JP6195716B2

JP6195716B2 - Anticancer drug resistance diagnostic marker

Info

Publication number: JP6195716B2
Application number: JP2013027405A
Authority: JP
Inventors: 伸之伊勢; 繁樹東山; 信暁武森; 真季黒川
Original assignee: Fujirebio Inc; Ehime University NUC
Current assignee: Fujirebio Inc; Ehime University NUC
Priority date: 2013-02-15
Filing date: 2013-02-15
Publication date: 2017-09-13
Anticipated expiration: 2033-02-15
Also published as: JP2014157057A

Description

本発明は、抗癌剤の効果の診断試薬およびキット、ならびに抗癌剤の効果の試験方法などに関する。 The present invention relates to a diagnostic reagent and kit for the effect of an anticancer agent, a test method for the effect of an anticancer agent, and the like.

従来の細胞障害性抗癌剤とは異なる作用メカニズムを有する抗癌剤として、ゲフィチニブ等の分子標的薬が開発され臨床応用されるようになった。ゲフィチニブ等の分子標的薬は、活性型ＥＧＦＲ変異等の特徴を有する癌細胞に劇的な抗腫瘍効果をもたらすが、従来の細胞障害性抗癌剤と同様に、耐性癌が出現するためそれらによる治療には限界がある。そこで、それらの耐性癌を特徴付けるマーカーにより耐性癌の性質を診断する方法を開発すると共に、それらの癌の増殖を阻害する、あるいは転移を阻害するような治療方法を開発することにより患者の生存延長に寄与することが期待されている。 Molecular target drugs such as gefitinib have been developed and clinically applied as anticancer agents having a different mechanism of action from conventional cytotoxic anticancer agents. Molecular target drugs such as gefitinib have dramatic antitumor effects on cancer cells with characteristics such as active EGFR mutations, but, as with conventional cytotoxic anticancer drugs, resistant cancers appear, so they can be used for treatment with them. There are limits. Therefore, we will develop methods to diagnose the nature of resistant cancers using markers that characterize those resistant cancers, and also extend the survival of patients by developing therapeutic methods that inhibit the growth of those cancers or metastasis. It is expected to contribute to

これまで、ゲフィチニブにより治療された肺癌から生じる耐性癌として、治療ターゲットであるＥＧＦＲに２次的に生じる遺伝子変異（ゲートキーパー変異）を治療中に獲得した癌の出現が耐性癌の５０％程度に同定された。この耐性癌に対してはこの２次変異を有するＥＧＦＲをも阻害可能なＥＧＦＲ阻害剤により克服可能であることが示された。また、ゲフィチニブ治療中にＭＥＴ遺伝子増幅という特徴を獲得した癌の出現が耐性癌の２０％に同定され、この耐性癌に対してはゲフィチニブとＭＥＴ阻害剤の２剤併用により克服し得ることが示された。 Until now, as a resistant cancer arising from lung cancer treated with gefitinib, a gene mutation (gate keeper mutation) secondary to the treatment target EGFR has occurred during the treatment, and the appearance of cancer is about 50% of resistant cancer. Identified. It was shown that this resistant cancer can be overcome by an EGFR inhibitor that can also inhibit EGFR having this secondary mutation. In addition, the appearance of cancer that acquired the feature of MET gene amplification during gefitinib treatment was identified in 20% of resistant cancers, and it was shown that this resistant cancer can be overcome by the combined use of gefitinib and MET inhibitor. It was done.

しかしながら、ゲフィチニブ耐性肺癌には未知の性質を有し、治療方法が確立されていないものも存在する。また、ＥＧＦＲ以外をターゲットとする分子標的薬に対して耐性となった肺癌、あるいは他の癌種で分子標的薬に耐性となった耐性癌においてもどのような性質の耐性癌が生じ、どのような治療方法が有効であるかは未知である。 However, some gefitinib-resistant lung cancers have unknown properties and have not yet been established for treatment. What kind of resistant cancer occurs in lung cancer that has become resistant to molecular targeted drugs other than EGFR, or resistant cancer that has become resistant to molecular targeted drugs in other cancer types, It is unclear whether a different treatment method is effective.

ところで、癌遺伝子である受容体型チロシンキナーゼＡＸＬについては、以下の報告がある。
非特許文献１では、ＡＸＬが発現亢進することによりＥＧＦＲ阻害剤に対して耐性を獲得する肺癌の存在が同定されており、また、このような耐性癌細胞はＡＸＬの発現または活性を阻害することにより増殖及び運動能を抑制することが可能であることが示されている。
非特許文献２では、癌細胞から可溶性ＡＸＬが分泌されることが示されている。 By the way, the receptor tyrosine kinase AXL which is an oncogene has the following reports.
Non-Patent Document 1 identifies the presence of lung cancer that acquires resistance to EGFR inhibitors by enhancing expression of AXL, and that such resistant cancer cells inhibit the expression or activity of AXL. It has been shown that it is possible to suppress proliferation and motility.
Non-Patent Document 2 shows that soluble AXL is secreted from cancer cells.

ＮａｔＧｅｎｅｔ．２０１２Ｊｕｌ１；４４（８）：８５２−６０Nat Genet. 2012 Jul 1; 44 (8): 852-60 ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．１９９６Ｓｅｐ；１６８（３）：７３７−４４J Cell Physiol. 1996 Sep; 168 (3): 737-44.

本発明の目的は、癌に対する抗癌剤の治療効果の簡便な判定を実現することである。 An object of the present invention is to realize a simple determination of the therapeutic effect of an anticancer agent against cancer.

本発明者らは、抗癌剤に対する耐性を獲得した癌細胞から分泌されるタンパク質について鋭意検討した結果、受容体型チロシンキナーゼＡＸＬの細胞外ドメインフラグメントが、抗癌剤に耐性の癌などに対する特異的なバイオマーカーとして利用できることを見出した。したがって、本発明者らは、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定することにより、癌に対する抗癌剤の治療効果を簡便に判定し得ることを着想し、本願発明を完成するに至った。
As a result of intensive studies on proteins secreted from cancer cells that have acquired resistance to anticancer agents, the inventors have found that the extracellular domain fragment of receptor tyrosine kinase AXL is a specific biomarker for cancer resistant to anticancer agents. I found that it can be used. Therefore, the present inventors have conceived that the therapeutic effect of an anticancer agent on cancer can be easily determined by measuring the concentration of AXL extracellular domain fragment, and have completed the present invention.

すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む、癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬。
〔２〕ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに対する抗体である、〔１〕の診断試薬。
〔３〕抗癌剤が肺癌に対する抗癌剤である、〔１〕または〔２〕の診断試薬。
〔４〕抗癌剤の効果が抗癌剤に対する耐性である、〔１〕〜〔３〕のいずれかの診断試薬。
〔５〕抗癌剤がＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＴ阻害剤およびプラチナ製剤からなる群より選ばれる１以上の抗癌剤である、〔４〕の診断試薬。
〔６〕抗癌剤の効果が、ＡＸＬ阻害剤に対する感受性である、〔１〕〜〔３〕のいずれかの診断試薬。
〔７〕ＡＸＬ阻害剤に対する感受性が、ＡＸＬ阻害剤による癌の増殖および／または浸潤および／または転移の抑制である、〔６〕の診断試薬。
〔８〕ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質、およびＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントを含む、癌に対する抗癌剤の効果の診断キット。
〔９〕以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、癌に対する抗癌剤の効果の試験方法：
（ａ）被験体由来の生体サンプル中のＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程；および
（ｂ）測定されたＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程。 That is, the present invention is as follows.
[1] A diagnostic reagent for the effect of an anticancer agent on cancer, comprising a substance having affinity for an AXL extracellular domain fragment.
[2] The diagnostic reagent according to [1], wherein the substance having affinity for the AXL extracellular domain fragment is an antibody against the AXL extracellular domain fragment.
[3] The diagnostic reagent according to [1] or [2], wherein the anticancer agent is an anticancer agent against lung cancer.
[4] The diagnostic reagent according to any one of [1] to [3], wherein the effect of the anticancer agent is resistance to the anticancer agent.
[5] The diagnostic reagent according to [4], wherein the anticancer agent is one or more anticancer agents selected from the group consisting of an EGFR inhibitor, a MET inhibitor, and a platinum preparation.
[6] The diagnostic reagent according to any one of [1] to [3], wherein the effect of the anticancer agent is sensitivity to an AXL inhibitor.
[7] The diagnostic reagent according to [6], wherein the sensitivity to the AXL inhibitor is suppression of cancer growth and / or invasion and / or metastasis by the AXL inhibitor.
[8] A diagnostic kit for the effect of an anticancer agent on cancer, comprising a substance having affinity for an AXL extracellular domain fragment, and the AXL extracellular domain fragment.
[9] A method for testing the effect of an anticancer agent on cancer, comprising the following steps (a) and (b):
(A) measuring the concentration of AXL extracellular domain fragment in a biological sample derived from a subject; and (b) measuring the measured concentration of AXL extracellular domain fragment, the concentration of AXL extracellular domain fragment and an anticancer agent against cancer Comparing with criteria indicating a relationship between the effects of

