JP6190355B2 - アプタマーコーティングされた測定電極及び基準電極並びにこれらを使用してバイオマーカーを検出する方法 - Google Patents
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Description
http://www.mossmanassociates.com/TB%20Biomarker%20report%20Lancet_2010.pdf
i)DNA合成
5’−OHのDMTr化学保護及びβ−シアノエチル保護3’亜リン酸塩を使用して、ABI 394 DNA/RNA合成装置での段階的な固相合成を使用してDNAを合成した。
・50%アセトニトリル中の100%50mM酢酸アンモニウム(pH6.8)から100%50mM酢酸アンモニウムの勾配を55℃で使用するRPLC
・水〜100%1.2M NaClを60℃で使用するイオン交換クロマトグラフィーのいずれかを使用して、オリゴヌクレオチドを精製した。
アジド酢酸NHSエステルをMeCNに溶解した。3’−アミノ−DNAを0.1M炭酸塩/重炭酸塩(pH9)に溶解した。アジド酢酸NHSエステルを溶解したオリゴヌクレオチドに添加し、室温で2時間にわたり反応させた。濃縮するように、2容量の低温エタノールを添加し、−80℃で20分間培養し、ペレット化した(4000g、30分)。再溶解したDNAを18.2mΩの水に脱塩し、凍結乾燥した。
(図7参照)
アルキン標識DNA(水中)をアジド標識DNAに添加して、溶解した。0.1M TBTAをDMSO/t−ブタノール3:1(v/v)中に含むCuBr溶液を45℃で2時間培養した[1、2]。反応を水で希釈し、18.2mΩの水に脱塩し、凍結乾燥した。
合成されたDNAをマイナスモードのエレクトロスプレイイオン化質量分析にかけて、正確な質量を確認した。
参照:
1.Kocalka, P., A. H. El-Sagheer, and T. Brown「Rapid and efficient DNA strand cross-linking by click chemistry」(Chembiochem., 2008. 9(8):p.1280-5)
2.El-Sagheer, A. H. and T. Brown「Click chemistry with DNA」(Chem. Soc. Rev., 2010. 39: p.1388-1405)
3.Sambrook, J., Molecular Cloning「A Laboratory Manual. 2nd ed 1989, Cold Spring Harbour」(Cold Spring Harbour Laboratory Press)
プロトコル及び試薬
www.glenresearch.com
www.linktechnologies.co.uk
5’ビオチン基を用いて足場ストランド又は保護ストランドを合成し、ストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズの存在下での各Tm上での短時間(2分)の培養により、ssDNA GT「脚部」断片を介してTピースのCNT固定化後に除去することができた。磁石への露出後、「脚部」を介してCNTに付着した自由アプタマーストランドを含む上澄みを、電極要素のコーティングに使用した。
アプタマー水素結合相補的ストランド又は足場ストランドの保持により、基準電極の見本を作成し、それにより、アプタマースタンドの活性立体配座の形成を阻止した。あるいは、光活性架橋基を用いてアプタマーストランドを合成し、過剰な標的の存在下でUV照射により標的に共有結合させた。
アプタマー提示ナノチューブを作製するのに、キャップ付きアプタマー(正:aptamer)ストランドに共役した合成DNA、すなわち(GT)10を使用した。3.25mg/ml濃度の凍結した(GT)10溶液を室温で解凍した。115μlのDNA溶液を15分間超音波処理した。
リソグラフィ技法を使用して電極を生成した。電極は、図10aに示されるように、櫛状電極で構成された。この図面では、上の図が、相互に入り込む電極設計の部分の断面であり、図10bを含めて真ん中にあるのは基準及びセンサー対の平面レイアウトである。上の図は電極のうちの1つの断面であり、その一方で、下の図は、一方が「基準」電極として使用され、他方が「測定」電極として使用される電極対の平面図である。G、S、及びDと記される矩形パッドを使用して、電極を測定回路に接続する。ここで記されるラベルが、ソース端子、ドレイン端子、及びゲート端子を有するトランジスタセットアップの場合のものであることに留意する。しかし、ゲートバイアス有り又は無しで、2つの櫛状電極間の電流が測定される非トランジスタ状況においても、同じ電極設計を使用することができる。
