JP6216130B2 - Target substance introduction method and target substance introduction apparatus - Google Patents
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Description
本発明は標的物質導入方法及び標的物質導入装置に関する。 The present invention relates to a target substance introduction method and a target substance introduction apparatus.
細胞に遺伝子をはじめとする標的物質を導入する方法として、トランスフェクション法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法等が知られている。トランスフェクション法、エレクトロポーレーション法等においては、標的物質の導入は確率に従い、ある特定の細胞のみを狙って標的物質を導入することは不可能である。マイクロインジェクション法は、ある特定の細胞のみを狙って標的物質を導入することができるが、大量処理は困難である。また、細胞にキャピラリーを挿入するため、細胞に大きなダメージを与えるという問題がある。 As a method for introducing a target substance such as a gene into a cell, a transfection method, an electroporation method, a microinjection method and the like are known. In the transfection method, the electroporation method, etc., the introduction of the target substance follows the probability, and it is impossible to introduce the target substance only for a specific cell. The microinjection method can introduce a target substance targeting only a specific cell, but is difficult to process in large quantities. In addition, since the capillary is inserted into the cell, there is a problem that the cell is seriously damaged.
細胞に標的物質を導入する他の方法として、レーザ光を用いる方法がある。例えば、フェムト秒パルスレーザ光を用いて細胞膜に細孔を形成し、細孔から標的物質を導入する方法が検討されている（例えば、非特許文献１を参照。）。 As another method for introducing a target substance into cells, there is a method using laser light. For example, a method of forming a pore in a cell membrane using femtosecond pulsed laser light and introducing a target substance from the pore has been studied (see, for example, Non-Patent Document 1).
しかしながら、このようなパルスレーザ光を用いる標的物質の導入法は、フェムト秒パルスレーザ光を用いており、高価な装置を必要とする。また、穿孔した細胞内に標的物質が取り込まれるかどうかは、液相中の標的物質の濃度に依存する。しかし、液相中の標的物質の濃度には、分散・溶解性という観点からも、経済的な観点からも制約がある。このため、標的物質が細胞に導入される割合は通常１％未満である。フェムト秒パルスレーザ光により穿孔した後、キャピラリーを用いて標的物質を細胞内に直接インジェクションする方法も考えられるが、この場合には大量の細胞を処理することは困難である。 However, such a method of introducing a target substance using pulsed laser light uses femtosecond pulsed laser light, and requires an expensive apparatus. Whether the target substance is taken up into the perforated cells depends on the concentration of the target substance in the liquid phase. However, the concentration of the target substance in the liquid phase is limited from the viewpoints of dispersion and solubility as well as from an economic viewpoint. For this reason, the rate at which the target substance is introduced into the cells is usually less than 1%. A method of directly injecting a target substance into cells using a capillary after perforation with femtosecond pulse laser light is also conceivable, but in this case, it is difficult to process a large number of cells.
本発明の課題は、高価なフェムト秒パルスレーザ装置を用いることなく細胞を穿孔し、穿孔した細胞に効率良く標的物質を導入できるようにすることである。 An object of the present invention is to puncture a cell without using an expensive femtosecond pulse laser device, and to efficiently introduce a target substance into the perforated cell.
標的物質導入方法の一態様は、基板の細胞接着スポットに標的物質及び細胞を固定する工程と、細胞の外縁部で、細胞接着スポット側の位置にパルスレーザ光を照射することにより、細胞接着スポットに固定された標的物質を細胞に導入する工程とを備えている。 One aspect of the method for introducing a target substance is a step of fixing a target substance and cells to a cell adhesion spot on a substrate and irradiating a pulse laser beam at a position on the cell adhesion spot side at the outer edge of the cell, thereby And a step of introducing the target substance fixed to the cell into the cell.
標的物質導入方法の一態様において、パルスレーザ光のパルス幅は、５×１０-11秒以上、５×１０-7秒以下としてもよい。 In one embodiment of the target substance introduction method, the pulse width of the pulse laser beam may be 5 × 10 −11 seconds or more and 5 × 10 −7 seconds or less.
標的物質導入方法の一態様において、標的物質は、表面に第１の認識物質を有するマイクロセルに担持されており、第１の認識物質を認識する第２の認識物質が、細胞接着スポットに固定されていてもよい。 In one embodiment of the method for introducing a target substance, the target substance is supported on a microcell having a first recognition substance on the surface, and the second recognition substance that recognizes the first recognition substance is fixed to the cell adhesion spot. May be.
標的物質導入方法の一態様において、マイクロセルは、光ピンセットを用いて細胞接着スポットに固定してもよい。 In one embodiment of the target substance introduction method, the microcell may be fixed to a cell adhesion spot using optical tweezers.
標的物質導入方法の一態様において、ナノ秒パルスレーザ光は、細胞の外縁部に沿って位置を移動しながら複数回照射してもよい。 In one embodiment of the method for introducing a target substance, the nanosecond pulse laser beam may be irradiated a plurality of times while moving the position along the outer edge of the cell.
標的物質導入方法の一態様において、細胞接着スポットには、第１の温度領域において細胞接着性の状態となり、第２の温度領域において細胞非接着性の状態となる温度応答性ポリマーが固定されており、細胞の細胞接着スポットへの固定は、第１の温度領域において行ってもよい。 In one embodiment of the method for introducing a target substance, a cell-responsive spot is fixed with a temperature-responsive polymer that becomes cell-adhesive in the first temperature region and cell-non-adhesive in the second temperature region. The cells may be fixed to the cell adhesion spot in the first temperature range.
標的物質導入方法の一態様において、基板は、複数の細胞接着スポットを有し、パルスレーザ光の照射は、複数の細胞接着スポットのそれぞれに対して順次行ってもよい。 In one embodiment of the method for introducing a target substance, the substrate may have a plurality of cell adhesion spots, and irradiation with pulsed laser light may be sequentially performed on each of the plurality of cell adhesion spots.
標的物質導入方法の一態様は、パルスレーザ光を照射する工程よりも前に、細胞接着スポットに固定された細胞の画像データを画像処理部に取り込む工程及び取り込んだ画像データを処理してパルスレーザ光の照射位置を決定する工程をさらに備えていてもよい。 One aspect of the method for introducing a target substance is that a step of capturing image data of cells fixed to a cell adhesion spot into an image processing unit and a step of processing the captured image data before the step of irradiating the pulsed laser light to the pulse laser You may further provide the process of determining the irradiation position of light.
標的物質導入装置の一態様は、細胞接着スポットに標的物質及び細胞が固定された基板を載置するステージと、細胞接着スポットの光学像を取得する観察用光学系と、パルスレーザ光源と、パルスレーザ光源から出射されたパルスレーザ光を、細胞に照射する照射用光学系と、光学像を画像処理し、細胞接着スポットに固定された細胞の形状を認識し、細胞の外縁部で、細胞接着スポット側の位置にパルスレーザ光が照射されるように、照射用光学系及びステージを駆動する制御部とを備えている。 One aspect of the target substance introducing device includes a stage on which a substrate on which a target substance and cells are fixed is mounted on a cell adhesion spot, an observation optical system that acquires an optical image of the cell adhesion spot, a pulse laser light source, a pulse An irradiation optical system that irradiates cells with pulsed laser light emitted from a laser light source, optically processes the optical image, recognizes the shape of the cells fixed to the cell adhesion spots, and attaches cells at the outer edge of the cells. An irradiation optical system and a controller for driving the stage are provided so that the pulse laser beam is irradiated to the spot side position.
標的物質導入装置の一態様において、パルスレーザ光のパルス幅は、５×１０-11秒以上、５×１０-7秒以下としてもよい。 In one embodiment of the target substance introduction device, the pulse width of the pulse laser beam may be 5 × 10 −11 seconds or more and 5 × 10 −7 seconds or less.
