JP6981666B2 - Method of introducing foreign substances into cells using a laser - Google Patents

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Description

本発明は、レーザー光照射によって細胞膜に細孔を形成することにより、細胞内へ外来物質を導入する方法に関する。 The present invention relates to a method for introducing a foreign substance into a cell by forming pores in the cell membrane by laser irradiation.

細胞内に外来遺伝子等を導入することで、新たな形質を有する細胞又は生物の作製や、細胞内に蛍光色素を導入して細胞内の機能を蛍光測定するバイオイメージング解析が行われている。近年研究が進んでいるｉＰＳ（人工多能幹）細胞も任意の分化形質を有する細胞に分化させるために、細胞内への物質導入技術が必須である。 By introducing a foreign gene or the like into a cell, a cell or an organism having a new trait is produced, or a bioimaging analysis is performed in which a fluorescent dye is introduced into the cell to measure the intracellular function by fluorescence. In order to differentiate iPS (artificial pluripotent stem) cells, which have been studied in recent years, into cells having arbitrary differentiation traits, intracellular substance introduction technology is indispensable.

従来、細胞へ遺伝子やタンパク質を導入する方法として、トランスフェクション試薬を用いる方法、ウイルスを用いる方法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ソノポレーション法、リポソーム融合法、マイクロマニピュレーターを用いる方法等が用いられてきた。 Conventionally, as a method for introducing a gene or protein into a cell, a method using a transfection reagent, a method using a virus, an electroporation method, a particle gun method, a sonoporation method, a liposome fusion method, a method using a micromanipulator, etc. have been used. Has been used.

トランスフェクション試薬を用いる方法は、脂溶性の試薬で親水性の遺伝子やタンパク質を覆い、遺伝子やタンパク質が脂質からなる細胞膜を通過できるようにする方法である。導入効率は高いが、すべての細胞に適用できるわけではなく、例えばプライマリー培養細胞、神経細胞、血球細胞、粘菌細胞等には適用することができないという問題があった。また、トランスフェクション試薬は細胞に残ることから細胞毒性や発がん性が危惧されていること、加えて市販のトランスフェクション試薬は導入剤の成分が公開されていないことから、ガン医療や再生医療等の治療目的でヒトに使うことができないし、このようなトランスフェクション試薬を用いて導入改変した植物を使った食品をヒトが摂取するには安全性を確認する必要があるという問題があった。 The method using a transfection reagent is a method of covering a hydrophilic gene or protein with a fat-soluble reagent so that the gene or protein can pass through a cell membrane composed of a lipid. Although the introduction efficiency is high, it cannot be applied to all cells, and there is a problem that it cannot be applied to, for example, primary cultured cells, nerve cells, blood cells, slime mold cells and the like. In addition, since transfection reagents remain in cells, there is concern about cell toxicity and carcinogenicity, and in addition, commercially available transfection reagents do not disclose the components of the introduction agent, so they are used in cancer medicine, regenerative medicine, etc. There is a problem that it cannot be used for humans for therapeutic purposes, and it is necessary to confirm the safety in order for humans to ingest foods using plants introduced and modified using such transfection reagents.

ウイルスを用いる方法は、ウイルスに遺伝子を持たせ、細胞に感染させることで細胞内に導入する方法である。すべての細胞種に応用できず、ウイルスが感染できる細胞だけに使用が限定されるという問題や、ウイルスの一部が細胞に残るので、この方法で改変した細胞を医療又は食品に用いることができないという問題があった。 The method using a virus is a method in which a virus has a gene and is introduced into the cell by infecting the cell. The problem that it cannot be applied to all cell types and its use is limited to cells that can be infected with the virus, and because a part of the virus remains in the cells, the cells modified by this method cannot be used for medical treatment or food. There was a problem.

エレクトロポレーション法は、細胞に一過的に電流を流すことで細胞膜に細孔を形成し、細胞膜に接触させた液体中の遺伝子やタンパク質を細胞内に導入する方法である。操作は比較的簡単であるが、専用の装置が必要であること、細胞の生存率が１０〜５０％と低いこと、多量の細胞と多量の外来物質が必要となること、さらに導入効率が１×１０−４％以下と低いこと等の問題があった。The electroporation method is a method in which a pore is formed in a cell membrane by transiently passing an electric current through the cell, and a gene or protein in a liquid in contact with the cell membrane is introduced into the cell. The operation is relatively simple, but a dedicated device is required, the cell survival rate is as low as 10 to 50%, a large amount of cells and a large amount of foreign substances are required, and the introduction efficiency is 1. There was a problem that it was as low as × 10 -4% or less.

パーティクルガン法は主に植物細胞に用いられており、金属粒子に遺伝子などを付着させ、専用の銃によって高速で細胞を通過させる間に導入する方法である。導入効率が１×１０−７％以下程度と低く、また生存率も２０％以下と低いという問題があった。The particle gun method is mainly used for plant cells, and is a method of attaching genes to metal particles and introducing them while passing the cells at high speed with a dedicated gun. There was a problem that the introduction efficiency was as low as 1 × 10-7 % or less, and the survival rate was as low as 20% or less.

ソノポレーション法は超音波で細胞膜に穴をあけ、外液にある遺伝子などを穴が閉じるまでの間に導入する方法である。導入効率が１×１０−７％以下程度と低く、また生存率も２０％以下と低いという問題があった。The sonoporation method is a method in which a hole is made in the cell membrane by ultrasonic waves and genes and the like in the external fluid are introduced until the hole is closed. There was a problem that the introduction efficiency was as low as 1 × 10-7 % or less, and the survival rate was as low as 20% or less.

リポソーム融合法は、脂質からなるリポソーム（小胞）内部に遺伝子やタンパク質を入れ、細胞とリポソームを膜融合させることで、リポソーム内部の遺伝子やタンパク質を細胞に導入する方法である。汎用性及び簡便性が高いが、リポソームの調製が難しく、準備に時間がかかるという問題があった。 The liposome fusion method is a method of introducing genes and proteins inside liposomes into cells by inserting genes and proteins into liposomes (vesicles) made of lipids and membrane-fusing the cells with the liposomes. Although it is highly versatile and convenient, there is a problem that it is difficult to prepare liposomes and it takes time to prepare them.

マイクロマニピュレーターを用いる方法は、マイクロマニピュレーターを用いて細胞に直接微小注射して外来物質を導入する方法である。ねらった１細胞への古典的な物理的導入方法であり卵細胞のような比較的サイズの大きな細胞で利用されている。しかしながら、高度な操作技術が要求されると共に導入に時間がかるという問題や、導入効率及び生存率はその導入作業を行う人の技術次第という問題や、多数の細胞（例えば１０個の細胞）への導入は極めて時間と労力がかかるという問題があった。 The method using a micromanipulator is a method of introducing a foreign substance by directly injecting a microinjection into a cell using the micromanipulator. It is a classical method of physical introduction into a single cell, and is used in relatively large cells such as egg cells. However, there is a problem that advanced operation technology is required and it takes time to introduce, the problem that introduction efficiency and survival rate depend on the skill of the person who performs the introduction work, and a large number of cells (for example, 10 cells). There was a problem that the introduction was extremely time-consuming and labor-intensive.

また、細胞へ遺伝子やタンパク質を導入する方法として、レーザー光照射により細胞膜に孔を形成する方法も用いられている。 Further, as a method for introducing a gene or protein into a cell, a method for forming a pore in the cell membrane by laser light irradiation is also used.

例えば、細胞あるいは生組織に光ファイバーを通してレーザー光を照射し、照射された細胞の、細胞壁及び／又は細胞膜あるいは細胞全体を、切断、除去又は開孔し、該照射部位を通して前記細胞及び／又は生組織内へ外来物質を導入する方法（特許文献１参照）や、生細胞の細胞表面の一部に外来物質を担持した小粒子を置き、該細胞表面の一部にレーザー光を照射し加工することにより細胞壁及び／又は細胞膜に穿孔を設けると同時に外来物質を前記生細胞内へ導入する方法（特許文献２参照）が開示されているが、細胞壁及び／又は細胞膜に穿孔が生じる程の強いレーザーを細胞に直接照射するために、レーザー光を照射した細胞における損傷が大きくなるおそれがあった。さらに、細胞は立体的で複雑な３次元構造を有し、しかも常に刻々と形態を変化させており、細胞膜の一定の場所を狙ってレーザー光を照射することは難しいため、特定のシングル細胞をねらって物質を導入することが難しいという問題があった。 For example, a cell or living tissue is irradiated with laser light through an optical fiber, the cell wall and / or the cell membrane or the entire cell of the irradiated cell is cut, removed or perforated, and the cell and / or living tissue is cut through the irradiation site. A method of introducing a foreign substance into the cell (see Patent Document 1), or placing small particles carrying a foreign substance on a part of the cell surface of a living cell and irradiating a part of the cell surface with laser light for processing. Discloses a method of introducing a foreign substance into a living cell at the same time as forming a perforation in the cell wall and / or the cell membrane (see Patent Document 2). Since the cells are directly irradiated, there is a risk that the damage to the cells irradiated with the laser beam will be large. Furthermore, since cells have a three-dimensional and complicated three-dimensional structure, and the morphology is constantly changing, it is difficult to irradiate a certain place on the cell membrane with laser light. There was a problem that it was difficult to introduce the substance with the aim.

また、細胞を、導入目的物質の存在する液中、ゲル中若しくはゲル表面に配置し、前記液若しくはゲル又は前記細胞にパルスレーザー光を集光させて照射し、それにより生じた衝撃波により前記細胞の細胞膜の構造を一時的に変化させ、前記物質を細胞内に導入する方法（特許文献３参照）が開示されている。しかしながら、微粒子又は微粒子の近くを狙ってレーザー光を照射することは高度な技術を要するほか、導入効率が低く、さらに大型で高価なフェムト秒レーザーを用いる必要があるという問題があった。 Further, the cells are placed in a liquid in which the substance to be introduced is present, in a gel or on the surface of the gel, and the liquid or gel or the cells are irradiated with a pulsed laser beam focused on the cells, and the shock wave generated thereby causes the cells. A method for temporarily changing the structure of the cell membrane of the cell membrane and introducing the substance into the cell (see Patent Document 3) is disclosed. However, irradiating the fine particles or the vicinity of the fine particles with a laser beam requires a high level of technology, has low introduction efficiency, and requires the use of a large and expensive femtosecond laser.

