JP6210162B2 - プトレシン分解経路が破壊された腸内細菌科の細菌を使用するl−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
(i) 腸内細菌科のL−アミノ酸生産細菌を培養培地中で培養し、
(ii) 細菌若しくは培養培地又は両方に含まれる前記L−アミノ酸を回収することを含み、
前記細菌が、プトレシン分解経路を破壊するように改変されていることを特徴とする、L−アミノ酸の製造方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、プトレシン分解経路が、patA, patD, gabT, gabD, puuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びこれらの組合せからなる群から選択される遺伝子の発現の減弱によって破壊されている前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、プトレシン分解経路がグルタミル化プトレシン経路であり、グルタミル化プトレシン経路が、puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の1又は数個の遺伝子の発現の減弱によって破壊されているが、puuR遺伝子は減弱された唯一の遺伝子とはなり得ない前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、1又は数個の遺伝子の発現が、前記1又は数個の遺伝子の不活性化によって減弱されている前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、前記1又は数個の遺伝子が欠失している前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、細菌が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、細菌が、パントエア(Pantoea)属に属する前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、細菌が、パントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)である前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、L−アミノ酸がグルタミン酸ファミリーに属し、L−アルギニン、L−シトルリン、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−オルニチン、及びL−プロリンからなる群から選択される前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、L−アミノ酸が、L−アルギニンである前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、L−アミノ酸が、L−オルニチンである前記方法を提供するものである。
本発明を以下に詳細に説明する。
1.細菌
「L−アミノ酸生産細菌」という記載は、細菌を培地中で培養した場合に、培養培地中
又は細菌細胞内でL−アミノ酸を生産し、放出若しくは分泌し、かつ/又は蓄積させる能力を有する腸内細菌科の細菌を意味するものとすることができる。
「L−アミノ酸生産細菌」という記載は、野生株又は親株、例えば、E. coli K-12よりも多い量で培養培地中でL−アミノ酸を生産し、放出若しくは分泌し、かつ/又は蓄積させることのできる細菌を意味するものとすることができ、微生物が、0.5g/L以上又は1.0g/L以上の量の標的L−アミノ酸の培地中の蓄積させられることを意味するものとすることができる。細菌は、唯一の1種類のアミノ酸又は2種類以上のアミノ酸の混合物を生産することができる。
「非芳香族L−アミノ酸」という記載は、例えば、L−アラニン、L−アルギニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−シトルリン、L−システイン、L−グルタミン酸、L−グルタミン、グリシン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−メチオニン、L−オルニチン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、及びL−バリンを含むことができる。L−フェニルアラニン、L−トリプトファン、及びL−チロシンなどの芳香族アミノ酸の生合成経路は、L−ヒスチジンの生合成経路とは異なることから、「非芳香族L−アミノ酸」という記載は、前記した非芳香族L−アミノ酸の他に、L−ヒスチジンも含むことができる。
シン、L−リジン、L−オルニチン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、及びL−バリンが具体例である。グルタミン酸ファミリーアミノ酸、例えば、L−アルギニン、L−シトルリン、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−オルニチン、及びL−プロリンが具体例である。L−アルギニン及びL−オルニチンが具体例である。
腸内細菌科に属する細菌は、エシェリヒア属及び/又はパントエア属等に由来するものとすることができ、L−アミノ酸を生産する能力を有するものとすることができる。特に、NCBI(National Center for Biotechnology Information)データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543)で使用される分類学によって腸内細菌科に分類されるものを使用することができる。改変することのできる腸内細菌科に由来する株の例には、エシェリヒア属、エンテロバクター属又はパントエア属の細菌が含まれる。
腸内細菌科に属する細菌であって、プトレシン分解経路を破壊するように改変され、L−アミノ酸を生産することのできる細菌を使用することができる。
細菌は、L−アミノ酸生産能力を固有に有するものとすることができ、又は変異方法又はDNA組換え技術によってL−アミノ酸生産能力を有するように改変されたものとすることができる。細菌は、L−アミノ酸を生産する能力を固有に有する細菌中に、破壊したプトレシン分解経路を含むよう改変することができる。代替的に、細菌は、プトレシン分解経路を破壊するように既に改変した細菌に対して、L−アミノ酸を生産する能力を付与することによって取得することができる。
L−アルギニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli株237 (VKPM B-7925)
(米国特許出願2002/058315 A1)及びその誘導体株(変異体N−アセチルグルタメート合成酵素を保有する(ロシア特許第2215783号))、E. coli株382 (VKPM B-7926, EP1170358 A1)、 N-アセチルグルタメート合成酵素をコードするargA遺伝子が内部に導入されたL−アルギニン生産株(EP1170361 A1)等が含まれる。
L−アルギニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、L−アルギニン生合成酵素をコードする1以上の遺伝子の発現が増強された株も含まれる。この種の遺伝子の例には、N-アセチル−γ−グルタミルリン酸還元酵素(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、N-アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(argF)、アルギニノコハク酸合成酵素(argG)、アルギニノコハク酸リアーゼ(argH)、及びカルバモイルリン酸合成酵素(carAB)をコードする遺伝子が含まれる。
L−シトルリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli変異体N-アセチルグルタミン酸合成酵素株237/pMADS11, 237/pMADS12, 及び237/pMADS13 (ロシア特許第2215783号, 欧州特許第1170361 B1号, 米国特許第6790647 B2号)が含まれるとすることができる。共に変異体フィードバック耐性カルバモイルリン酸合成酵素を保有するE. coli株333
(VKPM B-8084)及び374 (VKPM B-8086)(ロシア特許RU2264459 C2)、α−ケトグルタル酸合成酵素活性が増加すると共にフェレドキシンNADP+還元酵素、ピルビン酸合成酵素又はα−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が付加的に改変されたE. coli株(EP 2133417 A1)、及びコハク酸脱水素酵素及びα−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が減少したP.