本発明に係る標的物質導入方法によれば、高価なフェムト秒パルスレーザ装置を用いることなく細胞を穿孔し、穿孔した細胞に効率良く標的物質を導入できる。 According to the method for introducing a target substance according to the present invention, a cell can be perforated without using an expensive femtosecond pulse laser device, and the target substance can be efficiently introduced into the perforated cell.
本実施形態の標的物質導入方法は、基板の細胞接着スポットに標的物質及び細胞を固定し、細胞接着スポットに固定された細胞の外縁部に、パルスレーザ光を照射する。これにより、高価なフェムト秒パルスレーザ装置を用いなくても、核に大きなダメージを与えることなく細胞を穿孔できる。また、標的物質も細胞接着スポットに固定されているため、高効率で標的物質を細胞に導入できる。 In the target substance introduction method of the present embodiment, the target substance and cells are fixed to the cell adhesion spot of the substrate, and the outer edge of the cell fixed to the cell adhesion spot is irradiated with pulsed laser light. As a result, cells can be perforated without damaging the nucleus without using an expensive femtosecond pulse laser device. Further, since the target substance is also fixed to the cell adhesion spot, the target substance can be introduced into the cells with high efficiency.
図１〜図４は、本実施形態の標的物質導入方法を工程順に示している。まず、図１に示すような処理基板１０１を準備する。処理基板１０１は、基材１１１の表面に設けられた細胞接着スポット１１２を有している。図１において細胞接着スポット１１２は、基材１１１の上に堆積されたスポット形成材料１１３に設けられた開口部である。細胞接着スポット１１２の表面には、温度により細胞接着性の状態と、細胞非接着性の状態とをスイッチできる温度応答性ポリマー１２１と、抗体１２２とが固定されている。処理基板１０１の細胞接着スポット１１２以外の部分には、細胞非接着性ポリマー１２５が固定されており、細胞非接着面となっている。 1 to 4 show the target substance introduction method of this embodiment in the order of steps. First, a processing substrate 101 as shown in FIG. 1 is prepared. The treatment substrate 101 has a cell adhesion spot 112 provided on the surface of the base material 111. In FIG. 1, the cell adhesion spot 112 is an opening provided in the spot forming material 113 deposited on the base material 111. On the surface of the cell adhesion spot 112, a temperature-responsive polymer 121 capable of switching between a cell adhesive state and a cell non-adhesive state depending on the temperature, and an antibody 122 are fixed. A cell non-adhesive polymer 125 is fixed to a portion of the processing substrate 101 other than the cell adhesion spot 112, which is a cell non-adhesive surface.
次に、図２に示すように、細胞接着スポット１１２に、標的物質である遺伝子を担持したマイクロセル１３１を固定する。マイクロセル１３１の表面には抗体１２２が特異的に認識する抗原が存在しており、マイクロセル１３１を細胞接着スポット１１２に容易に固定することができる。 Next, as shown in FIG. 2, a microcell 131 carrying a gene as a target substance is fixed to the cell adhesion spot 112. An antigen specifically recognized by the antibody 122 is present on the surface of the microcell 131, and the microcell 131 can be easily fixed to the cell adhesion spot 112.
次に、図３に示すように、マイクロセル１３１が固定された細胞接着スポット１１２に、細胞１４１を固定する。細胞１４１の固定は、温度応答性ポリマー１２１が細胞接着性の状態となる温度領域で行えばよい。次に、図４に示すように細胞接着スポット１１２に固定された細胞１４１にパルスレーザ光１５１を照射して細胞膜に細孔を形成する。これにより、細胞接着スポット１１２に固定されたマイクロセル１３１が細胞１４１に取り込まれる。 Next, as shown in FIG. 3, the cell 141 is fixed to the cell adhesion spot 112 to which the microcell 131 is fixed. The cell 141 may be fixed in a temperature region where the temperature-responsive polymer 121 is in a cell adhesive state. Next, as shown in FIG. 4, the cell 141 fixed to the cell adhesion spot 112 is irradiated with pulsed laser light 151 to form pores in the cell membrane. Thereby, the microcell 131 fixed to the cell adhesion spot 112 is taken into the cell 141.
この後、必要に応じて培養等を行った後、温度応答性ポリマー１２１が細胞非接着性の状態となる温度領域とすることにより、標的物質を導入した細胞１４１を細胞接着スポット１１２から遊離させて回収する。 Thereafter, after culturing as necessary, the temperature-responsive polymer 121 is brought into a temperature region where the cell non-adhesive state is achieved, thereby releasing the cells 141 introduced with the target substance from the cell adhesion spot 112. And collect.
以下に、本実施形態の標的物質導入法に用いる処理基板１０１の構成について説明する。基材１１１の材質は特に限定されず、ガラス基板、シリコン基板、ダイヤモンド様カーボン基板、若しくはセラミクス基板等の無機性基板、ＩＴＯ（酸化インジウムスズ）、若しくは金・チタン・クロム等の金属性基板、又は樹脂基板等の有機性基板等を用いることができる。中でも、ガラス等の透明な材料は、光学顕微鏡による観察が容易に行えるため好ましい。 Below, the structure of the process board | substrate 101 used for the target substance introduction | transduction method of this embodiment is demonstrated. The material of the substrate 111 is not particularly limited, and is an inorganic substrate such as a glass substrate, a silicon substrate, a diamond-like carbon substrate, or a ceramic substrate, ITO (indium tin oxide), or a metallic substrate such as gold, titanium, or chromium, Alternatively, an organic substrate such as a resin substrate can be used. Among them, a transparent material such as glass is preferable because it can be easily observed with an optical microscope.
細胞接着スポット１１２を形成するためのスポット形成材料１１３は、特に限定されないが、堆積及び加工が容易で、細胞に対する毒性が小さい材料が好ましい。例えば、金、若しくはクロムとチタンとの合金等の金属、ダイヤモンド様カーボン、又は樹脂等を用いることができる。なお、スポット形成材料１１３は、基材１１１と同じであってもよい。また、スポット形成材料１１３は積層材料であってもよい。 The spot forming material 113 for forming the cell adhesion spot 112 is not particularly limited, but a material that can be easily deposited and processed and has low toxicity to cells is preferable. For example, metal such as gold or an alloy of chromium and titanium, diamond-like carbon, resin, or the like can be used. Note that the spot forming material 113 may be the same as the base material 111. Further, the spot forming material 113 may be a laminated material.
図１において、細胞接着スポット１１２は、基材１１１を露出する開口部であるが、処理基板１０１の他の部分よりもへこんでいれば、基材１１１が露出している必要はない。また、スポット形成材料１１３を堆積して凹部を形成するのではなく、基材１１１をエッチングして形成した凹部を細胞接着スポット１１２としてもよい。細胞接着スポット１１２は凹部ではなく、処理基板１０１の他の部分よりも突出した凸部としてもよい。細胞接着スポット１１２を凹部又は凸部とすることにより、細胞接着スポット１１２の位置を明確にすることができるが、細胞接着スポット１１２は処理基板１０１の他の部分と同じ平面に存在していてもよい。 In FIG. 1, the cell adhesion spot 112 is an opening that exposes the base material 111, but the base material 111 does not need to be exposed as long as it is dented from the other part of the processing substrate 101. Further, instead of depositing the spot forming material 113 to form the recesses, the recesses formed by etching the base material 111 may be used as the cell adhesion spots 112. The cell adhesion spot 112 may not be a recess, but a protrusion that protrudes from other portions of the processing substrate 101. By making the cell adhesion spot 112 concave or convex, the position of the cell adhesion spot 112 can be clarified. However, even if the cell adhesion spot 112 exists on the same plane as the other part of the processing substrate 101. Good.