さらに、生体組織において、薬剤を導入する細胞の近傍に該薬剤を定位させ、該細胞の近傍に存在する光吸収体に吸収される波長のレーザー光を照射して、ヒト以外の生物の細胞に薬剤を導入することを特徴とする薬剤導入方法（特許文献４参照）が開示されている。しかしながら、生体組織に直接レーザー光を照射する方法であり、シリンジにより導入する薬剤をレーザー光照射前に生体組織へ注入する必要があるという問題があった。 Furthermore, in a living tissue, the drug is localized in the vicinity of the cell into which the drug is introduced, and laser light having a wavelength absorbed by a light absorber existing in the vicinity of the cell is irradiated to the cells of a non-human organism. A method for introducing a drug, which comprises introducing a drug (see Patent Document 4), is disclosed. However, this is a method of directly irradiating a living tissue with a laser beam, and there is a problem that a drug introduced by a syringe needs to be injected into the living tissue before the laser beam irradiation.

このほか、上面に集光剤からなる薄膜がコーティングされたカバースリップの前記薄膜上に細胞を静置し、導入する外来物質を含有する液体を前記細胞に接触させ、前記細胞に近接した薄膜に対してレーザー光を照射して細胞膜に細孔を形成し、前記細孔から前記外来物質を前記細胞内へ導入する方法（特許文献５、非特許文献１参照）が開示されている。しかしながら、例えば集光剤としてカーボンを用いた場合には、透過光のおよそ１０％はカーボンが吸収してしまい、蛍光観察するにあたって蛍光のロスが生じるという問題があった。 In addition, cells are allowed to stand on the thin film of coverslip coated with a thin film made of a light-collecting agent on the upper surface, and a liquid containing a foreign substance to be introduced is brought into contact with the cells to form a thin film close to the cells. On the other hand, a method of irradiating a cell membrane with laser light to form pores and introducing the foreign substance into the cells from the pores (see Patent Document 5 and Non-Patent Document 1) is disclosed. However, when carbon is used as a light-collecting agent, for example, about 10% of the transmitted light is absorbed by the carbon, and there is a problem that fluorescence loss occurs when observing fluorescence.

また、ａ）一つ以上の細胞を固体表面から有効な距離内の実質的に静止した位置に維持し、及びｂ）前記固体表面に、上記一つ以上の特定の３次元的な位置は前もって認識することなく、該一つ以上の細胞の膜の透過化を誘導するに十分な電磁放射線を指向させ、ここで前記一つ以上の細胞を前記電磁放射線の経路に一致させることを備える一つ以上の細胞を一時的に透過性にする方法（特許文献６参照）が開示されている。しかしながら、細胞膜だけでなく細胞自体に損傷を与えるという問題や、一つの細胞だけを狙って外来物質を導入できないという問題があった。 Also, a) one or more cells are maintained in a substantially stationary position within an effective distance from the solid surface, and b) one or more specific three-dimensional positions are previously placed on the solid surface. One comprising directing sufficient electromagnetic radiation to induce permeabilization of the membrane of the one or more cells without recognition, where the one or more cells are aligned with the path of the electromagnetic radiation. A method for temporarily making the above cells permeable (see Patent Document 6) is disclosed. However, there are problems that not only the cell membrane but also the cells themselves are damaged, and that foreign substances cannot be introduced by targeting only one cell.

ところで、近年は共鳴プラズモン効果を利用したバイオ系解析技術が進められている。例えば、試料中の被検物質を標識物質により標識するとともに捕捉物質により固定化して検出するイムノクロマト分析法において、２種の標識試薬を共鳴プラズモン効果によって発色を増感する方法（特許文献６参照）や、基板と、前記基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層と、前記基板及び前記増強電磁場形成層の上層に形成された保護層とを有する光増強素子を構成するセンサチップを備えたセンサ（特許文献７参照）が開示されている。 By the way, in recent years, bio-based analysis technology using the resonance plasmon effect has been promoted. For example, in an immunochromatographic analysis method in which a test substance in a sample is labeled with a labeling substance and immobilized with a capturing substance for detection, a method of sensitizing color development by a resonance plasmon effect of two types of labeling reagents (see Patent Document 6). Or, light having a substrate, an enhanced electromagnetic field forming layer in which a large number of metal fine particles are dispersed and arranged independently of each other on the surface of the substrate, and a protective layer formed on the upper layer of the substrate and the enhanced electromagnetic field forming layer. A sensor (see Patent Document 7) including a sensor chip constituting the reinforcing element is disclosed.

特開２００２−２８１９７０号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-281970 特開２００２−３２５５７２号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-325572 特開２００５−１６８４９５号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-168495 特開２００５−３３０１９４号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-330194 特開２０１５−１６７５５１号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2015-167551 特開２００９−１６２５５８号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2009-162558 特開２０１４−２２８３２２号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2014-228322

Yumura, S., A novel low-power laser-mediated transfer of foreign molecules into cells. Scientific Reports, 6:22055(2016)Yumura, S., A novel low-power laser-mediated transfer of foreign molecules into cells. Scientific Reports, 6: 22055 (2016)

バイオイメージング解析においては、シングル細胞レベルでの観察が必要となるが、従来の細胞内に外来遺伝子等を導入する方法では、特定のシングル細胞をねらって細胞膜に細孔を形成し、細胞に対して損傷による影響を与えずに物質を高効率、且つ、容易に細胞内へ導入することが困難であった。そこで、本発明の課題は、外来物質を高効率、且つ、容易にシングル細胞内へ導入でき、さらに細胞への損傷による影響が少ない方法を提供することにある。 In bioimaging analysis, observation at the single cell level is required, but in the conventional method of introducing foreign genes into cells, pores are formed in the cell membrane aiming at a specific single cell, and the cells are treated. Therefore, it was difficult to introduce the substance into cells with high efficiency and easily without being affected by damage. Therefore, an object of the present invention is to provide a method capable of introducing a foreign substance into a single cell with high efficiency and easily, and further having less influence due to damage to the cell.

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討する中で、カバースリップの表面を金又は白金の薄膜でコーティングし、前記薄膜上に細胞を静置し、前記細胞に近接した薄膜に対してレーザー光を照射して、前記薄膜にレーザー光を吸収させることで、細胞への損傷による影響が少なく、細胞膜に細孔を形成可能であることを見いだした。さらに、細胞内に導入したい外来物質を含有する液体を細胞に接触させておくことにより、形成した細孔から導入したい外来物質が細胞内に導入されることを見いだし、本発明を完成した。 In earnest studies to solve the above problems, the present inventors coated the surface of coverslip with a thin film of gold or platinum, allowed cells to stand on the thin film, and applied the thin film close to the cells. It was found that by irradiating the thin film with laser light to absorb the laser light, the effect of damage to cells is small and pores can be formed in the cell membrane. Furthermore, they have found that the foreign substance to be introduced into the cell is introduced into the cell by bringing the liquid containing the foreign substance to be introduced into the cell into contact with the cell, and completed the present invention.

すなわち、本発明は、以下に示すとおりのものである。
（１）細胞内への外来物質の導入方法であって、上面に金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属の薄膜がコーティングされたカバースリップの前記薄膜上に細胞を静置し、導入する外来物質を含有する液体を前記細胞に接触させ、前記細胞に近接した薄膜に対してレーザー光を照射して前記薄膜にレーザー光を吸収させることにより前記細胞膜に細孔を形成し、前記細孔から前記外来物質を前記細胞内へ導入することを特徴とする細胞内への外来物質の導入方法。
（２）カバースリップの下面から細胞に近接した薄膜に対してレーザー光を照射することを特徴とする上記（１）記載の細胞内への外来物質の導入方法。
（３）薄膜に対して対物レンズを通してレーザー光を照射することを特徴とする上記（１）又は（２）記載の細胞内への外来物質の導入方法。
（４）レーザー光のスポット径が０．２μｍ〜２μｍであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の細胞内への外来物質の導入方法。
（５）上面に金又は白金の薄膜がコーティングされたカバースリップを用いることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の細胞内への外来物質の導入方法。
（６）薄膜をスパッタ法により形成することを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の細胞内への外来物質の導入方法。
（７）外来物質がＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、糖類、脂質、薬剤、蛍光色素のいずれか１以上の物質であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載の細胞内への外来物質の導入方法。
（８）上記（１）〜（７）のいずれか記載の細胞内への外来物質の導入方法によって得られた形質転換細胞。
（９）上記（１）〜（７）のいずれか記載の細胞内への外来物質の導入方法に用いるための、上面に金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属からなる薄膜がコーティングされたカバースリップ。That is, the present invention is as shown below.
(1) A method for introducing a foreign substance into cells, in which cells are placed on the thin film of coverslip coated with a thin film of any metal selected from gold, platinum, silver and aluminum on the upper surface. Then, the liquid containing the foreign substance to be introduced is brought into contact with the cells, the thin film close to the cells is irradiated with laser light, and the thin film absorbs the laser light to form pores in the cell membrane. , A method for introducing a foreign substance into a cell, which comprises introducing the foreign substance into the cell from the pores.
(2) The method for introducing a foreign substance into a cell according to (1) above, which comprises irradiating a thin film close to the cell from the lower surface of the coverslip with a laser beam.
(3) The method for introducing a foreign substance into a cell according to the above (1) or (2), which comprises irradiating a thin film with a laser beam through an objective lens.
(4) The method for introducing a foreign substance into a cell according to any one of (1) to (3) above, wherein the spot diameter of the laser beam is 0.2 μm to 2 μm.
(5) The method for introducing a foreign substance into a cell according to any one of (1) to (4) above, which comprises using a coverslip coated with a thin film of gold or platinum on the upper surface.
(6) The method for introducing a foreign substance into a cell according to any one of (1) to (5) above, which comprises forming a thin film by a sputtering method.
(7) Any of the above (1) to (6), wherein the foreign substance is one or more of DNA, RNA, protein, polypeptide, amino acid, saccharide, lipid, drug, and fluorescent dye. The method for introducing a foreign substance into the cells described above.
(8) The transformed cell obtained by the method for introducing a foreign substance into the cell according to any one of (1) to (7) above.
(9) A thin film made of any metal selected from gold, platinum, silver and aluminum on the upper surface for use in the method for introducing a foreign substance into a cell according to any one of (1) to (7) above. Coated coverslip.