本発明によれば、癌に対する抗癌剤（例、ＥＧＦＲ阻害剤およびＭＥＴ阻害剤等の分子標的薬ならびにプラチナ製剤）の治療効果を簡便に判定でき、また、癌に対する抗癌剤の治療効果を簡便にモニタリングできる。例えば、本発明によれば、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントを測定することにより、抗癌剤治療前の癌細胞の集団における、ＥＧＦＲ阻害剤耐性能を有するＡＸＬ陽性癌細胞の存在を診断すること、ひいては、癌に対するＥＧＦＲ阻害剤の効果を予測することが可能である。また、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントを測定することにより、抗癌剤治療中に抗癌剤に耐性を獲得したＡＸＬ陽性癌細胞の出現を診断すること、ひいては、癌に対する抗癌剤の効果を予測することが可能である。また、プラチナ製剤等の細胞障害性抗癌剤による治療中に耐性を獲得するとともに副次的にＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性をも獲得したＡＸＬ陽性癌細胞の出現を診断することも可能である。さらに、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントを測定することにより、ＡＸＬ阻害剤に感受性の癌を診断すること、例えば、ＡＬＸ阻害剤により癌の増殖および／または癌の浸潤および／または転移を抑制する治療が有効な癌を予測することが可能である。
また、本発明によれば、抗癌剤に耐性の癌で多量のＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントが認められること、ならびにこのような多量のＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの測定は容易であることから、癌に対する抗癌剤の治療効果を容易に判定できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the therapeutic effect of the anticancer agent (for example, molecular target drugs and platinum preparations, such as an EGFR inhibitor and a MET inhibitor) with respect to cancer can be determined easily, and the therapeutic effect of the anticancer agent with respect to cancer can be monitored easily. . For example, according to the present invention, diagnosing the presence of AXL-positive cancer cells having EGFR inhibitor resistance in a population of cancer cells prior to anticancer drug treatment by measuring AXL extracellular domain fragments, and thus cancer It is possible to predict the effect of an EGFR inhibitor on. Further, by measuring the AXL extracellular domain fragment, it is possible to diagnose the appearance of AXL-positive cancer cells that have acquired resistance to the anticancer agent during anticancer agent treatment, and thus to predict the effect of the anticancer agent on cancer. It is also possible to diagnose the appearance of AXL-positive cancer cells that have acquired resistance during treatment with a cytotoxic anticancer agent such as a platinum preparation and secondaryly acquired resistance to an EGFR inhibitor. Furthermore, by measuring the AXL extracellular domain fragment, diagnosis of a cancer sensitive to an AXL inhibitor, for example, treatment that suppresses cancer growth and / or cancer invasion and / or metastasis with an ALX inhibitor is effective Can be predicted.
In addition, according to the present invention, since a large amount of AXL extracellular domain fragment is observed in a cancer resistant to an anticancer agent, and measurement of such a large amount of AXL extracellular domain fragment is easy, The therapeutic effect can be easily determined.

図１は、ヒト非小細胞肺癌に由来する種々の細胞（ＨＣＣ４００６、ＧＲ２ｗ、ＧＲ１ｍ、ＧＲ３ｍ、およびＧＲ５ｍ）のＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）感受性を示す図である（ｎ＝４）。ＨＣＣ４００６は、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）感受性細胞ＨＣＣ４００６を表す。ＧＲ２ｗ、ＧＲ１ｍ、ＧＲ３ｍ、およびＧＲ５ｍは、それぞれ、ＨＣＣ４００６を２週間、１ヶ月、３ヶ月および５ヶ月ゲフィチニブに暴露することにより樹立されたＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）耐性細胞を表す。略号は、以下同様である。FIG. 1 shows the sensitivity of various cells derived from human non-small cell lung cancer (HCC4006, GR2w, GR1m, GR3m, and GR5m) to EGFR inhibitors (gefitinib) (n = 4). HCC4006 represents the EGFR inhibitor (gefitinib) sensitive cell HCC4006. GR2w, GR1m, GR3m, and GR5m represent EGFR inhibitor (gefitinib) resistant cells established by exposing HCC4006 to gefitinib for 2 weeks, 1 month, 3 months, and 5 months, respectively. The abbreviations are the same below. 図２は、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）感受性細胞（ＨＣＣ４００６）、および種々のＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）耐性細胞（ＧＲ２ｗ、ＧＲ１ｍ、ＧＲ３ｍ、およびＧＲ５ｍ）におけるＡＸＬ発現および可溶性ＡＸＬ分泌、ならびにＥＭＴマーカーの発現を示す図である。ｓＡＸＬおよびＡＸＬは、ぞれぞれ、可溶性ＡＸＬおよび全長ＡＸＬを表す。略号は、以下同様である。FIG. 2 shows AXL expression and soluble AXL secretion and expression of EMT markers in EGFR inhibitor (gefitinib) sensitive cells (HCC4006) and various EGFR inhibitor (gefitinib) resistant cells (GR2w, GR1m, GR3m, and GR5m). FIG. sAXL and AXL represent soluble AXL and full-length AXL, respectively. The abbreviations are the same below. 図３は、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）感受性細胞（ＨＣＣ４００６）、および当該感受性細胞から分画された細胞（ＨＣＣ４００６−ＡＸＬ^＋およびＨＣＣ４００６−ＡＸＬ^＋−ＴＷ）の、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）に対する耐性を示す図である（ｎ＝４）。ＨＣＣ４００６−ＡＸＬ^＋は、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）感受性細胞（ＨＣＣ４００６）から分画されたＡＸＬ陽性細胞を表す。ＨＣＣ４００６−ＡＸＬ^＋−ＴＷは、このようなＡＸＬ陽性細胞から分画された、高い運動能を有する細胞を表す。FIG. 3 shows the resistance of EGFR inhibitor (gefitinib) sensitive cells (HCC4006) and cells fractionated from the sensitive cells (HCC4006-AXL ⁺ and HCC4006-AXL ⁺ -TW) to EGFR inhibitors (gefitinib). (N = 4). HCC4006-AXL ⁺ represents AXL positive cells fractionated from EGFR inhibitor (gefitinib) sensitive cells (HCC4006). HCC4006-AXL ⁺ -TW represents cells with high motility that are fractionated from such AXL positive cells. 図４は、ヒト非小細胞肺癌に由来する種々の細胞（ＨＣＣ８２７、ＧＲ５ｍおよびＧＲＰＲ）のＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）および／またはＭＥＴ阻害剤（ＰＨＡ−６６５７５２）感受性を示す図である（ｎ＝４）。ＨＣＣ８２７は、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）感受性細胞ＨＣＣ８２７を表す。ＧＲ５ｍは、ＨＣＣ８２７を５ヶ月ゲフィチニブに暴露することにより樹立されたゲフィチニブ耐性細胞を表す。ＧＲＰＲは、ＨＣＣ８２７をゲフィチニブに３ヶ月暴露し、次いでＰＨＡ−６６５７５２に３ヶ月暴露することにより樹立された、ゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５７５２の双方に耐性である細胞（ＨＣＣ８２７−ＧＲＰＲ）を表す。Ｇ−Ｐ−：ゲフィチニブおよびＰＨＡ−６６５７５２の双方の非存在下で処理；Ｇ＋Ｐ−：ゲフィチニブ（１μＭ）の存在下およびＰＨＡ−６６５７５２の非存在下で処理；Ｇ−Ｐ＋：ゲフィチニブの非存在下およびＰＨＡ−６６５７５２（１μＭ）の存在下で処理；Ｇ＋Ｐ＋：ゲフィチニブ（１μＭ）およびＰＨＡ−６６５７５２（１μＭ）の双方の存在下で処理。略号は、以下同様である。FIG. 4 shows the sensitivity of various cells derived from human non-small cell lung cancer (HCC827, GR5m and GRPR) to EGFR inhibitor (gefitinib) and / or MET inhibitor (PHA-665752) (n = 4). ). HCC827 represents the EGFR inhibitor (gefitinib) sensitive cell HCC827. GR5m represents gefitinib resistant cells established by exposing HCC827 to gefitinib for 5 months. GRPR represents cells that are resistant to both gefitinib and PHA-665752 (HCC827-GRPR) established by exposing HCC827 to gefitinib for 3 months and then to PHA-665752 for 3 months. G-P-: treatment in the absence of both gefitinib and PHA-666552; G + P-: treatment in the presence of gefitinib (1 μM) and in the absence of PHA-665575; G-P +: in the absence of gefitinib and Treatment in the presence of PHA-666552 (1 μM); G + P +: treatment in the presence of both gefitinib (1 μM) and PHA-665752 (1 μM). The abbreviations are the same below. 図５は、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）感受性細胞（ＨＣＣ８２７）、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）耐性細胞（ＧＲ５ｍ）、ならびにＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）およびＭＥＴ阻害剤（ＰＨＡ−６６５７５２）耐性細胞（ＧＲＰＲ）におけるＡＸＬ発現およびｓＡＸＬ分泌、ならびにＥＭＴマーカーの発現を示す図である。ｓＭＥＴおよびＭＥＴは、ぞれぞれ、可溶性ＭＥＴおよび全長ＭＥＴを表す。略号は、以下同様である。FIG. 5 shows in EGFR inhibitor (gefitinib) sensitive cells (HCC827), EGFR inhibitor (gefitinib) resistant cells (GR5m), and EGFR inhibitor (gefitinib) and MET inhibitor (PHA-666552) resistant cells (GRPR). It is a figure which shows AXL expression and sAXL secretion, and expression of an EMT marker. sMET and MET represent soluble MET and full-length MET, respectively. The abbreviations are the same below. 図６は、ＭＥＴ阻害剤（ＰＨＡ−６６５７５２）感受性細胞（Ｈ１９９３）、およびＭＥＴ阻害剤（ＰＨＡ−６６５７５２）耐性細胞（ＰＲ５ｍ、ＰＲ５ｍ−ＡＸＬ^＋およびＰＲ５ｍ−ＴＷ）におけるＡＸＬ発現およびｓＡＸＬ分泌、ならびにＥＭＴマーカーの発現を示す図である。Ｈ１９９３は、ＭＥＴ阻害剤（ＰＨＡ−６６５７５２）感受性細胞Ｈ１９９３を表す。ＰＲ５ｍは、Ｈ１９９３を５ヶ月ＰＨＡ−６６５７５２に暴露することにより樹立されたＰＨＡ−６６５７５２耐性細胞を表す。ＰＲ５ｍ−ＡＸＬ^＋は、耐性細胞ＰＲ５ｍから分画されたＡＸＬ陽性細胞を表す。ＰＲ５ｍ−ＴＷは、耐性細胞ＰＲ５ｍから分画された、高い運動能を有する細胞を表す。略号は、以下同様である。FIG. 6 shows AXL expression and sAXL secretion in MET inhibitor (PHA-665752) sensitive cells (H1993) and MET inhibitor (PHA-666552) resistant cells (PR5m, PR5m-AXL ⁺ and PR5m-TW), and EMT. It is a figure which shows expression of a marker. H1993 represents a MET inhibitor (PHA-665752) sensitive cell H1993. PR5m represents PHA-665752 resistant cells established by exposing H1993 to 5 months PHA-666552. PR5m-AXL ⁺ represents AXL positive cells fractionated from resistant cells PR5m. PR5m-TW represents a cell with high motility that is fractionated from the resistant cell PR5m. The abbreviations are the same below. 図７は、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）感受性細胞（ＨＣＣ４００６）、およびプラチナ製剤（シスプラチン）耐性細胞（ＨＣＣ４００６−ＣＲおよびＨＣＣ４００６−ＣＲ−ＧＲ）におけるＡＸＬ発現およびｓＡＸＬ分泌、ならびにＥＭＴマーカーの発現を示す図である。ＨＣＣ４００６は、ゲフィチニブ感受性肺癌細胞ＨＣＣ４００６を表す。ＨＣＣ４００６−ＣＲは、ＨＣＣ４００６を４ヶ月シスプラチンに暴露することにより樹立されたシスプラチン耐性細胞を表す。ＨＣＣ４００６−ＣＲ−ＧＲは、ＨＣＣ４００６−ＣＲを１μＭゲフィチニブに２週間暴露することにより樹立された、シスプラチンおよびゲフィチニブの双方に耐性である細胞を表す。略号は、以下同様である。FIG. 7 shows AXL expression and sAXL secretion and expression of EMT markers in EGFR inhibitor (gefitinib) sensitive cells (HCC4006) and platinum preparation (cisplatin) resistant cells (HCC4006-CR and HCC4006-CR-GR). It is. HCC4006 represents gefitinib-sensitive lung cancer cell HCC4006. HCC4006-CR represents cisplatin resistant cells established by exposing HCC4006 to cisplatin for 4 months. HCC4006-CR-GR represents cells resistant to both cisplatin and gefitinib established by exposing HCC4006-CR to 1 μM gefitinib for 2 weeks. The abbreviations are the same below. 図８は、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）感受性細胞（ＨＣＣ４００６）のＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）に対する感受性、ならびにプラチナ製剤（シスプラチン）耐性細胞（ＨＣＣ４００６−ＣＲおよびＨＣＣ４００６−ＣＲ−ＧＲ）のＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）に対する耐性を示す図である（ｎ＝４）。FIG. 8 shows the sensitivity of EGFR inhibitor (gefitinib) sensitive cells (HCC4006) to EGFR inhibitor (gefitinib), and platinum preparation (cisplatin) resistant cells (HCC4006-CR and HCC4006-CR-GR) EGFR inhibitors (gefitinib) It is a figure which shows the tolerance with respect to (n = 4). 図９は、ヒト非小細胞肺癌に由来する種々の細胞（ＨＣＣ４００６、ＧＲ２ｗ、およびＧＲ５ｍ）の運動能を示す図である（ｎ＝３）。FIG. 9 is a diagram showing the motility of various cells (HCC4006, GR2w, and GR5m) derived from human non-small cell lung cancer (n = 3). 図１０は、ヒト非小細胞肺癌に由来する種々の細胞（Ｈ１９９３、ＰＲ５ｍ、ＰＲ５ｍ−ＡＸＬ^＋、およびＰＲ５ｍ−ＴＷ）の運動能を示す図である（ｎ＝３）。FIG. 10 is a diagram showing the motility of various cells derived from human non-small cell lung cancer (H1993, PR5m, PR5m-AXL ⁺ , and PR5m-TW) (n = 3). 図１１は、ヒト非小細胞肺癌に由来する種々の細胞〔ＨＣＣ４００６、ＨＣＣ４００６−ＣＲ（ＣＲ）、およびＨＣＣ４００６−ＣＲ−ＧＲ（ＣＲ−ＧＲ）〕の運動能を示す図である（ｎ＝３）。FIG. 11 is a diagram showing the motility of various cells derived from human non-small cell lung cancer [HCC4006, HCC4006-CR (CR), and HCC4006-CR-GR (CR-GR)] (n = 3). . 図１２は、ＲＮＡ干渉による、プラチナ製剤（シスプラチン）およびＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）耐性細胞（ＨＣＣ４００６−ＣＲ−ＧＲ）におけるＡＸＬ遺伝子の発現阻害を示す図である。ｓｉ−Ｎ．Ｃ．は、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを示す。ｓｉ−ＡＸＬ−１、ｓｉ−ＡＸＬ−２、およびｓｉ−ＡＸＬ−３の標的配列は、実施例に示したとおりである。FIG. 12 is a graph showing inhibition of AXL gene expression in platinum preparation (cisplatin) and EGFR inhibitor (gefitinib) resistant cells (HCC4006-CR-GR) by RNA interference. si-N. C. Indicates negative control siRNA. The target sequences of si-AXL-1, si-AXL-2, and si-AXL-3 are as shown in the examples. 図１３は、ＲＮＡ干渉によりＡＸＬ遺伝子の発現が阻害されたプラチナ製剤（シスプラチン）およびＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）耐性細胞（ＨＣＣ４００６−ＣＲ−ＧＲ）の運動能を示す図である（ｎ＝３）。FIG. 13 is a diagram showing the motility of platinum preparation (cisplatin) and EGFR inhibitor (gefitinib) resistant cells (HCC4006-CR-GR) in which the expression of AXL gene is inhibited by RNA interference (n = 3).

