することにより、合成構成的プロモーター(PsynI)を含有するプラスミドpDE031を構築した。pDE035内のPsynI−dapAC352T遺伝子構築物をXhoIおよびPmeIで消化し、ついで、BsrGIで消化されヤエナリヌクレアーゼで平滑化されXhoIで再度消化されたプラスミドpJB90(実施例6に記載されている)に連結して、PtrcプロモーターからphaC−gsaRAt−orfZオペロンを、そしてPsynIプロモーターからdapAC352Tを発現するプラスミドpJGを得た。
プラスミドpJG22をプラスミドpJB91(実施例5に記載されている)と共に株MBX3342(MG1655 ΔgabD::FRT,ΔyneI::FRT)内に形質転換して、株MBX3342[pJB91、pJG22]を得た。また、プラスミドpSE380およびpACYC184(それぞれpJG22およびpJB91を構築するために使用した空ベクター)を株MBX3342内に形質転換して陰性対照株MBX3342[pSE380,pACYC184]を得た。これらの株を、2×E2培地内で、300rpmで振とうしながら30℃で48時間温置し、前記実施例に記載されているとおりに分析した。該培地は、15g/L グルコース、52mM NaNH4HPO4、66mM K2HPO4、54mM KH2PO4、2mM MgSO4、0.1mM IPTGおよび微量元素(前記のとおり)からなるものであった。MBX3342[pJB91,pJG22]の培地では25μg/mL クロラムフェニコールおよび5μg/mL ゲンタマイシンで補足し、MBX3342[pSE380,pACYC184]には100μg/mL アンピシリンを加えた。MBX3342[pJB91,pJG22]は2.60%乾燥細胞重量(DCW)のP(5HV)同種重合体を産生したが、株MBX3342[pSE380,pACYC184]はPHAを全く産生しなかったことを、表10におけるデータは示している。これらの結果は、L−リシンからP(5HV)への経路の遺伝子に加えてフィードバック耐性dapA遺伝子を発現する株が唯一の炭素源としてのグルコースからP(5HV)を産生しうることを示している。
次の実験は、3HB−CoAおよび5HV−CoA単量体を合成しそれらをPHA内に組込みうる大腸菌(E.coli)株におけるグルコースからのP(3HB−コ−5HV)共重合体の産生を示すためのものであった。
株MBX2114からのbtkB−phaB−kan遺伝子をMBX3342内にP1形質導入して株MBX3344を得た。MBX3344をプラスミドpJB91およびpJG22で形質転換して株MBX3344[pJB91,pJG22]を得た。また、pJG22およびpJB91を構築するために使用した空ベクターであるそれぞれプラスミドpSE380およびpACYC184をMBX3344内に形質転換して陰性対照株MBX3344[pSE380,pACYC184]を得た。これらの株を、2×E2培地内で、300rpmで振とうしながら30℃で48時間温置し、前記実施例に記載されているとおりに分析した。該培地は、15g/L グルコース、52mM NaNH4HPO4、66mM K2HPO4、54mM KH2PO4、2mM MgSO4、0.1mM IPTGおよび微量元素(前記のとおり)からなるものであった。MBX3342[pJB91,pJG22]の培地では25μg/mL クロラムフェニコールおよび5μg/mL ゲンタマイシンで補足し、MBX3344[pSE380,pACYC184]には25μg/mL クロラムフェニコールおよび100μg/mL アンピシリンを加えた。24時間の温置の後、該培養ブロスを10g/L グルコースで補足した。表11は、唯一の炭素源としてのグルコースから、P(3HB−コ−5HV)代謝経路遺伝子の全てを含有する株内に5HVが組込まれることが可能であったことを示している。
次の実験は、4HB−CoAおよび5HV−CoA単量体を合成しそれらをPHA内に組込みうる大腸菌(E.coli)株におけるP(4HB−コ−5HV)共重合体の産生を示すためのものであった。組換え生物において4HBコモノマーを操作するための方法は、米国特許第6,117,658号、米国特許第6,316,262号、米国特許第6,689,589号、米国特許第7,081,357号、米国特許第7,229,804号、米国特許第6,759,219号および米国特許出願公開第2004/0253693号(それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に詳細に記載されている。実施例1に記載されているものに類似した実験において、ナトリウム5−ヒドロキシバレラート(Na5HV)をナトリウム4−ヒドロキシブチラート(Na4HB)と共に株MG1655[pMS93]に供給した。株MG1655[pMS93]は遺伝子orfZおよびphaCを含有し、それらは共に、Na4HBおよびNa5HVからそれぞれ4HB−CoAおよび5HV−CoAを産生させるために、ならびに該前駆体をP(4HB−コ−5HV)共重合体に重合させるために必要である。基質として使用するNa4HBは、実施例1にNa5HVの製造に関して記載されているのと同様の方法で、DVLの代わりにγ−ブチロラクトン(GBL)を使用して製造した。共重合体の製造に用いた培養条件も、生産培地に4g/LのNa4HBを加えたこと以外は、実施例1に記載されているものと同じであった。PHA産生期間の後、MG1655[pMS93]培養物の重合体含量の分析を、実施例1に記載されているとおりに進めた。ただし、この場合は、5HV含量の決定のために作成された標準曲線のほかにGBL標準物を使用して、4HB含量を決定するための標準曲線を作成した。この分析は、Na4HBおよびNa5HVが同時供給されたMG1655[pMS93]培養が、67% 4HBおよび33% 5HVの組成を有し67%dcwを含むP(4HB−コ−5HV)共重合体を与えることを示した。この重合体の抽出サンプルを、DSCを用いて分析したところ、該サンプルは−54.9℃のTgを有し、検出可能なTmを有さないことが確認された。