本発明の細胞内への外来物質の導入方法によれば、細胞への損傷による影響が少なく、外来物質を高効率、且つ、容易にシングル細胞内へ導入することが可能となる。 According to the method for introducing a foreign substance into a cell of the present invention, the effect of damage to the cell is small, and the foreign substance can be easily introduced into a single cell with high efficiency.

（ａ）カバースリップの下面から細胞膜に近接した薄膜に対してレーザー光を照射する方法の説明図である。（ｂ）細胞膜に細孔が形成した様子を示す図である。（ｃ）細孔から外来物質が細胞内に導入した様子を示す図である。(A) It is explanatory drawing of the method of irradiating a thin film close to a cell membrane from the lower surface of a coverslip with a laser beam. (B) It is a figure which shows the appearance that the pore is formed in the cell membrane. (C) It is a figure which shows the state which the foreign substance introduced into the cell from the pore. ガラスボトムディッシュに静置した細胞にレーザーを照射する概略図である。It is a schematic diagram which irradiates a laser to the cell rested in a glass bottom dish. パルスレーザー光照射装置によるパルスレーザー光照射の概略図である。It is a schematic diagram of the pulse laser light irradiation by the pulse laser light irradiation apparatus. （ａ）実施例１における蛍光色素を導入した細胞のコンピューター画像による細胞の観察結果（金の薄膜をコーティングしたカバースリップを用いた場合）を示す図である。（ｂ）実施例１における蛍光色素を導入した細胞の相対蛍光量を示す図である。（ｃ）実施例１における蛍光色素を導入した細胞のコンピューター画像による細胞の観察結果（白金の薄膜をコーティングしたカバースリップを用いた場合）を示す図である。(A) It is a figure which shows the observation result (when the cover slip coated with the thin film of gold was used) by the computer image of the cell which introduced the fluorescent dye in Example 1. FIG. (B) It is a figure which shows the relative fluorescence amount of the cell which introduced the fluorescent dye in Example 1. FIG. (C) It is a figure which shows the observation result (when the cover slip coated with the platinum thin film) by the computer image of the cell which introduced the fluorescent dye in Example 1. 実施例２における蛍光色素を導入した細胞のコンピューター画像による細胞の観察結果（金の薄膜をコーティングしたカバースリップを用いた場合）を示す図である。It is a figure which shows the observation result (when the cover slip coated with the thin film of gold was used) by the computer image of the cell which introduced the fluorescent dye in Example 2. FIG. 実施例３におけるプラスミドを導入した細胞の顕微鏡による蛍光観察結果を示す図である。（ａ）は位相差顕微鏡写真、（ｂ）は同視野の蛍光顕微鏡写真を示す。It is a figure which shows the fluorescence observation result by the microscope of the cell which introduced the plasmid in Example 3. FIG. (A) shows a phase-contrast micrograph, and (b) shows a fluorescence micrograph of the same field of view. 参考例におけるカバースリップの観察結果を示す図である。It is a figure which shows the observation result of coverslip in a reference example.

本発明の細胞内への外来物質の導入方法としては、細胞内への外来物質の導入方法であって、上面に金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属の薄膜がコーティングされたカバースリップの前記薄膜上に細胞を静置し、導入する外来物質を含有する液体を前記細胞に接触させ、前記細胞に近接した薄膜に対してレーザー光を照射して前記薄膜にレーザー光を吸収させることにより前記細胞膜に細孔を形成し、前記細孔から前記外来物質を前記細胞内へ導入することを特徴とする細胞内への外来物質の導入方法であれば特に制限されず、かかる方法により、細胞への損傷による影響が少なく、外来物質を高効率、且つ、容易にシングル細胞内へ導入することが可能となる。 The method for introducing a foreign substance into a cell of the present invention is a method for introducing a foreign substance into a cell, wherein a thin film of any metal selected from gold, platinum, silver and aluminum is coated on the upper surface. The cells are allowed to stand on the thin film of the coverslip, the liquid containing the foreign substance to be introduced is brought into contact with the cells, the thin film close to the cells is irradiated with laser light, and the thin film is irradiated with laser light. The method is not particularly limited as long as it is a method for introducing a foreign substance into a cell, which comprises forming pores in the cell membrane by absorption and introducing the foreign substance into the cell from the pores. Depending on the method, the influence of damage to cells is small, and foreign substances can be easily introduced into single cells with high efficiency.

本発明において、細胞としては、単一の細胞であっても、組織の細胞であっても、培養した複数の細胞でもよく、細胞の種類としては原生生物、動物細胞、植物細胞、細菌、酵母を例示することができる。 In the present invention, the cell may be a single cell, a tissue cell, or a plurality of cultured cells, and the cell type may be a progenitor, an animal cell, a plant cell, a bacterium, or a yeast. Can be exemplified.

原生生物としては、細胞性粘菌、アメーバ、藻類、繊毛虫を例示することができ、細胞性粘菌としては、キイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoideum）の細胞を好適に例示することがでる。動物細胞を用いる場合、由来としてはヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ等の哺乳動物由来を例示することができ、細胞の種類としてはプライマリー細胞、細胞株、受精卵、神経細胞等の哺乳動物細胞を例示することができる。動物細胞を用いる場合には、接着性細胞でも浮遊性細胞でもよいが、接着性細胞を好適に例示することができる。また、植物細胞としては、ニコチアナ・タバカム、シロイヌナズナ由来の細胞を例示することができる。細菌としては、大腸菌、古細菌、マイコプラズマを例示することができる。 As the protozoa, cellular slime molds, amoeba, algae, and ciliates can be exemplified, and as cellular slime molds, cells of Dictyostelium discoideum can be preferably exemplified. When animal cells are used, the origin can be exemplified from mammalian origins such as humans, monkeys, mice, rats, hamsters, rabbits, goats, sheep, horses, pigs and dogs, and the cell types are primary cells. Mammalian cells such as cell lines, fertilized eggs, and nerve cells can be exemplified. When animal cells are used, they may be adhesive cells or floating cells, and adhesive cells can be preferably exemplified. In addition, examples of plant cells include cells derived from Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana. Examples of the bacterium include Escherichia coli, archaea, and mycoplasma.

本発明において、外来物質としては特に制限されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、アミノ酸、糖類、脂質、薬剤、蛍光色素のいずれか１以上の物質であることが好ましく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛍光色素のいずれか１以上の物質であることがより好ましい。また、外来物質としてこれらの物質を単独でも、組み合わせてもよく、また、これらの物質を金属、無機物、有機高分子等の微粒子の表面に結合させて用いてもよい。 In the present invention, the foreign substance is not particularly limited, but is preferably any one or more of DNA, RNA, peptide, amino acid, saccharide, lipid, drug, and fluorescent dye, and any of DNA, RNA, and fluorescent dye. More preferably, it is one or more substances. Further, these substances may be used alone or in combination as foreign substances, or these substances may be used by being bonded to the surface of fine particles such as metals, inorganic substances and organic polymers.

本発明における薄膜は、金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属で形成されていればよく、金又は白金で形成されていることが好ましく、透過性の観点から金で形成されていることがより好ましい。上記金属で形成される薄膜は上記金属の粒子から形成されていてもよい。照射したレーザー光を金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属が吸収することにより、細胞に損傷の影響を与えずに、低い出力のレーザー光で、吸収した位置に近接した細胞膜に細孔を形成することが可能となる。細孔は、細胞が本来持っている細胞膜修復機構によって速やかに閉じられる。金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属のコーティング方法としては、スパッタリングや真空蒸着によりコーティングする方法や、上記金属粒子を塗布してコーティングする方法を例示することができるが、薄膜作製工程の容易性の観点からスパッタリング法であることが好ましい。 The thin film in the present invention may be formed of any metal selected from gold, platinum, silver and aluminum, preferably gold or platinum, and is formed of gold from the viewpoint of permeability. Is more preferable. The thin film formed of the metal may be formed of particles of the metal. By absorbing the irradiated laser light with any metal selected from gold, platinum, silver and aluminum, the cell membrane close to the absorbed position with low power laser light without affecting the cells. It becomes possible to form pores in the aluminum. The pores are rapidly closed by the cell membrane repair mechanism inherent in the cell. As a coating method of any of the metals selected from gold, platinum, silver and aluminum, a method of coating by sputtering or vacuum vapor deposition or a method of applying and coating the above metal particles can be exemplified. The sputtering method is preferable from the viewpoint of ease of manufacturing process.

本発明において、上記薄膜の厚さとしては、５ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは８ｎｍ〜５０ｎｍ、より好ましくは１０ｎｍ〜２０ｎｍを例示することができる。薄膜の厚さが２００ｎｍを超えれば、カバースリップの透明性が低下し、外来物質を導入した細胞の顕微鏡観察を妨げることとなり、５ｎｍ未満であれば、レーザー光を吸収する能力が不十分で、外来物質を導入するために十分な細孔が細胞膜に形成されないこととなる。なお、薄膜の厚さと細胞に細孔を形成するレーザー光の出力とは反比例の関係にあり、薄膜の厚さを薄くすると出力を高める必要があるため、薄膜の厚さは用いるレーザー光の出力に応じて調整することができる。 In the present invention, the thickness of the thin film can be exemplified by 5 nm to 200 nm, preferably 8 nm to 50 nm, and more preferably 10 nm to 20 nm. If the thickness of the thin film exceeds 200 nm, the transparency of the coverslip will decrease, which will hinder the microscopic observation of cells into which foreign substances have been introduced, and if it is less than 5 nm, the ability to absorb laser light will be insufficient. Sufficient pores will not be formed in the cell membrane to introduce foreign substances. The thickness of the thin film is inversely proportional to the output of the laser light that forms pores in the cells, and it is necessary to increase the output if the thickness of the thin film is reduced. Therefore, the thickness of the thin film is the output of the laser light used. It can be adjusted according to.

本発明において、上記薄膜は分光光度計によって測定（５３２ｎｍ）した場合のＯＤ値として、０．００５〜０．１、好ましくは０．０１〜０．０８である。 In the present invention, the thin film has an OD value of 0.005 to 0.1, preferably 0.01 to 0.08, as measured by a spectrophotometer (532 nm).

また、金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属の粒子の平均粒径としては特に制限されないが、２ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは５ｎｍ〜１００ｎｍを挙げることができる。 The average particle size of the particles of any of the metals selected from gold, platinum, silver and aluminum is not particularly limited, but may be 2 nm to 200 nm, preferably 5 nm to 100 nm.