本発明の試験方法は、以下（ａ）および（ｂ）の工程を含み得る：
（ａ）被験体由来の生体サンプル中のＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程；および
（ｂ）測定されたＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程。 The test method of the present invention may include the following steps (a) and (b):
(A) measuring the concentration of AXL extracellular domain fragment in a biological sample derived from a subject; and (b) measuring the measured concentration of AXL extracellular domain fragment, the concentration of AXL extracellular domain fragment and an anticancer agent against cancer Comparing with criteria indicating a relationship between the effects of

ＡＸＬは、受容体チロシンキナーゼサブファミリーに属し、他の受容体チロシンキナーゼと類似の構造を有するが、免疫グロブリンおよびフィブロネクチンＩＩＩ型の繰り返し配列からなる細胞外ドメインによって特徴付けられる。ＡＸＬは、そのリガンドである成長停止特異的遺伝子６（Ｇａｓ６）として公知のビタミンＫ依存性タンパク質によって活性化され、細胞内シグナル伝達系を介して細胞増殖などを制御する（例えば、Ｏ‘Ｂｒｙａｎら、ＭｏｌｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９１,Ｖｏｌ．１１,Ｎｏ．１０，ｐｐ．５０１６−５０３１を参照。また、ヒトＡＸＬについては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１６９９．４を参照のこと。） AXL belongs to the receptor tyrosine kinase subfamily and has a similar structure to other receptor tyrosine kinases, but is characterized by an extracellular domain consisting of immunoglobulin and fibronectin type III repeats. AXL is activated by a vitamin K-dependent protein known as its ligand, growth arrest-specific gene 6 (Gas6), and controls cell proliferation and the like via an intracellular signal transduction system (for example, O'Bryan et al. (See Molecular and Cellular Biology, 1991, Vol. 11, No. 10, pp. 5016-5031. For human AXL, see GenBank Accession Number: NP_001699.4.)

本明細書中で用いられる場合、用語「ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメント」とは、外部ドメイン排出（ＥｃｔｏｄｏｍａｉｎＳｈｅｄｄｉｎｇ）により排出されるＡＸＬ細胞外ドメインのポリペプチド（即ち、可溶性ＡＸＬ）またはそのポリペプチドの分解産物をいう。本明細書では、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントを、可溶性ＡＸＬということがある。 As used herein, the term “AXL extracellular domain fragment” refers to a polypeptide of AXL extracellular domain that is excreted by ectodomain shedding (ie, soluble AXL) or degradation of the polypeptide. A product. In the present specification, the AXL extracellular domain fragment is sometimes referred to as soluble AXL.

上記（ａ）において、被験体としては、癌に罹患している哺乳動物、または癌に罹患している可能性がある哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類、愛玩動物、使役動物が挙げられる。具体的には、哺乳動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、マウス、ラットが挙げられるが、好ましくは、ヒトである。 In the above (a), examples of the subject include a mammal suffering from cancer or a mammal possibly having cancer. Examples of mammals include primates, pets, and working animals. Specific examples of mammals include humans, chimpanzees, dogs, cats, cows, sheep, horses, pigs, rabbits, mice, and rats, with humans being preferred.

