JP6218088B2 - ペリオスチンのExon−21部位によりコードされるペプチドに対する抗体及び該抗体を含む炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物 - Google Patents
ペリオスチンのExon−21部位によりコードされるペプチドに対する抗体及び該抗体を含む炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6218088B2 JP6218088B2 JP2015504400A JP2015504400A JP6218088B2 JP 6218088 B2 JP6218088 B2 JP 6218088B2 JP 2015504400 A JP2015504400 A JP 2015504400A JP 2015504400 A JP2015504400 A JP 2015504400A JP 6218088 B2 JP6218088 B2 JP 6218088B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- amino acid
- periostin
- seq
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
Description
(1)全てを保持しているもの(PN−1と呼ぶ;配列番号1として示す838アミノ酸からなる;cDNA配列を配列番号2として示す)、
(2)Exon−17が欠失しているもの(PN−2と呼ぶ;配列番号3として示す811アミノ酸からなる;PN−1から配列番号4で示される27アミノ酸(Exon−17)が欠失しているもの;cDNA配列を配列番号5として示す)、
(3)Exon−21が欠失しているもの(PN−3と呼ぶ;810アミノ酸からなる;PN−1から、N末端から785番目のアミノ酸から812番目のアミノ酸(配列番号6で示される28アミノ酸(Exon−21))が欠失しているもの)、
(4)Exon−17とExon−21が欠失しているもの(PN−4と呼ぶ;配列番号7として示す783アミノ酸からなる;PN−2から配列番号6で示される28アミノ酸(Exon−21)が欠失しているもの;cDNA配列を配列番号8として示す)。
[1]配列番号6で表されるアミノ酸配列、配列番号17で表されるアミノ酸配列及び配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる1種以上のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体。
[2]配列番号19で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号20で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号21で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号22で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選ばれる1種以上のペプチドと特異的に結合する抗体。
[3]抗体が、細胞接着活性を有するペリオスチンの細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識し、かつ当該ペリオスチンの細胞接着活性を中和する能力を有する抗体である、前記[1]又は[2]記載の抗体。
[4]抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、前記[1]〜[3]のいずれか1項に記載の抗体。
[5]抗体が、モノクローナル抗体である、前記[4]記載の抗体。
[6]ハイブリドーマ細胞株NITE BP−01546により産生される、前記[5]記載の抗体。
[7]前記[5]又は[6]記載のモノクローナル抗体の部分断片からなる抗体断片。
[8]前記[1]〜[6]のいずれか1項に記載の抗体又は前記[7]記載の抗体断片と、タンパク質又は低分子の薬剤とを結合させた抗体の誘導体。
[9]前記[1]〜[5]のいずれか1項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
[10]ハイブリドーマ細胞株NITE BP−01546。
[11]配列番号6で表されるアミノ酸配列、配列番号17で表されるアミノ酸配列及び配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド又は当該ペプチドのN末端にCys基を付加したペプチドでヒトを除く哺乳動物を免疫した後、当該動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを培養する工程を有する前記[4]に記載の抗体を製造する方法。
[12]ハイブリドーマが、ハイブリドーマ細胞株NITE BP−01546である、前記[11]記載の製造方法。
[13]前記[1]〜[6]のいずれか1項に記載の抗体、前記[7]記載の抗体断片又は前記[8]記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害用医薬組成物。
[14]前記[1]〜[6]のいずれか1項に記載の抗体、前記[7]記載の抗体断片又は前記[8]記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物。
[15]前記[1]〜[6]のいずれか1項に記載の抗体、前記[7]記載の抗体断片又は前記[8]記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する血管内膜肥厚抑制用、癌治療用、血管新生抑制用又は動脈瘤の予防若しくは治療用医薬組成物。
[16]前記[1]〜[6]のいずれか1項に記載の抗体、前記[7]記載の抗体断片又は前記[8]記載の抗体の誘導体を用いて、生体試料中の細胞接着活性を有するペリオスチンを検出又は定量する方法。
免疫グロブリンG(以下、単に「IgG」という。)は、分子量約23000の軽ポリペプチド鎖(以下「軽鎖」という)、分子量約50000の重ポリペプチド鎖(以下「重鎖」という)の各2本ずつから構成される。重鎖、軽鎖とも約110残基からなる、アミノ酸配列が保存されている領域の繰り返し構造を持ち、これらはIgGの3次元構造の基本単位(以下、「ドメイン」という。)を構成する。重鎖及び軽鎖は、それぞれ連続した4個、及び2個のドメインから構成されている。重鎖、軽鎖いずれにおいても、アミノ末端のドメインは他のドメインに比べ各抗体分子間でのアミノ酸配列の変異が大きく、このドメインは可変ドメイン(variable domain:以下、「Vドメイン」という。)と呼ばれる。IgGのアミノ末端においては、重鎖、軽鎖のVドメインが相補的に会合し可変領域を形成している。これに対し、残余のドメインは、全体として定常領域を形成する。定常領域は、各動物種に特徴的な配列を有し、例えば、マウスIgGの定常領域はヒトIgGの定常領域とは異なっているので、マウスIgGはヒトの免疫系によって異物として認識され、その結果、ヒト抗マウス抗体(Human Anti Mouse Antibody:以下「HAMA」という。)応答が起こる(SchroffRW. et al Cancer Res. (1985)45,879-85)。従って、マウス抗体はヒトに繰返し投与することはできない。このような抗体をヒトに投与するためには、抗体の特異性を保持したままHAMA応答を起こさないように抗体分子を修飾する必要がある。
(a)アクセプターのフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアクセプターの前記位置において普通であること
(b)該アミノ酸がCDRのひとつのすぐ近くであること
(c)該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてCDRの約3Å(オングストローム)以内に側鎖原子を有し、そして抗原と又はヒト化抗体のCDRと相互作用することができると予想されること。