細胞接着スポット１１２は、取り扱う細胞の大きさにもよるが、直径ｄを２０μｍ〜５００μｍ程度とすればよい。また、細胞接着スポット１１２同士の中心間の間隔ｐは直径ｄに応じて決めればよいが、３０μｍ〜５００μｍ程度のマトリックス状に配置すればよい。細胞接着スポット１１２が凹部の場合には、深さは数ｎｍから数十μｍとすることが好ましい。細胞接着スポット１１２が凸部の場合には、高さは数ｎｍから数μｍとすることが好ましい。 The cell adhesion spot 112 may have a diameter d of about 20 μm to 500 μm, although it depends on the size of the cell to be handled. The distance p between the centers of the cell adhesion spots 112 may be determined according to the diameter d, but may be arranged in a matrix of about 30 μm to 500 μm. When the cell adhesion spot 112 is a recess, the depth is preferably several nm to several tens of μm. When the cell adhesion spot 112 is a convex portion, the height is preferably several nm to several μm.
細胞接着スポット１１２を含む処理基板１０１の表面は平滑であってもよいが、周期が１μｍ〜５μｍ程度で、高さが１μｍ程度の周期的な凹凸構造を有していてもよい。処理基板１０１の表面に周期的な凹凸構造を設けることにより、細胞への標的物資の導入効率をさらに高めることができる。凹凸構造はどのようなものであってもよいが、例えば、円錐状、角錐状、円錐台状、角錐台状、円筒状又は角筒状等の凸部又は凹部とすることができる。これらの凸部又は凹部の表面にさらに周期的な凸部又は凹部が設けられた形状であってもよい。凹凸構造の形状、周期及び高さ等は特に限定されないが、周期が１μｍ以上、５μｍ以下程度で、高さが１μｍ以下程度の周期的な凹凸構造は、リソグラフィーを用いて容易に形成することができ好ましい。 The surface of the processing substrate 101 including the cell adhesion spot 112 may be smooth, but may have a periodic uneven structure with a period of about 1 μm to 5 μm and a height of about 1 μm. By providing a periodic concavo-convex structure on the surface of the treatment substrate 101, the introduction efficiency of the target material into the cells can be further increased. The concavo-convex structure may be any shape, and may be, for example, a convex portion or a concave portion such as a cone shape, a pyramid shape, a truncated cone shape, a truncated pyramid shape, a cylindrical shape, or a rectangular tube shape. The shape in which the periodic convex part or the recessed part was further provided in the surface of these convex part or the recessed part may be sufficient. The shape, period, height, and the like of the concavo-convex structure are not particularly limited, but a periodic concavo-convex structure having a period of about 1 μm to 5 μm and a height of about 1 μm can be easily formed using lithography. This is preferable.
凹凸構造は、細胞接着スポット１１２を含む処理基板１０１の全面に形成してもよく、選択的に形成してもよい。例えば、細胞接着スポット１１２である凹部又は凸部にのみ形成してもよく、細細胞接着スポット１１２以外の部分にのみ形成してもよい。 The uneven structure may be formed on the entire surface of the processing substrate 101 including the cell adhesion spot 112 or may be selectively formed. For example, it may be formed only in the concave portion or convex portion that is the cell adhesion spot 112, or may be formed only in a portion other than the fine cell adhesion spot 112.
温度応答性ポリマー１２１は、細胞接着性のタンパク質及びペプチド等を補助物質として細胞を接着させる足場を形成でき、温度変化によって接着した細胞が表面から遊離する性質を有している。細胞の温度応答性ポリマーからの遊離は、温度変化によるポリマー鎖の媒体への溶解性の変化、ポリマー表面の親水性と疎水性との間の変化又はポリマー表面のイオン状態の変化等により引き起こすことができる。従って、これらの少なくとも１つの変化が生じるポリマーを温度応答性ポリマーとして用いることができる。細胞が温度応答性ポリマーから遊離する際に、タンパク質及びペプチド等の細胞接着の補助物質が共に遊離してもよく、補助物質が遊離しなくてもよく、補助物質の遊離が別のタイミングで生じてもよい。 The temperature-responsive polymer 121 can form a scaffold for attaching cells using cell-adhesive proteins and peptides as auxiliary substances, and has a property that the adhered cells are released from the surface by temperature change. Release of cells from temperature-responsive polymers is caused by changes in the solubility of polymer chains in the medium due to temperature changes, changes between the hydrophilicity and hydrophobicity of the polymer surface, or changes in the ionic state of the polymer surface, etc. Can do. Therefore, a polymer in which at least one of these changes occurs can be used as a temperature-responsive polymer. When the cells are released from the temperature-responsive polymer, the cell adhesion auxiliary substances such as proteins and peptides may be released together, the auxiliary substances may not be released, and the auxiliary substances are released at different timings. May be.
例えば、高温において疎水性となり相分離し、低温において溶解する、いわゆる下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を示すポリマーを用いることができる。ＬＣＳＴを示す温度応答性ポリマーの例としては、ポリ（Ｎ−置換アクリルアミド）、ポリ（Ｎ−置換メタクリルアミド）、ポリエーテル類及びメチルセルロース等がある。また、低温において疎水性となり相分離し、高温において溶解する、いわゆる上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を示すポリマーを用いることもできる。ＵＣＳＴを示す温度応答性ポリマーの例としては、双極性高分子であるスルホベタインポリマー等がある。目的に応じてどちらのタイプの温度応答性ポリマーを用いてもよい。 For example, a polymer exhibiting a so-called lower critical solution temperature (LCST) that becomes hydrophobic at high temperatures and phase-separates and dissolves at low temperatures can be used. Examples of temperature responsive polymers exhibiting LCST include poly (N-substituted acrylamide), poly (N-substituted methacrylamide), polyethers and methylcellulose. In addition, a polymer exhibiting a so-called upper critical solution temperature (UCST) that becomes hydrophobic at low temperatures and phase-separates and dissolves at high temperatures can be used. Examples of temperature-responsive polymers exhibiting UCST include sulfobetaine polymers that are bipolar polymers. Either type of temperature responsive polymer may be used depending on the purpose.
温度応答性ポリマー１２１の細胞接着スポット１１２への固定はどのようにして行ってもよい。細胞接着スポット１１２がガラス又はシリコン等からなる場合には、例えばシリコンと反応するシランカップリング剤等を用いて固定すればよい。具体的には、末端にアミノ基又はカルボキシル基等を有する温度応答性ポリマー１２１を重合した後、温度応答性ポリマー１２１の末端をアルコキシルシラン等により修飾し、修飾した温度応答性ポリマー１２１を細胞接着スポット１１２と反応させればよい。また、細胞接着スポット１１２に予めω−アミノプロピルテトラアルコキシシラン等のシランカップリング剤をリンカーとして導入した後、導入したリンカーと温度応答性ポリマー１２１とを反応させることにより、温度応答性ポリマー１２１を固定してもよい。 The temperature-responsive polymer 121 may be fixed to the cell adhesion spot 112 in any way. When the cell adhesion spot 112 is made of glass, silicon, or the like, it may be fixed using, for example, a silane coupling agent that reacts with silicon. Specifically, after polymerizing the temperature-responsive polymer 121 having an amino group or a carboxyl group at the terminal, the terminal of the temperature-responsive polymer 121 is modified with alkoxyl silane or the like, and the modified temperature-responsive polymer 121 is attached to the cell. What is necessary is just to make it react with the spot 112. FIG. In addition, after introducing a silane coupling agent such as ω-aminopropyltetraalkoxysilane in advance into the cell adhesion spot 112 as a linker, the introduced linker and the temperature responsive polymer 121 are reacted to thereby change the temperature responsive polymer 121. It may be fixed.