本明細書中で用いられる場合、用語「癌」とは、ＡＸＬ遺伝子の増幅を伴い得る癌をいう。このような癌としては、例えば、肺癌（例、扁平上皮がん、腺がんおよび大細胞がん等の非小細胞癌、ならびに小細胞癌）、消化器系癌（例、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、肉腫、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、固形癌、上皮性癌、中皮腫が挙げられる。 As used herein, the term “cancer” refers to a cancer that can be accompanied by amplification of the AXL gene. Examples of such cancer include lung cancer (eg, squamous cell carcinoma, non-small cell cancer such as adenocarcinoma and large cell cancer, and small cell cancer), digestive system cancer (eg, stomach cancer, small intestine cancer). , Colorectal cancer, rectal cancer), pancreatic cancer, kidney cancer, liver cancer, thymus cancer, spleen cancer, thyroid cancer, adrenal cancer, prostate cancer, bladder cancer, ovarian cancer, uterine cancer (eg, endometrial cancer, cervix) Cancer), bone cancer, skin cancer, brain tumor, sarcoma, melanoma, blastoma (eg, neuroblastoma), adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, solid cancer, epithelial cancer, mesothelioma.

好ましい被験体の例は、特定の抗癌剤による治療が検討されている癌患者である。特定の抗癌剤としては、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＴ阻害剤およびＡＸＬ阻害剤等の分子標的薬、ならびにプラチナ製剤等のＤＮＡ複製阻害剤が挙げられる。ＥＧＦＲ阻害剤としては、例えば、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ＺＤ６４７４、ＣＬ−３８７７８５、ＨＫＩ−２７２、ＸＬ６４７、ＰＤ１５３０３５、ＣＩ−１０３３、ＡＥＥ７８８、ＢＩＢＷ−２９９２、ＥＫＢ−５６９、ＰＦ−２９９８０４が挙げられる。ＭＥＴ阻害剤としては、例えば、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＸＬ−８８０、ＸＬ−１８４、ＡＲＱ１９７、ＡＭＧ２０８、ＡＭＧ４５８、ＣＥ−３５５６２１、ＭＰ４７０が挙げられる。ＡＸＬ阻害剤としては、例えば、Ｒ４２８、ＭＰ４７０、ＸＬ８８０、ＢＭＳ７７７６０７が挙げられる。プラチナ製剤としては、例えば、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏxａｌｉｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）が挙げられる。 An example of a preferred subject is a cancer patient that is being treated with a particular anticancer agent. Specific anticancer agents include, for example, molecular target drugs such as EGFR inhibitors, MET inhibitors and AXL inhibitors, and DNA replication inhibitors such as platinum preparations. Examples of the EGFR inhibitor include gefitinib, erlotinib, cetuximab, lapatinib, ZD6474, CL-387785, HKI-272, XL647, PD6473B, E6473 2992, EKB-569, PF-299804. Examples of the MET inhibitor include PHA-665752, SU11274, XL-880, XL-184, ARQ 197, AMG208, AMG458, CE-355621, and MP470. Examples of the AXL inhibitor include R428, MP470, XL880, and BMS777607. Examples of the platinum preparation include cisplatin, oxaliplatin, carboplatin, and nedaplatin.

好ましい被験体の別の例は、特定の抗癌剤による治療効果がモニタリングされている癌患者である。癌患者はまた、特定の抗癌剤による治療効果の低下が認められた場合に、別の抗癌剤による治療に切り替えるかどうかの判断が求められている患者であってもよい。抗癌剤は、上述した抗癌剤と同様であり得る。 Another example of a preferred subject is a cancer patient whose therapeutic effect by a particular anticancer agent is being monitored. The cancer patient may also be a patient who is required to determine whether or not to switch to treatment with another anticancer agent when a decrease in the therapeutic effect with a specific anticancer agent is observed. The anticancer agent can be the same as the anticancer agent described above.

本発明において用いられ得る生体サンプルは、上述の被験体から採取された生体サンプルであり得る。生体サンプルは、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントが存在するサンプルである限り特に限定されず、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、腹水、組織試料、細胞試料、組織抽出液、細胞抽出液が挙げられる。なお、侵襲性の低さの観点からは、上記のうち、血液、血清、血漿、尿、唾液が好ましい。必要に応じて、生体サンプルは、測定前に、事前に処理されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、濃縮、分画、細胞固定、組織固定、組織凍結、組織薄片化が挙げられる。 The biological sample that can be used in the present invention can be a biological sample collected from the subject described above. The biological sample is not particularly limited as long as the AXL extracellular domain fragment is present, and examples thereof include blood, serum, plasma, urine, saliva, ascites, tissue sample, cell sample, tissue extract, and cell extract. It is done. Of these, blood, serum, plasma, urine, and saliva are preferable from the viewpoint of low invasiveness. If necessary, the biological sample may be processed in advance prior to measurement. Examples of such treatment include centrifugation, extraction, concentration, fractionation, cell fixation, tissue fixation, tissue freezing, and tissue thinning.

ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度の測定は、例えば、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに対して親和性を有する物質（後述）を用いて行うことができる。測定はまた、免疫学的手法により行なわれてもよい。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、ラテックス凝集法が挙げられる。ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度の測定を可能とする上記以外の方法としては、例えば、ＬＣ−ＭＳが挙げられる。 The concentration of the AXL extracellular domain fragment can be measured using, for example, a substance having affinity for the AXL extracellular domain fragment (described later). Measurement may also be performed by immunological techniques. Examples of such immunological techniques include enzyme immunoassay (EIA) (eg, direct competition ELISA, indirect competition ELISA, sandwich ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), Examples include immunochromatography, luminescence immunoassay, spin immunoassay, western blot, and latex agglutination. Examples of methods other than the above that enable measurement of the concentration of the AXL extracellular domain fragment include LC-MS.

上記（ｂ）において、測定されたＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度が、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較され得る。基準は、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度の高低と、抗癌剤の効果の強弱（抗癌剤への感受性または耐性）との間の相対的な関係を示すものであり得る。例えば、測定されたＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い場合には、ＡＸＬ阻害剤の治療効果が高い可能性があり、または他の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤およびＭＥＴ阻害剤等の分子標的薬、ならびにプラチナ製剤等のＤＮＡ複製阻害剤）の治療効果が低い可能性がある。また、測定されたＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い場合には、ＡＸＬ阻害剤の治療効果が低い可能性があり、または他の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤およびＭＥＴ阻害剤等の分子標的薬、ならびにプラチナ製剤等のＤＮＡ複製阻害剤）の治療効果が高い可能性がある。本発明の場合、基準として、特定の基準値を設けてもよい。このような基準値として、ＡＸＬ阻害剤に感受性である患者、または他の抗癌剤に耐性である患者で高い陽性率（基準値以上）を示し、かつ、ＡＸＬ阻害剤に耐性である患者、または他の抗癌剤に感受性である患者で高い陰性率（基準値未満）を示し得る、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度を設定してもよい。このような基準値の例は、カットオフ値である。基準値の算出方法は、本分野において周知である。 In (b) above, the measured concentration of AXL extracellular domain fragment can be compared to a criterion indicating the relationship between the concentration of AXL extracellular domain fragment and the effect of an anticancer agent on cancer. The criteria may indicate a relative relationship between high and low concentrations of AXL extracellular domain fragment and the strength of the anticancer drug's effect (sensitivity or resistance to the anticancer drug). For example, if the measured concentration of AXL extracellular domain fragment is relatively high, the therapeutic effect of the AXL inhibitor may be high, or other anticancer agents (eg, EGFR inhibitors and MET as described above) The therapeutic effect of molecular target drugs such as inhibitors and DNA replication inhibitors such as platinum preparations may be low. Also, if the measured concentration of AXL extracellular domain fragment is relatively low, the therapeutic effect of the AXL inhibitor may be low, or other anticancer agents (eg, EGFR inhibitors and MET as described above) There is a possibility that therapeutic effects of molecular target drugs such as inhibitors and DNA replication inhibitors such as platinum preparations) are high. In the case of the present invention, a specific reference value may be provided as a reference. As such a reference value, a patient who is sensitive to an AXL inhibitor, a patient who is resistant to other anticancer agents, shows a high positive rate (above the reference value), and is resistant to an AXL inhibitor, or others The concentration of AXL extracellular domain fragment that may show a high negative rate (less than the reference value) in patients sensitive to other anticancer agents may be set. An example of such a reference value is a cutoff value. The calculation method of the reference value is well known in this field.

本発明によれば、癌患者が、特定の抗癌剤に対して感受性であるのか、または耐性であるのかを判定することができる。このような判定は、例えば、被験体に投与する抗癌剤の決定に有用である。例えば、測定されたＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い場合には、癌患者は、ＡＸＬ阻害剤に対して感受性である可能性があり、ＡＸＬ阻害剤による治療効果が高い可能性がある。また、この場合には、癌の浸潤および／または転移が生じる可能性が相対的に高いと考えられる。さらに、この場合には、他の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤およびＭＥＴ阻害剤等の分子標的薬、ならびにプラチナ製剤等のＤＮＡ複製阻害剤）に対して耐性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が低い可能性がある。一方、測定されたＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い場合には、癌患者は、ＡＸＬ阻害剤に対して耐性である可能性があり、ＡＸＬ阻害剤による治療効果が低い可能性がある。また、この場合には、癌の浸潤および／または転移が生じる可能性が相対的に低いと考えられる。さらに、この場合には、他の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤およびＭＥＴ阻害剤等の分子標的薬、ならびにプラチナ製剤等のＤＮＡ複製阻害剤）に対して感受性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が高い可能性がある。 According to the present invention, it can be determined whether a cancer patient is sensitive or resistant to a specific anticancer agent. Such determination is useful, for example, for determining an anticancer agent to be administered to a subject. For example, if the measured concentration of AXL extracellular domain fragment is relatively high, the cancer patient may be sensitive to an AXL inhibitor and may have a high therapeutic effect with the AXL inhibitor. is there. In this case, it is considered that the possibility of cancer invasion and / or metastasis is relatively high. Furthermore, in this case, there is a possibility that it is resistant to other anticancer agents (eg, molecular target drugs such as EGFR inhibitor and MET inhibitor as described above, and DNA replication inhibitors such as platinum preparations). The therapeutic effect of the anticancer agent may be low. On the other hand, if the measured concentration of AXL extracellular domain fragment is relatively low, the cancer patient may be resistant to the AXL inhibitor and the therapeutic effect of the AXL inhibitor may be low is there. In this case, it is considered that the possibility of cancer invasion and / or metastasis is relatively low. Furthermore, in this case, it may be sensitive to other anticancer agents (eg, molecular target drugs such as EGFR inhibitors and MET inhibitors as described above, and DNA replication inhibitors such as platinum preparations). The therapeutic effect of the anticancer drug may be high.