ananantis株NA1sucAsdhA (米国特許出願第2009286290号)等が更なる例である。
L−シトルリンは、L−アルギニン生合成経路の中間体であることから、L−シトルリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、L−アルギニン生合成酵素をコードする1以上の遺伝子の発現が増強された株が含まれる。この種の遺伝子の例には、限定されるものではないが、N−アセチルグルタミン酸合成酵素(argA)、N−アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、N−アセチルグルタミルリン酸還元酵素(argC)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ(argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(argF/I)、及びカルバモイルリン酸合成酵素(carAB)、並びにこれらの組合せが含まれる。
L−シトルリン生産細菌は、いずれかのL−アルギニン生産細菌、例えば、E. coli 382株(VKPM B-7926)から、argG遺伝子によってコードされるアルギノコハク酸合成酵素の不活性化によっても容易に取得することができる。
L−システイン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、フィードバック耐性セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysE 対立遺伝子により形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号, ロシア特許第2279477号)、細胞に有毒な物質を分泌
するのに適切なタンパク質をコードする過剰発現した遺伝子を有するE. coli W3110(米国特許第5,972,663号)、低下したシステインデスルホヒドラーゼ活性を有するE. coli株(特開平11-155571 A2)、cysB遺伝子によってコードされたシステインレギュロン(cysteine regulon)についての正の転写レギュレータの増加した活性を有するE. coli W3110 (WO0127307 A1)、E. coli JM15(ydeD) (米国特許第6,218,168号)等が含まれるものとすることができる。
L−グルタミン酸生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)が含まれるものとすることができる。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC及びilvA遺伝子に変異を有する、L−イソロイシン及びL−スレオニン栄養要求株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型対立遺伝子は、野生型E. coli K-12株 (VKPM B-7)細胞上で生育させたバクテリオファージP1を使用する一般的なトランスダクションの方法によって転移させた。この結果、L−グルタミン酸を生産することのできるL−イソロイシン栄養要求株VL334thrC+ (VKPM B-8961)を取得した。
クエン酸合成酵素遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子及び/又はグルタミン酸脱水素酵素遺伝子の発現が増強されるよう改変された株の例には、EP1078989 A2, EP955368 A2及びEP952221 A2に開示されるものが含まれる。
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
E. coli W3110sucA::KmRは、E. coli W3110のα−ケトグルタル酸脱水素酵素遺伝子(
以下では「sucA遺伝子」と呼ぶ)を破壊することによって得られた株である。この株は、α−ケトグルタル酸脱水素酵素を完全に欠損している。
L−ヒスチジン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli株24 (VKPM B-5945, RU2003677), E. coli株80 (VKPM B-7270, RU2119536), E. coli NRRL B-12116−B12121
(米国特許第4,388,405号), E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号), E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087),
E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)等が含まれるものとすることができる。
hisG及びhisBHAFIによってコードされるL−ヒスチジン生合成酵素は、L−ヒスチジンによって阻害され、したがって、L−ヒスチジン生産能力も、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼに変異を導入してフィードバック阻害に対する耐性を与えることによって効率的に増強することができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL−1,2,4-トリアゾール-3-アラニン、及びストレプトマイシン耐性を付与されたE. coli 80株(VKPM B-7270, RU2119536)、及びE. coli MG1655+hisGr hisL'_ΔpurR(RU2119536、及びDoroshenko V.G.ら、「ヒスチジン生産変異体を得るためのEscherichia coli MG1655の指向性修飾」、Prikl. Biochim.
Mikrobiol. (ロシア語), 2013, 49(2):149-154)等が含まれる。
L−イソロイシン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、6−ジメチルアミノプリンに対する耐性を有する変異体(特開平05-304969 A)、チアイソロイシン及びイソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに対する耐性を有する変異体、及びDL−エチオニン及び/又はアルギニンヒドロキサメートに対する耐性を付加的に有する変異体(特開平05-130882 A)が含まれる。加えて、スレオニンデアミナーゼ及びアセトヒドロキサメート合成酵素などのL−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子により形質転換された組換え株も、親株として使用することができる(特開平02-458 A, EP0356739 A1及び米国特許第5,998,178号)。
L−ロイシン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、ロイシン(例えば、株57 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))又はβ−2−チエニルアラニン、3−ヒドロキシロイシン、4−アザロイシン、5,5,5−トリフルオロロイシンを含むロイシンアナログ(特開昭62-34397 B及び特開平08-70879 A)に対して耐性のE. coli株;WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法によって得られたE. coli株;E. coli H-9068 (特開平08-70879
A)等が含まれる。
細菌は、L−ロイシン生合成に関与する1以上の遺伝子の発現を増強することによって改良することができる。例には、leuABCDオペロンの遺伝子が含まれ、これは、L−ロイシンによるフィードバック阻害から解放されたイソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードする変異体leuA遺伝子によって代表されるものとすることができる(米国特許第6,403,342号)。加えて、細菌は、細菌細胞からL−アミノ酸を分泌させるタンパク質をコードする1以上の遺伝子の発現を増強することによって改良することができる。この種の遺伝子の例には、b2682及びb2683 (ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が含まれる。