さらに、シランカップリング剤を介在させて重合開始剤を、処理基板１０１の露出部分に導入した後、導入した重合開始剤を用いて温度応答性ポリマー１０３を重合してもよい。具体的には、まずリンカーとして３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を、細胞接着スポット１１２に導入する。この後、４，４’−アゾビス（２−シアノ吉草酸）クロライド等の酸クロライド基を有する重合開始剤をシランカップリング剤のアミノ基と反応させ、重合開始剤をカップリングする。カップリングされた重合開始剤によりＮ−イソプロピルアクリルアミド等の温度応答性を発現するモノマーを重合して温度応答性ポリマー１２１を形成すればよい。リンカーのアミノ基と重合開始剤のカルボキシル基とを反応させる例を示したが、これに限らずどのようにしてリンカーと重合開始剤とを結合させてもよい。 Furthermore, after introducing a polymerization initiator into the exposed portion of the processing substrate 101 with a silane coupling agent interposed therebetween, the temperature-responsive polymer 103 may be polymerized using the introduced polymerization initiator. Specifically, first, a silane coupling agent having an amino group such as 3-aminopropyltrimethoxysilane as a linker is introduced into the cell adhesion spot 112. Thereafter, a polymerization initiator having an acid chloride group such as 4,4'-azobis (2-cyanovaleric acid) chloride is reacted with the amino group of the silane coupling agent to couple the polymerization initiator. A temperature-responsive polymer 121 may be formed by polymerizing a monomer exhibiting temperature responsiveness such as N-isopropylacrylamide with the coupled polymerization initiator. Although the example in which the amino group of the linker is reacted with the carboxyl group of the polymerization initiator has been shown, the present invention is not limited thereto, and the linker and the polymerization initiator may be combined in any manner.
シリコンと反応する部位を有する（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシヘキシルトリエトキシシラン又は２−フェニル−２−[（２，２，６，６−テトラメチルピペリジノ）オキシ]オクチルトリエトキシシラン等を用いれば、リンカーを用いることなく重合開始剤を細胞接着スポット１１２に導入できる。この場合には、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法等により温度応答性ポリマー１２１を形成すればよい。なお、ＡＴＲＰ法に限らず熱重合法、光重合法又は付加開裂移動型（ＲＡＦＴ）重合法等のどのような重合方法を用いてポリマーの重合を行ってもよい。さらに、導入する開始剤を適宜選択することによりアニオン重合又はカチオン重合を用いてもよい。 (2-Bromo-2-methyl) propionyloxyhexyltriethoxysilane or 2-phenyl-2-[(2,2,6,6-tetramethylpiperidino) oxy] octyltriethoxy having a site that reacts with silicon If silane or the like is used, the polymerization initiator can be introduced into the cell adhesion spot 112 without using a linker. In this case, the temperature-responsive polymer 121 may be formed by an atom transfer radical polymerization (ATRP) method or the like. In addition, you may superpose | polymerize a polymer not only using ATRP method but what kind of polymerization methods, such as a thermal-polymerization method, a photopolymerization method, or an addition cleavage transfer type | mold (RAFT) polymerization method. Furthermore, anionic polymerization or cationic polymerization may be used by appropriately selecting an initiator to be introduced.
さらに、温度応答性ポリマー１２１は共有結合により細胞接着スポット１１２に固定されている必要はなく、アミノ基とカルボキシル基との間等に生じるイオン結合により固定されていたり、疎水結合等により固定されていたりしてもよい。また、細胞を遊離させる際に温度応答性ポリマー１２１も細胞接着スポット１１２から剥離する構成としてもよい。 Furthermore, the temperature-responsive polymer 121 does not need to be fixed to the cell adhesion spot 112 by a covalent bond, and is fixed by an ionic bond generated between an amino group and a carboxyl group or by a hydrophobic bond. Or you may. Further, the temperature-responsive polymer 121 may be peeled off from the cell adhesion spot 112 when the cells are released.
なお、細胞接着スポット１１２に温度応答性ポリマー１２１を固定することにより、標的物質を導入した細胞の回収が容易となるが、細胞接着スポット１１２の表面に温度応答性ポリマー１２１が固定されている必要はない。単純に疎水性の表面としたり、細胞接着性のタンパク質を固定したりしてもよい。また、細胞の表面に特異的に存在する物質の認識物質を固定してもよい。例えば、細胞の表面抗原を認識する抗体を固定してもよい。 In addition, by fixing the temperature-responsive polymer 121 to the cell adhesion spot 112, it becomes easy to collect the cells into which the target substance has been introduced. However, the temperature-responsive polymer 121 needs to be fixed to the surface of the cell adhesion spot 112. There is no. A simple hydrophobic surface or a cell-adhesive protein may be immobilized. In addition, a substance that specifically recognizes a cell surface may be immobilized. For example, an antibody that recognizes a cell surface antigen may be immobilized.
細胞非接着性ポリマー１２５は、基材１１１及びスポット形成材料１１３よりも細胞との相互作用が小さく、細胞の非特異的な接着が少ない材料であればどのような材料であってもよい。一般的に細胞は親水性の表面には接着しにくいため、細胞非接着性ポリマー１２５は、基材１１１及びスポット形成材料１１３よりも親水性が高いポリマーが好ましい。例えば、ポリ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等の合成リン脂質系ポリマー、ポリ２−エトキシアクリレート又はポリエチレングリコール等とすればよい。合成リン脂質系ポリマーは、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと２−（メタ）アクリロイルオキシエチルイソシアネートとの共重合体等であってもよい。ポリエチレングリコールは、ポリ（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール又はポリ（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコールアルキルエステル等とすればよい。 The cell non-adhesive polymer 125 may be any material as long as it has a smaller interaction with cells and less non-specific cell adhesion than the base material 111 and the spot forming material 113. In general, since cells are difficult to adhere to a hydrophilic surface, the cell non-adhesive polymer 125 is preferably a polymer having higher hydrophilicity than the base material 111 and the spot forming material 113. For example, a synthetic phospholipid polymer such as poly-2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, poly-2-ethoxyacrylate, polyethylene glycol, or the like may be used. The synthetic phospholipid-based polymer may be a copolymer of methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and 2- (meth) acryloyloxyethyl isocyanate. Polyethylene glycol may be poly (meth) acrylic acid polyethylene glycol or poly (meth) acrylic acid polyethylene glycol alkyl ester or the like.
また、ポリビニルアルコールと、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリスチレンスルホン酸の水溶性塩、ポリアクリル酸の水溶性塩、ポリグルタミン酸の水溶性塩及びポリビニルピロリドン等のうちの少なくとも１つとからなる混合高分子の含水ゲル成型物等を用いてもよい。ポリ（ＭＰＣ）等の双性構造イオンのポリマー、ポリ（Ｏ−メタクリロイル−Ｌ−セリン）等の両性イオン構造のポリマー並びにポリアクリル酸及びポリエチレンイミン等のポリイオンコンプレックスを用いてもよい。さらに、これらのポリマーセグメントに、ランダム、ブロック又はグラフト状に他の共重合セグメントが含まれている構成としてもよい。合成ポリマーに限らず細胞非接着性のタンパク質等の天然高分子を用いてもよい。細胞非接着性のタンパク質としては、例えばアルブミンを用いることができる。また、親水性にするのではなく、含フッ素ポリマー等を用いて高撥水性の表面とすることにより細胞非接着性を実現してもよい。この他、細胞又は微生物等を細胞接着スポット１１２以外の部分に吸着させることにより、細胞接着スポット１１２以外の部分をターゲット細胞が吸着しにくい表面としてもよい。 Also, a mixed polymer comprising polyvinyl alcohol and at least one of polyethylene glycol, polyacrylamide, water soluble salt of polystyrene sulfonic acid, water soluble salt of polyacrylic acid, water soluble salt of polyglutamic acid, polyvinyl pyrrolidone and the like. A hydrogel molded product or the like may be used. Polymers of zwitter structure ions such as poly (MPC), polymers of zwitterion structures such as poly (O-methacryloyl-L-serine), and polyion complexes such as polyacrylic acid and polyethyleneimine may be used. Furthermore, it is good also as a structure by which the other copolymer segment is contained in these polymer segments at random, a block, or the graft form. Not only synthetic polymers but also natural polymers such as non-cell-adhesive proteins may be used. For example, albumin can be used as the non-cell-adhesive protein. In addition, cell non-adhesiveness may be realized by making the surface highly hydrophobic using a fluorine-containing polymer or the like instead of making it hydrophilic. In addition, by adsorbing cells, microorganisms, or the like to a portion other than the cell adhesion spot 112, a portion other than the cell adhesion spot 112 may be a surface on which the target cell is difficult to adsorb.