また、本発明によれば、特定の抗癌剤による治療効果を経時的にモニタリングすることができる。このようなモニタリングは、例えば、特定の抗癌剤による治療効果の低下が認められた場合に、別の抗癌剤による治療に切り替えるかどうかの判断に有用である。例えば、測定されたＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い状態が維持されている場合には、癌患者は依然として、ＡＸＬ阻害剤に対して感受性である可能性があり、ＡＸＬ阻害剤による治療効果が引き続き高い可能性がある。また、この場合には、依然として、他の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤およびＭＥＴ阻害剤等の分子標的薬、ならびにプラチナ製剤等のＤＮＡ複製阻害剤）に対して耐性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が低い可能性がある。一方、測定されたＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い状態が維持されている場合には、癌患者は依然として、ＡＸＬ阻害剤に対して耐性である可能性があり、ＡＸＬ阻害剤による治療効果が引き続き低い可能性がある。また、この場合には、依然として、他の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤およびＭＥＴ阻害剤等の分子標的薬、ならびにプラチナ製剤等のＤＮＡ複製阻害剤）に対して感受性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が引き続き高い可能性がある。 Moreover, according to the present invention, it is possible to monitor the therapeutic effect of a specific anticancer agent over time. Such monitoring is useful, for example, in determining whether or not to switch to treatment with another anticancer agent when a decrease in treatment effect with a specific anticancer agent is observed. For example, if the measured concentration of AXL extracellular domain fragment remains relatively high, cancer patients may still be sensitive to AXL inhibitors and are The therapeutic effect may continue to be high. In this case, it may still be resistant to other anticancer agents (eg, molecular target drugs such as EGFR inhibitors and MET inhibitors as described above, and DNA replication inhibitors such as platinum preparations). There is a possibility that the therapeutic effect of the anticancer drug is low. On the other hand, if the measured concentration of AXL extracellular domain fragment remains relatively low, the cancer patient may still be resistant to the AXL inhibitor, and the AXL inhibitor The therapeutic effect may continue to be low. In this case, it may still be sensitive to other anticancer agents (eg, molecular target drugs such as EGFR inhibitors and MET inhibitors as described above, and DNA replication inhibitors such as platinum preparations). There is a possibility that the therapeutic effect of the anticancer drug will continue to be high.

さらに、本発明によれば、癌患者において、癌の浸潤および／または転移が生じる可能性が高いのか、または低いのかを判定することができる。このような判定は、例えば、癌患者の予後の予測に有用である。例えば、測定されたＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い場合には、癌の浸潤および／または転移が生じる可能性が相対的に高いと考えられる。一方、測定されたＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い場合には、癌の浸潤および／または転移が生じる可能性が相対的に低いと考えられる。 Furthermore, according to the present invention, it is possible to determine whether cancer invasion and / or metastasis is likely to occur or not in cancer patients. Such determination is useful for predicting the prognosis of cancer patients, for example. For example, if the measured concentration of AXL extracellular domain fragment is relatively high, it is likely that cancer invasion and / or metastasis is likely to occur. On the other hand, if the measured concentration of AXL extracellular domain fragment is relatively low, it is considered that the likelihood of cancer invasion and / or metastasis is relatively low.

本発明の試験方法は、上記（ｂ）の代わりに、（ｂ’）測定されたＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントの濃度を指標として、癌に対する抗癌剤の効果を判断する工程を含んでいてもよい。本工程は、上記（ｂ）と同様に行うことができる。本発明の試験方法はまた、このような判断に基づき、投与する抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＴ阻害剤およびＡＸＬ阻害剤等の分子標的薬、ならびにプラチナ製剤等のＤＮＡ複製阻害剤）を決定する工程、および／または投与する抗癌剤を別の抗癌剤（例、ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＴ阻害剤およびＡＸＬ阻害剤等の分子標的薬、ならびにプラチナ製剤等のＤＮＡ複製阻害剤）に切り替えるか否かを決定する工程を含んでいてもよい。本発明の試験方法はさらに、このような決定に基づき、抗癌剤を投与する工程を含んでいてもよい。 The test method of the present invention may include (b ') instead of the above (b), a step of judging the effect of the anticancer agent on cancer using the measured concentration of the AXL extracellular domain fragment as an index. This step can be performed in the same manner as (b) above. The test method of the present invention is also based on such judgment, and inhibits anti-cancer drugs to be administered (eg, molecular target drugs such as EGFR inhibitors, MET inhibitors and AXL inhibitors as described above, and DNA replication inhibition such as platinum preparations). Switching to another anticancer agent (eg, molecular target drug such as EGFR inhibitor, MET inhibitor and AXL inhibitor, and DNA replication inhibitor such as platinum preparation). A step of determining whether or not may be included. The test method of the present invention may further include a step of administering an anticancer agent based on such determination.

本発明は、癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬を提供する。本発明の試薬は、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む。本発明の診断試薬は、キットの形態であってもよい。本発明の診断試薬は、本発明の試験方法を行なうために好適に用いることができる。 The present invention provides a diagnostic reagent for the effect of an anticancer agent on cancer. The reagent of the present invention contains a substance having affinity for the AXL extracellular domain fragment. The diagnostic reagent of the present invention may be in the form of a kit. The diagnostic reagent of the present invention can be suitably used for performing the test method of the present invention.

本明細書中で用いられる場合、用語「ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質」とは、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに結合する能力を有する物質をいう。ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質は、ＡＸＬの細胞外領域からなるポリペプチドまたはその部分ペプチドに親和性を有する物質であり得る。ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質としては、例えば、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに対する抗体、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに対するアプタマー、ならびに成長停止特異的遺伝子６（Ｇａｓ６）およびＡＸＬに結合する能力を保持する成長停止特異的遺伝子６（Ｇａｓ６）変異体が挙げられる。 As used herein, the term “substance having an affinity for an AXL extracellular domain fragment” refers to a substance having the ability to bind to an AXL extracellular domain fragment. The substance having affinity for the AXL extracellular domain fragment may be a substance having affinity for a polypeptide consisting of the extracellular region of AXL or a partial peptide thereof. Substances having affinity for AXL extracellular domain fragments include, for example, antibodies to AXL extracellular domain fragments, aptamers to AXL extracellular domain fragments, and the ability to bind to growth arrest specific gene 6 (Gas6) and AXL A growth arrest specific gene 6 (Gas6) mutant.

ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに対する抗体は、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに特異的に結合し得る抗体である限り特に限定されない。例えば、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体はまた、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２）、組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。抗体は、プレート等の基板上に固定された形態、またはストリップ等の支持体中に含侵された形態で提供されてもよい。抗体は、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチド（例、α鎖の部分ペプチド、β鎖の細胞外領域の部分ペプチド）を抗原として用いて、自体公知の方法により作製できる。抗原は、ｃ−ＭＥＴのアミノ酸配列情報を参考にして適宜作製できる。また、培養癌細胞の上清から得られるＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントを、抗原として用いてもよい。 The antibody against the AXL extracellular domain fragment is not particularly limited as long as it is an antibody that can specifically bind to the AXL extracellular domain fragment. For example, the antibody against the AXL extracellular domain fragment may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The antibody may also be a fragment of an antibody (eg, Fab, F (ab ′) ₂ ), a recombinant antibody (eg, scFv). The antibody may be provided in a form immobilized on a substrate such as a plate or impregnated in a support such as a strip. The antibody can be prepared by a method known per se using an AXL extracellular domain fragment or a partial peptide thereof (eg, a partial peptide of α chain, a partial peptide of extracellular region of β chain) as an antigen. The antigen can be appropriately prepared with reference to the amino acid sequence information of c-MET. Further, an AXL extracellular domain fragment obtained from the supernatant of cultured cancer cells may be used as an antigen.

ポリクローナル抗体は、例えば、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原は、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを、キャリアタンパク質（例、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ）に架橋した複合体であってもよい。抗原を投与する動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。 Polyclonal antibodies can be used, for example, by using the AXL extracellular domain fragment or a partial peptide thereof as an antigen together with a commercially available adjuvant (eg, complete or incomplete Freund's adjuvant) in the animal subcutaneously or intraperitoneally every 2 to 3 weeks. It can be obtained by administering about twice, collecting whole blood about 3 to about 10 days after the final immunization, and purifying the antiserum. The antigen may be a complex in which an AXL extracellular domain fragment or a partial peptide thereof is cross-linked to a carrier protein (eg, bovine serum albumin, KLH). Examples of animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, cows, guinea pigs, and hamsters.