本発明における「ヒト抗体」又は「ヒト免疫グロブリン」とは、免疫グロブリンを構成するH鎖の可変領域(VH)及びH鎖の定常領域(CH)並びにL鎖の可変領域(VL)及びL鎖の定常領域(CL)を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。換言すれば、H鎖がヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来し、軽鎖がヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来するものである抗体を意味する。
ヒト抗体は、常法に従って、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、既報(Mendez MJ et al.Nature Genetics(1997)15,146-56,Green LL et al.Nature Genetics(1994)7,13-21,表平4−504365号公報;国際出願公開WO94/25585号公報;日経サイエンス、6月号、第40〜第50頁、1995年;Nils Lonberg et al.Nature(1994)368,856-9,及び特表平6−500233号公報)に記載の方法に従って作製することができる。
1−1 心不全病態モデルラットの作製及び左心室サンプルの採取
雄性ダール食塩感受性ラット(Dahl−S)(清水実験材料)を6週齢より8%高食塩含有食で飼育し、心肥大期(11週齢)及び心不全期(14週齢)に各3匹の左心室を採取した。
総RNAは上記左心室約500mgからISOGEN(ニッポンジーン社)を用いて説明書に記載の方法にしたがって調整した。次に、心肥大期、心不全期それぞれ3匹分を合わせた総RNA約400μgよりFast Track 2.0 Kit(インビトロジェン社)を用いて説明書に記載の方法にしたがってmRNAを精製し、それぞれ約3μgのmRNAを回収した。
cDNAサブトラクションは、PCR−Select cDNA subtraction kit(クローンテック社)により、説明書に記載の方法にしたがって行った。すなわち、上記1−2で得られたmRNAそれぞれ2μgよりcDNAを合成し、制限酵素Rsalで消化した。次に、14週齢から合成されたcDNAをテスターcDNA、11週齢から合成されたcDNAをドライバーcDNAとし、テスターcDNAにkit添付の2種類のアダプターを別々に連結させた後、サブトラクトハイブリダイゼーションを行った。次に、アダプターに相補的なプライマーを用いてPCRを行い、発現量に違いのあるcDNA断片を特異的に増幅させ、増幅産物1を得た。
A.ドットブロットの作製
増幅産物1をPCR IIベクター(インビトロジェン社)にTAクローニングし、挿入断片の入ったクローンを選択した。各クローンの挿入断片を増幅したPCR反応後、それぞれ1μLを熱処理後、2枚のナイロンメンブレンフィルター(ベーリンガー社)にドットブロットし、UVクロスリンカー(ストラタジーン社)により固定した。
増幅産物1を制限酵素Rsal及びEael、Smalで消化し、アダプターを除去し、DIGハイプライムDNAラベリング/検出キットII(ベーリンガー社)を用いて説明書に記載の方法に従ってDIG−dUTPでランダムプライム標識を行い、cDNAプローブ1を作製した。同様にして、増幅産物2を用いてcDNAプローブ2を作製した。
上記Aで作製したドットブロットメンブランの1枚をcDNAプローブ1、他の1枚をcDNAプローブ2とハイブリダイゼーションを行った。具体的には、ベーリンガー社のDIGハイプライムDNAラベリング/検出キットIIを用いて、説明書に記載の方法にしたがい、ハイブリダイゼーション液(DIGイージーハイブ(DIG Easy Hyb)液)中42℃で一晩ハイブリダイセーションを行った。2×SSC、0.1%SDSで室温にて5分間2回、0.1×SSC、0.1%SDSで68℃にて15分間2回洗浄した後、キットに添付のブロッキングバッファー中でアルカリホスファターゼ標識抗DIG抗体と反応後、化学発光基質(CSPD ready−to−use)を加えて化学発光を進行させ、X線フィルムを露光させた。cDNAプローブ1でのシグナルがcDNAプローブ2でのシグナルより強いクローンをポジティブクローンとして選択し、塩基配列の決定を行った。
塩基配列は、ダイターミネーターシークエンシングキット(商品名:THERMO SequenaseTM II dye terminator cycle sequencing kit、アマシャムファルマシア社)を用いて自動DNA配列読み取り装置モデル373A(PE Applied Biosystems社)で解析することにより決定した。得られた遺伝子配列をGenBanKのデータバンクに照会した結果、クローンの1つ(SF014)がマウスペリオスチン(GenBank Accession No.D13664)と86%ホモロジーのある遺伝子であることが判明した。
ラットペリオスチンcDNAの単離はλgt IIベクターに挿入されたrat aorta cDNA library(クローンテック社)より作製した約4000クローンのファージサブプール10個(計約4万クローン)をSF014の塩基配列を基に設計したプライマー(1)5’−GTTCATTGAAGGTGGCGATGGTC−3’(配列番号23)、(2)5’−GAGATAAAATCCCTGCATGGTCCT−3’(配列番号24)を用いてPCRスクリーニングを行い、3個のポジティブなサブプールを得た。そのうち1個のサブプールを上記PCRによって増幅された断片をAlkPhos DirectTM(アマシャムファルマシア社)を用いてアルカリフォスファターゼ標識したプローブを用いてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い、1個のポジティブクローンラットペリオスチン#1を得た。その挿入断片をpBluescript II(ストラタジーン社)のEcoRI部位に組み込み、製造例1の1−5の方法に従って全塩基配列を決定した。
製造例1で使用したダールラットの心肥大期のcDNAと、製造例2でクローニングした遺伝子配列を元にプライマー5‘−AAGCTAGCGAAGATGGTTCCTCTCCTGCCCT−3’(配列番号27)、プライマー5‘−CTTTGGGTTTTTCCAGCCTC−3’(配列番号28)を用いてPCRを行い、得られたPCR産物をインビトロジェン社のPCR4Blunt TOPOベクターにTAクローニングした。得られたコロニーを96穴プレートに1コロニー/穴ずつ96コロニーを選び、プライマー5’−CCCCATGACTGTCTATAGACCT−3’(配列番号29)、プライマー5’−ATTTCCCTTAAAAATCAGATTG−3’(配列番号30)を用いてラットペリオスチン−2及び4遺伝子の候補を選別した後に、遺伝子配列を決定しPCRエラーの無いクローンを選別した。
製造例3で得られたプラスミドpCR4 Blunt TOPO/ラットペリオスチン−2、−4を、制限酵素Spe I及びNot Iで消化し、ラットペリオスチン−2、−4断片を切り出した。これを、pFastBacHTc(インビトロジェン社)を制限酵素pe I及びNot Iで消化して得られたベクター断片に、ライゲーションキット(宝酒造(株))を用いて連結し、得られた発現ベクターをpFastBac/ラットペリオスチン−2、−4と命名した。挿入部分の塩基配列は製造例1の1−5に記載の方法により確認した。
エシェリキア コリ(Escherichia coli)のDH10BAC細胞を、製造例4で得られたpFastBac/ラットペリオスチン−2、−4で形質転換し、組換えバキュロウイルスを調製した。得られたバキュロウイルスは、電気泳動及びPCRにより、目的のものが挿入されていることを確認した。
製造例5で得られた培養上清2000mLを平衡化バッファー(50mM酢酸ナトリウムバッファー pH6.0 0.1M塩化ナトリウム)で平衡化したSPsepharose Fast Flow 10mL bedに供し、得られたFlow Through(通過分画)をSPセファロース通過分画とした。
次に、100mLのSPセファロース溶出分画を、50mMリン酸ナトリウムバッファー pH8.0、0.5M塩化ナトリウム及び5mMイミダゾールで平衡化したNi−NTAagarose 5mL bedに供し、得られた通過分画をNi−NTAアガロース通過分画とした。