細胞非接着性ポリマー１２５の固定は、温度応答性ポリマー１２１の固定と同様に、リンカーを用いる方法、表面に導入した開始剤を用いて重合する方法等により行うことができる。また、イオン結合、又は疎水結合等により固定してもよい。 Immobilization of the cell non-adhesive polymer 125 can be performed by a method using a linker, a method of polymerizing using an initiator introduced on the surface, and the like, similar to the fixation of the temperature-responsive polymer 121. Moreover, you may fix by an ionic bond or a hydrophobic bond.
なお、処理基板１０１の細胞接着スポット１１２以外の部分に細胞非接着性ポリマー１２５を固定することにより、細胞接着スポット１１２以外の部分へ細胞が接着しにくくできるが、必ずしも細胞非接着性ポリマー１２５を固定する必要はない。スポット形成材料をチタン合金又は酸化チタン等の細胞非接着性の材料としたり、界面活性剤等の低分子物質を利用したりして、処理基板１０１の細胞接着スポット１１２以外の部分を細胞非接着性としてもよい。 In addition, by fixing the cell non-adhesive polymer 125 to a portion other than the cell adhesion spot 112 of the treatment substrate 101, it is possible to make it difficult for cells to adhere to a portion other than the cell adhesion spot 112. There is no need to fix. The spot forming material is made of a non-cell-adhesive material such as titanium alloy or titanium oxide, or a low-molecular substance such as a surfactant is used, so that the portion other than the cell-adhesion spot 112 of the processing substrate 101 is not cell-adhered. It may be sex.
細胞接着スポット１１２に固定する抗体１２２は、標的物質を担持したマイクロセル１３１の表面に存在する抗原を特異的に認識するものであればよい。細胞接着スポット１１２に抗体１２２を固定し、マイクロセル１３１の表面に抗原を設ける例を示したが、細胞接着スポット１１２に抗原を固定し、マイクロセル１３１の表面に抗体を設ける構成としてもよい。また、特異的な認識をする物質であれば同様に用いることができ抗原と抗体に代えて、糖とレクチン、リガンドとレセプター等の組み合わせとしてもよい。 The antibody 122 immobilized on the cell adhesion spot 112 may be any antibody that specifically recognizes the antigen present on the surface of the microcell 131 carrying the target substance. Although the example in which the antibody 122 is fixed to the cell adhesion spot 112 and the antigen is provided on the surface of the microcell 131 has been described, the antigen may be fixed to the cell adhesion spot 112 and the antibody may be provided on the surface of the microcell 131. In addition, any substance that specifically recognizes can be used in the same manner, and instead of antigen and antibody, a combination of sugar and lectin, ligand and receptor or the like may be used.
抗体１２２の固定は、既知の方法により行えばよい。例えば、２官能性のリンカー等を用いて固定することができる。また、温度応答性ポリマー１２１に反応性の官能基を導入して、これを用いて抗体を固定してもよい。抗体以外の認識物質を用いる場合も同様にして固定することができる。 The antibody 122 may be fixed by a known method. For example, it can be fixed using a bifunctional linker or the like. Alternatively, a reactive functional group may be introduced into the temperature-responsive polymer 121 and used to immobilize the antibody. When a recognition substance other than an antibody is used, it can be immobilized in the same manner.
標的物質を担持したマイクロセル１３１は、標的物質を担持でき、細胞に取り込まれればどのような構成としてもよい。例えば、遺伝子等の標的物質を導入した細胞をマイクロセル化して形成すればよい（Katoh et al. BMC Biotechnology 2010, 10:37等を参照）。また、リポソーム等を用いることもできる。マイクロセルは、表面に認識物質を有していることが好ましい。本明細書において認識物質とは、特定の対となる認識物質を認識するか、特定の対となる認識物質により認識され、特異的に結合する物質である。認識物質と対となる認識物質との例としては、抗原と抗体との組み合わせ、糖鎖とレクチンとの組み合わせ、各種のリガンドとレセプターとの組み合わせ等が挙げられる。マイクロセルの素材は磁性微粒子、高分子微粒子、ウイルスベクター、高分子ミセル、高分子微粒子、ナノゲル等を用いることができる。なお、標的物質は、マイクロセル１３１の内部に包摂されていても、表面に固定されていてもよい。 The microcell 131 carrying the target substance may have any configuration as long as it can carry the target substance and is taken up by the cells. For example, a cell into which a target substance such as a gene has been introduced may be formed into a microcell (see, for example, Katoh et al. BMC Biotechnology 2010, 10:37). Liposomes and the like can also be used. The microcell preferably has a recognition substance on the surface. In this specification, a recognition substance is a substance that recognizes a specific pair of recognition substances or is recognized by a specific pair of recognition substances and specifically binds to the recognition substance. Examples of the recognition substance paired with the recognition substance include a combination of an antigen and an antibody, a combination of a sugar chain and a lectin, a combination of various ligands and a receptor, and the like. As the microcell material, magnetic fine particles, polymer fine particles, virus vectors, polymer micelles, polymer fine particles, nanogels, and the like can be used. The target substance may be included in the microcell 131 or may be fixed on the surface.
マイクロセル１３１の大きさは特に限定されないが、ターゲット固定結合部位への結合、及びターゲット細胞への取り込みの観点から、０．１μｍ〜５μｍ程度が好ましく、０．５μｍ〜３μｍ程度がより好ましい。マイクロセル１３１をこの程度の大きさとすることにより、レーザ光ピンセットによる操作が容易であるという利点も有している。レーザ光ピンセットを用いることにより、マイクロセル１３１を細胞接着スポット１１２に集め、確実に固定することが容易にできる。レーザ光ピンセットはどのような構成としてもよいが、６００ｎｍ〜１１００ｎｍ程度の波長のものがレーザ装置の取り扱いの容易さやマイクロカプセルに光エネルーギーによるダメージが少ないことから好ましい。 The size of the microcell 131 is not particularly limited, but is preferably about 0.1 μm to 5 μm, more preferably about 0.5 μm to 3 μm, from the viewpoint of binding to the target fixed binding site and uptake into the target cell. By setting the microcell 131 to such a size, there is an advantage that the operation by laser light tweezers is easy. By using the laser beam tweezers, the microcell 131 can be easily collected and fixed to the cell adhesion spot 112. The laser light tweezers may have any configuration, but those having a wavelength of about 600 nm to 1100 nm are preferable because the laser device is easy to handle and the microcapsules are less damaged by light energy.
マイクロセル１３１は特異的に認識させて細胞接着スポット１１２に固定する必要はなく、イオン結合、又は疎水結合等により細胞接着スポット１１２に固定してもよい。また、マイクロセル１３１の表面に存在するアミノ基又はカルボキシル基等を用いて、細胞接着スポット１１２に共有結合させてもよい。 The microcell 131 does not need to be specifically recognized and fixed to the cell adhesion spot 112, but may be fixed to the cell adhesion spot 112 by ionic bond or hydrophobic bond. Alternatively, an amino group or a carboxyl group present on the surface of the microcell 131 may be used to covalently bond to the cell adhesion spot 112.