モノクローナル抗体は、例えば、細胞融合法により作製できる。例えば、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに２〜４回皮下または腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、ＮＳ−１）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合としては、ＰＥＧ法、電圧パルス法が挙げられる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等のいずれのアイソタイプであってもよい。 A monoclonal antibody can be prepared, for example, by a cell fusion method. For example, an AXL extracellular domain fragment or a partial peptide thereof is administered to a mouse 2 to 4 times subcutaneously or intraperitoneally with a commercially available adjuvant, and the spleen or lymph node is collected approximately 3 days after the final administration, and leukocytes are collected. The leukocytes and myeloma cells (eg, NS-1) are fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the factor. Examples of cell fusion include a PEG method and a voltage pulse method. A hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a well-known EIA or RIA method. The hybridoma producing the monoclonal antibody can be cultured in vitro or in vivo, such as mouse or rat, preferably mouse ascites, and the antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and the ascites of the animal, respectively. The monoclonal antibody may be any isotype such as IgG, IgM, IgA, and IgE.

ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質は、必要に応じて、標識用物質で標識された形態で提供されてもよい。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。 The substance having affinity for the AXL extracellular domain fragment may be provided in a form labeled with a labeling substance, if necessary. Examples of the labeling substance include fluorescent substances such as FITC and FAM, luminescent substances such as luminol, luciferin, and lucigenin, radioisotopes such as ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S, and ¹²³ I, biotin, and streptavidin. And the like, and the like.

本発明の試薬は、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質に加えて、さらなる構成要素を含むキットの形態で提供されてもよい。この場合、キットに含まれる各構成要素は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器（例、チューブ）に格納された形態で提供されてもよい。例えば、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が標識用物質で標識されていない場合、このようなキットは、標識用物質をさらに含んでいてもよい。このようなキットはまた、ポジティブコントロールとして、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントを含んでいてもよい。 The reagent of the present invention may be provided in the form of a kit containing additional components in addition to the substance having affinity for the AXL extracellular domain fragment. In this case, each component included in the kit may be provided in a form isolated from each other, for example, stored in a different container (eg, a tube). For example, when a substance having affinity for the AXL extracellular domain fragment is not labeled with a labeling substance, such a kit may further contain a labeling substance. Such a kit may also include an AXL extracellular domain fragment as a positive control.

本発明の試薬がキットの形態で提供される場合、キットは、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質の種類に応じたさらなる構成要素を含んでいてもよい。例えば、ＡＸＬ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が抗体である場合、キットは、２次抗体（例、抗ＩｇＧ抗体）、２次抗体の検出試薬をさらに含んでいてもよい。 When the reagent of the present invention is provided in the form of a kit, the kit may contain additional components depending on the type of substance having affinity for the AXL extracellular domain fragment. For example, when the substance having affinity for the AXL extracellular domain fragment is an antibody, the kit may further contain a secondary antibody (eg, anti-IgG antibody) and a detection reagent for the secondary antibody.

本発明の試薬がキットの形態で提供される場合、キットは、生体サンプルを採取し得る器具をさらに含んでいてもよい。生体サンプルを採取し得る器具は、被験体から生体サンプルを入手可能である限り特に限定されないが、例えば、注射器等の採血器具が挙げられる。 When the reagent of the present invention is provided in the form of a kit, the kit may further include an instrument capable of collecting a biological sample. The device that can collect the biological sample is not particularly limited as long as the biological sample can be obtained from the subject, and examples thereof include a blood collection device such as a syringe.

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.

実施例１：ゲフィチニブ耐性細胞株の樹立およびそのゲフィチニブ感受性の解析
ゲフィチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤）感受性細胞株ＨＣＣ４００６（ヒト非小細胞肺癌由来、ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００６；１２：７１１７−７１２５．）を、２週間、１ヶ月、３ヶ月または５ヶ月ゲフィチニブ（１μＭ）に暴露することにより、ゲフィチニブ耐性細胞株を樹立した（それぞれＧＲ２ｗ、ＧＲ１ｍ、ＧＲ３ｍ、ＧＲ５ｍ）。これらのゲフィチニブ耐性細胞株を各種濃度のゲフィチニブに暴露し、次いで７２時間後の生存細胞の割合をＭＴＳ法でアッセイすることにより、各細胞株のゲフィチニブ感受性を解析した。
その結果、ゲフィチニブ感受性細胞は、ゲフィチニブ暴露期間に依存してゲフィチニブに対する耐性を獲得することが示された（図１）。 Example 1: Establishment of gefitinib-resistant cell line and analysis of its sensitivity to gefitinib Gefitinib (EGFR inhibitor) sensitive cell line HCC4006 (derived from human non-small cell lung cancer, Clin Cancer Res 2006; 12: 7117-7125.) For 2 weeks Gefitinib resistant cell lines were established by exposure to gefitinib (1 μM) for 1, 3 or 5 months (GR2w, GR1m, GR3m, GR5m, respectively). These gefitinib resistant cell lines were exposed to various concentrations of gefitinib, and then the susceptibility of each cell line to gefitinib was analyzed by assaying the percentage of viable cells 72 hours later by the MTS method.
As a result, it was shown that gefitinib-sensitive cells acquire resistance to gefitinib depending on the gefitinib exposure period (FIG. 1).

実施例２：ゲフィチニブ耐性細胞特異的可溶性ＡＸＬの検出及び上皮間葉移行マーカーの発現解析
実施例１で樹立したゲフィチニブ耐性細胞株による可溶性ＡＸＬの分泌を、限外濃縮した培養上清（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）に対してＡＸＬ細胞外ドメインを認識する抗体（ＵｎｉＰｒｏｔａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｐ３０５３０登録のアミノ酸配列において３０〜１４０位のアミノ酸残基からなる組換え体断片を抗原として用いて作製されたモノクローナル抗体）によるウェスタンブロットにより評価した。併せて、細胞抽出液（Ｌｙｓａｔｅ）において、ＡＸＬ、並びに間葉系マーカーおよび上皮系マーカーの上皮間葉移行マーカー（ＥＭＴ）についてウェスタンブロットを行った。
その結果、可溶性ＡＸＬの分泌は、ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性獲得に伴って亢進することが確認された。また、耐性獲得に伴うＡＸＬの発現亢進と間葉系マーカー（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＺＥＢ１）の発現亢進と共に、上皮系マーカー（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の発現抑制が認められた（図２）。
以上より、ＥＭＴの進行を伴う、ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性獲得の過程において、ＡＸＬの発現および可溶性ＡＸＬの分泌が亢進することが示された。 Example 2: Detection of gefitinib-resistant cell-specific soluble AXL and expression analysis of epithelial-mesenchymal transition marker Secretion of soluble AXL by the gefitinib-resistant cell line established in Example 1 was made into an ultra-concentrated culture supernatant (Supernatant) In contrast, Western blotting with an antibody that recognizes the AXL extracellular domain (UniProt accession: a monoclonal antibody prepared using a recombinant fragment consisting of amino acid residues 30 to 140 in the amino acid sequence registered in P30530 as an antigen) was evaluated. did. In addition, Western blotting was performed on AXL and mesenchymal markers and epithelial-mesenchymal transition markers (EMT) of epithelial markers in the cell extract (Lysate).
As a result, it was confirmed that the secretion of soluble AXL was enhanced with the acquisition of resistance to the EGFR inhibitor. Moreover, the expression suppression of the epithelial marker (E-cadherin) was recognized with the increase in the expression of AXL accompanying the acquisition of resistance and the expression increase of the mesenchymal markers (N-cadherin, Vimentin, ZEB1) (FIG. 2).
From the above, it was shown that the expression of AXL and the secretion of soluble AXL are enhanced in the process of acquiring resistance to the EGFR inhibitor accompanying the progression of EMT.

実施例３：ＡＸＬに陽性であり、かつゲフィチニブに耐性能を有する細胞の単離および解析
ゲフィチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤）感受性細胞株ＨＣＣ４００６中のＡＸＬ陽性細胞を、抗ＡＸＬ抗体を吸着させた磁性粒子（ダイナビーズ）により分画した（ＨＣＣ４００６−ＡＸＬ^＋）。さらにその分画から、トランスウェルチャンバーを通過した細胞を、運動性の高い細胞として分画した（ＨＣＣ４００６−ＡＸＬ^＋−ＴＷ）。これらの細胞分画のゲフィチニブ感受性をＭＴＳアッセイにより比較した。
その結果、ＡＸＬ陽性細胞ＡＸＬ^＋およびＡＸＬ陽性高運動性細胞ＡＸＬ^＋−ＴＷは、ゲフィチニブに対して親細胞株よりも耐性であった（図３）。
以上より、ＥＧＦＲ阻害剤感受性癌細胞中にＡＸＬ陽性細胞が存在すること、およびこのようなＡＸＬ陽性細胞がゲフィチニブに耐性能を有することが示された。 Example 3: Isolation and analysis of cells positive for AXL and resistant to gefitinib Magnetic particles in which anti-AXL antibody was adsorbed on AXL positive cells in gefitinib (EGFR inhibitor) sensitive cell line HCC4006 Fractionated by Dynabeads (HCC4006-AXL ⁺ ). Furthermore, from the fraction, cells that passed through the transwell chamber were fractionated as cells having high motility (HCC4006-AXL ⁺ -TW). The gefitinib sensitivity of these cell fractions was compared by MTS assay.
As a result, AXL positive cells AXL ⁺ and AXL positive highly motile cells AXL ⁺ -TW were more resistant to gefitinib than the parent cell line (FIG. 3).
From the above, it was shown that AXL positive cells exist in EGFR inhibitor-sensitive cancer cells, and that such AXL positive cells are resistant to gefitinib.