上記薄膜上には、細胞増殖のために必要に応じてコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、エラスチン、その他の細胞外マトリックスをコーティングしてもよい。また、細胞として浮遊性細胞を用いる場合には、ポリリジン、ポリエチレンイミン、スペルミジン、スペルミン、その他のポリカチオンで薄膜の上面をコーティングすることが好ましい。 The thin film may be coated with collagen, gelatin, fibronectin, elastin, or other extracellular matrix as needed for cell proliferation. When floating cells are used as cells, it is preferable to coat the upper surface of the thin film with polylysine, polyethyleneimine, spermidine, spermine, or other polycations.

本発明において、カバースリップの材質としては特に制限されないが、顕微鏡観察をする上で透過性の観点から、ガラス、ポリスチレン、ポリメタクリルアクリルアミドを例示することができる。また、カバースリップの厚さとしては特に制限されないが、０．０５ｍｍ〜０．３ｍｍを例示することができる。 In the present invention, the material of the coverslip is not particularly limited, but glass, polystyrene, and polymethacrylic acrylamide can be exemplified from the viewpoint of transparency in microscopic observation. Further, the thickness of the coverslip is not particularly limited, but 0.05 mm to 0.3 mm can be exemplified.

本発明において、薄膜上に細胞を静置するとは、静止した薄膜上に細胞が置かれた状態にすることを意味する。細胞は立体的で複雑な３次元構造を有し、しかも常に形態を変化させているが、上述のように薄膜上に細胞を静置すると、細胞膜の一部は薄膜と接する状態となる。その結果、薄膜に接する面の細胞膜は平坦となり形態変化がほとんどない状態となり、細胞膜の一定の場所を狙ってレーザー光照射を行うことが容易となる。 In the present invention, placing cells on a thin film means placing the cells on a stationary thin film. The cell has a three-dimensional and complicated three-dimensional structure and constantly changes its morphology. However, when the cell is placed on the thin film as described above, a part of the cell membrane is in contact with the thin film. As a result, the cell membrane on the surface in contact with the thin film becomes flat and there is almost no change in morphology, and it becomes easy to irradiate a certain place of the cell membrane with laser light.

本発明において、細胞を静置し、導入する外来物質を含有する液体を細胞に接触させる方法としては、薄膜上で細胞を培養し、その後上清の培養液を除き、外来物質を含有する培養液を加える方法を例示することができる。多くの動物培養細胞では酵素処理やＥＤＴＡ等の２価カチオンキレート剤を加えることで細胞を培養している基盤から引きはがして懸濁細胞を作製することが一般的であるが、この作業は手間を要する。そのため、上記作業を不要とするため、例えば後述するガラスボトムディッシュに細胞をあらかじめ培養しておき、上清の培養液を除いて外来物質を含む培養液を少量加えればよい。 In the present invention, as a method of allowing the cells to stand still and bringing the liquid containing the foreign substance to be introduced into contact with the cells, the cells are cultured on a thin film, and then the culture medium of the supernatant is removed, and the culture containing the foreign substance is removed. A method of adding the liquid can be exemplified. In many cultured animal cells, it is common to remove the cells from the base in which the cells are cultured by treating them with an enzyme or adding a divalent cation chelating agent such as EDTA to prepare suspended cells, but this work is troublesome. Requires. Therefore, in order to eliminate the above work, for example, cells may be cultured in advance in a glass bottom dish described later, and a small amount of a culture solution containing a foreign substance may be added excluding the culture solution of the supernatant.

このほか、細胞を液体に懸濁し、かかる懸濁液を薄膜上に加え、重力により細胞が薄膜に接着若しくは接触した後、外来物質を含有する液体を懸濁液に滴下若しくは注入し、細胞が外来物質を含有する液体で覆われる状態とする方法や、外来物質を含有する液体に細胞を前もって懸濁し、かかる懸濁液を薄膜上に加え、細胞を薄膜に接着若しくは接触させ、細胞が外来物質を含有する液体で覆われる状態とする方法を例示することができる。かかる方法は、基盤から簡単にはがしやすく、懸濁する方が容易な細胞、例えば粘菌細胞や血球系の細胞の場合に好ましい。さらに、かかる方法においては、細胞数が少ない場合において外来物質を含有する液体が１０μｌ〜３０μｌ程度の少量でよいため、高価若しくは希少な外来物質を用いる場合には好ましい。 In addition, the cells are suspended in a liquid, the suspension is added onto the thin film, the cells adhere to or come into contact with the thin film by gravity, and then a liquid containing a foreign substance is dropped or injected into the suspension to allow the cells to adhere. A method of covering with a liquid containing a foreign substance, or suspending a cell in a liquid containing a foreign substance in advance, adding such a suspension on a thin film, adhering or contacting the cell to the thin film, and the cell is foreign. An example can be exemplified of a method of making the state covered with a liquid containing a substance. Such a method is preferred for cells that are easy to remove from the substrate and easier to suspend, such as slime mold cells and blood cell lineage cells. Further, in such a method, when the number of cells is small, the amount of the liquid containing the foreign substance may be as small as about 10 μl to 30 μl, which is preferable when an expensive or rare foreign substance is used.

導入する外来物質を含有する液体における外来物質の濃度は、導入する外来物質量や細胞の数により適宜調整することができるが、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである。 The concentration of the foreign substance in the liquid containing the foreign substance to be introduced can be appropriately adjusted depending on the amount of the foreign substance to be introduced and the number of cells, but is 1 ng / ml to 10 mg / ml, preferably 0.1 μg / ml to 100 μg. / Ml.

本発明に用いるレーザー光の光源としては特に制限されず、パルスレーザーや、連続波（ＣＷ）レーザーを例示することができるが、パルスレーザーであることが好ましい。 The light source of the laser light used in the present invention is not particularly limited, and a pulse laser or a continuous wave (CW) laser can be exemplified, but a pulse laser is preferable.

本発明に用いる、薄膜に対して照射するレーザー光の波長としては特に制限されないが、３８０ｎｍ〜１１００ｎｍ、好ましくは４５０ｎｍ〜７００ｎｍを例示することができる。レーザー光を照射することにより熱やプラズモン効果によって細胞膜に細孔が形成されるが、４５０ｎｍ〜７００ｎｍとすることで、プラズモン効果を生じやすくさせることが可能となり、レーザー光をより低出力で照射しても細胞膜に細孔が形成される。また、レーザー光の周波数としては０．１ＫＨｚ〜１００ＫＨｚ、好ましくは１ＫＨｚ〜１０ＫＨｚを例示することができ、レーザー光の出力としては、細胞が損傷による影響を受けずに細孔が形成できる範囲であればよく、好ましくは０．１ｍＷ〜２０ｍＷ、より好ましくは０．５ｍＷ〜５ｍＷ、さらに好ましくは０．８ｍＷ〜１．８ｍＷを例示することができる。なお、上述のように薄膜の厚さと細胞に細孔を形成するレーザー光の出力は反比例の関係にあり、薄膜の厚さに応じてレーザー光の出力を調整することができる。 The wavelength of the laser light irradiating the thin film used in the present invention is not particularly limited, but 380 nm to 1100 nm, preferably 450 nm to 700 nm can be exemplified. By irradiating with laser light, pores are formed in the cell membrane due to heat and plasmon effect, but by setting it to 450 nm to 700 nm, it is possible to make the plasmon effect more likely to occur, and the laser light is irradiated at a lower output. However, pores are formed in the cell membrane. Further, the frequency of the laser light can be exemplified by 0.1 KHz to 100 KHz, preferably 1 KHz to 10 KHz, and the output of the laser light is within a range in which pores can be formed without being affected by damage to the cells. It is preferable, preferably 0.1 mW to 20 mW, more preferably 0.5 mW to 5 mW, and further preferably 0.8 mW to 1.8 mW. As described above, the thickness of the thin film and the output of the laser beam forming pores in the cells are in an inversely proportional relationship, and the output of the laser beam can be adjusted according to the thickness of the thin film.

レーザー光の照射回数は特に制限されず、導入したい外来物質の量、外来物質の種類に応じて１回でも複数回でもよい。また、複数の外来物質を細胞内に導入する場合は、導入する複数の外来物質を含有する液体を細胞膜に接触させて１回のレーザー光照射で細胞内に導入してもよく、レーザー光照射ごとに導入する外来物質を含有する液体を置換して、それぞれ細胞膜に接触させて、複数回のレーザー光照射で細胞内に順に導入してもよい。 The number of times of irradiation of the laser beam is not particularly limited, and may be once or a plurality of times depending on the amount of the foreign substance to be introduced and the type of the foreign substance. When introducing a plurality of foreign substances into the cell, the liquid containing the plurality of foreign substances to be introduced may be brought into contact with the cell membrane and introduced into the cell with a single laser beam irradiation. The liquid containing the foreign substance to be introduced may be substituted for each of them, and each of them may be brought into contact with the cell membrane and introduced into the cells in order by a plurality of laser beam irradiations.

本発明において、レーザー光の照射は、カバースリップの上面から細胞に近接した薄膜に対して照射しても、カバースリップの下面から細胞に近接した薄膜に対して照射してもよいが、カバースリップの下面から細胞に近接した薄膜に対して照射することがより細胞の損傷を低減させる観点から好ましい。なお、本発明において、前記細胞に近接した薄膜に対してカバースリップの下面から照射レーザー光を照射するとは、細胞が近接している領域の薄膜の一部に対してカバースリップの下面からレーザー光を照射することをいう。また、レーザー光を照射する際には、予めレーザー光照射の焦点を薄膜に合わせることが好ましい。図１（ａ）に、カバースリップ１の下面から、細胞７が近接している領域４の薄膜２の一部に対してレーザー光を照射する方法を示す。 In the present invention, the laser beam may be irradiated from the upper surface of the coverslip to the thin film close to the cells, or from the lower surface of the coverslip to the thin film close to the cells. It is preferable to irradiate the thin film close to the cells from the lower surface of the cell from the viewpoint of further reducing the damage to the cells. In the present invention, irradiating the thin film close to the cells with the irradiation laser light from the lower surface of the coverslip means that a part of the thin film in the region where the cells are close to the cells is irradiated with the laser beam from the lower surface of the coverslip. It means to irradiate. Further, when irradiating the laser beam, it is preferable to focus the laser beam irradiation on the thin film in advance. FIG. 1A shows a method of irradiating a part of the thin film 2 of the region 4 in which the cells 7 are close to each other with a laser beam from the lower surface of the coverslip 1.

