JP6170080B2 - 異常ヘモグロビン症の治療のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
[0001]本出願は、PCT国際特許出願として2013年2月22日に出願され、そしてその開示が、全体として本明細書に援用される、2012年2月24日出願の米国仮特許出願第61/603,231号に優先権を請求する。
[0002]本出願には、「配列表54428.0006WOU1_ST25」と題され、そして2013年2月22日に作成され、そして174キロバイト(KB)のサイズを有するtxtファイルとしての電子形式の配列表が含まれる。txtファイル「配列表54428.0006WOU1_ST25」の内容は、本明細書に援用される。
[0003]本開示は、一般的に、遺伝病の治療に関する。より具体的には、本開示は、グロビン遺伝子の発現を改変するための、ホーミングエンドヌクレアーゼに、そしてCas9エンドヌクレアーゼに基づく組成物および方法を含む、エンドヌクレアーゼに基づく組成物および方法を提供し、該組成物および方法は、サラセミア、鎌状赤血球症、および他の異常ヘモグロビン症の治療に有用である。
[0004]異常ヘモグロビン症、例えばサラセミアおよび鎌状赤血球症は、非常に蔓延している遺伝的赤血球障害であり、世界中で、重大な健康上の負荷を引き起こしている。重度のヘモグロビン障害を有する人々が、毎年、130万人を超えて生まれる。世界中で5%の人々がキャリアーであるが、サラセミアおよび鎌状赤血球症(SCD)の臨床的に重度の型に関しては、出生率は、それぞれ、千人あたり0.44人および1.96人である。
[0033]本開示の特定の側面は、以下の図を考慮するとよりよく理解されるであろう:
定義
[0072]本明細書において、用語「異常ヘモグロビン症」は、異常構造、異常機能またはヘモグロビン分子の1またはそれより多いグロビン鎖の発現改変を生じる、遺伝的欠陥のクラスを指す。異常ヘモグロビン症は、遺伝性単一遺伝子障害である。一般的な異常ヘモグロビン症には、サラセミアおよび鎌状赤血球症が含まれる。
[0077]本明細書において、用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」または「HE」は、ゲノムにおいて1回しか生じないために十分に長く、そしてランダムであり、非常に低い確率(例えば7x1010bpごとに1回)である認識配列によって特徴付けられる、制限エンドヌクレアーゼのクラスを指す。
[0085]上に論じるように、そして以下に例示するように、本開示は、ヒトにおいて臨床的利益を有することが示された、ターゲティングされる細胞において一過性にまたは持続性に発現されてもよい、1またはそれより多いエンドヌクレアーゼ(単数または複数)をコードするポリヌクレオチドを含む組成物および方法であって、1またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ(単数または複数)(HE(単数または複数))、例えば1またはそれより多いI−HjeMIホーミングエンドヌクレアーゼ(単数または複数)、I−CpaMIホーミングエンドヌクレアーゼ(単数または複数)、および/またはI−OnuIホーミングエンドヌクレアーゼ(単数または複数)、ならびに/あるいは1またはそれより多いRNAガイド鎖と組み合わせた1またはそれより多いCas9エンドヌクレアーゼ(単数または複数)を含む、前記エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む組成物および方法を提供する。例示的なエンドヌクレアーゼは:(a)Bcl11aコード領域またはBcl11a遺伝子制御領域を破壊し;(b)HbFサイレンシングDNA制御要素または経路、例えばBcl11a制御HbFサイレンシング領域を破壊し;(c)1またはそれより多いγ−グロビン遺伝子プロモーター(単数または複数)を突然変異させて、γ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し;(d)1またはそれより多いδ−グロビン遺伝子プロモーター(単数または複数)を突然変異させて、δ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し;そして/または(e)1またはそれより多いβ−グロビン遺伝子突然変異(単数または複数)を修正することによって、胎性ヘモグロビン産生に影響を及ぼす決定的なゲノム領域をターゲティングする。本明細書開示の組成物および方法は、β−サラセミアおよび鎌状赤血球症を含む異常ヘモグロビン症の治療に有用性を見出す。