実施例４：ＨＣＣ８２７由来耐性細胞株の樹立および解析
ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）感受性細胞株ＨＣＣ８２７（ヒト非小細胞肺癌由来、ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００６；１２：７１１７−７１２５．）をゲフィチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤，１μＭ）に５ヶ月暴露することにより、ゲフィチニブ耐性細胞株（ＧＲ５ｍ）を樹立した。また、ＨＣＣ８２７をゲフィチニブに３ヶ月暴露した後、ＰＨＡ−６６５７５２に３ヶ月暴露することによりＥＧＦＲ阻害剤およびＭＥＴ阻害剤の組合せに耐性の細胞株（ＨＣＣ８２７−ＧＲＰＲ）を樹立した。
その結果、樹立細胞株ＧＲ５ｍは、ゲフィチニブ単独には耐性であったが、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）及びＭＥＴ阻害剤（ＰＨＡ−６６５７５２、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００３；６３：７３４５―７３５５．）を参照）の組合せには感受性であった（図４）。また、樹立細胞株ＨＣＣ８２７−ＧＲＰＲは、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）及びＭＥＴ阻害剤（ＰＨＡ−６６５７５２）の双方に耐性であった（図４）。 Example 4: Establishment and analysis of HCC827-derived resistant cell line EGFR inhibitor (gefitinib) sensitive cell line HCC827 (derived from human non-small cell lung cancer, Clin Cancer Res 2006; 12: 7117-7125.) Gefitinib (EGFR inhibitor, Gefitinib resistant cell line (GR5m) was established by exposure to 1 μM) for 5 months. Further, after exposing HCC827 to gefitinib for 3 months, a cell line (HCC827-GRPR) resistant to a combination of an EGFR inhibitor and a MET inhibitor was established by exposing to PHA-665752 for 3 months.
As a result, the established cell line GR5m was resistant to gefitinib alone, but a combination of an EGFR inhibitor (gefitinib) and a MET inhibitor (PHA-665752, Cancer Res 2003; 63: 7345-7355.)). (Fig. 4). In addition, the established cell line HCC827-GRPR was resistant to both EGFR inhibitor (gefitinib) and MET inhibitor (PHA-665752) (FIG. 4).

実施例５：ＨＣＣ８２７由来耐性細胞における可溶性ＡＸＬの分泌
実施例４で作製したＨＣＣ８２７由来耐性細胞株における可溶性ＡＸＬの分泌を解析した。
その結果、ＥＧＦＲ及びＭＥＴの両方に依存性を示すゲフィチニブ耐性細胞株ＨＣＣ８２７−ＧＲ５ｍでは可溶性ＭＥＴの分泌が認められたが、ゲフィチニブ及びＭＥＴ阻害剤の双方に耐性であるＨＣＣ８２７−ＧＲＰＲは、可溶性ＭＥＴの低い分泌および可溶性ＡＸＬの分泌を示した（図５）。また、ＨＣＣ８２７−ＧＲＰＲは、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現亢進を示し（図５）、ＥＭＴの進行を呈した。
以上より、ゲフィチニブ耐性となったＭＥＴ遺伝子増幅肺癌細胞をさらにＭＥＴ阻害剤で治療するモデルケースにおいても、ＥＭＴの進行を伴う耐性癌にＡＸＬ発現および可溶性ＡＸＬ分泌の亢進が認められることが示された。 Example 5: Secretion of soluble AXL in HCC827-derived resistant cells Secretion of soluble AXL in the HCC827-derived resistant cell line prepared in Example 4 was analyzed.
As a result, secretion of soluble MET was observed in the gefitinib resistant cell line HCC827-GR5m, which is dependent on both EGFR and MET, but HCC827-GRPR, which is resistant to both gefitinib and MET inhibitors, It showed low secretion and secretion of soluble AXL (FIG. 5). HCC827-GRPR showed increased expression of N-cadherin (FIG. 5), and progressed EMT.
From the above, it was shown that, even in a model case where MET gene-amplified lung cancer cells that have become resistant to gefitinib are treated with a MET inhibitor, AXL expression and increased soluble AXL secretion are observed in resistant cancer with EMT progression. .

実施例６：Ｈ１９９３由来ＭＥＴ阻害剤耐性細胞の樹立および解析
ＭＥＴ遺伝子増幅を示し、かつＭＥＴ阻害剤感受性を示すＨ１９９３細胞株（ヒト非小細胞肺癌由来、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００７；６７：２０８１−２０８８．）より、ＭＥＴ阻害剤ＰＨＡ−６６５７５２に対する耐性細胞株を樹立した（ＰＲ５ｍ）。この細胞株から、ＡＸＬ陽性細胞を、抗ＡＸＬ抗体を吸着させた磁性粒子（ダイナビーズ）で分画した（ＰＲ５ｍ−ＡＸＬ^＋）。また、ＰＲ５ｍから、トランスウェルチャンバーを通過した細胞を、運動性の高い細胞として分画した（ＰＲ５ｍ−ＴＷ）。これらの細胞のＡＸＬ発現および可溶性ＡＸＬ分泌、ならびにＥＭＴマーカーの発現をウェスタンブロットで解析した。
その結果、ＰＲ５ｍ−ＡＸＬ^＋、およびＰＲ５ｍ−ＴＷでは、ＡＸＬの発現および可溶性ＡＸＬの分泌が認められ、また、間葉系マーカー（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＺＥＢ１）の発現の亢進が認められた（図６）。
以上より、ＭＥＴ阻害剤耐性細胞中に、ＡＸＬ陽性でＥＭＴが進行した細胞が存在することが示された。 Example 6: Establishment and analysis of H1993-derived MET inhibitor-resistant cells H1993 cell line showing MET gene amplification and MET inhibitor sensitivity (derived from human non-small cell lung cancer, Cancer Res 2007; 67: 2081-2088.) Thus, a resistant cell line against the MET inhibitor PHA-665752 was established (PR5m). From this cell line, AXL positive cells were fractionated with magnetic particles (dynabeads) adsorbed with anti-AXL antibody (PR5m-AXL ⁺ ). From PR5m, cells that passed through the transwell chamber were fractionated as cells having high motility (PR5m-TW). These cells were analyzed by Western blot for AXL expression and soluble AXL secretion, and expression of EMT markers.
As a result, PR5m-AXL ⁺ and PR5m-TW showed expression of AXL and secretion of soluble AXL, and increased expression of mesenchymal markers (N-cadherin, Vimentin, ZEB1) ( FIG. 6).
As mentioned above, it was shown that the cell which AMT positive and EMT advanced exists in the MET inhibitor resistant cell.

実施例７：シスプラチン耐性細胞株の樹立および解析
ＨＣＣ４００６を段階的に濃度を上げたシスプラチン（０．５〜２５μＭ）に４ヶ月暴露することによりシスプラチン耐性細胞株（ＨＣＣ４００６−ＣＲ）を樹立した。さらに、シスプラチン耐性細胞株ＨＣＣ４００６−ＣＲを１μＭゲフィチニブに２週間暴露することにより、シスプラチンおよびゲフィチニブの双方に耐性である細胞株（ＨＣＣ４００６−ＣＲ−ＧＲ）を樹立した。これらの細胞株におけるＡＸＬ発現および可溶性ＡＸＬ分泌、ならびにＥＭＴマーカー発現をウェスタンブロットにより解析した。また、ゲフィチニブへのこれらの細胞株の耐性を評価した。
その結果、シスプラチン耐性化に伴い間葉系マーカー（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＴＷＩＳＴ１等）の発現と共にＡＸＬ発現および可溶性ＡＸＬ分泌の亢進が認められた（図７）。また、シスプラチンおよびゲフィチニブの双方に耐性である細胞株（ＨＣＣ４００６−ＣＲ−ＧＲ）では、マーカーの発現の変動が顕著に認められた（図７）。さらに、可溶性ＡＸＬ分泌が認められるシスプラチン耐性細胞株ＨＣＣ４００６−ＣＲは、ゲフィチニブに部分的に耐性であった（図８）。
以上より、プラチナ製剤に対する耐性獲得に伴うＥＭＴの進行とＡＸＬ発現および可溶性ＡＸＬ分泌との関連性、ならびにプラチナ製剤暴露によりＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性能を獲得する細胞の存在が示された。 Example 7: Establishment and analysis of cisplatin-resistant cell line A cisplatin-resistant cell line (HCC4006-CR) was established by exposing HCC4006 to cisplatin (0.5 to 25 μM) whose concentration was gradually increased for 4 months. Furthermore, a cell line (HCC4006-CR-GR) resistant to both cisplatin and gefitinib was established by exposing the cisplatin resistant cell line HCC4006-CR to 1 μM gefitinib for 2 weeks. AXL expression and soluble AXL secretion, and EMT marker expression in these cell lines were analyzed by Western blot. The resistance of these cell lines to gefitinib was also evaluated.
As a result, an increase in AXL expression and soluble AXL secretion was observed along with the expression of mesenchymal markers (N-cadherin, TWIST1, etc.) along with the resistance to cisplatin (FIG. 7). Moreover, in the cell line resistant to both cisplatin and gefitinib (HCC4006-CR-GR), a marked change in the expression of the marker was observed (FIG. 7). Furthermore, the cisplatin resistant cell line HCC4006-CR in which soluble AXL secretion was observed was partially resistant to gefitinib (FIG. 8).
From the above, it was shown that the progression of EMT accompanying the acquisition of resistance to the platinum preparation and the relationship between AXL expression and soluble AXL secretion, and the existence of cells that acquire the resistance to the EGFR inhibitor by exposure to the platinum preparation.