上記照射により、薄膜２及び／又は細胞７の細胞膜３がレーザー光を吸収し、薄膜２及び／又は細胞膜３にレーザー光のエネルギーが集中することで、図１（ｂ）の矢印で示すように細胞膜３に細孔５が形成し、図１（ｃ）に示すように細孔５から受動拡散により外来物質６を細胞内に導入することができる。なお、形成した細孔は短時間で修復されて閉じるため、細孔の形成による細胞の生育への影響はほとんどない。また、本発明において、細胞膜に細孔が形成されることは、細胞の損傷に含まれない。 By the above irradiation, the cell membrane 3 of the thin film 2 and / or the cell 7 absorbs the laser beam, and the energy of the laser beam is concentrated on the thin film 2 and / or the cell membrane 3, as shown by the arrow in FIG. 1 (b). Pore 5 is formed in the cell membrane 3, and as shown in FIG. 1 (c), the foreign substance 6 can be introduced into the cell by passive diffusion from the pore 5. Since the formed pores are repaired and closed in a short time, the formation of the pores has almost no effect on cell growth. Further, in the present invention, the formation of pores in the cell membrane is not included in cell damage.

本発明において、レーザー光の照射は、薄膜に対して対物レンズを通して行うことが好ましい。対物レンズを通す場合のレーザー光の瞳径は、３ｍｍ〜１８ｍを例示することができ、好ましくは５ｍｍ〜１５ｍｍを例示することができ、より好ましくは１１ｍｍ〜１３ｍｍを例示することができる。 In the present invention, it is preferable to irradiate the thin film with the laser beam through the objective lens. The pupil diameter of the laser beam when passing through the objective lens can be exemplified by 3 mm to 18 m, preferably 5 mm to 15 mm, and more preferably 11 mm to 13 mm.

本発明において、細胞に近接した薄膜に対してレーザー光を照射する場合のレーザー光のスポット（焦点）径としては特に制限されないが、０．２μｍ〜２μｍを例示することができ、より好ましくは０．５μｍ〜１．５μｍを例示することができる。 In the present invention, the spot (focal) diameter of the laser beam when irradiating the thin film close to the cell with the laser beam is not particularly limited, but 0.2 μm to 2 μm can be exemplified, and more preferably 0. It can be exemplified from .5 μm to 1.5 μm.

本発明の上面に金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属の薄膜がコーティングされたカバースリップとしては、当該カバースリップの前記薄膜上に細胞を静置し、導入する外来物質を含有する液体を前記細胞に接触させ、前記細胞に近接した薄膜に対してレーザー光を照射して前記薄膜にレーザー光を吸収させることにより前記細胞膜に細孔を形成し、前記細孔から前記外来物質を前記細胞内へ導入する方法に用いるためのカバースリップであって、上面に金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属の薄膜がコーティングされてあれば特に制限されない。本発明の上面に金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属の薄膜がコーティングされたカバースリップを用いることで、本発明の細胞内への外来物質の導入方法を高効率、且つ、容易に行うことが可能となる。 As the coverslip coated with a thin film of any metal selected from gold, platinum, silver and aluminum on the upper surface of the present invention, a foreign substance into which cells are allowed to stand on the thin film of the coverslip is introduced. The liquid contained is brought into contact with the cells, the thin film close to the cells is irradiated with laser light, and the thin film absorbs the laser light to form pores in the cell membrane, and the foreign cells are formed from the pores. It is a coverslip for use in the method for introducing a substance into the cell, and is not particularly limited as long as the upper surface is coated with a thin film of any metal selected from gold, platinum, silver and aluminum. By using a coverslip coated on the upper surface of the present invention with a thin film of any metal selected from gold, platinum, silver and aluminum, the method for introducing a foreign substance into the cells of the present invention can be performed with high efficiency. , Can be easily done.

本発明の上面に金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属の薄膜がコーティングされたカバースリップの使用としては、上面に金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属の薄膜がコーティングされたカバースリップの前記薄膜上に細胞を静置し、導入する外来物質を含有する液体を前記細胞に接触させ、前記細胞に近接した薄膜に対してレーザー光を照射して前記薄膜にレーザー光を吸収させることにより前記細胞膜に細孔を形成し、前記細孔から前記外来物質を前記細胞内へ導入する方法に用いるための、上面に金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属の薄膜がコーティングされたカバースリップの使用であれば特に制限されないが、金又は白金がコーティングされたカバースリップであることが好ましい。 For the use of coverslips coated with a thin film of any metal selected from gold, platinum, silver and aluminum on the top surface of the invention, any metal selected from gold, platinum, silver and aluminum on the top surface. The cells are allowed to stand on the thin film of coverslip coated with the thin film of the above, a liquid containing a foreign substance to be introduced is brought into contact with the cells, and the thin film close to the cells is irradiated with laser light. The upper surface is selected from gold, platinum, silver and aluminum for use in a method of forming pores in the cell membrane by allowing a thin film to absorb laser light and introducing the foreign substance into the cells from the pores. The use of coverslips coated with a thin film of any metal is not particularly limited, but gold or platinum coated coverslips is preferable.

本発明の細胞内への外来物質の導入方法によって得られた形質転換細胞としては、上面に金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属からなる薄膜がコーティングされたカバースリップの前記薄膜上に細胞を静置し、導入する外来物質を含有する液体を前記細胞に接触させ、前記細胞に近接した薄膜に対してレーザー光を照射して前記薄膜にレーザー光を吸収させることにより前記細胞膜に細孔を形成し、前記細孔から前記外来物質を前記細胞内へ導入することによって得られた形質転換細胞であれば特に制限されず、かかる形質転換細胞は、外来物質による新たな形質を有する細胞として有用であるほか、バイオイメージングによる細胞の機能解析に有用である。 The transformed cell obtained by the method for introducing a foreign substance into a cell of the present invention is the coverslip having a thin film coated on the upper surface thereof made of any metal selected from gold, platinum, silver and aluminum. The cells are allowed to stand on the thin film, a liquid containing a foreign substance to be introduced is brought into contact with the cells, the thin film close to the cells is irradiated with laser light, and the thin film absorbs the laser light. The cell is not particularly limited as long as it is a transformed cell obtained by forming a pore in the cell membrane and introducing the foreign substance into the cell from the pore, and the transformed cell is a new trait due to the foreign substance. In addition to being useful as cells with, it is also useful for functional analysis of cells by bioimaging.

［細胞（細胞性粘菌）内への蛍光色素の導入］
（金の薄膜がコーティングされたカバースリップの作製）
イオンスパッタリング装置（サンユー電子社製）を用いて、金（Ａｕ）をターゲットとして、１４ｍＡ、２０、３０、３５、４０、５０、又は６０秒の条件で厚さ０．１７ｍｍのカバースリップＮｏ．１（松浪硝子工業社製）の上面に金の薄膜がコーティングされたカバースリップを作製した。作製した金の薄膜の厚さは２０、３０、３５、４０、５０、６０秒の場合でそれぞれ順に６．６、１０、１１．６、１３．３、１６．６、２０ｎｍであった。また、分光光度計により透過光の吸収度を調べたところ、いずれも５３２ｎｍで測定限界以下であった。一方、上記特許文献５の方法で作製したカーボンからなる薄膜がコーティングされたカバースリップの場合はＯＤ５３２ｎｍに基づく透過光の吸収度は１０％であった。したがって、金の薄膜がコーティングされたカバースリップはより蛍光のロスが少なく、蛍光観察においてより蛍光シグナルを失わず、ＳＮ（シグナル／ノイズ）比を上げることができることが明らかとなった。[Introduction of fluorescent dye into cells (cellular slime mold)]
(Making a coverslip coated with a thin film of gold)
Using an ion sputtering device (manufactured by Sanyu Electronics Co., Ltd.), a coverslip No. A coverslip was prepared by coating the upper surface of No. 1 (manufactured by Matsunami Glass Ind.) With a thin film of gold. The thicknesses of the prepared gold thin films were 6.6, 10, 11.6, 13.3, 16.6, and 20 nm, respectively, in the cases of 20, 30, 35, 40, 50, and 60 seconds, respectively. Moreover, when the absorption degree of transmitted light was examined by a spectrophotometer, it was 532 nm, which was below the measurement limit. On the other hand, in the case of the coverslip coated with the thin film made of carbon produced by the method of Patent Document 5, the absorption of transmitted light based on OD532 nm was 10%. Therefore, it was clarified that the coverslip coated with the gold thin film has less fluorescence loss, does not lose more fluorescence signal in fluorescence observation, and can increase the SN (signal / noise) ratio.

（白金の薄膜がコーティングされたカバースリップの作製）
マグネトロンスパッタリング装置（ＪＦＣ−１６００：日本電子社製）を用いて、白金（Ｐｔ）をターゲットとして、２０ｍＡ−１０秒、２０ｍＡ−２０秒、３０ｍＡ−２０秒、３０ｍＡ−３０秒、４０ｍＡ−２０秒、又は４０ｍＡ−３０秒の条件で厚さ０．１７ｍｍのカバースリップＮｏ．１（松浪硝子工業社製）の上面に白金粒子をスパッタリングし、白金の薄膜がコーティングされたカバースリップを６種類作製した。作製したカバースリップを分光光度計（５３２ｎｍ）で測定したところ、ＯＤ値はそれぞれ０．００２，０．０１８，０．０２６，０．０３９，０．０５８，０．０６２であった。(Preparation of coverslip coated with a thin film of platinum)
Using a magnetron sputtering device (JFC-1600: manufactured by JEOL Ltd.), targeting platinum (Pt), 20 mA-10 seconds, 20 mA-20 seconds, 30 mA-20 seconds, 30 mA-30 seconds, 40 mA-20 seconds, Alternatively, a coverslip No. with a thickness of 0.17 mm under the condition of 40 mA-30 seconds. Platinum particles were sputtered on the upper surface of No. 1 (manufactured by Matsunami Glass Industry Co., Ltd.) to prepare 6 types of coverslips coated with a thin film of platinum. When the prepared coverslip was measured with a spectrophotometer (532 nm), the OD values were 0.002, 0.018, 0.026, 0.039, 0.058, and 0.062, respectively.