標的物質は、遺伝子に限らず、細胞１４１に何らかの機能導入できる物質であればよい。例えば、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ＤＮＡベクター、染色体、染色体断片、染色体ベクター等を用いることができる。この場合、数ｋｂのＤＮＡ断片から数Ｍｂの染色体断片、数十Ｍｂの染色体まで細胞に導入することができる。ＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であてもよい。また、タンパク質、ペプチド、又はウイルスベクター等であってもよい。 The target substance is not limited to a gene, and may be any substance that can introduce some function into the cell 141. For example, DNA, DNA fragment, DNA vector, chromosome, chromosome fragment, chromosome vector, etc. can be used. In this case, a DNA fragment of several kb, a chromosome fragment of several Mb, and a chromosome of several tens of Mb can be introduced into the cell. The DNA may be double stranded or single stranded. Further, it may be a protein, peptide, virus vector or the like.
これらの標的物質は、マイクロセルに担持させるのではなく、細胞接着スポット１１２に直接固定してもよい。この場合、細胞接着スポット１１２には、標的物質を特異的に認識する抗体等の認識物質を固定すればよい。また、標的物質が、細胞接着スポット１１２に、イオン結合又は疎水結合するような構成としたり、標的物質に存在する官能基を用いて共有結合する構成としたりしてもよい。 These target substances may be directly fixed to the cell adhesion spot 112 instead of being supported on the microcell. In this case, a recognition substance such as an antibody that specifically recognizes the target substance may be immobilized on the cell adhesion spot 112. Further, the target substance may be configured to be ionically or hydrophobically bonded to the cell adhesion spot 112, or may be configured to be covalently bonded using a functional group present in the target substance.
細胞１４１は特に限定されない。血球系の細胞、間葉系細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ（人工多能性幹細胞）細胞等のいずれも用いることができる。 The cell 141 is not particularly limited. Any of blood cells, mesenchymal cells, ES cells (embryonic stem cells), iPS (artificial pluripotent stem cells) cells and the like can be used.
細胞１４１を穿孔するパルスレーザ光１５１は特に限定されないが、ナノ秒パルスレーザ光でよい。但し、パルス幅がさらに短いピコ秒パルスレーザ光又はフェムト秒パルスレーザ光を用いてもよい。本明細書において、ナノ秒パルスレーザ光とは、パルス幅が１ｎ秒（１×１０-9秒）以上、１μ秒（１×１０-6秒）未満のパルスレーザ光であり、ピコ秒パルスレーザ光とは、パルス幅が１ｐ秒（１×１０-12秒）以上、１ｎ秒（１×１０-9秒）未満のパルスレーザ光であり、フェムト秒パルスレーザ光とは、パルス幅が１ｆ秒（１×１０-15秒）以上、１ｐ秒（１×１０-12秒）未満のパルスレーザ光である。特に、パルス幅が５×１０-11秒〜５×１０-7秒程度のものが好ましく、１×１０-10秒〜１×１０-7秒程度のものがより好ましく、１×１０-9秒〜×１×１０-8秒程度のものがさらに好ましい。 The pulse laser beam 151 for perforating the cell 141 is not particularly limited, but may be a nanosecond pulse laser beam. However, a picosecond pulse laser beam or a femtosecond pulse laser beam having a shorter pulse width may be used. In this specification, the nanosecond pulse laser beam is a pulse laser beam having a pulse width of 1 nsec (1 × 10 −9 sec) or more and less than 1 μsec (1 × 10 −6 sec), and is a picosecond pulse laser. Light is pulse laser light with a pulse width of 1 p seconds (1 × 10 −12 seconds) or more and less than 1 n seconds (1 × 10 −9 seconds), and femtosecond pulse laser light has a pulse width of 1 f seconds. The pulse laser light is (1 × 10 −15 seconds) or more and less than 1 p seconds (1 × 10 −12 seconds). In particular, the pulse width is preferably about 5 × 10 −11 seconds to 5 × 10 −7 seconds, more preferably about 1 × 10 −10 seconds to 1 × 10 −7 seconds, and more preferably 1 × 10 −9 seconds. More preferable is about ~ 1 x 10-8 seconds.
パルスレーザ光１５１の照射は、１点に１回の照射でもよいが、複数回照射してもよい。この場合、細胞１４１の外縁に沿って位置をずらしながら照射してもよい。複数回の照射をする場合には、細胞１４１への熱ダメージを抑えるために、ある程度の間隔をおいて照射することが好ましい。例えば、数ｍ秒から数百ｍ秒の間隔をおいて照射を行うことが好ましい。 Irradiation with the pulse laser beam 151 may be performed once per point, or may be performed a plurality of times. In this case, irradiation may be performed while shifting the position along the outer edge of the cell 141. In the case of performing irradiation a plurality of times, it is preferable to irradiate with a certain interval in order to suppress thermal damage to the cell 141. For example, the irradiation is preferably performed at intervals of several milliseconds to several hundred milliseconds.
パルスレーザ光１５１の波長は特に限定されないが、細胞膜の穿孔性という観点からは、波長がある程度短い方がよい。一方、核へのダメージを低減する観点から波長がある程度長い方が好ましい。但し、レーザ光のスポット径を小さくする観点からは波長が長すぎないことが好ましい。具体的には、３００ｎｍ〜６８０ｎｍ程度の波長範囲のレーザ光を用いることができる。例えば、紫外レーザを用いることができる。具体的には、波長が３３７ｎｍの窒素レーザ、３４９ｎｍのＮｄ（ネオジウム）：ＹＬＦ（イットリウム−リチウム−フロライド）レーザ、３５５ｎｍのＮｄ（ネオジウム）：ＹＡＧ（イットリウム−アルミニウム−ガーネット）レーザ等を用いることができる。また、紫外レーザ光に限らず、青紫色、青色、緑色、赤色等のレーザ光を用いることもできる。 The wavelength of the pulsed laser beam 151 is not particularly limited, but it is preferable that the wavelength is short to some extent from the viewpoint of the piercing property of the cell membrane. On the other hand, it is preferable that the wavelength is long to some extent from the viewpoint of reducing damage to the nucleus. However, the wavelength is preferably not too long from the viewpoint of reducing the spot diameter of the laser beam. Specifically, laser light having a wavelength range of about 300 nm to 680 nm can be used. For example, an ultraviolet laser can be used. Specifically, a nitrogen laser having a wavelength of 337 nm, a 349 nm Nd (neodymium): YLF (yttrium-lithium-fluoride) laser, a 355 nm Nd (neodymium): YAG (yttrium-aluminum-garnet) laser, or the like may be used. it can. Further, not only ultraviolet laser light but also laser light such as blue-violet, blue, green, and red can be used.