エシェリヒア・ファミリーに属するL−リジン生産細菌の例には、L−リジンアナログに対する耐性を有する変異体が含まれる。L−リジンアナログは、エシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、培地中にL−リジンが存在する場合は、完全に又は部分的に脱感作される。L−リジンアナログの例には、限定されるものではないが、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、S−(2−アミノエチル)−L−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム等が含まれる。これらのリジンアナログに対する耐性を有する変異体は、エシェリヒア属に属する細菌を従来の人工的な変異誘発処理に供することによって取得することができる。L−リジンを生産するのに有用な細菌株の具体例には、E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びE. coli VL611が含まれる。これらの微生物においては、L−リジンによるアスパルトキナーゼのフィードバック阻害が脱感作されている。
のではないが、L−リジン生合成酵素をコードする1以上の遺伝子の発現が増強された株も含まれる。この種の遺伝子の例には、限定されるものではないが、ジヒドロジピコリネート合成酵素(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリネート還元酵素(dapB)、ジアミノピメレート脱水素酵素(lysA)、ジアミノピメレート脱水素酵素(ddh)(米国特許第6,040,160号)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒド脱水素酵素(asd)、及びアスパルターゼ(aspA)(EP1253195 A1)をコードする遺伝子が含まれる。加えて、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo)(EP1170376 A1)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(pntAB)(米国特許第5,830,716号)をコードする遺伝子、ybjE遺伝子(WO2005/073390)又はこれらの組合せの増加したレベルの発現を有し得る。
リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子の両者の発現は、リジンデカルボキシラーゼ活性を減少させるか、又は欠失させるために減少させることができる。両者の遺伝子の発現は、例えば、WO2006/078039に記載された方法によって減少させることができる。
L−メチオニン生産細菌及びL−メチオニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア細菌、例えば株AJ11539 (
NRRL B-12399), AJ11540 (NRRL B-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ 11542 (NRRL B-12402) (特許GB2075055); 株218 (VKPM B-8125) (特許RU2209248)及び73 (VKPM B-8126) (特許RU2215782)(L−メチオニンアナログであるノルロイシン等に耐性である)が含まれる。株E. coli 73は、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス(Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (ロシア連邦, 117545 モスクワ, 1st Dorozhny Proezd, 1))において、2001年5月14日に、受託番号VKPM B-8126の下で寄託され、ブダペスト条約の規定の下で、2002年2月1日に国際寄託に移管された。更に、メチオニンリプレッサ欠損株並びにホモセリントランススクシニラーゼ及びシスタチオニンγ−合成酵素(特開2000-139471 A)などのL−メチオニン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子により形質転換された組換え株も、親株として使用することができる。
L−オルニチン生産細菌は、argF及びargI遺伝子の両者によってコードされるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの不活性化により、いずれかのL−アルギニン生産細菌、例えば、E. coli 382株(VKPM B-7926)から容易に取得することができる。オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの不活性化のための方法は、ここに記載されている。
L−フェニルアラニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), 変異体pheA34遺伝子を保有するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第5,354,672号), E. coli MWEC101-b (KR8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)が含まれる。また、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB](AJ 12604 (FERM BP-3579)として命名された)を親株として使用することができる(EP488424
B1)。更に、yedA遺伝子又はyddG遺伝子によってコードされるタンパク質の増強された活性を有するエシェリヒア属に属するL−フェニルアラニン生産細菌も使用することができる(米国特許出願2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
L−プロリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli 702ilvA (VKPM B-8012)が含まれるものとすることができ、これはilvA遺伝子を欠損し、L−プロリンを生産することのできるものである(EP1172433 A1)。この細菌は、L−プロリン生合成に関与する1以上の遺伝子の発現を増強することによって改良することができる。L−プロリン生産細菌中で使用することのできる遺伝子の例には、L−プロリンによるフィードバック阻害が脱感作されたグルタミン酸キナーゼをコードするproB遺伝子が含まれる(DE3127361 A1)。加えて、この細菌は、細菌細胞からL−アミノ酸を分泌する要因であるタンパク質をコードする1以上の遺伝子の発現を増強することによって改良することができる。この種の遺伝子としては、b2682及びb2683 (ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)を例示することができる。
L−プロリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する細菌の例には、次のE. coli株が含まれる:NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (GB特許2075056), VKPM B-8012 (ロシア特許出願第2000124295号), DE3127361 A1に記載されたプラスミド変異体, Bloom F.R.ら「第15回マイアミ冬季シンポジウム」, 1983, p.34に記載されたプラスミド変異体等。
L−スレオニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5, 175, 107号, 米国特許第5,705,371号), E. coli 472T23/pYN7
(ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号), E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号), E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号), E. coli FERM BP-3519 and FERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号), E. coli MG442 (Gusyatinerら、Genetika
(ロシア語), 1978, 14:947-956), E. coli VL643及びVL2055 (EP1149911 A2)等が含まれる。
−ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子;
−スレオニン合成酵素をコードするthrC遺伝子;
−スレオニン及びホモセリン排出系の推定膜貫通タンパク質をコードするrhtA遺伝子;
−アスパルテート−β−セミアルデヒド脱水素酵素をコードするasd遺伝子;及び
−アスパルテートアミノトランスフェラーゼ(アスパルテートトランスアミナーゼ)をコードするaspC遺伝子。
E. coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は、既に解明されている(KEGGエントリー番号b0003; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 2,801〜3,733;
遺伝子ID: 947498)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrA遺伝子とthrC遺伝子との間に局在している。
E. coliのスレオニン合成酵素をコードするthrC遺伝子は、既に解明されている(KEGGエントリー番号b0004; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 3,734〜5,020;
遺伝子ID: 945198)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrB遺伝子とyaaX遺伝子との間に局在している。これら3つの遺伝子の全ては、単一のスレオニンオペロンthrABCとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増強するためには、転写に影響を与えるアテニュエータ領域を、望ましくはオペロンから除去する(WO2005049808 A1, WO2003097839 A1)。
E. coliのスレオニン及びホモセリン排出系のタンパク質(内側膜輸送体)をコードするrhtA遺伝子は、既に解明されている(KEGGエントリー番号b0813; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 848,433〜849,320, 相補体; 遺伝子ID: 947045)。rhtA遺伝子は、glnHPQオペロンに近接したE. coli K-12の染色体上のdps遺伝子とompX遺伝子との間に局在しており、これはグルタミン輸送系の構成要素をコードする。rhtA遺伝子は、ybiF遺伝子と同一である(KEGGエントリー番号B0813)。
また、E. coliのアスパルテートアミノトランスフェラーゼをコードするaspC遺伝子も、既に解明されている(KEGGエントリー番号b0928; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 983,742〜984,932, 相補体; 遺伝子ID: 945553)。aspC遺伝子は、E. coli K-12の染色体上で、反対側のストランド上のycbL遺伝子と同一のストランド上のompF遺伝子との間に局在している。
L−トリプトファン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、変異体trpS遺伝子によってコードされるトリプトファニル-tRNA合成酵素が欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害から解放されたホスホグリセレート脱水素酵素をコードするserA対立遺伝子及びトリプトファンによるフィードバック阻害から解放されたアントラニレート合成酵素をコードするtrpE対立遺伝子を有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、酵素トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、ホスホエノールピルビン酸生産能力が増強されたE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)等が含まれる。yedA遺伝子又はyddG遺伝子によってコードされる、同定されたタンパク質の増強された活性を有するエシェリヒア属に属するL−トリプトファン生産細菌も使用することができる(米国特許出願2003/0148473 A1、及び2003/0157667 A1)。
の酵素に導入することができる。この種の変異を有する株の具体例には、脱感作したアントラニレート合成酵素を保有するE. coli SV164、及びE. coli SV164にプラスミドpGH5 (WO 94/08031)(フィードバック脱感作ホスホグリセレート脱水素酵素をコードする変異体serA遺伝子を含む)を導入することにより得られる形質転換体株が含まれる。
L−バリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株が含まれるものとすることができる(米国特許第5,998,178号)。生産されるL−バリンによってオペロンの発現が減弱されないよう、減弱に必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去することが望ましい。更に、オペロン内のilvA遺伝子は、スレオニンデアミナーゼ活性が減少するように、望ましくは破壊させるものとする。
117545 モスクワ, 1st Dorozhny Proezd, 1)において、1988年6月24日に、受託番号VKPM B-4411の下で寄託された。
更に、生育にリポ酸を要求しかつ/又はH+-ATPaseを欠如する変異体も、親株として使用することができる(WO96/06926)。
B-12288 (米国特許第4,391,907号), VKPM B-4411 (米国特許第5,658,766号), VKPM B-7707 (欧州特許出願EP1016710A2)が含まれる。
腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属する本発明の細菌は、トランスアミナーゼ経路又はグルタミル化プトレシン経路とすることのできるプトレシン分解経路を破壊させるよう改変することができる。例示的であって、本発明の範囲を限定するものではないが、プトレシン分解経路は、経路由来の酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子の発現の減弱により、特に、puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の1又は数個の遺伝子、及び/又はpatA, patD, gabT又はgabD遺伝子などの1又は数個の遺伝子(種E. coliの細菌などの腸内細菌科ファミリーに属する細菌の染色体上にある)の不活性化により破壊させることができる。
ンスアミナーゼ(PatA)、γ−アミノブチルアルデヒド脱水素酵素(PatD)、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ(GabT)、及びコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素(GabD)によって触媒される1組の連続した酵素反応に言及するものであり、この場合、Schneider B.L.ら、2013, 88(3):537-550に記載されているように、プトレシンは、γ−アミノブチルアルデヒド(ABAL)、GABA及びコハク酸セミアルデヒド(SSA)を介してコハク酸(コハク酸塩)へと変換される。E. coliのトランスアミナーゼ経路由来の酵素をコードする遺伝子は、既に解明されており、例えば、patA (oat, pat, ygjGと同義; KEGG, 京都遺伝子ゲノム百科事典, エントリー番号b3073; PatAをコードする), patD (prr, ydcWと同義; KEGG, エントリー番号b1444; PatDをコードする), gabT (KEGG, エントリー番号b2662; GabTをコードする), 及びgabD (KEGG, エントリー番号b2661; GabDをコードする)がある。
puuA遺伝子(同義はycjK)は、γ−グルタミルプトレシン合成酵素PuuAをコードする(KEGG, エントリー番号b1297; プロテイン・ナレッジベース(Protein Knowledgebase), UniProtKB/Swiss-Prot, 受託番号P78061)。puuA遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2;
ヌクレオチド位置: 1357514〜1358932, 相補体; 遺伝子ID: 946202)は、E. coli K-12株の染色体上で、同一のストランド上のpuuP遺伝子と反対側のストランド上のpuuD遺伝子との間に局在している。puuA遺伝子のヌクレオチド配列及びpuuA遺伝子によってコードされるPuuAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号1及び配列番号2に示す。
puuR遺伝子(同義はycjC)は、puuダイバーゴン(divergon) PuuRのためのDNA結合転写リプレッサをコードする(KEGG, エントリー番号b1299; プロテイン・ナレッジベース,