細胞培養用96穴マルチウェルプレートに10μg/ml フィブロネクチン、100μg/ml BSA、10μg/ml PN−2タンパク質、10μg/ml PN−4タンパク質をそれぞれ添加し4℃にて一晩コーティングした。タンパク質液を除去したウェルに、DMEM(10% BSA,PC/SM)に懸濁したラット胎仔心臓由来線維芽細胞104cells/ウェルを加え、37℃インキュベーターにて3時間培養した。細胞の接着量測定は、培養上清を除去した後、2.5%グルタルアルデヒドにて30分間固定し、0.02%クリスタルバイオレットにて染色した後プレートリーダー(BIO−RAD、 Model 680 マイクロプレートリーダー)にてOD 550nmの吸光度を測定した。バックグラウンドとして、無処理のウェルを染色したものを用い、その吸光度値にて補正した値を比較した。データの解析はFisherのPLSD検定により行った(図2)。その結果、陽性コントロールであるフィブロネクチン(図中、FNで表示)では細胞が接着し、陰性コントロールであるBSAでは細胞が接着しなかった。また、各タンパク質をコートしなかったウェルでも細胞接着が観察されたが、陽性コントロールであるフィブロネクチンほどの接着量は観察されなかった。一方、ラットPN−2タンパク質を添加した群では細胞の接着がフィブロネクチンと同程度以上に認められたのに対し、ラットPN−4タンパク質を添加した群では、コートしなかったウェルと同程度の接着活性しかないことが明らかとなった。
実施例1に示したように、ラットPN−2タンパク質に比べラットPN−4タンパク質には細胞接着作用が弱いことが明らかとなったことを受け、ラットPN−2タンパク質に特異的な構造は、それぞれの配列比較からExon−21配列であると同定した。このExon−21を構成するアミノ酸配列のN末端にCys残基を付加したペプチドを、純度80%以上にて10mg、化学合成した。キャリアータンパク質としてKLH6mgを結合させたものをウサギ(Kbl:JW)に免疫させた。免疫(投与)には、初回免疫にはFCA(フロイント完全アジュバント)を使用し、2次免疫以降はFIA(フロイント不完全アジュバント)を使用した。また、投与部位は背部皮下20ヶ所、投与した週は、初回投与後、2、4、6週後、投与量は初回免疫では800μgペプチド/匹、2次免疫以降では400μgペプチド/匹にて免疫した。抗体力価はELISA法にて測定し、投与開始から7週目に全血清を集めた。その後、合成ペプチドを用いたアフィニティーカラムを作製し、Exon−21ペプチドに特異的に反応する抗体のみを回収した。上記の、ラットペリオスチンのExon−21がコードするペプチドに対するポリクローナル抗体を、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体と称する。
実施例2で得られたポリクローナル抗体2種(No.1及びNo.3)について、ラットペリオスチンタンパク質(PN−2)との結合性について、ドットブロット法にて確認した。すなわち、製造例6で得られた精製タンパク質(30μg/ml)を5μlずつHybond−ECLニトロセルロースメンブレン(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)にスポットし、TBS溶液(10mM Tris−HCl(pH8.0)、150mM NaCl)で1回洗浄した。ブロッキングバッファー(ブロックエース、雪印乳業株式会社製)を加えて、室温で1時間振盪した。メンブレンにモノクローナル抗体(一次抗体)の1μg/ml濃度溶液を加えて3時間振盪した後、TBS溶液で10分間振盪洗浄を4回行った。メンブレンにHRP標識抗ラビットIgG抗体(プロメガ社製)(二次抗体)の0.4μg/ml濃度溶液を加えて室温にて1時間振盪した後、メンブレンをTBS溶液で10分間振盪洗浄を4回行った。検出用試薬(ECL plus western blotting detection system、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)を加えて1分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、得られたポリクローナル抗体2種はラットペリオスチンPN−2とも結合することが確認された。
細胞培養用96穴マルチウェルプレートにDB1Xラット由来血管平滑筋細胞A7r5細胞(Cat.No.09−1444、大日本住友製薬)を0.5〜1×104cells/ウェル播き、サブコンフルエントまで培養し、その後Serum(−)にした培地に交換した。次に、THP−1細胞(Human acute monocytic leukemia Cat.No.06−202、大日本住友製薬)を蛍光標識するために、THP−1細胞を2nMのBCECF−AM((株)同仁科学研究所BCECF−AM special packaging cat.No.B221)を添加し、30分間インキュベート後、遠心してPBS(−)で2回洗浄した。次に、蛍光標識したTHP−1細胞の接着量を測定するために1×104cells/ウェルと予め抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb) または、ラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)とPN−2タンパク質を混合し、室温で1時間反応させた溶液を加えた。コントロールとして、(1)ファイブロネクチンのみ、(2)PN−2のみ、(3)PN−2+ラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)、(5)THP−1のみを用い、各々6時間インキュベートした。その後、各ウェルにRPMI1640培地をゆっくりと添加して完全に満たした後、空気が入らないようにパラフィルムで覆い、裏返して更に30分間インキュベートした。その後、ゆっくりと取り外し、培地を吸引した後PBS(−)で3回洗浄し、プレートリーダー(Wallac 1420 ARVOmx/light(Perkin−Elmer))で細胞接着量を励起波長485nm/蛍光波長535nmにて蛍光強度測定にて計測した。その結果、図3(A)及び(B)に示されるように、(1)ファイブロネクチンのみ、(2)PN−2のみ、(3)PN−2+ラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)の群では細胞の接着が認められたのに対し、(4)抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)を処理した群では、(5)THP−1のみのように、接着が認められなかったことから、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体にはPN−2が持つ細胞接着作用を抑制する、即ち中和活性を有していることが判明した。
(1)抗原の作製
ヒトペリオスチンExon−21を構成するアミノ酸配列(配列番号18)のN末端にCys残基を付加したペプチド(抗原ペプチド;CEVTKVTKFIE GGDGHLFEDE EIKRLLQG(配列番号31))を、Fmoc法にて化学合成し、純度90%以上の抗原ペプチド10mgを得た。この抗原ペプチド5mgにキャリアータンパク質としてKLH(CALBIOCHEM社製)5mgを結合させ、抗原溶液を得た。すなわち、KLHをPBS(0.01M)に溶解して3.3mg/mLに調整し、0.2524mg/mLのMBS溶液(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を滴下して室温で60分間攪拌し反応させた。ジクロロメタンを用いてフリーのMBSを除き、KLH−MBを得た。このKLH−MB5mgと、0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)に溶解した抗原ペプチド5mgとを混合し、4℃で12時間攪拌して反応させ、抗原溶液を得た。
6週齢のBALB/c雌性マウス3匹の両足に、(1)で得られたKLH結合抗原ペプチド100μgを含む抗原溶液50μlと、FCA(フロイント完全アジュバント)50μlとの混合乳濁液全量を皮下注射した。その後2週間間隔で2回、用時調製した上記抗原溶液とFIA(フロイント不完全アジュバント)との混合乳濁液を両足に投与した。その後、そのマウスを頸椎脱臼により致死させ、無菌的に足部リンパ節を採取した。
8−アザグアニン耐性でかつイムノグロブリン非分泌型のマウスミエローマ細胞株P3X63Ag8U.1(P3U1株)を、20%のウシ胎児血清(FCS)を含むRPMI培地で、10%CO2・37℃インキュベーター内で培養し、対数増殖期にある細胞を集め、1,000rpm、5分間の遠心分離にかけて沈殿画分として細胞のみを取得し、RPMI培地に懸濁させた。
