JP6217141B2 - 細菌の検出方法、及び、検出器具 - Google Patents
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Description
(1)希釈液は有機酸を含み、かつ、特定成分は亜硝酸塩である。
(2)希釈液は亜硝酸塩を含み、かつ、特定成分は有機酸である。
(A)希釈液は有機酸を含み、かつ、特定成分は亜硝酸塩である場合には、希釈液中の有機酸濃度は0.06Mを超えて0.14M未満、かつ、固相において担持を行うために用いられる溶液の亜硝酸塩濃度は0.04Mを超えて0.14M未満(ただし、(a)前記有機酸濃度が0.08M以下、かつ、前記亜硝酸塩濃度が0.06M以下又は0.12M以上の場合、並びに、(b)前記有機酸濃度が0.12M以上、かつ、前記亜硝酸塩濃度が0.06M以下の場合を除く)である。
(B)希釈液は亜硝酸塩を含み、かつ、特定成分は有機酸である場合には、希釈液中の亜硝酸塩濃度は0.60Mを超えて1.4M未満、かつ、固相において担持を行うために用いられる溶液の有機酸濃度は0.06Mを超えて0.16M未満(ただし、前記亜硝酸塩濃度が0.80M以下、かつ、前記有機酸濃度が0.14M以上の場合を除く)である。
(A’)希釈液は有機酸を含み、かつ、特定成分は亜硝酸塩である場合には、希釈液中の有機酸濃度は0.06Mを超えて0.14M未満、かつ、固相において担持を行うために用いられる溶液の亜硝酸塩濃度は0.06Mを超えて0.12M未満(ただし、前記有機酸濃度が0.08M以下、かつ、前記亜硝酸塩濃度が0.10M以上の場合を除く)である。
(B’)希釈液は亜硝酸塩を含み、かつ、特定成分は有機酸である場合には、希釈液中の亜硝酸塩濃度は0.60Mを超えて1.40M未満、かつ、固相において担持を行うために用いられる溶液の有機酸濃度は0.06Mを超えて0.14M未満(ただし、(a)前記亜硝酸塩濃度が0.80M以下、かつ、前記有機酸の濃度が0.08M以下の場合、あるいは、(b)前記亜硝酸塩濃度が1.20M以上、かつ、前記有機酸の濃度が0.08M以下の場合を除く)である。
(1)抗体修飾金コロイド塗布液の調製
直径40nmの金コロイド水溶液10mLに50mM HEPESバッファー(pH8.0)1mLを加えることでpHを調整し、1mLの抗溶連菌抗体溶液を加え攪拌した。10分間静置した後、5%ポリエチレングリコール20000水溶液を120μL加え攪拌し、続いて10%カゼインナトリウム水溶液を1.2mL加え攪拌した。直ちにこの溶液を12000×g・4℃で15分間遠心した後、上清を取り除き、金コロイド標識抗体保存溶液(10%トレハロース、0.1%カゼインナトリウムを含む)1mLを加え、超音波清浄機により金コロイドを再分散した。この後、金コロイド標識抗体保存溶液により520nmのODが2.0になるように調整し、金コロイド標識抗体溶液を得た。
9mm×300mmのコットン製パッドに、下記表1に示す濃度の亜硫酸ナトリウム水溶液又はクエン酸水溶液を含浸し、室温で一晩乾燥させ、担持部を構成する特定成分固定化パッドを得た。
9mm×300mmのコットン製パッドに、1Mホウ酸緩衝液(pH8.3)を含浸し、室温で一晩乾燥させ、中和部を構成する中和成分固定化パッドを得た。
4mm×300mmの平坦なグラスウールに金コロイド標識抗体溶液を含浸し、室温で一晩乾燥させ、標識抗体結合部を構成する金コロイド標識抗体保持パッドを得た。
25mm×300mmにカットしたニトロセルロースメンブレンに対して、1mg/mLのテストライン(検出部)用抗溶連菌抗体溶液、及び、1mg/mLのコントロール(コントロール部)用抗ウサギIgG抗体を、インクジェット方式の塗布装置を用いて0.75μL/cmで塗布した後、乾燥機を用いて50℃で30分乾燥することで抗体固定化メンブレンを得た。