パルスレーザ光１５１は、細胞接着スポット１１２に固定された細胞１４１の外縁部に集光して照射することが好ましい。このようにすれば、ナノ秒パルスレーザを用いても、細胞１４１の核はほとんどダメージを受けない。また、パルスレーザ光１５１は、細胞接着スポット１１２と細胞１４１との界面近傍に焦点を合わせて照射することが好ましい。細胞接着スポット１１２側の細胞膜の外表面に焦点を合わせることがより好ましい。パルスレーザ光１５１の照射は、長焦点の対物レンズの使用等により、観察用光学系３１１と同軸に又は切り替えて、処理基板１０１の上部から照射してもよい。しかし、細胞接着スポット１１２と細胞１４１との界面がある処理基板１０１側から照射することにより、核へのダメージをより小さくすることができる。 The pulsed laser beam 151 is preferably condensed and irradiated on the outer edge of the cell 141 fixed to the cell adhesion spot 112. In this way, even if a nanosecond pulse laser is used, the nucleus of the cell 141 is hardly damaged. In addition, it is preferable that the pulsed laser beam 151 is irradiated with focusing on the vicinity of the interface between the cell adhesion spot 112 and the cell 141. It is more preferable to focus on the outer surface of the cell membrane on the cell adhesion spot 112 side. The pulse laser beam 151 may be irradiated from the upper part of the processing substrate 101 by using a long-focus objective lens or the like, or coaxially with the observation optical system 311 or switched. However, by irradiating from the processing substrate 101 side where the interface between the cell adhesion spot 112 and the cell 141 is present, damage to the nucleus can be further reduced.
パルスレーザ光１５１のスポット径は、融合効率を高くするためには、小さくすることが好ましい。波長が３４９ｎｍ程度の場合には、２μｍ以下としてよく、１μｍ程度又はそれ以下にまで集光してもよい。但し、集光による細胞へのダメージを避けるという観点からは、細胞全体を照射する程度までパルスレーザ光１５１のスポット径を広げることも可能である。細胞全体を照射する程度までパルスレーザ光１５１のスポット径を広げることにより、レーザ光の集中による細胞へのダメージを抑えることができる。この場合にも、細胞１４１に標的物質を導入することが可能である。 The spot diameter of the pulsed laser beam 151 is preferably reduced in order to increase the fusion efficiency. When the wavelength is about 349 nm, the wavelength may be 2 μm or less, and the light may be condensed to about 1 μm or less. However, from the viewpoint of avoiding damage to the cells due to light collection, the spot diameter of the pulsed laser light 151 can be increased to the extent that the entire cell is irradiated. By expanding the spot diameter of the pulse laser beam 151 to such an extent that the whole cell is irradiated, damage to the cell due to the concentration of the laser beam can be suppressed. Also in this case, it is possible to introduce the target substance into the cell 141.
パルスレーザ光の出力は、照射により細胞が破壊されない強さに設定する。パルスレーザ光のスポット径を１μｍ〜２μｍ程度に集光する場合には、パルスレーザ装置の出力（パルスエネルギー）を２９μＪ以下とすればよく、１５μＪ以下としてもよく、６μＪ以下としてもよい。細胞を短時間で確実に穿孔するためには、パルスエネルギーをある程度高くすることが好ましいが、パルスエネルギーが低い場合には照射するパルス数を増やせばよい。 The output of the pulse laser beam is set to a strength at which cells are not destroyed by irradiation. When the spot diameter of the pulse laser beam is focused to about 1 μm to 2 μm, the output (pulse energy) of the pulse laser device may be 29 μJ or less, 15 μJ or less, or 6 μJ or less. In order to reliably perforate the cells in a short time, it is preferable to increase the pulse energy to some extent, but if the pulse energy is low, the number of pulses to be irradiated may be increased.
図５に示すように、観察用光学系３１１とカメラ３１２を有する顕微鏡３０１と、パルスレーザ光源３０２と、制御部３０３とを組み合わせた自動導入装置３００を用いることにより、標的物質の導入を自動化することができる。 As shown in FIG. 5, the introduction of a target substance is automated by using an automatic introduction apparatus 300 that combines a microscope 301 having an observation optical system 311 and a camera 312, a pulse laser light source 302, and a control unit 303. be able to.
以下に、本実施形態の自動導入装置３００の動作を説明する。細胞接着スポットにマイクロセルと細胞とが固定された処理基板１０１をチャンバー３１３内にセットする。まず、ステージ３１４を駆動して、最初の細胞接着スポットについて光学像をデータとして制御部３０３に取り込む。細胞接着スポットに細胞が固定されていない場合には、スキップして次の細胞接着スポットに移動する。細胞接着スポットに細胞が固定されている場合には、画像処理により細胞接着スポットにおける細胞の外縁部の位置を把握し、レーザ光のＸ軸方向、Ｙ軸方向及びＺ軸方向（焦点深さ）の照射位置を決定する。次に、ステージ３１４及び照射用光学系３２１を駆動して、レーザ光の焦点位置を決定した位置に合わせ、パルスレーザ光源３０２を駆動して、パルスレーザ光１５１を照射する。パルスレーザ光１５１の照射位置は、照射用光学系３２１を駆動することにより細胞の外縁に沿って移動させることができる。次に、ステージ３１４を駆動して、次の細胞接着スポットに移動し同様の操作を行う。 Below, operation | movement of the automatic introduction apparatus 300 of this embodiment is demonstrated. The processing substrate 101 in which the microcell and the cell are fixed to the cell adhesion spot is set in the chamber 313. First, the stage 314 is driven, and an optical image of the first cell adhesion spot is taken into the control unit 303 as data. When the cell is not fixed to the cell adhesion spot, it skips and moves to the next cell adhesion spot. When cells are fixed in the cell adhesion spot, the position of the outer edge of the cell in the cell adhesion spot is grasped by image processing, and the X-axis direction, Y-axis direction, and Z-axis direction (focus depth) of the laser beam Determine the irradiation position. Next, the stage 314 and the irradiation optical system 321 are driven to adjust the focal position of the laser light to the determined position, and the pulse laser light source 302 is driven to irradiate the pulse laser light 151. The irradiation position of the pulse laser beam 151 can be moved along the outer edge of the cell by driving the irradiation optical system 321. Next, the stage 314 is driven to move to the next cell adhesion spot and the same operation is performed.
細胞接着スポット内におけるパルスレーザ光の照射位置の調整は、例えばミラーを用いたシステムにより行うことができる。 Adjustment of the irradiation position of the pulsed laser beam in the cell adhesion spot can be performed by a system using a mirror, for example.
なお、基板へのマイクロセルの固定操作、細胞の固定操作等も行えるように、レーザ光ピンセット、細胞の供給部等を設けてもよい。また、導入操作後の細胞の培養、細胞の基板からの剥離等も行えるように、細胞の回収機構等を設けてもよい。 Note that laser light tweezers, a cell supply unit, and the like may be provided so that a micro cell fixing operation, a cell fixing operation, and the like can be performed on the substrate. Further, a cell recovery mechanism or the like may be provided so that the cells can be cultured after the introduction operation, and the cells can be detached from the substrate.
以下において、パルスレーザ光の強度について検討した結果を示す。ガラス基板の表面にＵ９３７細胞を吸着させて、ガラス基板側から、波長３４９ｎｍで１０００Ｈｚのパルスレーザ光をＵ９３７細胞に照射した。パルスレーザ装置（spectra-physics社製：EXPL-349-60-EK1-W）からのパルスレーザ光をスポット径が約２μｍとなるように集光し、１パルスの照射を行った。パルスレーザ光のパルスエネルギーが３０μＪ（ダイオードレーザーポンプ電流が３．０Ａ）の場合には、細胞の破壊が生じた。パルスエネルギーが１６．５μＪ（ダイオードレーザーポンプ電流が２．５Ａ）の場合には、細胞の破壊が生じる場合と、生じない場合が認められた。パルスエネルギーが６μＪ（ダイオードレーザーポンプ電流が２．０Ａ）の場合には細胞の破壊は認められなかった。 Below, the result of having examined the intensity | strength of pulsed laser beam is shown. U937 cells were adsorbed on the surface of the glass substrate, and pulsed laser light having a wavelength of 349 nm and 1000 Hz was irradiated to the U937 cells from the glass substrate side. Pulse laser light from a pulse laser device (manufactured by spectra-physics: EXPL-349-60-EK1-W) was condensed so that the spot diameter was about 2 μm and irradiated with one pulse. When the pulse energy of the pulse laser beam was 30 μJ (diode laser pump current was 3.0 A), cell destruction occurred. When the pulse energy was 16.5 μJ (the diode laser pump current was 2.5 A), it was recognized that cell destruction occurred or not occurred. When the pulse energy was 6 μJ (diode laser pump current was 2.0 A), cell destruction was not observed.