(2)で得た免疫化リンパ節細胞1×108〜3×108個を含むRPMI培地と、(3)で得たミエローマ細胞108個を含むRPMI培地とを混合した後、1,000rpm、10分間の遠心分離にかけた。上清を静かに除いて沈殿画分として細胞を取得し、これに25%(w/v)のポリエチレングリコール1500(PEG 1500、ベーリンガー社製) 1mlを加えた後、更にRPMI培地をゆっくりと加えて総量を10mlとした。これに20% FCSを含むRPMI培地10mlを加えて、少し静置させた後、1,000rpm、5分間の遠心分離にかけ、得られた沈殿画分(細胞画分)に20% FCSを含む RPMI培地を加えて細胞濃度が106個/mlになるように調整した細胞懸濁液を、コーニング社製の96穴培養プレートに200μL/ウェルずつ分注した。5%CO2・37℃インキュベーター中で24時間培養後、HAT溶液(インビトロジェン社製)を添加した後、更に2週間培養した。
培養上清が抗原ペプチドと反応する陽性ウェルのスクリーニングを行った。アッセイ用の抗原溶液には、(1)で得られた抗原ペプチド2mgに、キャリアータンパク質として卵白アルブミン(OVA)を結合させたコンジュゲートを用いた。
96穴マイクロタイタープレート(ファルコン353912)の各ウェルを、上記コンジュゲート1μg/mlで4℃下一夜静置してコーティングした。このプレートを洗浄後、(4)の培養上清(モノクローナル抗体を含む)50μlを各ウェルに滴下し、37℃のインキュベーター内で2時間放置した後、PBS(−)(リン酸緩衝液)で洗浄した。これにアルカリフォスターゼ結合ヒツジ抗マウスIgG抗体(Zymed社製)を加え、37℃インキュベーターで1時間放置し、PBS(−)で洗浄後、発色基質剤(ALP)を加えて20分間発色させ、プレートリーダー(BIO−RAD、 Model 680 MICRO PLATE READER)で各ウェルのOD490nmの吸光度(抗体価)を測定し、抗原ペプチドとの反応性を確認し、培養上清が抗原ペプチドと反応する陽性ウェルを決定した。
(5)のELISA法で抗原ペプチドとの反応性が確認された陽性ウェル内の細胞から、限界希釈法により、抗体産生細胞株のクローニングを行った。すなわち、陽性ウェル内の細胞を96穴培養プレートの各ウェルに撒き込み、5%CO2・37℃インキュベーター内で2週間培養した。各ウェルの培養上清について、(5)の方法と同様に、ELISA法にて、抗原ペプチドとの反応性を確認し、陽性ウェルについて、再度、限界希釈法によるクローニングを行い、抗原ペプチドとの反応性が高く、細胞コロニーの発育が良好な30個の細胞を得た。これら細胞を24穴培養プレートに移し、5%CO2・37℃インキュベーター内で2週間培養した。培養上清について、再び、(5)の方法と同様に、ELISA法にて、抗原ペプチドとの反応性(抗体価)を確認した。OD490nmの吸光度が高かった2ウェル内の細胞、すなわち2個のハイブリドーマ細胞株(No.8及びNo.10)を、抗体産生細胞として有用であると判断し、選別した。
(6)で得られた抗体産生細胞2個が産生する抗体と、ヒトとマウスのアミノ酸配列はほぼ同じであることから、マウスペリオスチンタンパク質(PN−2)との結合性について、ドットブロット法にて確認した。すなわち、マウスPN−2タンパク質(Recombinant Mouse Periostin/ OSF−2, R&D SYSTEMS)(100μg/ml)を5μlずつHybond−ECLニトロセルロースメンブレン(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)にスポットし、TBS溶液(10mM Tris−HCl(pH8.0)、150mM NaCl)で1回洗浄した。ブロッキングバッファー(ブロックエース、雪印乳業株式会社製)を加えて、室温で1時間振盪した。メンブレンに(6)で得られたモノクローナル抗体(一次抗体)の1μg/ml濃度溶液を加えて3時間振盪した後、TBS溶液で10分間振盪洗浄を4回行った。メンブレンにHRP標識抗マウスIgG抗体(プロメガ社製)(二次抗体)の0.4μg/ml濃度溶液を加えて室温にて1時間振盪した後、メンブレンをTBS溶液で10分間振盪洗浄を4回行った。検出用試薬(ECL plus western blotting detection system、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)を加えて1分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、(6)でクローニングした抗体産生細胞2個全てが、ヒトペリオスチンPN−2と結合することが確認された。
BALB/cマウスの腹腔内にプリスタン[2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン(和光純薬製)]0.5mlを投与し、2〜3週間飼育した。予め、対数増殖期に維持しておいたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ No.8及びNo.10を回収し、培養上清を除いた沈殿画分の細胞にFCS不含のRPMI培地を加え、細胞数が1×107個/mlになるように細胞液を調製した。この細胞液を、プリスタン前投与したBALB/cマウスの腹腔中に注入し、3週間後頃から漏出した腹水を腹部より注射器で回収した。採取した腹水を、孔径0.22μmφのフィルターを用いて濾過した後、濾液をプロテインG−セファロースカラム(Millipore、11511324)によるアフィニティークロマトグラフィーによって常法に従い精製し、抗ヒトExon−21モノクローナル抗体2種を調製した。
Replitope(ガラススライド上に37種類のペプチドが固定化されたアレイ)を作製し、ヒトペリオスチンExon−21ペプチドに対するモノクローナル抗体(2種)及びラットペリオスチンExon−21ペプチドに対するポリクローナル抗体(2種)のエピトープを同定した。
一次抗体として、ポリクローナル抗体はラビット IgG No.1(0.51mg/ml),No.3(0.62mg/ml)を用い、モノクローナル抗体としてNo.8 Mouse IgG2b(2.21mg/ml),No.10 Mouse IgG1(1.35mg/ml)を用いた。二次抗体はCy5でラベルされたAnti−rabbit−IgG(H+L)(JIR 111−175−144)、Dylight649でラベルされたAnti−mouse−IgG(Pierce,シャープ35515)を用いた。ペプチドはセルロース膜によって合成した。その後、マイクロリッター・プレートに移し、ペプチド・アレイ用(JPT Peptide Technologies GmbH,Berlin,Germany)のナノパイペティング・システムによってガラス表面に撒いた。ペプチドマイクロ・アレイは、ブロッキングバッファー(Pierce International,Superblock TBS,orderシャープ37536)にて2時間インキュベートさせた。その後、マイクロアレイハイブリダイゼーションステーション(TECAN HS400 microarray hybridization station)を用いて一次抗体(10μg/ml in blocking buffer,total assay volume 200μl)またはブロッキングバッファーのみとインキュベートさせた。さらに、TBS−バッファー(50mM TBS−buffer + 0.1% Tween20(JPT), pH 7.2)にて洗浄した後、蛍光色素をラベルした二次抗体(anti rabbit IgG or anti−mouse−IgG)を、ブロッキングバッファー中の最終濃度1μg/mlでインキュベートさせた。3度TBS−バッファーで洗浄させた後にSSC−バッファー(3mM SSC−buffer(JPT), pH 7.0)で洗浄し、nitrogen streamで乾燥させた。最後に、高解度蛍光スキャナー(商品名: GenePix 4200AL、 Axon社)を用いて解析を行った。ソフトはGenePix 6.0を用いてスポットを解析した。
結果として、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体からは、配列TKVTK(配列番号21)と配列QGDTPVRK(配列番号22)が確認され、抗ヒトExon−21モノクローナル抗体からは配列VTKVTK(配列番号19)と配列FEDEEIK(配列番号20)を確認した。