80mm×300mmの粘着性シートに、前述で作成した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。粘着性シートのテストライン側の端より特定成分固定化パットを貼り付け、さらに抗体修飾金コロイド保持パッドを抗体固定化メンブレンと約1mm重なるように貼り付けた。中和成分固定化パッドを特定成分固定化パッドと当接し、さらに金コロイド保持パッドに約1mm重なった状態で貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンのコントロールライン側には吸収パッドを重ねて貼り付けた。これら重ね貼り合わせた部材を、部材の長辺側を5.5mm幅になるようにギロチン式カッターで切断し、イムノクロマト用ストリップを作成した。
前述により作成したイムノクロマト用ストリップをABS製プラスチックケースに格納し、イムノクロマトデバイスとした。
溶連菌は、エルナスストリップA(TFB社)に添付されている陽性コントロール(1×108菌体/mL)をリン酸緩衝液にて希釈して1×105菌体/mLとしたものを調製した(A)。他方で、綿棒により咽頭を擦過し、綿棒の頭上から細胞片を抽出液にて抽出し、疑似陽性検体用の希釈液(B)を調製した。当該抽出液(B)は、クエン酸又は亜硝酸塩濃度(疑似陽性検体全体における濃度)が下記表1に示すそれぞれ値となるように調整された水溶液である。
菌体液(A)を30μL、及び、抽出液(B)を270μL、それぞれ分取して混合し、細胞片を含む溶連菌の菌体濃度が1×104菌体/mLの疑似陽性検体300μLを調製した。この希釈濃度は現在最も優れる溶連菌の検出感度に相当する。
50’:本発明の検出器具のケース
51:上外装部
511:滴下窓
512:検出窓
52:下外装部
521’:矩形領域(引っ掛かり構造)
53:固相
531:担持部
532:中和部
533:標識抗体結合部
534:検出部
535:コントロール部
54:凹凸部位(握持用)
60:混合滴下用器具
61:チューブ
611:チューブ本体
612:接続用部材
62:蓋部
621:フィルター
622:注入口
70:綿棒
71:綿棒の頭
80、80’:検体の希釈液(試料)
90:本発明の検出キット
Claims (5)
- 検出対象である化膿連鎖球菌のバイオフィルムを固相上で分解し、当該バイオフィルム分解後の化膿連鎖球菌の成分に対する当該固相上における抗原抗体反応を示すシグナルにより、当該化膿連鎖球菌を検出する方法であって、当該固相上には、検出対象の化膿連鎖球菌の存在を抗原抗体反応のシグナルを介して顕すための検出部が設けられ、かつ、当該検出部とは別個に、試料中の希釈液の溶解成分に反応して化膿連鎖球菌菌体のバイオフィルムを分解する成分である硝酸を産生する特定成分が担持された担持部が設けられ、検体が希釈液で抽出された試料の当該担持部における滴下による接触により、バイオフィルムを分解する成分である硝酸が当該担持部において産生されて、試料中の化膿連鎖球菌のバイオフィルムが分解され、当該のバイオフィルムが分解された化膿連鎖球菌の成分の、引き続く当該固相における移動による検出部との接触により発生する、抗原抗体反応のシグナルの検出により検出対象化膿連鎖球菌を検出する化膿連鎖球菌の検出方法において、さらに前記希釈液、及び、前記特定成分は、下記(1)及び(2):