2つの遺伝子産物のどちらが、実施例7において特定された主要GSAデヒドロゲナーゼであるのかを識別するために、野生型株MG1655[pJB91]、MG1655ΔyneI::FRT[pJB91]およびMG1655ΔgabD::FRT[pJB91]を、L−リシンとGSAとの間の中間代謝産物である5−アミノペンタノアートからグルタラートを産生するそれらの能力に関して比較した(図2を参照されたい)。3つの株は全て、実施例5に記載されているとおりPompAプロモーターからdavBATを発現するプラスミドpJB91を含有する。それらの3つの株を、前記のとおりに2g/L 5−アミノペンタノアートを含有するE0最少培地内で増殖させ、培養上清からのグルタラートをGC−MS法により測定した。該温置方法および条件は、実施例7に記載されているものと同じであった。
株の構築
1,5−ペンタンジオール(PDO)が蓄積され培地内に分泌されうるかどうかを評価するための宿主株として、株MBX3017(LS5218 ΔadhE::FRT,ΔldhA::FRT,ΔackA−pta::FRT)およびK−12株MG1655を使用した。Gene BridgesのRed/ET法により各単一欠失株を構築した。それらの3つの経路に関するノックアウトカセットを構築するためのプライマーを表14に示す。簡潔に説明すると、種々の染色体欠失体の構築のために以下のプライマーを使用した:ΔadhEカセットにはMS286およびMS287;ΔackA−ptaカセットにはMS289およびMS290;ならびにΔldhAカセットにはMS292およびMS293。前記実施例に記載されているとおりに、各単一ヌル突然変異をLS5218内に反復的にP1形質導入し、該マーカーを除去することにより、LS5218 ΔadhE::FRT,ΔldhA::FRT,ΔackA−pta::FRTを得た。
Claims (34)
- グルタラートセミアルデヒドを5−ヒドロキシバレラート単量体、その重合体または共重合体に変換するように遺伝的に操作された組換え微生物または細胞であって、該組換え微生物または細胞が、リシン2−モノオキシゲナーゼ,EC 1.13.12.2;5−アミノペンタンアミダーゼ(δ−アミノバレロアミダーゼ),EC 3.5.1.30;5−アミノバレラートトランスアミナーゼ,EC 2.6.1.48;リシンデカルボキシラーゼ,EC 4.1.1.18;グルタラートセミアルデヒドレダクターゼ,EC 1.1.1.61;4−ヒドロキシブチラートデヒドロゲナーゼ,EC 1.1.1.61;CoA−トランスフェラーゼ,EC 2.8.3.14およびEC 2.8.3.n;アシル−CoAシンテターゼ,EC 6.2.1.3;PHAシンターゼ,EC 2.3.1.n;β−ケトアシル−CoAチオラーゼ,EC 2.3.1.9;アセトアセチル−CoAレダクターゼ,EC 1.1.1.36;プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ,EC 1.2.1.3;アルコールデヒドロゲナーゼ,EC1.1.1.1;1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ EC 1.1.1.202からなる群から選択される2以上の酵素をコードする少なくとも2つ又はそれ以上の異種遺伝子を発現し、ならびに該組換え微生物または細胞が、未修飾の微生物または細胞より大量の5−アミノペンタノアートを産生し、ならびに該5−アミノペンタノアートが該組換え微生物または細胞により該5−ヒドロキシバレラート単量体、その重合体または共重合体に変換され、ならびに該5−ヒドロキシバレラート単量体、その重合体または共重合体は単離可能である、組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が、1,5ペンタンジオールを産生する、請求項1の組換え微生物または細胞。
- 重合体または共重合体がポリヒドロキシアルカノアートを含む、請求項1から2のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が5−アミノペンタノアートをグルタラートセミアルデヒドに変換する、請求項1から3のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞がリシンを5−アミノペンタノアートに変換する、請求項1から4のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞にリシンが供給される、請求項5の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞を構築するために使用した微生物または細胞が、未修飾の微生物または細胞と比較してリシンを過剰産生するように修飾されている、請求項1から6のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が毒性リシン類似体S−(2−アミノエチル)システインに対して耐性である、請求項1から7のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が、リシンフィードバック耐性ジヒドロジピコリナートシンターゼを発現する、請求項1から7のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞がリシンフィードバック耐性アスパルタートキナーゼIIIを発現する、請求項1から8のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞に再生可能な炭素基質が供給される、請求項1から10のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が、リシン輸出を抑制または阻止するように更に操作されている、請求項1から11のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が、グルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を軽減または排除するように修飾されている、請求項1から12のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- グルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼが、davD、yneIおよびgabDまたはそれらのホモログからなる群から選択される1以上の遺伝子を欠失させ又は破壊することにより軽減または排除される、請求項13の