SDラットの左総頸動脈に2F(フレンチ)のFogartyバルーンカテーテルにて搾過して傷害を与え、同時に抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)又はラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)を血管内投与した。内膜傷害モデルを作製後、1日、3日、1週間、2週間、3週間後において5匹ずつ灌流固定後、血管を摘出し、バルーン傷害を与えた頸動脈をサンプル、与えていない側をコントロールとして約1cm程各々摘出した。摘出した血管のうち約2〜3mm程度は4%パラホルムアルデヒドにて固定し、残りから各々 total RNA を抽出しcDNAを合成した。固定した組織から切片を作製し、HE(ヘマトキシリン・エオシン)染色を行なった(図4(B))。HE染色された切片全てに対し内膜と中膜の面積をグラフィック解析ソフト(商品名:Graphic converter ver.4.02)を用いて求めた。また、その面積より内膜/中膜比を算出し内膜肥厚の程度を調べた。図4(A)に示されるように、内膜/中膜比において抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)投与群とラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)群とではp=0.0362の有意差が得られ(N=8)、内膜の肥厚が抑制されていることが示された(図4)。
ApoEノックアウトマウスの高脂肪食刺激を行い、動脈硬化を誘導するモデルで抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)又はラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)を高脂肪食開始と同時に100μg/mlで1回/週で腹腔内投与した。3か月後に、大動脈を展開後、動脈硬化を血管全体に対するOil red O染色で陽性となった面積比率を動脈硬化度とし、IgGを投与した場合の動脈硬化度の平均値で割った値を動脈硬化の%変化度と考えて比較した。その結果、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)を投与した群はラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)を投与した群と比して大動脈の動脈硬化が有意に抑制されていた(N=3)(P<0.05)(図5)。
マウス大腸炎モデルのクローン病モデルである1.75%デキストラン硫酸(Dextran Sulfate Sodium; DDS)投与下での抗ヒトExon−21モノクローナル抗体(ex21MoAb)又はマウス・コントロールIgG抗体(mIgG)の効果を検討した。DDS投与と同時に100μg/匹で1回/週で各抗体を腹腔内投与した。2週間後に、大腸を摘出し、大腸の長さを測定し比較した。その結果、DDS投与によって大腸の長さはSham群と比して有意に縮小したが(N=6)(P<0.01)、抗ヒトExon−21モノクローナル抗体(ex21MoAb)を投与した群はマウス・コントロールIgG抗体(mIgG)を投与した群やDDSだけを投与した群と比して有意に大腸長の縮小作用が抑制されていた(N=6)(P<0.05)(図6)。
C57BL6Nの下肢大腿動脈を結紮し、下肢虚血モデルを作製した。抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb) 又はラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)を結紮3日前より40μg/mlで腹腔内投与(2回/1週)し、0(投与直前)、1、7、14、21、28日後にLaser Doppler Image (LDI; Moor社)を用いて健側、患側の下肢血流を測定し、Relative perfusion rate=患側/健側を下肢血流の評価として計算し両群を比較検討した。28日後のRelative perfusion rateは、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)がラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)を投与した群と比して有意に下肢血流が低下していた(P<0.05)(図7)。さらに、マウスの内転筋を摘出し、凍結切片を作製してCD31抗体で免疫染色し、血管を評価したところ抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)がラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)を投与した群と比して有意に単位面積当たりの血管数少なく、有意に血管新生が抑制されていた(P<0.01)(N=6)(図8)。さらに、同様の実験を、抗ヒトExon−21モノクローナル抗体(ex21MoAb)を用いて検討したところ、ポリクローナル抗体と同様に、LDIにて計算したRelative perfusion rateはマウス・コントロールIgG抗体(mIgG)を投与した群と比して、有意に血流が低下しており血管新生が抑制されていることが示された(図9)。
マトリゲル(Matrigel、BD Bioscience、No.356231)中に4T1乳癌細胞の上清を加えてさらに、マウス・コントロール IgG抗体(mIgG)、抗ヒトExon−21モノクローナル抗体(ex21MoAb)、ラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)をそれぞれ1/100の濃度で投与したものを96ウェルプレートに70μl/ウェルずつ入れ、30分インキュベートしゲル化させ、1.5×104個/ウェルのHUVEC(正常ヒト臍帯静脈内皮細胞)を播種した。5時間インキュベート後、クリスタルバイオレット溶液で染色、顕微鏡で写真撮影し、管腔の数をカウントした。4T1乳癌細胞の上清は血管新生作用を有しており、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体及び抗ヒトExon−21モノクローナル抗体はその血管新生作用を有意に抑制した(P<0.05)(図10(A)、(B))。次に、PN−2タンパク質を各種濃度で加えたものを同様に処置し評価したところ5μg/ml以上の濃度では濃度依存的にPN−2タンパク質が有意に管腔形成を誘導し、血管新生作用があることが示された(P<0.05)(図11(A)、(B))。このことから、抗Exon−21抗体は、血管新生抑制作用を有していることが示された。また、PN−2タンパク質の血管新生作用も示された。
細胞培養用96穴マルチウェルプレートにマウス4T1乳癌細胞105個/ウェル in DMEM(serum free,PC/SM)を添加し、37℃インキュベーターにて一晩培養した。培養上清を除去した後、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)及びラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)各々200μg/mlを1μg/mlの終濃度になるように添加したDMEM(serum free,PC/SM)培地を加えて、再度一晩培養した。翌日、全てのウェルの培地をDMEM(10% BSA,PC/SM)に交換し、細胞増殖試験キット(商品名:Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit、プロメガ)を用いて、Cell Titer液を100μlの培地に対し20μlずつ加え、37℃で1時間培養した。その後、490nmのプレートリーダー(BIO−RAD、 Model 680 MICRO PLATE READER)を用いて細胞の染色度を測定した(図12(A))。その結果、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)は、高濃度にてラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)と比して細胞増殖を抑制する活性を有した抗体であることが判明した(P<0.05)。