UniProtKB/Swiss-Prot, 受託番号P0A9U6)。puuD遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 1359935〜1360492, 相補体; 遺伝子ID: 945886)は、E. coli K-12株の染色体上で、同一のストランド上のpuuD遺伝子とpuuC遺伝子との間に局在している。puuR遺伝子のヌクレオチド配列及びpuuR遺伝子によってコードされるPuuRタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号5及び配列番号6に示す。
puuB遺伝子(同義はycjA, ordL)は、γ−グルタミルプトレシン酸化酵素PuuBをコードする(KEGG, エントリー番号b1301; プロテイン・ナレッジベース, UniProtKB/Swiss-Prot, 受託番号P37906)。puuB遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 1362256〜1363536, 相補体; 遺伝子ID: 945072)は、E. coli K-12株の染色体上で、同一のストランド上のpuuC遺伝子とpuuB遺伝子との間に局在している。puuB遺伝子のヌクレオチド配列及びpuuB遺伝子によってコードされるPuuBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号9及び配列番号10に示す。
a Y.とShimizu K. 「13−C代謝流束分析と代謝制御」, Chemical Biology, Prof. Deniz Ekinci (編集), DOI: 10.5772/35121, http://www.intechopen.com/books/chemical-biology/13c-metabolic-flux-analysis-and-metabolic-regulation)。
「改変された細菌において、プトレシン分解経路が減弱されている」という記載は、改変された細菌において、プトレシン分解経路由来の酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子の発現が減弱されているような様式で、細菌が改変されたことを意味するものとすることができる。例えば、トランスアミナーゼ経路由来の酵素をコードするpatA, patD, gabT及びgabDから選択される1又は数個の遺伝子の発現を減弱させることができる。他の例では、グルタミル化プトレシン経路由来の酵素をコードするpuuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びpuuR遺伝子の1又は数個の発現を減弱させることができる。更に他の例では、patA, patD, gabT, gabD, puuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びpuuR遺伝子の1又は数個の発現を減弱させることができる。プトレシン分解経路を破壊させるためにその発現を減弱させることのできる遺伝子の組合せは、1又は数個の遺伝子の減弱が経路の破壊に帰着する限り、特に限定されない。すなわち、patA, patD, gabT, gabD, puuA, puuB, puuC, puuD及びpuuE遺伝子の1又は数個の発現は、細菌がL−アミノ酸生産能力を有する限り、プトレシン分解経路を破壊させるためのあらゆる組合せで減弱させることができる。例えば、プトレシン分解経路を破壊させるために、例としてpuuAなどの1つの遺伝子の発現を減弱させることができ、又は全puuADRCBE遺伝子クラスタを構成するpuuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びpuuR遺伝子を減弱させることができる。しかしながら、puuR遺伝子の減弱は、プトレシン分解経路の破壊のために必須ではない。
gabD, puuA, puuB, puuC, puuD及びpuuE遺伝子の1又は数個、又はこれらの組合せに対して、準用して適用することができる。
「減弱」又は「減弱された」という記載は、細菌中の1以上の酵素の量又は活性が減少するか、又は存在しなくなり、これにより遺伝子産物の活性が減少するか、又は完全に除去されるよう、プトレシン分解経路由来の酵素をコードする細菌中の少なくとも1つの遺伝子を減弱させるか、又は改変することを意味するものとすることができる。
遺伝子の一部の欠失又は全遺伝子の欠失、遺伝子によってコードされるタンパク質中でアミノ酸の置換を引き起こす1以上の塩基の交換(ミスセンス変異)、ストップコドンの導入(ナンセンス変異)、遺伝子のリーディングフレームのシフトを引き起こす1又は2の塩基の欠失、薬剤耐性遺伝子及び/又は転写終止信号の挿入、又はプロモータ(1又は複数)、エンハンサ(1又は複数)、アテニュエータ(1又は複数)、リボソーム結合部位(1又は複数)(RBS)等などの遺伝子発現を調節する配列を含む、遺伝子の隣接する領域の改変のために、puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の改変されたDNA領域の少なくとも1つが、遺伝子を自然に発現することができないということも可能である。puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の少なくとも1つの遺伝子の不活性化は、例えば、UV照射又はニトロソグアニジン(N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン)を使用する変異誘発処理、部位特異的変異誘発、相同組換えを使用する遺伝子破壊、及び/又は「Red/ET-駆動組込み(Red/ET-driven integration)」又は「λRed/ET-媒介組込み(λRed/ET-mediated integration)」に基づいた挿入−欠失変異誘発(Yu D.ら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 2000, 97(11):5978-5983; Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645; Zhang Y.ら、Nature Genet., 1998, 20:123-128)などの従来の方法によって行うこともできる。
されているように、標的遺伝子のプロモータ領域にいくつかのヌクレオチドについてヌクレオチド置換を導入することにより、プロモータが弱くなるよう改変することもできる。更に、シャイン・ダルガーノ(SD)配列における、及び/又はSD配列と開始コドンとの間のスペーサにおける、及び/又はリボソーム結合部位(RBS)中で開始コドンから直ぐ上流及び/又は下流の配列におけるいくつかのヌクレオチドの置換は、mRNAの転写効率に大きく影響を与えることが知られている。このRBSの改変は、puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の少なくとも1つの遺伝子の転写を減少させることと組合せることができる。
腸内細菌科の属、種又は株の間で、DNA配列が幾分異なり得ることから、puuA, puuD, puuR, puuC, puuB及びpuuE遺伝子は、配列番号1、3、5、7、9及び11にそれぞれ示す遺伝子に限定されるものではないが、配列番号1、3、5、7、9及び11の変異体(variant)ヌクレオチド配列またはそれに相同なものであって、それぞれPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB及びPuuEタンパク質の変異体をコードする遺伝子を含むものとすることができる。
及び/又は付加のいずれであるかに拘らず、配列番号2、4、6、8、10又は12と比較して、配列中に1又は数個の変更を有するが、それぞれPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB又はPuuEタンパク質のものと類似する活性又は機能を依然として維持するか、又はPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB又はPuuEタンパク質の三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていないタンパク質を意味するものとすることができる。変異体タンパク質における変更の数は、タンパク質の三次元構造中の位置又はアミノ酸残基の種類に依存する。これは、厳密には限定されるものではないが、配列番号2、4、6、8、10又は12において、1〜30、他の例では1〜15、他の例では1〜10、更に他の例では1〜5とすることができる。これは、いくつかのアミノ酸は互いに高い相同性を有し、このため、この種の変更によって活性又は機能が影響を受けないか、又はPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB又はPuuEタンパク質の三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていないためである。したがって、puuA, puuD, puuR, puuC, puuB及びpuuE遺伝子によってコードされるタンパク質変異体は、PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB及びPuuEタンパク質の活性又は機能が維持されるか、又はPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB及びPuuEの三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていない限り、コンピュータプログラムBLASTを使用した場合、配列番号2、4、6、8、10又は12にそれぞれ示す全アミノ酸配列に対して80%以上、90%以上、95%以上、又は98%以上のパラメータ「同一性」として特定される相同性を有し得る。