(1)希釈液は酢酸又はクエン酸を含み、かつ、特定成分は亜硝酸塩であり、当該希釈液中の酢酸又はクエン酸の濃度は0.06Mを超えて0.14M未満、かつ、固相において担持を行うために用いられる溶液の亜硝酸塩濃度は0.04Mを超えて0.14M未満(ただし、(a)前記酢酸又はクエン酸の濃度が0.08M以下、かつ、前記亜硝酸塩濃度が0.06M以下又は0.12M以上の場合、並びに、(b)前記酢酸又はクエン酸の濃度が0.12M以上、かつ、前記亜硝酸塩濃度が0.06M以下の場合を除く)である;
(2)希釈液は亜硝酸塩を含み、かつ、特定成分は酢酸又はクエン酸であり、当該希釈液中の亜硝酸塩濃度は0.60Mを超えて1.4M未満、かつ、固相において担持を行うために用いられる溶液の酢酸又はクエン酸の濃度は0.06Mを超えて0.16M未満(ただし、前記亜硝酸塩濃度が0.80M以下、かつ、前記酢酸又はクエン酸の濃度が0.14M以上の場合を除く)である;
のいずれかの条件に従い、
さらに、固相における特定成分の担持部の検出部側に、硝酸の中和成分が担持されていることを特徴とする、化膿連鎖球菌の検出方法。 - 検出対象である化膿連鎖球菌のバイオフィルムを固相上で分解し、当該バイオフィルム分解後の化膿連鎖球菌の成分に対する当該固相上における抗原抗体反応を示すシグナルにより、当該化膿連鎖球菌を検出する方法であって、当該固相上には、検出対象の化膿連鎖球菌の存在を抗原抗体反応のシグナルを介して顕すための検出部が設けられ、かつ、当該検出部とは別個に、試料中の希釈液の溶解成分に反応して化膿連鎖球菌菌体のバイオフィルムを分解する成分である硝酸を産生する特定成分が担持された担持部が設けられ、検体が希釈液で抽出された試料の当該担持部における滴下による接触により、バイオフィルムを分解する成分である硝酸が当該担持部において産生されて、試料中の化膿連鎖球菌のバイオフィルムが分解され、当該のバイオフィルムが分解された化膿連鎖球菌の成分の、引き続く当該固相における移動による検出部との接触により発生する、抗原抗体反応のシグナルの検出により検出対象化膿連鎖球菌を検出する化膿連鎖球菌の検出方法において、さらに前記希釈液、及び、前記特定成分は、下記(3)及び(4):
(3)希釈液は酢酸又はクエン酸を含み、かつ、特定成分は亜硝酸塩であり、当該希釈液中の酢酸又はクエン酸の濃度は0.06Mを超えて0.14M未満、かつ、固相において担持を行うために用いられる溶液の亜硝酸塩濃度は0.06Mを超えて0.12M未満(ただし、前記酢酸又はクエン酸の濃度が0.08M以下、かつ、前記亜硝酸塩濃度が0.10M以上の場合を除く)である;
(4)希釈液は亜硝酸塩を含み、かつ、特定成分は酢酸又はクエン酸あり、当該希釈液中の亜硝酸塩濃度は0.60Mを超えて1.40M未満、かつ、固相において担持を行うために用いられる溶液の酢酸又はクエン酸の濃度は0.06Mを超えて0.14M未満(ただし、(a)前記亜硝酸塩濃度が0.80M以下、かつ、酢酸又はクエン酸の濃度が0.08M以下の場合、並びに、(b)前記亜硝酸塩濃度が1.20M以上、かつ、酢酸又はクエン酸の濃度が0.08M以下の場合を除く)である;
のいずれかの条件に従い、
さらに、固相における特定成分の担持部の検出部側に、硝酸の中和成分が担持されていることを特徴とする、化膿連鎖球菌の検出方法。 - 検出対象である化膿連鎖球菌のバイオフィルムを固相上で分解し、当該バイオフィルム分解後の化膿連鎖球菌の成分に対する当該固相上における抗原抗体反応を示すシグナルにより、当該化膿連鎖球菌を検出する方法を行うための検出器具であって、当該固相上には、検出対象の化膿連鎖球菌の存在を抗原抗体反応のシグナルを介して顕すための検出部が設けられ、かつ、当該検出部の上流に、試料中の希釈液に反応して化膿連鎖球菌菌体のバイオフィルムを分解する成分である硝酸を産生する特定成分が担持されている担持部が設けられ、当該固相はケース内に配置固定され、当該固相の検出部に対応する位置に当該ケースの検出窓が設けられ、当該担持部又は当該担持部の上流側に対応する位置に、希釈液にて希釈された試料を滴下して当該固相に接触させるための滴下窓が設けられている化膿連鎖球菌の検出器具において、さらに前記希釈液、及び、前記特定成分は、下記(1)及び(2):