マウス4T1細胞(ATCC)を10%牛血清アルブミン (FBS)(Bio west)、Penicillin−streptomycin Mixed solution(ナカライテスク)、含有RPMI1640(Gibco)を用いて10cm Tissue Culture Dishes (Greiner)に播種し、37℃インキュベーターにて24時間培養した。その後、培養上清を除去し、PBSにて洗浄した後にトリプシン/EDTAにより浮遊させた。細胞を回収し1500rpm、3分間遠心した後、1.5×105個の細胞を継代し37℃インキュベーターにて72時間培養後、対数増殖期にある細胞を1×106個/匹になるようにカウントし100μlのPBSに懸濁した。調製した細胞は、29Gマイジェクター注射針付インスリン用シリンジ(TERMO)を用いマウスBALB/cメス8週齢の足底部に注入し、肺転移モデルマウスを作製した。また、29Gマイジェクター注射針付インスリン用シリンジにて、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)とラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)の各抗体100μg/匹/週を腹腔内投与した。抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)(1mg/ml)を用いた実験では、細胞注射と同時に抗体を投与し、さらに細胞注射を行なった1週間後と2週間後に抗体を投与した。ラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)としてNormal Rabbit IgG(R&D Systems)を用いた。細胞注射を行なった後、下肢腫大部の径をノギスにて計測し、原発巣の体積を評価した。評価方法はDethlefsen LA. et al. J. Natl. Cancer Inst., 40, 389 (1968)に記載方法に従い、(足裏の長さ)×(足裏の幅)^2÷2にて求めた。細胞注射後3週目に剖検を行い、体重測定、原発巣から肺への転移の有無と肺への転移コロニー数のカウントを行なった。それぞれ、Studentのt検定によりデータ解析を行なった。3週間後の下肢の原発巣の体積は抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)投与によって有意に縮小されていた(P<0.05)(図13(A))。また、細胞注射から5週間後の肺への転移コロニー数を比較したところ、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)投与によって有意にコロニー数が減少していた(P<0.05)(図13(B))。同様の実験を抗ヒトExon−21モノクローナル抗体(ex21MoAb)でも検討し、同様にマウス・コントロールIgG抗体(mIgG)又はPBS(−)投与群と比して有意に、肺転移コロニー数の減少を示した(図14)。これにより、抗Exon−21抗体による、4T1乳癌細胞への原発巣及び、転移巣の抑制作用が示された。
マウスB16F10メラノーマ細胞(マウス悪性黒色腫細胞株B16F10細胞)を37℃インキュベーターにて培養し、PBSで洗浄した後、トリプシン/EDTAにて細胞を浮遊させ回収した。その後1500rpm、3分間遠心を行い回収した細胞を5×105個/匹になるようにカウントし100μlのPBSに懸濁した。調製した細胞は、29Gマイジェクター注射針付インスリン用シリンジ(TERMO)を用いマウスC57BL/6Nオス8週齢の足底部に注入し、肺転移モデルマウスを作製した。29Gマイジェクター注射針付インスリン用シリンジにて、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)とラビット・コントロールのIgG抗体(rIgG)の各抗体100μg/匹/週を投与した。コントロールはNormal Rabbit IgG (R&D Systems)を用いた。
次に、臨床に近い形を再現するためマウスB16F10メラノーマ細胞を接種後1週間してから抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb) (1mg/ml)または、コントロールとしてラビット・コントロールのIgG抗体(rIgG) (1mg/ml) 100μg/匹/週を投与した。原発巣に関してはノギスを用いて計測し原発巣の体積を評価した。評価方法は、Dethlefsen LA. et al. J. Natl. Cancer Inst., 40, 389 (1968)に記載方法に従い、(足裏の長さ)×(足裏の幅)^2÷2にて求めた。細胞注射後、3週間で抗ラットExon−21ポリクローナル抗体投与によってラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)を投与したものと比して有意に原発巣の増殖を抑制した(P<0.05)(図15(A))。肺転移コロニー数に関しては、目視にて計測し比較検討した。その結果、細胞注射から5週間後、抗ラットExon−21ポリクローナル抗体(ex21PoAb)投与によってラビット・コントロールIgG抗体(rIgG)を投与したものと比して有意に肺転移を抑制した(P<0.05)(図15(B))。また、肺への転移コロニー数はMann−Whitney検定によりデータ解析を行なった。
老齢(生後6ヶ月以上)のApoEノックアウトマウスを用いた。Angiotensin IIを生理食塩水に溶解した。Angiotensin II(シグマアルドリッチ・A9525)を浸透圧による持続投与ポンプ(Alzet・室町機械・Model 2004)に充填した。投与量は1,000ng/kg/dayに設定した。調製した浸透圧ポンプは一昼夜生理食塩水中にてプライミング処置を行った。イソフルラン気化液を濃度2%・流量1L/minでマウスに吸入させ十分な鎮静を得たことを確認し、マウスを伏臥位で保持した。頸部皮膚を70%エタノール溶液で消毒し、小切開を加えた。切開部位より剪刀をマウス皮下に挿入して皮膚を剥離し、ポンプ留置スペースを確保したうえで、浸透圧ポンプをマウス皮下に留置した。留置後は小動物手術用ステープル(Fine Science Tools・室町機械・Model 12040−01)で閉創した。
0週よりマウス・コントロールIgG抗体(mIgG、100μg/匹)または抗ヒトExon−21モノクローナル抗体(ex21MoAb; 100μg/匹)を1回/週で腹腔内投与した。4週間後に超音波装置(東芝ネディカルシステムズ Aplio XV)で大動脈の直径を計測した。その結果、抗ヒトExon−21モノクローナル抗体(ex21MoAb)は有意に大動脈径の拡大を抑制することを確認した(図16)。
識別の表示:KS−0259#8,080611 Kohjin Bio
受託番号:NITE BP−01546
受託日
2013年2月26日
国際寄託当局
名称:独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
住所:〒292−0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室
Claims (19)
- 配列番号6で表されるアミノ酸配列、配列番号17で表されるアミノ酸配列及び配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる1種以上のアミノ酸配列からなるペプチドと特異的に結合する抗体。
- 配列番号19で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号20で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号21で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選ばれる1種以上のペプチドと特異的に結合する抗体。
- 抗体が、細胞接着活性を有するペリオスチンの細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識し、かつ当該ペリオスチンの細胞接着活性を中和する能力を有する抗体である、請求項1又は2に記載の抗体。
- 抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