[0098]鎌状赤血球マウスモデルにおけるBcl11aのノックアウトは疾患を寛解させ、この経路の臨床的関連を支持する。Xuら, Science 334:993−6(2011)。さらに、ヒトβ−グロビン遺伝子座に渡るYAC導入遺伝子を含有するマウスを用いて、HbFのBcl11a仲介サイレンシングにおける混乱をモデリングする。これらのマウスにおける内因性Bcl11a遺伝子のヘテロ接合性およびホモ接合性ノックアウトは、対照における0.24%に比較して、それぞれ、20および76%の総β様mRNAを含むγ−グロビンmRNAを生じる。Sankaranら, Nature 460:1093−7(2009)。これは、Bcl11aは可変抵抗器として作用し、HbF抑制の度合いを調節することを示唆する。これと一致して、Bcl11a中の機能突然変異の減少は、上昇したレベルのHbFならびに臨床的サラセミアおよび/または鎌状赤血球症表現型の軽減を生じる。Galanelloら, Blood 114:3935−7(2009)。
[00102]上に要約するように、特定の態様内で、本開示は、遺伝病、例えばサラセミアおよび/または鎌状赤血球症を含む異常ヘモグロビン症を治療し、そして/または寛解させるための組成物および方法を提供する。これらの態様の特定の側面には、β−グロビン遺伝子座またはδ−グロビン遺伝子座内のHbFサイレンシング要素または経路を破壊する、1またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ(単数または複数)をコードするポリヌクレオチドの一過性発現が含まれ、それによってγ−またはδ−グロビン遺伝子などの内因性遺伝子の発現を療法レベルまで増加させる。
[00111]他の態様内で、本開示は、臨床的利益を提供するため、ゲノム編集を通じて、患者ゲノム内の1またはそれより多い天然存在突然変異(単数または複数)を再現するための組成物および方法を提供する。より具体的には、本開示は、ゲノム編集を通じたサラセミアおよび/または鎌状赤血球症(SCD)突然変異の直接修正を達成するための組成物および方法を提供する。
[00124]さらなる態様内で、本開示は、本明細書記載の1またはそれより多いHE、Cas9、TALEN、および/またはTREX2ヌクレアーゼを送達するための系、特に非組込みベクター系を提供する。造血幹細胞(HSC)の療法的遺伝子編集には3つの主要な困難がある:(1)ヌクレアーゼ試薬を一過性にHSCに送達しなければならない;(2)ヌクレアーゼを受け入れる細胞において、遺伝子編集効率が高くなければならない;そして(3)療法効果に十分なレベルまで、遺伝子編集HSCを生着させなければならない。これらの困難は、多様なベクター形成アプローチを使用することによって克服可能である。
[00134]さらなる態様内で、本開示は、修正された細胞の効率的な生着、ならびにスクリーニングおよび臨床適用のための人工多能性幹細胞(iPSC)の使用を可能にするため、修飾造血幹細胞(HSC)のex vivo拡大のための組成物および方法を提供する。これらの態様の特定の側面内で、自己HSC、自己遺伝子修飾HSC、ES、およびiPSC由来HSCの効率的な拡大のための組成物および方法を提供する。正常ドナーから得られた動員末梢血CD34+を用い、造血性増殖因子を補充した血清不含培地中でDelta1を利用する臍帯血拡大方法論を使用してもよい。1またはそれより多いさらなる試薬と組み合わせてこれらの組成物および方法を用いて、造血幹細胞/前駆細胞の生存および増殖を増進してもよい。他の側面内で、これらの組成物および方法は、修正iPSC由来HSCを含む長期再増殖細胞の増進された拡大のため、内皮細胞共培養を使用してもよい。
[00142]別の態様内で、本開示は、対症療法を提供するための組成物および方法であって、遺伝子修正自己HSCの移植後、移植後好中球減少症を抑止し、そして転帰を改善する、オフザシェルフ細胞療法を提供する。ex vivo拡大された凍結保存臍帯血(CB)幹細胞/前駆細胞を、例えば、対症療法の手段として、自己CD34+遺伝子修正細胞での骨髄破壊的HCTを経ている、サラセミアおよび/または鎌状赤血球症患者に投与してもよい。
in vitro区画化(IVC)を用いたI−HjeMI、I−CpaMI、およびI−OnuIに基づくBcl11a遺伝子ターゲティングホーミングエンドヌクレアーゼの選択
[00155]大腸菌における発現のためにコドン最適化されている、親LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)、I−HjeMIのオープンリーディングフレーム(ORF)(図14;配列番号28; Jacobyら, Nucl. Acids Res. 40(11):4954−4964(2012); Taylorら, Nucl. Acids Res. 40(Web Server issue):W110−6(2012))を、pET21−a(+)(図11; Merck KGaAのEMD Millipore(Novagen)部門)のNcoIおよびNotI制限部位の間にクローニングした。部位特異的飽和突然変異誘発をI−HjeMIのORF内に導入するため、縮重コドン5’−NNK−3’(すべての20アミノ酸をコードする)を含有するプライマーを用いて、両端に隣接断片と重複する領域のおよそ20塩基対の領域を持つ、部分的ORFを含有するDNA断片をPCR増幅した。こうしたPCRプライマーを用いて突然変異されたアミノ酸残基を表2に示す。アガロースゲルからの抽出によってPCR産物を精製し、そして続く周期のPCRにおいて、選択しようとする変異体エンドヌクレアーゼのターゲット部位2コピーを含有する配列と組み合わせた。組み立てが成功したDNA断片を再び、ゲル抽出によって精製し、そしてin vitro区画化(IVC)において、ライブラリーとして用いた。