られるヒューリスティックなサーチアルゴリズムであり、これらのプログラムは、Samuel
K.とAltschul S.F. (「一般的なスコアリングスキームを使用することにより分子配列特徴の統計的な有意性を評価する方法」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; 「分子配列におけるマルチプルな高スコアリング断片についての応用と統計」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877)の統計的な方法を使用するその所見に有意性を帰するものである。コンピュータプログラムBLASTにより、3つのパラメータ:スコア、同一性及び類似性が計算される。FASTAサーチ法は、Pearson W.R. (「FASTP及びFASTAを用いる迅速で感度の高い配列比較」, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98)によって記載されている。ClustalW法は、Thompson J.D.ら(「CLUSTAL W:配列の重み付け、位置特異的ギャップペナルティ及びウエイトマトリックス選択により斬新的なマルチプル配列の並びの感度を改良する」, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680)によって記載されている。
5:185-189参照);又は例えば、ヒドロキシルアミンを用いた試験管内で野生型puuA, puuD, puuR, puuC, puuB及びpuuE遺伝子を含むDNAを処理することによる部位特異的変異誘発方法、又はこの種の処理に通常使用される紫外線(UV)照射又はN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)及び亜硝酸などの変異剤を用いて、微生物、例えば、野生型puuA, puuD, puuR, puuC, puuB及びpuuE遺伝子を保有する腸内細菌科に属する細菌を処理する方法;又は全長の遺伝子として化学的に合成された構造によって取得することができる。他の微生物のPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB及びPuuEタンパク質又はその変異体タンパク質をコードする遺伝子は、類似する様式で取得することができる。
ここに記載する細菌は、L−アミノ酸を生産する能力を固有に有する細菌中で、プトレシン分解経路の少なくとも1つの遺伝子の発現を減弱させることによって取得することができる。代替的に、ここに記載する細菌は、プトレシン分解経路の少なくとも1つの遺伝子の発現が既に減弱された細菌に対して、L−アミノ酸を生産する能力を付与することにより取得することができる。
細菌は、既に言及した性質に加えて、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の栄養要求、薬剤耐性、薬剤感受性、及び薬剤依存性などの他の特定の性質を有するものとすることができる。
本発明の方法は、L−アラニン、L−アルギニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−シトルリン、L−システイン、L−グルタミン酸、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−メチオニン、L−オルニチン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、及びL−バリンなどのアミノ酸、又はこれらの混合物を製造する方法を含む。更に詳しくは、本発明の方法は、L−アルギニン、L−シトルリン、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−プロリン、及びL−オルニチンなどのグルタミン酸ファミリーのL−アミノ酸、又はこれらの混合物を製造する方法を含む。更に、本発明の方法は、L−アルギニンを製造する方法を含む。
製は、微生物を使用してL−アミノ酸を製造する従来の発酵法に類似する様式で行うことができる。L−アミノ酸の製造のための培養培地は、合成又は天然培地、例えば、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン、及び必要に応じて他の有機及び無機成分を含む典型的な培地とすることができる。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、ショ糖、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、及び澱粉の加水分解物などの糖類;グリセリン、マンニトール、及びソルビトールなどのアルコール;グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、及びコハク酸などの有機酸等を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及びリン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩;大豆加水分解物などの有機窒素;アンモニアガス;アンモニア水等を使用することができる。イオウ源は、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン等を含むものとすることができる。ビタミンB1などのビタミン、要求物質、例えば、有機栄養素、例えば、アデニン及びRNAなどの核酸、又は酵母エキス等は、例え微量であっても、適量存在するものとし得る。これらの他、少量のリン酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を、必要に応じて添加し得る。
培養の後、細胞及び細胞の残骸などの固体を、遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除去することができ、その後、標的L−アミノ酸又はその塩を、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、及び結晶化などの従来の技術のいずれかの組合せにより、発酵液から回収することができる。
Datsenko K.A.とWanner B.L.によって最初に開発され、「λRed/ET-媒介組込み」と呼ばれる方法により(Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)、不活性化されたpuuADRCBE遺伝子クラスタを有するE. coli株を構築した。プライマーP1(配列番号:13)及びP2(配列番号:14)並びに鋳型としてpMW118-λattL-Cm-λattRプラスミド(WO2005010175 A1)を用いるPCRにより、λattL-Cm-λattRカセットを含むDNA断片を取得した。プライマーP1は、puuA遺伝子の5’−末端に局在する領域に相補的な領域及びattR領域に相補的な領域の両者を含む。プライマーP2は、puuE遺伝子の3’−末端に局在する領域に相補的な領域及びattL領域に相補的な領域の両者を含む。PCRの条件は次の通りとした:95℃で3分の変性工程;最初の2つのサイクルのプロフィール:95℃で1分、50℃で30秒、72℃で40秒;最後の25のサイクルのプロフィール:95℃で30秒、54℃で30秒、72℃で1分40秒;最終工程:72℃で5分。
し、温度感受性の複製開始点を有するpKD46プラスミドを含むE. coli MG1655株のエレクトロポーレーションに使用した。pKD46プラスミド(Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)は、ファージλの2,154ヌクレオチドのDNA断片を含み(31088〜33241のヌクレオチド位置、GenBank受託番号: J02459)、アラビノース誘導性のParaBプロモータの調節下にあるlRed相同組換え系の遺伝子(γ,