（ガラスボトムディッシュの作製）
図２に示すように、プラスチックディッシュ８の底に直径１２ｍｍの穴をあけ、カバースリップ１の薄膜２をコーティングした側を内側（上側）になるように接着剤で貼付け、ガラスボトムディッシュ９を作製した。(Making a glass bottom dish)
As shown in FIG. 2, a hole having a diameter of 12 mm is made in the bottom of the plastic dish 8 and the coated side of the thin film 2 of the coverslip 1 is attached with an adhesive so as to be inside (upper side) to prepare a glass bottom dish 9. did.

（細胞の静置）
細胞性粘菌の一種であるキイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoideum）の細胞を含む培養液を滅菌したガラスボトムディッシュ９に加えることによって、キイロタマホコリカビの細胞を金の薄膜上に静置した。なお、静置されたキイロタマホコリカビの細胞の周りには培養液があるため、キイロタマホコリカビの細胞は生育可能な状態にある。(Cell still)
Dictyostelium discoideum cells, which are a type of cellular slime mold, were placed on a thin gold film by adding a culture medium containing cells of Dictyostelium discoideum to a sterilized glass bottom dish 9. Since there is a culture solution around the static cells of Dictyostelium discoideum, the cells of Dictyostelium discoideum are in a viable state.

（カバースリップの下面からの薄膜に対するパルスレーザー光の照射）
FDSS532-Qパルスレーザー光照射装置(Crylas社製)を用いて、カバースリップの下面から薄膜に対してパルスレーザー光を照射する方法を図３に示す。レーザー１０から導入したパルスレーザー光１１は透過率可変のＮＤフィルター１２、レンズ１３、シャッター１４、ダイクロミックミラー１５、対物レンズ１６を通過してガラスボトムディッシュ９に貼付けたカバースリップ１の下面から薄膜２に対して照射する。細胞７に細孔５を形成する場合は、細胞７の直下に近接している領域の薄膜２に対してレーザー光１１をカバースリップ１の下面から照射し、細胞７に細孔を形成しない場合は、カバースリップ１の下面から細胞が近接していない領域の薄膜２に対してレーザー光１１を照射する。ガラスボトムディッシュ９は倒立顕微鏡のステージを動かすことで水平方向にスライドさせることでき、細胞７の位置とパルスレーザー光１１の吸収の位置を調整することや、細胞７を観察しながらパルスレーザー光１１を照射することが可能である。照射時間はシャッター１４によって制御し、パルスレーザー光１１の出力は透過率可変のＮＤフィルター１２で制御した。細胞７に細孔５を形成する場合は、透過率可変のＮＤフィルターを用い、焦点の調整の際には、透過率可変のＮＤフィルターを除いて照射した。１回のレーザー照射時間は１／１２５秒とした。なお、倒立顕微鏡の代わりに正立顕微鏡を用いる場合には、カバースリップの上面から、上記と同様の流れでパルスレーザー光を照射すればよい。(Irection of pulsed laser light on the thin film from the underside of the coverslip)
FIG. 3 shows a method of irradiating a thin film with pulsed laser light from the lower surface of a coverslip using an FDSS532-Q pulsed laser light irradiator (manufactured by Crylas). The pulsed laser light 11 introduced from the laser 10 passes through the ND filter 12, the lens 13, the shutter 14, the dichromic mirror 15, and the objective lens 16 having variable transmittance, and is a thin film from the lower surface of the coverslip 1 attached to the glass bottom dish 9. Irradiate to 2. When the pores 5 are formed in the cells 7, the laser beam 11 is irradiated from the lower surface of the coverslip 1 to the thin film 2 in the region immediately under the cells 7 and the pores are not formed in the cells 7. Irradiates the thin film 2 in the region where the cells are not close to the lower surface of the coverslip 1 with the laser beam 11. The glass bottom dish 9 can be slid horizontally by moving the stage of the inverted microscope to adjust the position of the cell 7 and the absorption position of the pulsed laser light 11, and the pulsed laser light 11 while observing the cell 7. It is possible to irradiate. The irradiation time was controlled by the shutter 14, and the output of the pulsed laser beam 11 was controlled by the ND filter 12 having a variable transmittance. When the pores 5 were formed in the cells 7, an ND filter having a variable transmittance was used, and when adjusting the focal point, irradiation was performed excluding the ND filter having a variable transmittance. The time of one laser irradiation was 1/125 second. When an upright microscope is used instead of the inverted microscope, pulsed laser light may be irradiated from the upper surface of the coverslip in the same flow as described above.

（パルスレーザー光照射の焦点の調整）
倒立顕微鏡（IX70I オリンパス社製）のステージに、上述のキイロタマホコリカビを静置し、培養したガラスボトムディッシュ９を設置し、対物レンズ１６（ＡｐｏＮ ６０×：オリンパス社製）の焦点をスポット（焦点）径が０．５μｍとなるようにカバースリップ１の表面に合わせた。次に、細胞膜が近接していない領域の薄膜２に対してカバースリップ１の下面からパルスレーザー光１１（532nm,15mW, 1nsec pulse, 4.8 KHz）を照射し、薄膜２が剥がれる位置を指標として、パルスレーザー光１１の照射の焦点をスポット（焦点）径が１μｍとなるように薄膜２に合わせた。対物レンズを通したレーザー光の瞳径は、１２ｍｍであった。なお、カバースリップは、以下の実施例で、金の薄膜をコーティングしたカバースリップとしては１４ｍＡ−３５秒の条件でコーティングしたもの、白金の薄膜をコーティングしたカバースリップとしては３０ｍＡ−２０秒の条件でコーティングしたものを用いた。(Adjusting the focus of pulsed laser irradiation)
The above-mentioned Kiirotama dust mold was placed on the stage of an inverted microscope (IX70I Olympus), a cultured glass bottom dish 9 was installed, and the focal point of the objective lens 16 (ApoN 60 ×: Olympus) was spotted (ApoN 60 ×: Olympus). Focus) The surface of Coverslip 1 was adjusted so that the diameter was 0.5 μm. Next, pulsed laser light 11 (532 nm, 15 mW, 1nsec pulse, 4.8 KHz) is irradiated from the lower surface of the coverslip 1 to the thin film 2 in the region where the cell membrane is not close to each other, and the position where the thin film 2 is peeled off is used as an index. The focus of the irradiation of the pulsed laser beam 11 was adjusted to the thin film 2 so that the spot (focal) diameter was 1 μm. The pupil diameter of the laser beam passing through the objective lens was 12 mm. In the following examples, the coverslip is coated under the condition of 14 mA-35 seconds for the cover slip coated with the gold thin film, and under the condition of 30 mA-20 seconds for the coverslip coated with the platinum thin film. The coated one was used.

（パルスレーザー光照射）
ガラスボトムディッシュ９中の培養液に外来物質として蛍光色素１７（ＰＩ（propidium iodide：同仁化学社製）を０．１ｍｇ／ｍｌとなるように加えて、細胞膜３に蛍光色素１７を含有する液体を接触させ、細胞７に近接している領域の薄膜２の一部に対して図３に示す方法でパルスレーザー光１１(532nm, 15mW, 1nsec pulse, 4.8 KHz)を照射した。また、パルスレーザー光を照射した細胞数は１００であった。照射の際には透過率可変のＮＤフィルターを用いて出力を１．５ｍＷに減光させ、１回の照射時間は１／１２５秒とした。コントロールとして、薄膜をコーティングしていないカバースリップ１を貼付けたプラスチックディッシュ９を用い、上記と同様にキイロタマホコリカビのカバースリップ１上への静置から、細胞７に近接している領域の一部に対するパルスレーザー光１１の照射までの工程を行った。細胞７の観察やパルスレーザー光１１の照射の観察は、接眼レンズ１８を通して肉眼で行なうか、別ポートにカメラ（ORCA-ER 浜松ホトニクス社製）を接続してコンピューターに画像を取得して行なった。(Pulse laser light irradiation)
Fluorescent dye 17 (PI (propidium iodide: manufactured by Dojin Kagaku Co., Ltd.)) was added to the culture solution in the glass bottom dish 9 as a foreign substance at a concentration of 0.1 mg / ml, and a liquid containing the fluorescent dye 17 was added to the cell membrane 3. After contact, a part of the thin film 2 in the region close to the cell 7 was irradiated with pulsed laser light 11 (532 nm, 15 mW, 1nsec pulse, 4.8 KHz) by the method shown in FIG. The number of cells irradiated with was 100. At the time of irradiation, the output was dimmed to 1.5 mW using an ND filter having a variable transmission rate, and one irradiation time was set to 1/125 second as a control. Using a plastic dish 9 to which a cover slip 1 not coated with a thin film is attached, the pidium iodide dust mold is placed on the covers slip 1 in the same manner as above, and the part of the region close to the cells 7 is treated. The steps up to the irradiation of the pulsed laser light 11 were performed. The observation of the cells 7 and the irradiation of the pulsed laser light 11 was performed with the naked eye through the eyepiece lens 18 or a camera (manufactured by ORCA-ER Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) in another port. I connected and acquired the image on the computer.

パルスレーザー光を照射した細胞の下面方向からのコンピューター画像による観察結果の代表例を図４（ａ）、（ｃ）に示す。（ａ）は金の薄膜をコーティングしたカバースリップを用いた場合、（ｃ）は白金の薄膜をコーティングしたカバースリップを用いた場合である。図４（ａ）、（ｃ）における写真中の数値は、パルスレーザー光を照射した時間を０．０秒とした時の経過時間（秒）を示す。また、図４（ａ）の細胞写真から相対蛍光量を求めたグラフを図４（ｂ）に示す。図４（ｂ）において、横軸はレーザー光を照射した時間を０．０秒とした時の経過時間（秒）を示し、縦軸は相対蛍光量を示す。相対蛍光量は、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（アメリカ国立衛生研究所：ＮＩＨ）を用いて定量した。 Representative examples of observation results by computer images from the lower surface direction of cells irradiated with pulsed laser light are shown in FIGS. 4 (a) and 4 (c). (A) is a case where a coverslip coated with a thin film of gold is used, and (c) is a case where a coverslip coated with a thin film of platinum is used. The numerical values in the photographs in FIGS. 4 (a) and 4 (c) indicate the elapsed time (seconds) when the time of irradiation with the pulsed laser light is 0.0 seconds. Further, a graph obtained by obtaining the relative fluorescence amount from the cell photograph of FIG. 4 (a) is shown in FIG. 4 (b). In FIG. 4B, the horizontal axis shows the elapsed time (seconds) when the time of irradiation with the laser beam is 0.0 seconds, and the vertical axis shows the relative fluorescence amount. Relative fluorescence was quantified using ImageJ software (National Institutes of Health: NIH).