図9を参照して考察したプロトコルを使用して、半導体ナノチューブ(NanoIntegresis)を一本鎖DNAに分散した。0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.007mg/ml、及び0.001mg/mlのナノチューブ分散液を準備し、電極に堆積させた。2Vの電圧を電極にわたって印加し、電極電流を測定する際、ゲート電圧を変更した。
ステップ4で考察したプロトコルを使用して、半導体ナノチューブ(NanoIntegresis)を一本鎖DNAに分散した。実施例4で考察したように、0.1mg/mlのナノチューブを準備し、電極に堆積させた。2Vの電圧を電極にわたって印加し、電極電流を測定する際、ゲート電圧を変更した。
この実験では、アプタマーをDNAに適用した。実施例2において考察されるプロトコルを使用して、半導体ナノチューブ(NanoIntegresis)を1本鎖(GT)10−リゾチームアプタマーTピースと分散した。これらのサンプルは「保護」と呼ばれ、まだアプタマーに付着した共役保護ストランドを有する。第2のサンプルセットは、「非保護」と呼ばれ、単一ストランド(GT)10−リゾチームアプタマーTピース分散液を70℃で15分間加熱することにより生成し、それから、ナノチューブ分散液に導入した。0.007mg/mlの濃度で分散液を準備し、実施例4において考察されるように、2μlを電極に堆積させた。図13は、ゲート電圧の関数として、装置電流(右軸、暗い線)及び絶対装置電流(左軸、明るい線)を示す。左は、アプタマーがまだ保護ストランドと共役している「保護」装置のものであり、右は、アプタマーが共役ストランドを除去した「非保護」装置のものである。この場合に使用されるアプタマーはリゾチームに対するものであった。
凍結保護(GT)10トロンビンを室温で解凍した。100μlのこの溶液を900μlのPBSで希釈して、約1.2mg/mlの濃度の(GT)10トロンビンにした。溶液を90℃で2分間培養し、室温でゆっくりと冷却して、分散前に、全てのオリゴマーが塩基対合することを保証した。
電極を実施例1において説明したように作製した。しかし、最後の装置が保護トロンビンアプタマー内で覆われたナノチューブ網からなるように、保護基を所定位置に残した。この電極は「基準」電極である。
実施例1において説明されるように測定電極を生成し、実施例2において説明されるように基準電極を生成した。電極の電気的特性を測定した(図16)。次に、100nMトロンビンを電極に導入し、乾燥させ、電気的特性を再び測定した(図17)。基準電極では、トロンビンの導入後に大きな変化は観測されなかったが、その一方で、「測定」電極では、電流は2Vドレイン電圧で約4倍増大した。
ヒト/獣医学、特にヒト/ウシTB等の感染病、
炭疽菌、破傷風、神経ガス等のバイオハザード及びTNT、2,4−DNT、2−6−DNT等の爆発物を含む国土安全保障、
法執行、特にカンナビナイド、ベンゾイルエクゴニンを含むドラッグ、
健康及び安全−有害ガス/蒸気、ナフサ、炭化水素の検出、
プロセス及び品質制御、
香料、例えば、麝香(ガラクソリド)等の非常に価値の高い製品、
一般的な即時、連続、又は累積測定、
ガス、蒸気、液体、息、唾液、指紋、
一般環境又は個人環境、
単一又は複数の測定量、
である。
ウシTBの検出に特異的な診断構成、
通関港においてヒトTBを検出する特異的な診断構成、
TBの「バイオシグネチャ」の定量的な検出と平行した一連のアプタマーセンサーの使用、
特異的なバイオマーカー−他の疾病(例えば、B型肝炎及びC型肝炎)を検出する診断構成、
生物兵器を検出する特異的な診断構成、
爆発物を検出する特異的な診断構成、
ドラッグを検出する特異的な診断構成、
有害ガスを検出する特異的な診断構成、
である。
Claims (22)
- 電気的特性の変化の検出により、サンプル内の特定の標的分子又はバイオマーカーの存在を識別する装置であって、該装置は測定センサー(8)を含み、該測定センサー(8)は、
前記バイオマーカーに共役可能なアプタマーのコーティングを含み、それにより、前記電気的特性の変化を生じさせる導体又は半導体センサー構造(12)と、
該装置から信号を伝達する電極システム(3)と、
を備え、
該装置は、実質的に同一の形態の更なるセンサー(9)を含み、該センサー(9)は、内部基準として機能するために、前記バイオマーカーに共役しないようにキャップ付けされたセンサー構造(14)を有する、装置。 - 前記キャップ付けは、前記センサー構造が前記標的分子又はバイオマーカーで事前に飽和することにより行われる、又は、