βエクソ遺伝子)を含む。pKD46プラスミドは、E. coli MG1655株の染色体へのPCR産物の組込みのために必要である。組換えプラスミドpKD46を含むE. coli MG1655株は、Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, 米国(受託番号CGSC7669)から取得することができる。
最小寒天培地上で、良好に生育するコロニーとして、E. coli 382ilvA+のクローンを選択した。E. coli K-12株由来の野生型ilvA遺伝子のP1トランスダクションにより、L−アルギニン生産株382(VKPM B-7926, EP1170358 A1)から株382ilvA+を取得した。株382は、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス(VKPM) (ロシア連邦, 117545 モスクワ, 1st Dorozhny proezd, 1)において、2000年4月10日に、受託番号VKPM B-7926の下で寄託された後、2001年5月18日に、ブダペスト条約の下での寄託に移管された。L−アルギニン生産に対するpuuADRCBE遺伝子クラスタの不活性化に由来する効果を試験するために、得られたE. coli MG1655ΔpuuADRCBE::Cmの染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクション(Miller, J.H. (1972) 「分子遺伝学の実験」, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)によって、L−アルギニン生産性E. coli strain 382ilvA+へと転移させ、E. coli 382ilvA+ΔpuuADRCBE::Cm株を取得した。
培養後、培地中に蓄積したL−アルギニンの量を、ブタノール:酢酸:水=4:1:1(v/v)よりなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーによって決定した。アセトン中のニンヒドリン(2%)の溶液を、可視化試薬として使用した。L−アルギニン
を含むスポットを切り出し、0.5%塩化カドミウム水溶液を用いてL−アルギニンを溶出させ、L−アルギニンの量を、540 nmで分光光度的に見積もった。
グルコース 48.0
硫酸アンモニウム 35.0
リン酸二水素カリウム 2.0
硫酸マグネシウム・7水和物 1.0
塩酸チアミン 0.0002
酵母エキス 1.0
L−イソロイシン 0.1
炭酸カルシウム 5.0
グルコースと硫酸マグネシウムとは別々に殺菌した。炭酸カルシウムは、180℃で2時間乾熱殺菌した。水酸化カリウム溶液を用いてpH7.0に調整した。
puuA遺伝子が不活性化されたE. coli 382ilvA+ΔpuuA::Km株は、実施例5に記載する。
argF及びargI遺伝子の両者によってコードされるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの不活性化により、E. coli L−アルギニン生産株382ilvA+からE. coli L−オルニチン生産株を取得した。
Datsenko K.A.とWanner B.L.によって最初に開発され、「λRed/ET媒介組込み」(Datsenko K.AとWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)と呼ばれる方法により、argF遺伝子が欠失した株を構築した。プライマーP3(配列番号15)及びP4(配列番号16)並びに鋳型としてのpMW118-attL-Km-attRプラスミド(WO2011043485 A1)を使用するPCRにより、カナマイシン耐性マーカー(KmR)を含むDNA断片を取得した。プライマーP3は、argF遺伝子の5’−末端に局在する領域に相補的な領域と、attR領域に相補的な領域との両者を含む。プライマーP4は、argF遺伝子の3’−末端に局在する領域に相補的な領域と、attL領域に相補的な領域との両者を含む。PCRの条件は次の通りとした:95℃で3分の変性工程;最初の2つのサイクルのプロフィール:95℃で1分、50℃で30秒、72℃で40秒;最後の25サイクルのプロフィール:95℃で30秒、54℃で30秒、72℃で40秒;最終工程:72℃で5分。
得られたPCR産物(約1.6 kbp)をアガロースゲル中で電気泳動により精製し、前記したように(実施例1)λRed媒介組込みにより、E. coli MG1655株の染色体中に組込み、元の(native)argF遺伝子を交換した。このようにして、E. coli MG1655ΔargF::Km株を取得した。
Datsenko K.A.とWanner B.L.によって最初に開発され、「λRed/ET媒介組込み」(Datsenko K.AとWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)と呼ばれる方法により、argI遺伝子が欠失した株を構築した。プライマーP5(配列番号17)及びP6(配列番号18)並びに鋳型としてのpMW118-attL-Cm-attRプラスミド(WO2005010175 A1)を使用するPCRにより、λattL-Cm-λattRカセットを含むDNA断片を取得した。プライマーP5は、argI遺伝子の5'−末端に局在する領域に相補的な領域と、attR領域に相補的な領域との両者を含む。プライマーP6は、argI遺伝子の3’−末端に局在する領域に相補的な領域と、attL領域に相補的な領域との両者を含む。PCRの条件は次の通りとした:95℃で3分の変性工程;最初の2つのサイクルのプロフィール:95℃で1分、50℃で30秒、72℃で40秒;最後の25サイクルのプロフィール:95℃で30秒、54℃で30秒、72℃で40秒;最終工程:72℃で5分。
得られたPCR産物(約1.6 kbp)をアガロースゲル中で精製し、前記したように(実施例1)λRed媒介組込みにより、E. coli MG1655株の染色体中に組込み、元の(native)argI遺伝子を交換した。このようにして、E. coli MG1655ΔargI::Cm株を取得した。
E. coliのL−オルニチン生産株を取得するために、得られたE. coli MG1655ΔargF::Km(実施例3.1)及びE. coli MG1655ΔargI::Cm(実施例3.2)株の染色体由来のDNA断片を、L−アルギニン生産性E. coli株382ilvA+にP1トランスダクションによって継続的に転移させ、E. coli 382ilvA+ΔargI::Cm ΔargF::Km株を取得した。
pMW-Int/Xisヘルパープラスミド(WO2005010175 A1)を使用してCmR及びKmRマーカーを同時に除去し、これにより、PCRで生成されたDNA断片のエレクトロポーレーションのために、前記したような(実施例1)エレクトロポーレーションを使用し、選択されたプラスミドのない組込み体中へとエレクトロポーレーションを行った。エレクトロポーレーションの後、0.5%グルコース及びアンピシリン(150 mg/L)を含有するL寒天上で細胞をプレート処理し、30℃で一夜インキュベートし、Int/Xisタンパク質の合成を誘導した。生育したコロニーを、クロラムフェニコールとカナマイシンとの混合物を含む場合及び含まない場合で、L寒天上でレプリカプレート処理し、CmS及びKmS(クロラムフェニコール及びカナマイシン感受性)変異体を選択した。このようにして、E. coli 382ilvA+ΔargI ΔargF株を取得した。
L−オルニチン生産に対するpuuADRCBE遺伝子クラスタの不活性化に由来する効果を試験するために、得られたE. coli MG1655ΔpuuADRCBE::Cm(実施例1)の染色体に由来するDNA断片を、P1トランスダクションにより、L−オルニチン生産性E. coli株382ilvA+ΔargIΔargF(実施例3)に転移させ、E. coli 382ilvA+ΔargI ΔargF ΔpuuADRCBE::Cm株を取得した。
L−アルギニン生産(実施例2)について前記したように、L−オルニチン生産を評価した。6つの独立した試験管発酵の結果を(平均値として)表2に示す。表2から分るように、改変したE. coli 382ilvA+ΔargI ΔargF ΔpuuADRCBE::Cm株は、親株のE. coli 382ilvA+ΔargI ΔargFと比較して、より高い量のL−オルニチン(Orn)を生産することができた。