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が5−ヒドロキシバレラートを細胞外環境中に放出する、請求項1から14のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が5−ヒドロキシバレラートを5−ヒドロキシバレラートCoAに変換する、請求項1から14のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が5−ヒドロキシバレラート−CoAをポリヒドロキシアルカノアートに変換する、請求項1から12および16のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が5−ヒドロキシバレラートを1,5ペンタンジオールに変換する、請求項1から12および16のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が5−ヒドロキシバレラートをポリ(5−ヒドロキシバレラート)またはその共重合体に変換する、請求項1から12および16のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 共重合体が、ポリ(3−ヒドロキシプロピオナート−コ−5HV)、ポリ(3−ヒドロキシブチラート−コ−5HV)およびポリ(4−ヒドロキシブチラート−コ−5HV)からなる群から選択される、請求項19の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が原核生物である、請求項1から20のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が大腸菌(E.coli)である、請求項1から21のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が真核微生物である、請求項1から20のいずれか一項の組換え微生物または細胞。
- リシンから重合体を製造するための組換え微生物または細胞であって、該組換え微生物または細胞が、5−ヒドロキシバレラート単量体を含むポリヒドロキシアルカノアートを産生するために、リシン2−モノオキシゲナーゼ,EC 1.13.12.2;5−アミノペンタンアミダーゼ(δ−アミノバレロアミダーゼ),EC 3.5.1.30;5−アミノバレラートトランスアミナーゼ,EC 2.6.1.48;リシンデカルボキシラーゼ,EC 4.1.1.18;グルタラートセミアルデヒドレダクターゼ,EC 1.1.1.61;4−ヒドロキシブチラートデヒドロゲナーゼ,EC 1.1.1.61;CoA−トランスフェラーゼ,EC 2.8.3.14およびEC 2.8.3.n;アシル−CoAシンテターゼ,EC 6.2.1.3;PHAシンターゼ,EC 2.3.1.nからなる群から選択される少なくとも2つの異種酵素を発現するように遺伝的に操作されており、ならびに該組換え微生物または細胞が、未修飾の微生物または細胞より大量の5−アミノペンタノアートを産生し、ならび組換え微生物または細胞が、5−アミノペンタノアートを該5−ヒドロキシバレラートに変換し、ならびに該5−ヒドロキシバレラート単量体、その重合体または共重合体は単離可能である、組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞がリシンを産生しない、請求項24の組換え微生物または細胞。
- 組換え微生物または細胞が機能性グルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素活性を発現しない、請求項24または25の組換え微生物または細胞。
- リシンからの重合体の製造方法であって、該重合体が製造されるように、リシンおよび他の再生可能な炭素供給原料を請求項1〜26のいずれか一項の組換え微生物または細胞に供給することを含み、該再生可能な炭素供給原料が、デンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトースおよびアラビノースまたはそれらの組合せからなる群から選択される、製造方法。
- リシンまたは他の再生可能な炭素供給原料を請求項1〜26のいずれか一項に記載の遺伝的に操作された微生物または細胞に供給することを含む、5炭素に基づく単量体、その重合体または共重合体の製造方法であって、前記の遺伝的に操作された微生物または細胞が、未修飾の微生物または細胞より大量のグルタラートセミアルデヒドまたは5−アミノペンタノアートを産生するように操作されており、該グルタラートセミアルデヒドまたは5−アミノペンタノアートが、前記の遺伝的に操作された微生物または細胞により、5炭素単量体、その重合体または共重合体に変換され、ならびに該再生可能な炭素供給原料が、デンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトースおよびアラビノースまたはそれらの組合せからなる群から選択される、製造方法。
- 単量体が、グルタラート、1,5−ペンタンジオールおよび5−ヒドロキシバレラートからなる群から選択される、請求項28の製造方法。
- 重合体がポリヒドロキシアルカノアートを含む、請求項28または29のいずれか一項の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノアートが5−ヒドロキシバレラートを含む、請求項30の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノアートが、ポリ(5−ヒドロキシバレラート)、ポリ(3−ヒドロキシプロピオナート−コ−5HV)、ポリ(3−ヒドロキシブチラート−コ−5HV)およびポリ(4−ヒドロキシブチラート−コ−5HV)からなる群から選択される、請求項31の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノアート、その重合体または共重合体を回収することを更に含む、請求項30〜32のいずれか一項の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノアート重合体または共重合体を溶媒抽出により回収する、請求項33の製造方法。
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