前記センサー構造はオリゴヌクレオチドアプタマーを含み、キャップ付けは、前記センサー構造が相補的なオリゴヌクレオチドに結合することにより行われる、又は、
前記キャップ付けは、前記バイオマーカーがもはや認識されないような配列変化を有する前記センサー構造の変異型を使用することにより行われる、請求項1に記載の装置。 - 前記センサー構造(12)は、前記バイオマーカーと共役可能なアプタマーがコーティングされた半導体ベース上に作られる、請求項1に記載の装置。
- 前記アプタマーはオリゴヌクレオチドアプタマーである、請求項3に記載の装置。
- 前記アプタマーは立体特異的である、請求項3又は4に記載の装置。
- 前記半導体ベースはカーボンナノチューブ(CNT)骨格を含み、
DNAストランドが、前記DNAに付着したアプタマーを用いて前記CNT骨格に付着する、請求項3〜5のいずれか一項に記載の装置。 - 前記半導体ベースは、PVP、Al、又はSiによりコーティングされて、「ナノワイヤ」を形成して、電気効果の測定を強化するDNA骨格である、請求項3に記載の装置。
- 前記電極システムは、前記センサー構造が間に延びる一対の櫛状電極(3)を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の装置。
- 前記電極(3)は、前記CNTの平均長よりも大きな間隔を有し、約10μm〜50μm離間している金又は他の導体ストリップを含む、請求項6を引用する請求項8に記載の装置。
- 前記センサー及び電極が上に形成される基板(2)を更に含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の装置。
- 前記基板はPET、PEN、PVP、又はPEGのポリマー、又はシリコンである、請求項10に記載の装置。
- それぞれが異なる特定のバイオマーカー向けの2つ以上のそのような測定センサーを有し、測定電極及び基準電極から測定される前記電気的特性の比率を使用して、化合物を識別する、請求項9又は10に記載の装置。
- 同じ前記バイオマーカーの複数測定に関して、1つ又は複数の基準及び複数の測定センサー構造を有する、請求項9に記載の装置。
- 前記バイオマーカーに共役可能なアプタマーのコーティングには、疾病により生成される、又はバイオハザード材料への露出により生成される他の破壊生物学的プロセスから生じるバイオマーカーが関連付けられる、請求項3〜7のいずれか一項に記載の装置。
- 前記疾病が、結核、B型肝炎、若しくはC型肝炎である、請求項14に記載の装置。
- 前記バイオハザード材料が、サリン、VX、若しくはリシンから選択される、請求項14に記載の装置。
- 適切な電気接続を用いて成形体(1)内に組み込まれ、使用前はポリマーバリア薄膜を用いて密封され、
リーダー装置に差し込まれるインターフェースを更に含み、前記リーダー装置は、アレイの応答を測定し、判断又は診断を付与し、
前記電極システム(3、4)に接続され、前記2つのセンサー構造からの信号を比較して、前記サンプル内の1又は複数の前記標的分子の濃度を測定するように適合される回路(100〜110)と組み合わされる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の装置。 - 使用時に、前記共役(結合事象)が測定される前に、含まれる電解質の測定を介して前記サンプル容積の適切性をチェックする、請求項1〜17のいずれか一項に記載の装置。
- 標的分子又はバイオマーカーの存在についてサンプルを分析する方法であって、前記サンプルは、前記標的に結合するようになっている一対の2つの実質的に同一のセンサー構造を含む検出器を通過し、前記センサー構造のうちの一方は、前記標的に結合しないように保護され、もう一方からとられる測定に対する基準として使用され、
前記標的分子は、疾病バイオマーカーであるか、又は爆発物、麻薬、若しくは他の望ましくない分子から放出され、前記センサー構造は、これらの分子に結合するようになっているアプタマーを含む、方法。 - 2つ以上の対の測定(非共役)電極及び基準(共役)電極が使用され、各対は異なる標的を用いて官能基化される、請求項19に記載の方法。
- 前記標的分子は化学兵器を含む、請求項19又は20に記載の方法。
- 前記化学兵器はサリンである、請求項21に記載の方法。
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