Datsenko K.A.とWanner B.L.によって最初に開発され、「λRed/ET媒介組込み」(Datsenko K.AとWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)と呼ばれる方法により、puuA遺伝子が欠失した株を構築した。プライマーP7(配列番号19)及びP8(配列番号20)並びに鋳型としてのpMW118-attL-Km-attRプラスミド(WO2011043485 A1)を使用するPCRにより、λattL-Km-λattRカセットを含むDNA断片を取得した。プライマーP7は、puuA遺伝子の5’−末端に局在する領域に相補的な領域と、attR領域に相補的な領域との両者を含む。プライマーP8は、puuA遺伝子の3’−末端に局在する領域に相補的な領域と、attL領域に相補的な領域との両者を含む。PCRの条件は次の通りとした:95℃で3分の変性工程;最初の2つのサイクルのプロフィール:95℃で1分、50℃で30秒、72℃で40秒;最後の25サイクルのプロフィール:95℃で30秒、59℃で30秒、72℃で40秒;最終工程:72℃で5分。
得られたPCR産物(約1.6 kbp)をアガロースゲル中で精製し、前記したように(実施例1)λRed媒介組込みにより、E. coli MG1655株の染色体中に組込み、元の(native)puuA遺伝子を交換した。このようにして、E. coli MG1655ΔpuuA::Km株を取得した。
L−アルギニン生産に対するpuuA遺伝子の不活性化の効果を試験するために、得られたE. coli MG1655ΔpuuA::Kmの染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによって、L−アルギニン生産性E. coli株382ilvA+に転移させ、E. coli 382ilvA+ΔpuuA::Km株を取得した。
実施例2に記載したようにL−アルギニン生産を評価した。8つの独立した試験管発酵の結果を(平均値として)表1に示す。表1から分るように、改変されたE. coli 382ilvA+ΔpuuA::Km株は、親株のE. coli 382ilvA+と比較して、より高い量のL−アルギニンを蓄積することができた。
L−シトルリン生産に対するpuuADRCBE遺伝子クラスタの不活性化に由来する効果を試験するために、前記したE. coli MG1655ΔpuuADRCBE::Cm株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによってシトルリン生産性E. coli株382ΔargGに転移させ、株382ΔargG ΔpuuADRCBE::Cmを取得した。株382ΔargGは、Datsenko K.A.とWanner B.L.によって最初に開発され、「λRed/ET-媒介組込み」と呼ばれる方法により(Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)、L−アルギニン生産株382(VKPM B-7926, EP1170358 A1)の染色体上のargG遺伝子を欠失させることによって取得される。この手順によれば、argG遺伝子に隣接する領域と鋳型プラスミド中で抗生物質耐性を与える遺伝子との両者に相同なPCRプライマーが構築される。プラスミドpMW118-λattL-Cm-λattR (WO2005010175 A1)を、PCR反応における鋳型として使用する。
養する
培養後、培地中に蓄積するL−シトルリンの量を、ブタン−1−オール:酢酸:水=4:1:1(v/v)よりなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーにより決定する。アセトン中のニンヒドリン(2%)の溶液を可視化剤として使用する。シトルリンを含有するスポットを切り出し、0.5%塩化カドミウム水溶液を用いてL−シトルリンを溶出させ、540nmで分光光度的にL−シトルリンの量を見積もる。
グルコース 48.0
硫酸アンモニウム 35.0
リン酸二水素カリウム 2.0
硫酸マグネシウム・7水和物 1.0
塩酸チアミン 0.0002
酵母エキス 1.0
L−イソロイシン 0.1
L−アルギニン 0.1
炭酸カルシウム 5.0
グルコースと硫酸マグネシウムとは別々に殺菌する。炭酸カルシウムは、180℃で2時間乾熱する。pHは7.0に調整する。
L−グルタミン酸生産に対するpuuADRCBE遺伝子クラスタの不活性化に由来する効果を試験するために、前記したE. coli MG1655ΔpuuADRCBE::Cm株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによって、グルタミン酸生産性E. coli株VL334thrC+ (EP1172433 A1)に転移させ、株VL334thrC+ΔpuuADRCBE::Cmを取得した。株VL334thrC+は、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス(VKPM) (ロシア連邦, 117545 モスクワ, 1 Dorozhny proezd, 1)において、2004年12月6日に、受託番号VKPM B-8961の下で寄託された後、2004年12月8日にブダペスト条約の下での寄託に移管された。
培養の後、培地中に蓄積するL−グルタミン酸の量を、ブタン−1−オール:酢酸:水=4:1:1(v/v)よりなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーにより、後続するニンヒドリン(アセトン中の1%溶液)による染色、0.5%塩化カドミウム水溶液を用いる50%エタノール中での化合物の抽出、更に540 nmでのL−グルタミン酸の見積もりを行って決定する。
グルコース 60.0
硫酸アンモニウム 25.0
リン酸二水素カリウム 2.0
硫酸マグネシウム・7水和物 1.0
塩酸チアミン 0.1
L−イソロイシン 0.07
炭酸カルシウム 25.0
グルコースと炭酸カルシウムとは別々に殺菌する。pHは7.2に調整する。
L−プロリン生産に対するpuuADRCBE遺伝子クラスタの不活性化由来の効果を試験するために、前記したE. coli MG1655ΔpuuADRCBE::Cm株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによってプロリン生産性E. coli株702ilvAに転移させ、株702ilvAΔpuuADRCBE::Cmを取得する。株702ilvAは、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス(VKPM) (ロシア連邦, 117545 モスクワ, 1st Dorozhny proezd, 1)において、2000年7月18日に、受託番号VKPM B-8012の下で寄託された後、2001年5月18日にブダペスト条約の下での寄託に移管された。
E. coli株702ilvA及び702ilvAΔpuuADRCBE::Cmを、L寒天平板上で37℃で18〜24時間別々に培養する。その後、実施例8(L−グルタミン酸の生産)と同一の条件下でこれらの株を培養する。
Claims (8)
- L−アミノ酸の製造方法であって、
(i)腸内細菌科のL−アミノ酸生産細菌を培養培地中で培養し、
(ii)細菌若しくは培養培地又は両方に含まれる前記L−アミノ酸を回収することを含み、
前記細菌が、プトレシン分解経路を破壊するように改変されており、
前記プトレシン分解経路が、グルタミル化プトレシン経路であり、
前記細菌が、エシェリヒア(Escherichia)属に属し、
前記L−アミノ酸が、L−アルギニン又はL−オルニチンである、方法。 - 前記プトレシン分解経路が、puuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びこれらの組合せからなる群から選択される1又は数個の遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、請求項1に記載の方法。
- さらに、puuR遺伝子の発現が減弱されている、請求項2に記載の方法。
- 前記プトレシン分解経路が、少なくともpuuA遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プトレシン分解経路が、puuA遺伝子又は全puuADRCBE遺伝子クラスタの発現の減弱
によって破壊されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記発現が、前記1又は数個の遺伝子又は前記遺伝子クラスタの不活性化のために減弱している、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1又は数個の遺伝子又は前記遺伝子クラスタが欠失している、請求項6に記載の方法。
- 前記細菌が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
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