次に、パルスレーザ光の焦点の精度について検討した結果を示す。厚さが０．２１ｍｍのガラス基板の表面に、ローダミンを含む水不溶性のポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）樹脂層を形成した。ＰＩＣ樹脂層は、ローダミンを含むポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ）水溶液を、バーコーターを用いてロール塗装した後、１４５℃で３分間焼き付けた後、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｍｗ＝２５０００）水溶液を、同様にしてロール塗装し、１４５℃で３分間焼き付けることにより形成した。走査型プローブ顕微鏡測定から求めた、得られたＰＩＣ樹脂層の厚さは１μｍであり、３０μｍ×３０μｍの領域における高低差は３０ｎｍ以下であった。 Next, the result of examining the focus accuracy of the pulse laser beam will be shown. A water-insoluble polyion complex (PIC) resin layer containing rhodamine was formed on the surface of a glass substrate having a thickness of 0.21 mm. For the PIC resin layer, a polymethacrylic acid (PMAA) aqueous solution containing rhodamine was roll-coated using a bar coater, baked at 145 ° C. for 3 minutes, and then a polyethyleneimine (PEI, Mw = 25000) aqueous solution was similarly applied. It was formed by roll coating and baking at 145 ° C. for 3 minutes. The thickness of the obtained PIC resin layer obtained from the scanning probe microscope measurement was 1 μm, and the height difference in the region of 30 μm × 30 μm was 30 nm or less.
得られたＰＩＣ樹脂層を疑似細胞膜として、図５に示す装置により、ＸＹステージを走査しながら、４ｎｓのパルスレーザ光を１パルスずつ照射した。パルスレーザ光の波長は３４９ｎｍとし、レーザ光のパルスエネルギーは３０μＪとし、レーザ光径は約１μｍとした。図６に示すように、Ｚ軸方向の位置決め精度が高く、ＰＩＣ樹脂層とガラス基板との界面（焦点高さ±０）及びＰＩＣ樹脂層側に＋０．５μｍ及び＋１．０μｍの位置に焦点を合わせた場合には、ＰＩＣ樹脂膜に径が約１μｍの開口部を形成できた。 The obtained PIC resin layer was used as a pseudo cell membrane, and a pulse laser beam of 4 ns was irradiated one pulse at a time while scanning the XY stage with the apparatus shown in FIG. The wavelength of the pulse laser beam was 349 nm, the pulse energy of the laser beam was 30 μJ, and the laser beam diameter was about 1 μm. As shown in FIG. 6, the positioning accuracy in the Z-axis direction is high, and the focal point is at the position of +0.5 μm and +1.0 μm on the interface (focus height ± 0) between the PIC resin layer and the glass substrate and on the PIC resin layer side. When combined, an opening having a diameter of about 1 μm could be formed in the PIC resin film.
本発明に係る、標的物質導入方法は、高価なフェムト秒パルスレーザ装置を用いることなく、細胞を穿孔して効率良く標的物質を導入でき、細胞への遺伝子の導入等に有用である。 The method for introducing a target substance according to the present invention can efficiently introduce a target substance by perforating cells without using an expensive femtosecond pulse laser device, and is useful for introducing genes into cells.
１０１ 処理基板
１０３ 温度応答性ポリマー
１１１ 基材
１１２ 細胞接着スポット
１１３ スポット形成材料
１２１ 温度応答性ポリマー
１２２ 抗体
１２５ 細胞非接着性ポリマー
１３１ マイクロセル
１４１ 細胞
１５１ パルスレーザ光
３００ 自動導入装置
３０１ 顕微鏡
３０２ パルスレーザ光源
３０３ 制御部
３１１ 観察用光学系
３１２ カメラ
３１３ チャンバー
３１４ ステージ
３２１ 照射用光学系
DESCRIPTION OF SYMBOLS 101 Processing substrate 103 Temperature-responsive polymer 111 Base material 112 Cell adhesion spot 113 Spot formation material 121 Temperature-responsive polymer 122 Antibody 125 Cell non-adhesion polymer 131 Microcell 141 Cell 151 Pulse laser beam 300 Automatic introduction apparatus 301 Microscope 302 Pulse laser Light source 303 Control unit 311 Observation optical system 312 Camera 313 Chamber 314 Stage 321 Irradiation optical system
Claims (13)
前記細胞の外縁部で、前記細胞接着スポット側の位置にパルスレーザ光を照射することにより、前記細胞を穿孔し、前記細胞接着スポットに固定された標的物質を前記細胞に導入する工程とを備え、
前記パルスレーザ光は、波長が３００ｎｍ以上、６８０ｎｍ以下である、標的物質導入方法。 Immobilizing a target substance and cells on a cell adhesion spot on a substrate;
Irradiating a pulse laser beam at a position on the cell adhesion spot side at the outer edge of the cell to pierce the cell and introduce a target substance fixed to the cell adhesion spot into the cell. ,
The method for introducing a target substance , wherein the pulse laser beam has a wavelength of 300 nm or more and 680 nm or less .
前記第１の認識物質を認識する第２の認識物質が、前記細胞接着スポットに固定されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標的物質導入方法。 The target substance is carried on a microcell having a first recognition substance on the surface,
It said first recognition substance second recognition substance recognizes that the are fixed to the cell adhesion spot, a target substance introduction method according to any one of claims 1 to 5.
前記細胞の前記細胞接着スポットへの固定は、前記第１の温度領域において行う、請求項１〜８のいずれか１項に記載の標的物質導入方法。 A temperature-responsive polymer that is in a cell adhesive state in the first temperature region and in a cell non-adhesive state in the second temperature region is fixed to the cell adhesion spot,
Fixed to said cell adhesion spots of the cells is performed in the first temperature region, the target substance introduction method according to any one of claims 1-8.
前記パルスレーザ光の照射は、複数の前記細胞接着スポットのそれぞれに対して順次行う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の標的物質導入方法。 The substrate has a plurality of the cell adhesion spots,
The irradiation of the pulsed laser beam is sequentially performed, the target substance introduction method according to any one of claims 1 to 9 for each of the plurality of the cell adhesion spot.
前記細胞接着スポットの光学像を取得する観察用光学系と、
パルスレーザ光源と、
前記パルスレーザ光源から出射されたパルスレーザ光を、前記細胞に照射する照射用光学系と、
前記光学像を画像処理し、前記細胞接着スポットに固定された細胞の形状を認識し、前記細胞の外縁部で、前記細胞接着スポット側の位置に前記パルスレーザ光が照射され、前記細胞が穿孔されるように、前記照射用光学系及び前記ステージを駆動する制御部とを備え、
前記パルスレーザ光は、波長が３００ｎｍ以上、６８０ｎｍ以下である、標的物質導入装置。 A stage for mounting a substrate on which a target substance and cells are fixed in a cell adhesion spot;
An observation optical system for obtaining an optical image of the cell adhesion spot;
A pulsed laser light source;
An irradiation optical system for irradiating the cell with pulsed laser light emitted from the pulsed laser light source;
The optical image is image-processed, the shape of the cell fixed to the cell adhesion spot is recognized, the pulse laser beam is irradiated to the position on the cell adhesion spot side at the outer edge of the cell, and the cell is perforated. in so that the, and a control unit for driving the illumination optical system and said stage,
The target substance introducing device, wherein the pulsed laser light has a wavelength of 300 nm or more and 680 nm or less .
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