（結果）
図４に示すように、レーザー光を照射した後に細胞内の蛍光量が増加していた。また、レーザー光を照射した１００細胞中、９９細胞において細胞内での蛍光が観察された。さらに、レーザー光照射の前後の細胞の動きを顕微鏡で観察した結果、レーザー光照射後の細胞の形態変化はレーザー光照射前の正常な細胞の形態変化と差はみられなかった。また、導入した蛍光色素はそのまま維持され数時間後でも細胞から出ることはなかった。なお、図に示していないが、薄膜をコーティングしていない上記コントロールのカバースリップを用いた場合は細胞膜に細孔が全く形成されず、細胞内での蛍光量に変化はなかった。(result)
As shown in FIG. 4, the amount of intracellular fluorescence increased after irradiation with the laser beam. In addition, intracellular fluorescence was observed in 99 cells out of 100 cells irradiated with laser light. Furthermore, as a result of observing the movement of cells before and after laser light irradiation with a microscope, the morphological change of cells after laser light irradiation was not different from the morphological change of normal cells before laser light irradiation. In addition, the introduced fluorescent dye was maintained as it was and did not leave the cells even after several hours. Although not shown in the figure, when the cover slip of the above control not coated with the thin film was used, no pores were formed on the cell membrane, and the amount of fluorescence in the cell did not change.

したがって、本発明の細胞内への外来物質の導入方法により、細胞膜に細孔が形成され、非常に高い効率で蛍光色素が細胞内に導入していることが明らかとなった。さらに、本発明の細胞内への外来物質の導入方法においては、細胞への損傷による影響が少ないことが明らかとなった。 Therefore, it was clarified that the method for introducing a foreign substance into the cell of the present invention formed pores in the cell membrane and introduced the fluorescent dye into the cell with extremely high efficiency. Furthermore, it was clarified that the method for introducing a foreign substance into cells of the present invention has little effect on cell damage.

このほか、本発明の細胞内への外来物質の導入方法では、細胞が薄膜上に静置されており、薄膜に近接する細胞膜は大きな形態の変化がなく薄膜上に位置するため、細胞の一定の場所を狙ってパルスレーザー光照射を行うことが容易であった。 In addition, in the method for introducing a foreign substance into a cell of the present invention, the cell is stationary on the thin film, and the cell membrane close to the thin film is located on the thin film without major morphological change, so that the cell is constant. It was easy to irradiate the pulsed laser light at the location of.

［細胞（Ｃｏｓ−１）内への蛍光色素の導入］
細胞性粘菌の代わりにアフリカミドリザル由来のＣｏｓ−１細胞を用い、外来物質としての蛍光色素としてＰＩの代わりにＦＭ４‐６４を１０μＭとなるように加えた以外は実施例１と同様の方法で細胞内に蛍光色素を導入した。カバースリップは金の薄膜がコーティングされたカバースリップを用いた。結果を図５に示す。図５の写真中の数値は、パルスレーザー光を照射した時間を０．０秒とした時の経過時間（秒）を示し、矢印はレーザーをスポットした位置を示す。[Introduction of fluorescent dye into cells (Cos-1)]
Cos-1 cells derived from African green monkeys were used instead of cellular slime molds, and FM4-64 was added instead of PI as a fluorescent dye as a foreign substance so as to be 10 μM, in the same manner as in Example 1. A fluorescent dye was introduced into the cells. As the coverslip, a coverslip coated with a thin film of gold was used. The results are shown in FIG. The numerical value in the photograph of FIG. 5 indicates the elapsed time (seconds) when the time of irradiation with the pulsed laser light is 0.0 seconds, and the arrow indicates the position where the laser is spotted.

図５に示すように、Ｃｏｓ−１細胞を用いても細胞内に蛍光色素ＦＭ４‐６４が取り込まれていることが確認された。したがって、本発明の細胞内への外来物質の導入方法は、哺乳動物細胞でも利用可能であることが明らかとなった。 As shown in FIG. 5, it was confirmed that the fluorescent dye FM4-64 was incorporated into the cells even when Cos-1 cells were used. Therefore, it was clarified that the method for introducing a foreign substance into cells of the present invention can also be used in mammalian cells.

［細胞内へのプラスミドの導入］
（パルスレーザー光照射）
実施例１に記載の方法と同様で、倒立顕微鏡（IX70I オリンパス社製）のステージにキイロタマホコリカビの細胞を静置し、次いで培養したガラスボトムディッシュを設置し、対物レンズ（ＡｐｏＮ ６０×：オリンパス社製）の焦点をスポット（焦点）径が０．５μｍとなるようにカバースリップの表面に合わせ、パルスレーザー光照射の焦点を金の薄膜に合わせた。次に、ガラスボトムディッシュ中の培養液に外来物質として本発明者らがpBIG expression vector（Ruppel et al., Journal of Biological Chemistry, 269:18773-187780, 1994）をバックボーンとして作製したGFP-lifeactプラスミド（Yumura, S. Scientific Reports, 6:22055(2016)）を０．０５ｍｇ／ｍｌとなるように加えて細胞膜にGFP-lifeactプラスミドを含有する液体を接触させ、その後、細胞に近接している領域の金の薄膜の一部に対して図３に示す方法でパルスレーザー光(532nm, 15mW, 1nsec pulse, 4.8 KHz)を照射した。対物レンズを通したレーザー光の瞳径は、１２ｍｍであった。また、パルスレーザー光を照射した細胞数は１２であった。照射の際には透過率可変のＮＤフィルターを用いて出力を１．５ｍＷに減光させ、１回の照射時間は１／１２５秒とした。パルスレーザー光照射によりGFP-lifeactプラスミドを細胞内に導入して１週間後に、GFP-lifeactの発現を蛍光顕微鏡ＩＸ７１（オリンパス社製）で観察した。GFP-actinプラスミドを導入した１２細胞のうち１細胞の１週間後の観察結果を図６に示す。図６中、（ａ）は位相差顕微鏡写真、（ｂ）は同視野の蛍光顕微鏡写真である。[Introduction of plasmid into cells]
(Pulse laser light irradiation)
Similar to the method described in Example 1, the cells of Kiirotama dust mold were placed on the stage of an inverted microscope (manufactured by IX70I Olympus), and then a cultured glass bottom dish was placed, and an objective lens (ApoN 60 ×:: The focus of (Olympus) was focused on the surface of the coverslip so that the spot diameter was 0.5 μm, and the focus of the pulsed laser beam irradiation was focused on the gold thin film. Next, the GFP-lifeact plasmid prepared by the present inventors as a foreign substance in the culture solution in the glass bottom dish using the pBIG expression vector (Ruppel et al., Journal of Biological Chemistry, 269: 18773-187780, 1994) as the backbone. (Yumura, S. Scientific Reports, 6: 22055 (2016)) was added to 0.05 mg / ml and the cell membrane was contacted with a liquid containing the GFP-lifeact plasmid, followed by regions in close proximity to the cells. A part of the gold thin film was irradiated with a pulsed laser beam (532 nm, 15 mW, 1 nsec pulse, 4.8 KHz) by the method shown in FIG. The pupil diameter of the laser beam passing through the objective lens was 12 mm. The number of cells irradiated with pulsed laser light was 12. At the time of irradiation, the output was dimmed to 1.5 mW using an ND filter having a variable transmittance, and the irradiation time was set to 1/125 second. One week after the GFP-lifeact plasmid was introduced into the cells by pulsed laser light irradiation, the expression of GFP-lifeact was observed with a fluorescence microscope IX71 (manufactured by Olympus Corporation). FIG. 6 shows the observation results of 1 of the 12 cells into which the GFP-actin plasmid was introduced after 1 week. In FIG. 6, (a) is a phase-contrast micrograph, and (b) is a fluorescence micrograph of the same field of view.

（結果）
図６に示すように、１つの細胞が１０細胞以上まで***しており、また、蛍光顕微鏡写真においてすべての細胞で蛍光が観察された。図に示していないが、GFP-lifeactプラスミドを細胞内に導入した他の１１細胞も同様の結果であった。したがって、本発明の細胞内への外来物質の導入方法により細胞内に遺伝子が高効率で導入でき、受精卵や***増殖がほとんどないため多量の細胞を利用できない細胞種（例えば，神経細胞など）のような１細胞が非常に貴重な細胞に外来物質を導入する場合に特に効果的である。また、１つの細胞が１０細胞以上にまで***していたことや、図６の矢印で示した細胞のように細胞***が観察されたことから、本発明の細胞内への外来物質の導入方法においては正常細胞と同様に細胞***能力を有し、細胞への損傷による影響が少ないことが確認された。(result)
As shown in FIG. 6, one cell was divided into 10 or more cells, and fluorescence was observed in all cells in fluorescence micrographs. Although not shown in the figure, the same results were obtained for the other 11 cells into which the GFP-lifeact plasmid was introduced into the cells. Therefore, a cell type (for example, nerve cell) in which a large amount of cells cannot be used because the gene can be introduced into the cell with high efficiency by the method for introducing a foreign substance into the cell of the present invention and there is almost no fertilized egg or division and proliferation. It is especially effective when one cell such as the above introduces a foreign substance into a very valuable cell. In addition, since one cell had divided into 10 or more cells and cell division was observed as shown by the arrow in FIG. 6, the method for introducing a foreign substance into the cell of the present invention. It was confirmed that the cells have the same cell division ability as normal cells and have little effect on cell damage.

［参考例］
１細胞レベルで外来物質を導入するためには、細胞の大きさと比較して非常に狭い範囲にパルスレーザー光を吸収する必要がある。そこで、上面に金薄膜がコーティングされたカバースリップの下面から薄膜に対してパルスレーザー光を照射した場合の吸収レベルを調べた。[Reference example]
In order to introduce a foreign substance at the cell level, it is necessary to absorb pulsed laser light in a very narrow range compared to the size of the cell. Therefore, the absorption level when the thin film was irradiated with pulsed laser light from the lower surface of the coverslip coated with a gold thin film on the upper surface was investigated.