- 抗体が、モノクローナル抗体である、請求項4記載の抗体。
- ハイブリドーマ細胞株NITE BP−01546により産生される、請求項5記載の抗体。
- 請求項5又は6記載のモノクローナル抗体のFab、F(ab’)2、Fv、scFvまたはdsFvを含有するペプチドである抗体断片。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体又は請求項7記載の抗体断片と、タンパク質又は低分子の薬剤とを結合させた抗体の誘導体。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
- ハイブリドーマ細胞株NITE BP−01546。
- 配列番号6で表されるアミノ酸配列、配列番号17で表されるアミノ酸配列及び配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド又は当該ペプチドのN末端にCys基を付加したペプチドでヒトを除く哺乳動物を免疫した後、当該動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを培養する工程を有する請求項4に記載の抗体を製造する方法。
- ハイブリドーマが、ハイブリドーマ細胞株NITE BP−01546である、請求項11記載の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体、請求項7記載の抗体断片又は請求項8記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンに対する阻害用医薬組成物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体、請求項7記載の抗体断片又は請求項8記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体、請求項7記載の抗体断片又は請求項8記載の抗体の誘導体を含む、細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する血管内膜肥厚抑制用、癌治療用、血管新生抑制用又は動脈瘤の予防若しくは治療用医薬組成物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体、請求項7記載の抗体断片又は請求項8記載の抗体の誘導体を用いて、生体試料中の細胞接着活性を有するペリオスチンを検出又は定量する方法。
- ペリオスチンのExon−21のみを抗原として得られる抗体。
- 配列番号6で表されるアミノ酸配列、配列番号17で表されるアミノ酸配列及び配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる1種以上のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する請求項17に記載の抗体。
- 配列番号19で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号20で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号21で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選ばれる1種以上のペプチドと特異的に結合する請求項17に記載の抗体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013047097 | 2013-03-08 | ||
JP2013047097 | 2013-03-08 | ||
PCT/JP2014/055861 WO2014136910A1 (ja) | 2013-03-08 | 2014-03-06 | ペリオスチンのExon-21部位によりコードされるペプチドに対する抗体及び該抗体を含む炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2014136910A1 JPWO2014136910A1 (ja) | 2017-02-16 |
JP6218088B2 true JP6218088B2 (ja) | 2017-11-01 |
Family
ID=51491417
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015504400A Expired - Fee Related JP6218088B2 (ja) | 2013-03-08 | 2014-03-06 | ペリオスチンのExon−21部位によりコードされるペプチドに対する抗体及び該抗体を含む炎症関連疾患の予防又は治療用医薬組成物 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10227396B2 (ja) |
EP (1) | EP2966087B1 (ja) |
JP (1) | JP6218088B2 (ja) |
ES (1) | ES2811060T3 (ja) |
WO (1) | WO2014136910A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2015046451A1 (ja) * | 2013-09-27 | 2017-03-09 | 株式会社アクアセラピューティクス | 眼科疾患を除くペリオスチン発現に起因する疾患用医薬、およびその用途 |
US20210047642A1 (en) * | 2018-01-25 | 2021-02-18 | Osaka University | Pharmaceutical composition for treatment of diseases associated with upregulated periostin expression or periostin splice variant switching |
US20210085828A1 (en) * | 2018-03-22 | 2021-03-25 | Queen Mary University Of London | Implantable cell dressing for treatment of disease |
JP7235262B1 (ja) | 2021-12-07 | 2023-03-08 | 国立大学法人大阪大学 | 抗体又はその抗原結合性断片 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
WO1991010741A1 (en) | 1990-01-12 | 1991-07-25 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
ES2108048T3 (es) | 1990-08-29 | 1997-12-16 | Genpharm Int | Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. |
JPH05268982A (ja) | 1992-03-27 | 1993-10-19 | Hoechst Japan Ltd | 骨形成作用を有する新規な蛋白質およびその製造法 |
CA2161351C (en) | 1993-04-26 | 2010-12-21 | Nils Lonberg | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
JP4534092B2 (ja) | 2000-09-08 | 2010-09-01 | 第一三共株式会社 | 心不全治療剤 |
ATE403149T1 (de) * | 2001-08-13 | 2008-08-15 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Diagnostische tests auf periostinbasis |
CA2527571A1 (en) * | 2003-05-29 | 2004-12-09 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer |
WO2005019471A2 (en) | 2003-08-13 | 2005-03-03 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Periostin-like factor: compositions and methods for making and using the same |