IVCにおける飽和突然変異誘発に供するアミノ酸位
BCL11A遺伝子ターゲットの(−)および(+)ハーフ部位に関与するI−HjeMI変異体エンドヌクレアーゼのN末端およびC末端ハーフドメインをコードするDNA断片を組み立てて、そして全長BCL11A遺伝子ターゲット部位を切断するヌクレアーゼのプールを、3周期のIVCを通じて選択した(図13)。
細菌における2プラスミド遺伝子除去切断アッセイを用いたBCL11A遺伝子ターゲティングI−HjeMI変異体の活性の最適化
[00161]Doyonら, J. Am. Chem. Soc. 128(7):2477−2484(2006)の方法論にしたがって、細菌細胞における2プラスミド選択系を用いて、IVCディスプレイ選択(上記実施例1に開示する)を用いた選択において得られるI−HjeMI変異体の活性を最適化した。エンドヌクレアーゼ遺伝子のORFを、pENDO(図12、Doyonら, J. Am. Chem. Soc. 128(7):2477−2484(2006))発現プラスミドのNcoIおよびNotI部位の間に挿入した。4コピーのBCL11A遺伝子ターゲットを含有するpCcdBレポータープラスミド(図31、Doyonら, J. Am. Chem. Soc. 128(7):2477−2484(2006); Takeuchiら, Nucl. Acids Res. 37(3):877−890(2009);およびTakeuchiら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10.1073/pnas.1107719108(2011))を宿するNovaXGF(EMD Millipore(Novagen))コンピテント細胞を、I−HjeMI変異体をコードするpEndoプラスミドのプールで形質転換した。形質転換体を2xYT培地(16g/Lトリプトン、10g/L酵母エキス、および5g/L NaCl)中、37℃で30分間増殖させ、そして次いで、100μg/mLカルベニシリンおよび0.02%L−アラビノース(I−HjeMI変異体の発現をあらかじめ誘導するため)を補充した2xYT培地で10倍希釈した。培養を30℃で15時間増殖させた後、細胞を採取し、滅菌水中に再懸濁し、そして非選択プレート(1xM9塩、1%グリセロール、0.8%トリプトン、1mM MgSO4、1mM CaCl2、2μg/mLチアミン、および100μg/mLカルベニシリン)および選択プレート(すなわち、0.02%L−アラビノースおよび0.4mM IPTGを補充して毒性CcdBタンパク質の発現を誘導した非選択プレート)の両方の上にスプレッドした。30℃で30〜40時間インキュベーションした後、選択プレート上の生存コロニーからpEndoプラスミドを抽出した。
2プラスミド切断アッセイにおいて試験したBCL11A遺伝子ターゲティングエンドヌクレアーゼの活性
[00163]例示的なBCL11A遺伝子ターゲティングエンドヌクレアーゼ(BCL11Ahje;図17、配列番号31)、その触媒的に不活性である変異体(BCL11Ahje D18N)、およびその親LHE I−HjeMI(図14、配列番号28)の活性を、I−HjeMIのターゲット部位(I−HjeMIターゲット)またはBCL11A遺伝子ターゲット(TCCAAGTGATGTCTCGGTGGTG(配列番号39;下線ヌクレオチドは、親LHE I−HjeMIのターゲット部位のものとは異なる))のいずれかの4コピーを含有するpCcdBレポータープラスミド(Doyonら, J. Am. Chem. Soc. 128(7):2477−2484(2006))を宿する細菌細胞において測定した。pCcdBレポータープラスミドは、「細胞死制御B」(「ccdB」、IPTGの添加によって誘導可能な、細菌における毒性タンパク質)をコードする。レポータープラスミド中のターゲット部位の切断は、レポータープラスミドのRecBCD仲介性分解、およびIPTGを含有する選択培地上での対応する細胞生存を導く。選択プレート上のコロニー数を非選択プレート上のコロニー数で、割ることによって、生存率を決定した。エラーバーは、3回の独立の実験の±S.D.を指す。
内因性ヒトBCL11A遺伝子でのターゲティング化突然変異誘発の検出