（パルスレーザー光の吸収レベルの確認）
実施例１に記載の方法と同様でガラスボトムディッシュを作製し、キイロタマホコリカビをカバースリップの金の薄膜上に静置した後、倒立顕微鏡（IX70I オリンパス社製）のステージにガラスボトムディッシュを設置した。次に、対物レンズ（ＡｐｏＮ ６０×：オリンパス社製）の焦点をカバースリップの表面に合わせ、パルスレーザー光照射の焦点を金の薄膜に合わせた後、倒立顕微鏡に設置したガラスボトムディッシュをスライドしてパルスレーザー光照射の焦点付近に細胞を近づけた。その後、透過率可変のＮＤフィルターを用いずに図３に示す方法でパルスレーザー光(532nm, 15mW, 1nsec pulse, 4.8 KHz)を１／１２５秒間照射した。レーザー光照射後の倒立顕微鏡によるカバースリップの観察結果を図７に示す。図７中、矢印はパルスレーザー光を吸収させた位置を表す。(Confirmation of absorption level of pulsed laser light)
A glass bottom dish was prepared in the same manner as in Example 1, and after the Dictyostelium discoideum was allowed to stand on a gold thin film of coverslip, the glass bottom dish was placed on the stage of an inverted microscope (IX70I Olympus). installed. Next, the objective lens (ApoN 60 ×: manufactured by Olympus) was focused on the surface of the coverslip, the pulsed laser light irradiation was focused on the gold thin film, and then the glass bottom dish installed in the inverted microscope was slid. The cells were brought closer to the focal point of pulsed laser light irradiation. Then, a pulsed laser beam (532 nm, 15 mW, 1 nsec pulse, 4.8 KHz) was irradiated for 1/125 second by the method shown in FIG. 3 without using an ND filter having a variable transmittance. FIG. 7 shows the observation result of the coverslip by the inverted microscope after the laser beam irradiation. In FIG. 7, the arrow indicates the position where the pulsed laser beam is absorbed.

（結果）
図７において、矢印で示すパルスレーザー光を吸収させた位置（スポット（焦点）径０．５μｍ）のみに金の薄膜が剥がれ、近接する細胞には何ら損傷はみられなかった。したがって、上面に金の薄膜がコーティングされたカバースリップの薄膜に対してパルスレーザー光を照射した場合には、非常に狭い範囲にパルスレーザー光が吸収しており、吸収レベルが高いことが明らかとなった。(result)
In FIG. 7, the gold thin film was peeled off only at the position (spot (focal) diameter 0.5 μm) where the pulsed laser beam indicated by the arrow was absorbed, and no damage was observed in the adjacent cells. Therefore, when a pulsed laser beam is applied to a cover slip thin film coated with a gold thin film on the upper surface, it is clear that the pulsed laser beam is absorbed in a very narrow range and the absorption level is high. became.

上記結果から、本発明を用いると、隣り合う２つの細胞に異なる外来物質を導入して、それらの細胞間の反応を調べることや、プライマリーカルチャーのように２種類以上の細胞が混じり合う中で、特定の種類の細胞だけに目的の外来物質を導入することも可能となる。 From the above results, using the present invention, different foreign substances can be introduced into two adjacent cells to investigate the reaction between those cells, or when two or more types of cells are mixed as in primary culture. It is also possible to introduce a foreign substance of interest only into a specific type of cell.

また、レーザー光の照射時間や照射回数を変えることにより、外来物質の導入量を調整することや、複数の外来物質を同一の細胞内に段階的に導入し、各段階での外来物質導入による影響を観察することが可能となる。 In addition, the amount of foreign substance introduced can be adjusted by changing the irradiation time and number of irradiations of the laser beam, or multiple foreign substances can be introduced stepwise into the same cell, and the foreign substance can be introduced at each stage. It is possible to observe the effect.

さらに、従来の細胞内へ外来物質を導入する方法では、外来物質を導入した細胞の増殖を前提とし、外来物質を導入した細胞が増殖した後に細胞を観察して外来物質導入による影響を調べていたが、本発明の細胞内への外来物質の導入方法によれば、シングル細胞への外来物質の導入が可能であることにより、増殖が非常に遅い、あるいは神経細胞のような増殖しないシングル細胞に外来物質を導入し、かかるシングル細胞をそのまま観察して外来物質導入による影響を調べることが可能となる。 Furthermore, the conventional method of introducing a foreign substance into cells presupposes the proliferation of cells into which the foreign substance has been introduced, and after the cells into which the foreign substance has been introduced have proliferated, the cells are observed to investigate the effects of the introduction of the foreign substance. However, according to the method for introducing a foreign substance into a cell of the present invention, the foreign substance can be introduced into a single cell, so that the single cell grows very slowly or does not grow like a nerve cell. It is possible to introduce a foreign substance into the cell and observe the single cell as it is to investigate the effect of introducing the foreign substance.

このほか、細胞として植物細胞を用いれば、本発明の細胞内への外来物質の導入方法で作製したシングル細胞からカルスを形成させて、外来物質により改変した植物体を作製することも可能となる。 In addition, if a plant cell is used as a cell, it is possible to form a callus from a single cell prepared by the method for introducing a foreign substance into a cell of the present invention to prepare a plant modified by the foreign substance. ..

加えて、金や白金の薄膜がコーティングされたカバースリップの作製は、スパッタリング装置により１分以内という短時間で作製可能であると共に、スパッタリング装置の清掃が容易である。そのため、カーボンの薄膜がコーティングされたカバースリップの作製と比べて製造工程が簡易であり、かつ低コストというメリットも有している。 In addition, the coverslip coated with a thin film of gold or platinum can be produced in a short time of less than 1 minute by a sputtering device, and the sputtering device can be easily cleaned. Therefore, the manufacturing process is simpler and the cost is lower than that of the cover slip coated with the carbon thin film.

本発明の細胞内への外来物質の導入方法によれば、細胞に損傷を与えることなく外来物質を高効率、且つ、容易にシングル細胞内へ導入することが可能となることから、バイオイメージング、再生医療、有用植物作製等の分野において有用である。 According to the method for introducing a foreign substance into a cell of the present invention, the foreign substance can be easily introduced into a single cell with high efficiency without damaging the cell. It is useful in the fields of regenerative medicine and useful plant production.

１ カバースリップ
２ 薄膜
３ 細胞膜
４ 細胞膜が近接している領域
５ 細孔
６ 外来物質
７ 細胞
８ プラスチックディッシュ
９ ガラスボトムディッシュ
１０ レーザー
１１ パルスレーザー光
１２ 透過率可変のＮＤフィルター
１３ レンズ
１４ シャッター
１５ ダイクロミックミラー
１６ 対物レンズ
１７ 蛍光色素
１８ 接眼レンズ1 Coverslip 2 Thin film 3 Cell membrane 4 Area where the cell membrane is close 5 Pore 6 Foreign substance 7 Cell 8 Plastic dish 9 Glass bottom dish 10 Laser 11 Pulse laser light 12 Variable transmittance ND filter 13 Lens 14 Shutter 15 Dichromic Mirror 16 Objective lens 17 Fluorescent dye 18 Eyepiece

Claims (7)

細胞内への外来物質の導入方法であって、上面に厚さが５ｎｍ〜２００ｎｍであって金、白金、銀及びアルミニウムから選択されるいずれかの金属の薄膜がコーティングされたカバースリップの前記薄膜上に細胞を静置し、導入する外来物質を含有する液体を前記細胞に接触させ、前記カバースリップの下面から前記細胞に近接した薄膜に対して、予めレーザー光照射の焦点を薄膜に合わせたうえで出力が０．１ｍＷ〜２０ｍＷのレーザー光を照射して前記薄膜にレーザー光を吸収させることにより前記細胞膜に細孔を形成し、前記細孔から前記外来物質を前記細胞内へ導入することを特徴とする細胞内への外来物質の導入方法。 A method for introducing a foreign substance into a cell, the thin film of coverslip having a thickness of 5 nm to 200 nm and coated with a thin film of any metal selected from gold, platinum, silver and aluminum. The cells were allowed to stand on the cells, and the liquid containing the foreign substance to be introduced was brought into contact with the cells, and the focus of laser light irradiation was previously focused on the thin film from the lower surface of the coverslip to the thin film close to the cells. Then, by irradiating a laser beam having an output of 0.1 mW to 20 mW to cause the thin film to absorb the laser beam, pores are formed in the cell membrane, and the foreign substance is introduced into the cell from the pores. A method for introducing a foreign substance into a cell, which is characterized by. 細胞が接着性細胞であることを特徴とする請求項１記載の細胞内への外来物質の導入方法。 The method for introducing a foreign substance into a cell according to claim 1, wherein the cell is an adhesive cell. 薄膜に対して対物レンズを通してレーザー光を照射することを特徴とする請求項１又は２記載の細胞内への外来物質の導入方法。 The method for introducing a foreign substance into a cell according to claim 1 or 2, wherein the thin film is irradiated with a laser beam through an objective lens. レーザー光のスポット径が０．２μｍ〜２μｍであり、瞳径が３ｍｍ〜１５ｍｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の細胞内への外来物質の導入方法。 The method for introducing a foreign substance into a cell according to any one of claims 1 to 3, wherein the spot diameter of the laser beam is 0.2 μm to 2 μm, and the pupil diameter is 3 mm to 15 mm. 上面に金又は白金の薄膜がコーティングされたカバースリップを用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の細胞内への外来物質の導入方法。 The method for introducing a foreign substance into a cell according to any one of claims 1 to 4, wherein a coverslip having a thin film of gold or platinum coated on the upper surface thereof is used. 薄膜をスパッタ法により形成することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の細胞内への外来物質の導入方法。 The method for introducing a foreign substance into a cell according to any one of claims 1 to 5, wherein a thin film is formed by a sputtering method. 外来物質がＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、糖類、脂質、薬剤、蛍光色素のいずれか１以上の物質であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の細胞内への外来物質の導入方法。 The intracellular substance according to any one of claims 1 to 6, wherein the foreign substance is a substance of any one or more of DNA, RNA, protein, polypeptide, amino acid, saccharide, lipid, drug, and fluorescent dye. How to introduce foreign substances.
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