実施例８：可溶性ＡＸＬ分泌陽性細胞の運動能の解析
先の実施例に記載した種々の細胞の運動能を、トランスウェルマイグレーションアッセイ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２０１２；３１：１４９３―１５０３．を参照）により測定した。
その結果、ＨＣＣ４００６由来耐性細胞株では、可溶性ＡＸＬの分泌亢進に相関して運動能の亢進が認められた（図９）。Ｈ１９９３由来耐性細胞株では、ＰＲ５ｍが親株よりも運動能が亢進していたが、ＡＸＬ（可溶性ＡＸＬ分泌）陽性分画でさらに運動能の亢進が認められた（図１０）。可溶性ＡＸＬ分泌が認められたＨＣＣ４００６由来シスプラチン耐性細胞株、およびシスプラチンおよびゲフィチニブの双方に耐性である細胞株でも、運動能の亢進が認められた（図１１）。癌細胞が浸潤および転移する能力は、トランスウェルマイグレーションアッセイにより細胞の運動能を測定することにより、評価できることが知られている（ＩnｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ２０１２；１３０：５５５−５６６．を参照）。
以上より、可溶性ＡＸＬの分泌が、細胞の運動能と強く相関することが示された。したがって、可溶性ＡＸＬの測定により、癌細胞の浸潤および／または転移する能力を評価できると考えられる。 Example 8: Analysis of motility of soluble AXL secretion positive cells The motility of the various cells described in the previous examples was measured by a transwell migration assay (see Oncogene 2012; 31: 1493-1503.).
As a result, in the HCC4006-derived resistant cell line, enhanced motility was observed in correlation with increased secretion of soluble AXL (FIG. 9). In the H1993-derived resistant cell line, PR5m had enhanced motility than the parent strain, but motility was further enhanced in the AXL (soluble AXL secretion) positive fraction (FIG. 10). Increased motility was also observed in the HCC4006-derived cisplatin resistant cell line in which soluble AXL secretion was observed, and in the cell line resistant to both cisplatin and gefitinib (FIG. 11). It is known that the ability of cancer cells to invade and metastasize can be evaluated by measuring the motility of the cells by a transwell migration assay (see International Journal of Cancer 2012; 130: 555-566.).
From the above, it was shown that secretion of soluble AXL strongly correlates with cell motility. Therefore, it is considered that the ability of cancer cells to infiltrate and / or metastasize can be evaluated by measuring soluble AXL.

実施例９：ＡＸＬノックダウンによる運動能の阻害
運動能の亢進が認められたＨＣＣ４００６−ＣＲ−ＧＲ（シスプラチンおよびゲフィチニブの双方に耐性である、ＨＣＣ４００６由来細胞株）のＡＸＬをｓｉ−ＲＮＡにより阻害し、ＡＸＬ阻害が運動能へ及ぼす影響をトランスウェルマイグレーションアッセイにより解析した。ｓｉ−ＡＸＬ−１は、ＡＸＬ遺伝子の第１標的配列（ＣＣＡＧＣＡＣＣＵＧＵＧＧＵＣＡＵＣＵＵＡＣＣＵＵ、配列番号１）に対する第１ｓｉ−ＲＮＡを示す。ｓｉ−ＡＸＬ−２は、ＡＸＬ遺伝子の第２標的配列（ＧＡＧＣＵＧＣＧＧＧＡＡＧＡＵＵＵＧＧＡＧＡＡＣＡ、配列番号２）に対する第２ｓｉ−ＲＮＡを示す。ｓｉ−ＡＸＬ−３は、ＡＸＬ遺伝子の第３標的配列（ＣＣＡＧＧＡＡＣＵＧＣＡＵＧＣＵＧＡＡＵＧＡＧＡＡ、配列番号３）に対する第３ｓｉ−ＲＮＡを示す。
その結果、ＡＸＬのノックダウンにより細胞の運動能が顕著に抑制された（図１２、１３）。
以上より、ＡＸＬが抗癌剤に耐性を示す細胞の運動能に機能的に関与していることが示された。
また、図１２、１３に示した結果より、ＡＸＬの発現量と抗癌剤に耐性を示す細胞の運動能との間には相関性があると考えられる。さらには、ＡＸＬの発現量と可溶性ＡＸＬの量との間にも相関性があると考えられる。したがって、可溶性ＡＸＬの測定により、抗癌剤に対する耐性を示す癌のうち、ＡＸＬ阻害剤による治療が有効な癌（例えば、ＡＸＬ阻害剤により癌細胞の運動能を抑制し、それによって癌の浸潤および／または転移を抑制する治療が有効な癌）を診断できると考えられる。 Example 9: Inhibition of motility by AXL knockdown AXL of HCC4006-CR-GR (an HCC4006-derived cell line that is resistant to both cisplatin and gefitinib) with enhanced motility was inhibited by si-RNA. The effect of AXL inhibition on motility was analyzed by transwell migration assay. si-AXL-1 shows the 1st si-RNA with respect to the 1st target sequence (CCAGCACCUGUGUGUCAUCUUACCUU, sequence number 1) of an AXL gene. si-AXL-2 indicates the second si-RNA for the second target sequence of the AXL gene (GAGCUGCGGGGAAGAUUUGGAGAACA, SEQ ID NO: 2). si-AXL-3 indicates the third si-RNA for the third target sequence of the AXL gene (CCAGGAACUGCAUGCUGAAUGAGAA, SEQ ID NO: 3).
As a result, the motility of the cells was remarkably suppressed by AXL knockdown (FIGS. 12 and 13).
From the above, it was shown that AXL is functionally involved in the motility of cells that are resistant to anticancer agents.
From the results shown in FIGS. 12 and 13, it is considered that there is a correlation between the expression level of AXL and the motility of cells that are resistant to anticancer agents. Furthermore, it is considered that there is a correlation between the expression level of AXL and the amount of soluble AXL. Therefore, among cancers showing resistance to anticancer agents by measuring soluble AXL, cancers that are effectively treated with an AXL inhibitor (for example, suppressing the motility of cancer cells with an AXL inhibitor, thereby causing cancer invasion and / or It is considered that a cancer for which treatment for suppressing metastasis is effective can be diagnosed.

本発明は、例えば、癌に対する抗癌剤の効果の試験に有用であり、また、診断試薬およびキットとして有用である。 The present invention is useful, for example, for testing the effects of anticancer agents on cancer, and is useful as a diagnostic reagent and kit.

Claims

可溶性ＡＸＬまたはその分解産物に親和性を有する物質を含む、癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬であって、該抗癌剤がＭＥＴ阻害剤、プラチナ製剤およびＡＸＬ阻害剤からなる群より選ばれる１以上の抗癌剤である、診断試薬。 One or more anticancer agents comprising a substance having an affinity for soluble AXL or a degradation product thereof and a diagnostic reagent for the effect of the anticancer agent against cancer , wherein the anticancer agent is selected from the group consisting of a MET inhibitor, a platinum preparation, and an AXL inhibitor A diagnostic reagent .

可溶性ＡＸＬまたはその分解産物に親和性を有する物質が、可溶性ＡＸＬまたはその分解産物に対する抗体である、請求項１記載の診断試薬。 Diagnostic reagent soluble AXL or substance having an affinity for its degradation products, is an antibody against soluble AXL or its degradation products, according to claim 1, wherein.

抗癌剤が肺癌に対する抗癌剤である、請求項１または２記載の診断試薬。 The diagnostic reagent of Claim 1 or 2 whose anticancer agent is an anticancer agent with respect to lung cancer.

抗癌剤の効果が、ＭＥＴ阻害剤またはプラチナ製剤に対する耐性である、請求項１〜３のいずれか一項記載の診断試薬。 The diagnostic reagent as described in any one of Claims 1-3 whose effect of an anticancer agent is tolerance with respect to a MET inhibitor or a platinum formulation .

抗癌剤の効果が、ＡＸＬ阻害剤に対する感受性である、請求項１〜３のいずれか一項記載の診断試薬。 The diagnostic reagent according to any one of claims 1 to 3, wherein the effect of the anticancer agent is sensitivity to an AXL inhibitor.

ＡＸＬ阻害剤に対する感受性が、ＡＸＬ阻害剤による癌の増殖および／または浸潤および／または転移の抑制である、請求項５記載の診断試薬。 6. The diagnostic reagent according to claim 5 , wherein the sensitivity to the AXL inhibitor is suppression of cancer growth and / or invasion and / or metastasis by the AXL inhibitor.

可溶性ＡＸＬまたはその分解産物に親和性を有する物質、および可溶性ＡＸＬまたはその分解産物を含む、癌に対する抗癌剤の効果の診断キットであって、該抗癌剤がＭＥＴ阻害剤、プラチナ製剤およびＡＸＬ阻害剤からなる群より選ばれる１以上の抗癌剤である、診断キット。 Soluble AXL or substance having an affinity for its degradation products, and comprising a soluble AXL or its degradation products, a diagnostic kit of the effect of anticancer agent on cancer, the anticancer agent consists of MET inhibitors, platinum agents and AXL inhibitor A diagnostic kit, which is one or more anticancer agents selected from the group .

癌に対する抗癌剤の効果の試験方法であって、
（ａ）被験体由来の生体サンプル中の可溶性ＡＸＬまたはその分解産物の濃度を測定する工程、および
（ｂ）測定された可溶性ＡＸＬまたはその分解産物の濃度を、可溶性ＡＸＬまたはその分解産物の濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程を含み、
該抗癌剤がＭＥＴ阻害剤、プラチナ製剤およびＡＸＬ阻害剤からなる群より選ばれる１以上の抗癌剤である、試験方法。 A method for testing the effect of an anticancer drug on cancer ,
(A) step of measuring the concentration of soluble AXL or its degradation products in a biological sample from a subject, and the concentration of (b) measured soluble AXL or its degradation products, and the concentration of the soluble AXL or its degradation products Comparing to a criterion indicating a relationship between the effect of an anticancer agent on cancer ,
A test method, wherein the anticancer agent is one or more anticancer agents selected from the group consisting of a MET inhibitor, a platinum preparation, and an AXL inhibitor .