BRPI0620747A2 (pt) | 2005-12-28 | 2011-11-22 | Univ Osaka | anticorpo contra periostina, e uma composição farmacêutica compreendendo este para prevenir ou tratar uma doença na qual está envolvida periostina |
US8017119B2 (en) * | 2005-12-28 | 2011-09-13 | Daiichi Sankyo Company, Ltd. | Antibody against periostin, and a pharmaceutical composition comprising it for preventing or treating a disease in which periostin is involved |
WO2007096142A2 (en) | 2006-02-22 | 2007-08-30 | Philogen Spa | Vascular tumor markers |
WO2008021290A2 (en) | 2006-08-09 | 2008-02-21 | Homestead Clinical Corporation | Organ-specific proteins and methods of their use |
WO2009001940A1 (ja) | 2007-06-27 | 2008-12-31 | Asubio Pharma Co., Ltd. | ペリオスチンのExon-17部位によりコードされるペプチドに対する抗体を含む癌治療剤 |
WO2011024114A1 (en) | 2009-08-25 | 2011-03-03 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Targeting extracellular matrix molecules for the treatment of cancer |
KR101556339B1 (ko) * | 2012-07-02 | 2015-10-13 | 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 | 페리오스틴에 대한 압타머 및 이를 포함하는 항암제 조성물 |
-
2014
- 2014-03-06 JP JP2015504400A patent/JP6218088B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-03-06 ES ES14761201T patent/ES2811060T3/es active Active
- 2014-03-06 US US14/772,122 patent/US10227396B2/en active Active
- 2014-03-06 EP EP14761201.4A patent/EP2966087B1/en active Active
- 2014-03-06 WO PCT/JP2014/055861 patent/WO2014136910A1/ja active Application Filing
-
2018
- 2018-10-23 US US16/168,275 patent/US20190106484A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2966087A4 (en) | 2016-12-21 |
ES2811060T3 (es) | 2021-03-10 |
WO2014136910A1 (ja) | 2014-09-12 |
US20190106484A1 (en) | 2019-04-11 |
EP2966087B1 (en) | 2020-05-06 |
JPWO2014136910A1 (ja) | 2017-02-16 |
EP2966087A1 (en) | 2016-01-13 |
US20160108109A1 (en) | 2016-04-21 |
US10227396B2 (en) | 2019-03-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101363695B1 (ko) | 항페리오스틴에 대한 항체, 및 페리오스틴이 관여하는 질환의 예방 또는 치료를 위해 그것을 함유하는 약제학적 조성물 | |
JP5238942B2 (ja) | ペリオスチンのExon−17部位によりコードされるペプチドに対する抗体を含む癌治療剤 | |
TWI468177B (zh) | 抗siglec-15抗體 | |
EP1937815B1 (en) | Methods and compositions for modulating tumor cell activity | |
US20190106484A1 (en) | Antibody against peptide encoded by exon-21 of periostin and pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation-associated diseases containing the same | |
US8372957B2 (en) | Antibody against periostin, and a pharmaceutical composition comprising it for preventing or treating a disease in which periostin is involved | |
US7357929B2 (en) | Placental growth factor as a target for the treatment of osteoporosis | |
JP4852773B2 (ja) | 肝再生・修復制御剤 | |
JP5876833B2 (ja) | 抗1本鎖iv型コラーゲンポリペプチド抗体、並びに該抗体を含む医薬、及び腫瘍の診断薬、予防薬、又は治療薬 | |
US20220227882A1 (en) | Anti-adam8 antibodies and uses of the same | |
MX2008008584A (es) | Anticuerpo contra periostina, y una composicion farmaceutica que lo comprende para prevenir o tratar una enfermedad en donde esta involucrada periostina. | |
EP1615996A2 (en) | Uses of vascular endothelial growth factor and type i collagen inducible protein (vcip) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170131 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170328 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170711 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170727 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170905 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170915 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6218088 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees | ||
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |