JP7377561B2 - エレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入方法、および、エレクトロポレーター用電源装置 - Google Patents
エレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入方法、および、エレクトロポレーター用電源装置 Download PDFInfo
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Description
該物質導入方法は、
一対のエレクトロポレーション用電極の間に、プロトプラストまたは藻類、および、導入する物質を含む混合液を配置する混合液配置工程と、
一対のエレクトロポレーション用電極間に電圧を印加する電圧印加工程と、
を含み、
電圧印加工程が、
一対のエレクトロポレーション用電極の一方に、プラス電圧のポレーションパルスに続きマイナス電圧のポレーションパルスを印加するポレーションパルス印加工程を1以上含み、
プラス電圧のポレーションパルスを印加後、マイナス電圧のポレーションパルスを印加するまでの間隔が50μsec以下である、
物質導入方法。
(2)ポレーションパルス印加工程の後に、ドライビングパルスを印加するドライビングパルス印加工程を含む、
上記(1)に記載の物質導入方法。
(3)導入する物質が、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、および、イオン化もしくは帯電する物質、から選択される、
上記(1)または(2)に記載の物質導入方法。
(4)エレクトロポレーター用電源装置であって、
電源装置は、
ポレーションパルスを出力するためのポレーションパルス直流電源部と、
制御部と、
を含み、
制御部は、
プラス電圧のポレーションパルスに続きマイナス電圧のポレーションパルスを印加し、且つ、
プラス電圧のポレーションパルスを印加後、マイナス電圧のポレーションパルスを印加するまでの間隔が50μsec以下、
となるように、ポレーションパルスの出力を制御する、
エレクトロポレーター用電源装置。
(5)ドライビングパルスを出力するためのドライビングパルス直流電源部を更に含み、
制御部は、ポレーションパルスを出力した後、電圧の絶対値がポレーションパルスより小さいドライビングパルスを出力するように制御する、
上記(4)に記載のエレクトロポレーター用電源装置。
(6)制御部が、ハードタイマーを更に含む、
上記(4)または(5)に記載のエレクトロポレーター用電源装置。
物質導入方法は、
(1)一対のエレクトロポレーション用電極の間に、プロトプラストまたは藻類、および、導入する物質を含む混合液を配置する混合液配置工程と、
(2)一対のエレクトロポレーション用電極間に電圧を印加する電圧印加工程と、
を含んでいる。
プラスPp印加後、マイナスPpを印加する間隔t1の下限値は、CPU性能に応じて決まる。より具体的には、従来装置では、プログラム上でt1(以下、プログラム上で設定するt1を「プログラムt1」と記載する。)を0秒に設定しても、実際にプログラムの指令に従って、プラスPpからマイナスPpを印加するまでに50μsecのタイムラグが発生することを新たに発見した。従来装置では、プラグラムt1は50msecとなるように作製されていたが、プログラムを改良し、プログラムt1を0秒とすることで、プラスPp印加後、マイナスPp印加までの実際の間隔t1が50μsecの電源装置を作製できる。なお、CPUの性能が上がれば、プログラムt1を0秒とすることで、実際の間隔t1を更に短くすることも可能である。また、上記の50μsecは、プログラムt1を0秒とした時の実際の間隔t1に相当することから、プログラミングする際に、プログラムt1を0秒以上の値とすることで、実際の間隔t1を50μsec以上に設定できる。例えば、従来装置の改良の場合、プログラムt1を50μsecに改良することで、実際の間隔t1を100μsecとすることができる。
上記のとおり、プログラムt1を0秒に改良しても、実際の間隔t1は50μsecのタイムラグがある。そのため、実際の間隔t1を50μsecより更に短くしたい場合は、プログラムの改良のみでは困難である。したがって、実際の間隔t1を50μsecより短くしたい場合は、プログラムの改良と共に、ハードタイマーを制御部に組み込むことで電源装置を作製できる。より具体的には、ハードタイマーに間隔t1を設定し、ハードタイマーはプラスPpの印加終了を検知すると同時にカウントを開始する。そして、ハードタイマーに設定した間隔t1に到達したと同時にハードタイマーからポレーションパルス直流電源部にマイナスPpを印加する指令を出すことで、上記タイムラグの50μsecより短い時間で、マイナスPpを印加できる。なお、ハードタイマーは、マイナスPpの印加指令に用いられ、マイナスPpの印加終了の指令はプログラムで行う。そのため、プログラムt1を0秒となるように改良すると、ハードタイマーの指令とプログラムの指令との間の誤差が少なくなるので望ましいが、誤差の許容範囲内であればプログラムt1は0秒でなくてもよい。なお、ハードタイマーには、t1として所望の数値を入力できる。そのため、ハードタイマーを用いる場合には、実際の間隔t1を50μsec以下の非常に短い時間で任意に調整が可能となる。したがって、ハードタイマーの設定を0秒にすれば、プラスPpの印加終了と同時にマイナスPpを印加できる。なお、本明細書において、t1の具体的な数値を挙げて説明した場合、厳密に当該数値の一点のみを意味するのではなく、解析の際の誤差を含んでもよい。
次に、図2を参照して、物質導入方法および電源装置の第2の実施形態について説明する。図2は、第2の実施形態に係る物質導入方法の電圧印加工程で印加されるパルスの波形の一例を示す図である。第2の実施形態では、ポレーションパルスを印加後、ドライビングパルスを印加する点で第1の実施形態と異なり、その他の点は第1の実施形態と同様である。したがって、物質導入方法および電源装置の第2の実施形態の説明では、第1の実施形態と異なる点を中心に説明し、第1の実施形態において説明済みの事項についての繰り返しとなる説明は省略する。よって、第2の実施形態において明示的に説明されなかったとしても、第2の実施形態において、第1の実施形態で説明済みの事項を採用可能であることは言うまでもない。
[電源装置の作製]
CUY21EDITII DECAY SQUARE MODE(株式会社ベックス社製)の制御部のプログラムを、プログラムt1が0秒となるように改良することで、プラスPpを印加後、マイナスPpを印加するまでの間隔が50μsecとなる電源装置を作製した。なお、その他の電気的条件は、CUY21EDITII DECAY SQUARE MODEと同じである。
CUY21EDITII DECAY SQUARE MODEを比較例1の電源装置とした。
<実施例2>
[タバコの葉]
(1)プロトプラストの単離
(a)無菌植物(タバコの葉:Nicotiana benthamiana)からよく展開した葉を切り取り、太い葉脈を除去してシャーレに置いた(1g)。
(b) 約1mlの酵素液を加え、葉を2mm幅くらいとなるように、メスで切り刻んだ。なお、酵素液には、1.5% Cellulase Y-C(キッコーマン社製)、0.25% Macerozyme R200(ヤクルト社製)、700mg/l 塩化カルシウム、0.5M マンニトール(富士フィルム和光純薬社製)、5mM MES(2-モルホリノエタンスルホン酸;2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate)(同仁化学研究所社製)を用いた。なお、酵素液のpHは5.6であった。以下において、pHを記載する場合は、個々の試薬のpHではなく、溶液全体のpHを表す。
(c)葉を全て刻んだら、更に9mlの酵素液を加え、シャーレの周りをサージカルテープで密封し、軽く振り混ぜた。
(d)暗黒下25℃で約4時間静置し、その間に数回軽く振り混ぜた。
(e)倒立顕微鏡でプロトプラスト単離されていることを確認した。
(f)パストゥールピペットを使って、プロトプラストを含んだ酵素液を100μmのナイロンメッシュに通した。
(g)ろ液を10mlの遠心管に移し、700rpmで5分間遠心分離した。
(h)上清をパストゥールピペットで除去し、8mlの洗浄液でプロトプラストを懸濁し、700rpmで3分間間遠心分離した。なお、洗浄液には、700mg/l 塩化カルシウム、0.5M マンニトール、5mM MES、pH5.6を用いた。
(i)さらに2回同操作を繰り返した。
(j)その後、プロトプラストを18%ショ糖溶液上に重層し、700rpmで5分間遠心分離して、プロトプラストを精製した。
(a)上記(1)で単離したプロトプラストを、1mlのエレクトロポレーション用緩衝液に懸濁した。なお、緩衝液には、70mM KCl、0.5M マンニトール、5mM MES、pH5.6を用いた。
(b)懸濁液の一部を用い、血球計算盤で密度を測定した。
(c)プロトプラストの密度が50万個/mlになるように、エレクトロポレーション用緩衝液で調整し、100μlを0.2cmのキュベット電極(BEX社製,SE-202)に移し、プラスミドDNAの濃度が10μg/100μlとなるように加えた。なお、プラスミドDNAは、GFPタンパク質を発現するように設計されたもので、図3にプラスミドマップを示す。また、配列(配列番号:1)を図4に示す。
<ポレーションパルス>
・電圧設定:140V
・パルス幅(t2):0.5msec
・プラスPpを印加後、マイナスPpを印加するまでの間隔(t1):50μsec
・マイナスPpを印加終了後、次のプラスPpを印加するまでの間隔(t3):50msec
・パルス印加回数:プラスPp→マイナスPpのセットを2回
・減衰率:10%
・電圧設定:25V
・パルス幅(t4):25msec
・パルス間隔(t5):50msec
・パルス印加回数:プラス電圧を印加後、マイナス電圧を5回印加
・減衰率:10%
(f)2週間毎に、培地の濃度を0.1mol/lずつ下げるよう新しい培地を追加することで、浸透圧を調整した。
(g)コロニーの形成を確認後、再分化用の培地に移した。再分化用の培地には、MS培地、30g/l マルトース、0.1mg/l NAA、0.5mg/l BA、2.5g/l gellan gum、pH5.7を用いた。
比較例1の電源装置を用い、プラスPpを印加後、マイナスPpを印加するまでの間隔(t1)を50msecとした以外は、実施例1と同様の手順により物質導入を実施した。図5Cは、オシロスコープで得られた、ポレーションパルスとドライビングパルスの波形を表す。また、図6Bは、エレクトロポレーション後、24時間培養後のプロップラストの蛍光写真である。
比較例1の電源装置を用い、プラスPpを連続して2回印加後、マイナスPpを連続して2回印加し、夫々のパルス間隔(t1)を50msecとした以外は、実施例1と同様の手順により物質導入を実施した。図5Dは、オシロスコープで得られた、ポレーションパルスとドライビングパルスの波形を表す。また、図6Cは、エレクトロポレーション後、24時間培養後のプロトプラストの蛍光写真である。
<実施例3>
[タマネギ]
(1)プロトプラストの準備
タバコの葉から形成したプロトプラストの代え、タマネギのプロトプラストを用いた実験を行った。タマネギのプロトプラストは、タマネギ種子を発芽させ、植物ホルモン0.5mg/l 2,4-D(2,4-ジクロロフェノキシ酢酸)、0.1mg/l TDZ(N-フェニル-N’-(1,2,3-チアジアゾール-5-イル)尿素)で脱分化したカルスを用いた。
(2)物質導入の実施
タバコの葉から形成したプロトプラストの代え、タマネギのプロトプラストを用いた以外は、実施例2と同様の手順で実験を行った。
<実施例4>
[タバコの葉のPDS遺伝子のノックアウト]
導入物質として、Cas9タンパク質とgRNAを用いた。ノックアウトのターゲットには、カロテノイド生合成酵素であるフィトエン不飽和化酵素(phytoene desaturase;PDS)遺伝子を選択した。PDSは、植物のカロテノイドの合成に関連しており、PDS遺伝子が欠損すると、カロテノイドが生成できなくなり、葉緑体特有の赤い自家蛍光が消失する。
(1)導入物質の調整
PDS遺伝子をターゲットとするためgRNAのデザインを行い、5’末端側の配列(gRNA_target1)と、3’末端側の配列(gRNA_target2)を決定した。
(a)gRNA_target1
5’-GCCGTTAATTTGAGAGTCCA-3’(配列番号2)
(b)gRNA_target2
5’-GTCAAGATGTTTGCTTGCAA-3’(配列番号3)
・Cas9:10μg/100μl
・crRNA:10μg/100μl
・tracrRNA:10μg/100μl
プラスミドに代え、調整した導入物質(Cas9およびgRNA)を用いた以外は、実施例2と同様の手順で物質の導入を行った。図8Aの左側の写真は、エレクトロポレーション実施後、約2.5カ月培養後の細胞塊の様子を示す写真である。図8Aの左側は細胞塊の通常の拡大写真、右側は同じ細胞塊の自家蛍光の蛍光写真である。また、図8Cの左側は6.5カ月培養後の細胞塊の通常の写真、右側は同じ細胞塊の自家蛍光の蛍光写真である。
導入物質を用いなかった以外は、実施例4と同様の手順で実験を行った。図8Bの左側の写真は、エレクトロポレーション実施後、約2.5カ月培養後の細胞塊の様子を示す写真である。図8Bの左側は細胞塊の通常の拡大写真、右側は同じ細胞塊の自家蛍光の蛍光写真である。また、図8Cの左側は6.5カ月培養後の細胞塊の通常の写真、右側は同じ細胞塊の自家蛍光の蛍光写真である。
<実施例5>
[タバコの葉のPDS遺伝子のノックインおよびノックアウト]
導入物質として、実施例4のCas9タンパク質とgRNAに加え、GFPを発現するdsDNA(10μg/100μl)を用いた。dsDNAの配列は以下のとおり。
5’-TGTTCAATAAAATGCCCCAATGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTACCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAACATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACAGGCTTCTTGAGATCCTTCAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTACAGTCGACTCTAGAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCACGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCCCGGCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCCCAAGGTAATTCAGCTTATC-3’(配列番号4)
導入物質を含まなかった以外は、実施例5と同様の手順で実験を行った。図9右側は、エレクトロポレーション実施後、約8カ月培養後のシュートの蛍光写真である。
次に、実施例5の実験で得られたシュートのDNA配列の確認を行った。実施例5では、PDS遺伝子を切断する機能を有するCas9およびgRNAと、切断した箇所に導入するdsDNAを混合してエレクトロポレーションを行った。したがって、得られたシュートは、PDS遺伝子上にGFPを発現するdsDNAがノックインされたゲノムと、PDS遺伝子がノックアウトされたゲノムのヘテロとなる。実施例5で得られたシュートの中から、図9に示す表現型でノックインが確認されたシュートを含め、6個の細胞塊およびシュートを選択し、以下の手順によりDNA配列を調べた。
図10に示すように、ゲノム編集標的部位を含むPDS遺伝子(713bp)をPCRで増幅できるように、フォーワードプライマー、リバースプライマーを設計した。配列は以下のとおり。
(a)フォーワードプライマー
5’-TGTGGGTAACGGCCAAACCACCAC-3’(配列番号5)
(b)リバースプライマー
5’-GAGTACGAATCCTTAACTTATGCC-3’(配列番号6)
実施例1の電源装置に、ハードタイマーを組み込むことで実施例6の電源装置を作製した。次に、実施例6で作製した電源装置を用い、ハードタイマーの設定を0秒にして、実施例2と同様の手順で物質導入実験を行った。図12は実施例6で作製した電源装置を用いてパルスを印加した際に、オシロスコープで得られた、1セット目のポレーションパルスの波形を表している(図5Bと同じ時間軸)。図12に示すように、プラスPpの印加終了と同時にマイナスPpが印加されたことを確認した。また、図示は省略するが、タバコの葉のプロトプラスにプラスミドが導入できたことも確認した。
Claims (5)
- エレクトロポレーションによるプロトプラストまたは藻類への物質導入方法であって、
該物質導入方法は、
一対のエレクトロポレーション用電極の間に、プロトプラストまたは藻類、および、導入する物質を含む混合液を配置する混合液配置工程と、
一対のエレクトロポレーション用電極間に電圧を印加する電圧印加工程と、
を含み、
電圧印加工程が、
一対のエレクトロポレーション用電極の一方に、プラス電圧のポレーションパルスに続きマイナス電圧のポレーションパルスを印加するポレーションパルス印加工程を1以上含み、
プラス電圧のポレーションパルスを印加後、マイナス電圧のポレーションパルスを印加するまでの間隔が50μsee以下である、
物質導入方法。 - ポレーションパルス印加工程の後に、ドライビングパルスを印加するドライビングパルス印加工程を含む、
請求項1に記載の物質導入方法。 - 導入する物質が、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、および、イオン化もしくは帯電する物質、から選択される、
請求項1または2に記載の物質導入方法。 - エレクトロポレーター用電源装置であって、
電源装置は、
ポレーションパルスを出力するためのポレーションパルス直流電源部と、
制御部と、
を含み、
制御部は、
ハードタイマーを含み、
プラス電圧のポレーションパルスに続きマイナス電圧のポレーションパルスを印加し、且つ、
プラス電圧のポレーションパルスを印加後、マイナス電圧のポレーションパルスを印加するまでの間隔が、0.01μsec以上、50μsec以下、となるように、ポレーションパルスの出力を制御する、
エレクトロポレーター用電源装置。 - ドライビングパルスを出力するためのドライビングパルス直流電源部を更に含み、
制御部は、ポレーションパルスを出力した後、電圧の絶対値がポレーションパルスより小さいドライビングパルスを出力するように制御する、
請求項4に記載のエレクトロポレーター用電源装置。
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