(1)希釈液は酢酸又はクエン酸を含み、かつ、特定成分は亜硝酸塩であり、当該希釈液中の酢酸又はクエン酸の濃度は0.06Mを超えて0.14M未満、かつ、固相において担持を行うために用いられる溶液の亜硝酸塩濃度は0.04Mを超えて0.14M未満(ただし、(a)前記酢酸又はクエン酸の濃度が0.08M以下、かつ、前記亜硝酸塩濃度が0.06M以下又は0.12M以上の場合、並びに、(b)前記酢酸又はクエン酸の濃度が0.12M以上、かつ、前記亜硝酸塩濃度が0.06M以下の場合を除く)である;
(2)希釈液は亜硝酸塩を含み、かつ、特定成分は酢酸又はクエン酸であり、当該希釈液中の亜硝酸塩濃度は0.60Mを超えて1.4M未満、かつ、固相において担持を行うために用いられる溶液の酢酸又はクエン酸の濃度は0.06Mを超えて0.16M未満(ただし、前記亜硝酸塩濃度が0.80M以下、かつ、前記酢酸又はクエン酸の濃度が0.14M以上の場合を除く)である;
のいずれかの条件に従い、
さらに、固相における特定成分の担持部の検出部側に、硝酸の中和成分が担持されていることを特徴とする、化膿連鎖球菌の検出器具。 - 検出対象である化膿連鎖球菌のバイオフィルムを固相上で分解し、当該バイオフィルム分解後の化膿連鎖球菌の成分に対する当該固相上における抗原抗体反応を示すシグナルにより、当該化膿連鎖球菌を検出する方法を行うための検出器具であって、当該固相上には、検出対象の化膿連鎖球菌の存在を抗原抗体反応のシグナルを介して顕すための検出部が設けられ、かつ、当該検出部の上流に、試料中の希釈液に反応して化膿連鎖球菌菌体のバイオフィルムを分解する成分である硝酸を産生する特定成分が担持されている担持部が設けられ、当該固相はケース内に配置固定され、当該固相の検出部に対応する位置に当該ケースの検出窓が設けられ、当該担持部又は当該担持部の上流側に対応する位置に、希釈液にて希釈された試料を滴下して当該固相に接触させるための滴下窓が設けられている化膿連鎖球菌の検出器具において、さらに前記希釈液、及び、前記特定成分は、下記(3)及び(4):
(3)希釈液は酢酸又はクエン酸を含み、かつ、特定成分は亜硝酸塩であり、当該希釈液中の酢酸又はクエン酸の濃度は0.06Mを超えて0.14M未満、かつ、固相において担持を行うために用いられる溶液の亜硝酸塩濃度は0.06Mを超えて0.12M未満(ただし、前記酢酸又はクエン酸の濃度が0.08M以下、かつ、前記亜硝酸塩濃度が0.10M以上の場合を除く)である;
(4)希釈液は亜硝酸塩を含み、かつ、特定成分は酢酸又はクエン酸あり、当該希釈液中の亜硝酸塩濃度は0.60Mを超えて1.40M未満、かつ、固相において担持を行うために用いられる溶液の酢酸又はクエン酸の濃度は0.06Mを超えて0.14M未満(ただし、(a)前記亜硝酸塩濃度が0.80M以下、かつ、酢酸又はクエン酸の濃度が0.08M以下の場合、並びに、(b)前記亜硝酸塩濃度が1.20M以上、かつ、酢酸又はクエン酸の濃度が0.08M以下の場合を除く)である;
のいずれかの条件に従い、
さらに、固相における特定成分の担持部の検出部側に、硝酸の中和成分が担持されていることを特徴とする、化膿連鎖球菌の検出器具。 - (1)請求項3又は4に記載の検出器具、(2)試料と希釈液を混合して、当該混合液を当該検出器具の滴下窓に向けて滴下するための混合滴下用器具、及び、(3)検体の希釈液を含む、化膿連鎖球菌検出用キット。
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