[00164]HEK293T細胞(1.6x105)を、トランスフェクションの24時間前に、12ウェルプレート中に植え付け、そしてBCL11A遺伝子ターゲティングヌクレアーゼおよびTREX2の発現プラスミド各0.5μgでトランスフェクションした。トランスフェクション48時間後、トランスフェクションした細胞を溶解し、そしてQuick−gDNA MiniPrepキット(Zymo Research)を用いて、ゲノムDNAを抽出した。BCL11A遺伝子ターゲットに渡るおよそ500bp断片を、以下のプライマー対を用いて、50ngの抽出ゲノムからPCR増幅した: Bcl11A_up1、5’− GCT GGA ATG GTT GCA GTA AC −3’(配列番号66); Bcl11A_down1、5’− CAA ACA GCC ATT CAC CAG TG −3’(配列番号67)。PCRアンプリコンを、組換えタンパク質を過剰発現する大腸菌から精製した0.5μMのBCL11A遺伝子ターゲティングヌクレアーゼを含みまたは含まず、1xBSA(New England Biolabs)を加えた1xNEB緩衝液4中で37℃で2時間インキュベーションした。5x停止溶液(50mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.5% SDS、25%グリセロール、0.1オレンジGおよび0.5mg/mLプロテイナーゼK)を添加することによって、反応を停止させた。室温で15分間インキュベーションした後、各試料の半分を、TAE中にエチジウムブロミドを含有する1.6%アガロースゲル上で分離した(上部パネル)。各試料の残りを、DNA Clean & Concentrator−5キット(Zymo Research)を用いて精製し、そして以下のプライマー対を用いた第二の周期のPCR中、テンプレートとして用いた: Bcl11A_up2、5’− CTG CCA GCT CTC TAA GTC TCC −3’(配列番号68); Bcl11A_down2、5’− TGC AAC ACG CAC AGA ACA CTC −3’(配列番号69)。PCR産物を再び、上述の条件下で、BCL11A遺伝子ターゲティングヌクレアーゼで消化し、そして1.6%アガロースゲル上で分析した(下部パネル)(図30を参照されたい)。
in vitro区画化を用いたI−OnuIに基づく胎性ヘモグロビンサイレンシング領域ターゲティングエンドヌクレアーゼの選択
[00165]フレンチHPFH欠失において破壊される、成体赤血球細胞におけるHbFサイレンシング領域内のBcl11a占有の領域を含む350bp領域(配列番号2)全体に均一に分布する例示的なホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)ターゲット配列を表4に提示する。これらのターゲット配列は、それに対する非常に活性が高いエンドヌクレアーゼ変異体のプールが単離され、そして配列決定されている、DNA配列モジュールを含む。
ヒト胎性グロビンサイレンシング領域に対するターゲティング化ホーミングエンドヌクレアーゼを生成するIVCにおける飽和突然変異誘発に供されるアミノ酸位
[00168]図23は、ヒト胎性グロビンサイレンシング領域由来の「ハーフターゲット」を用いた切断アッセイの結果を提示する。増幅バンドは、切断されたハーフ部位(相補的二重鎖オリゴヌクレオチドおよび対応するオーバーハングssDNAとの連結によって捕捉される)および切断されたDNA産物の生成に関与する酵素変異体の配列の両方を含有する。「ハーフ部位」エンドヌクレアーゼライブラリーの濃縮の完了に際しての最終段階には、gグロビンサイレンシング領域ターゲットの左(L)および右(R)ハーフ部位に関与する、I−OnuIホーミングエンドヌクレアーゼのN末端およびC末端ハーフドメインをコードするDNA断片の集合が含まれる。全長ヒト胎性グロビンサイレンシング領域ターゲットを切断するプールから、活性I−OnuIエンドヌクレアーゼを選択する。
遺伝子ターゲティング化エンドヌクレアーゼの特異性および活性を増加させるためのTALアンカーのN末端融合を伴うMegaTALホーミングエンドヌクレアーゼ
[00169]TALアンカーのN末端融合を使用して、1またはそれより多いホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば1またはそれより多いI−HjeMI、I−CpaMI、およびI−OnuIホーミングエンドヌクレアーゼを含む、遺伝子ターゲティング化エンドヌクレアーゼの特異性および活性を増加させてもよい。RVDプラスミドライブラリーおよびデスティネーションベクターを用いて、Cermakら, Nucl. Acids Res. 39:e82−e82(2011)に記載されるGolden Gate組み立て戦略を用いて、MegaTALを構築する(MegaTAL:5.5RVD+Y21−AniIのヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関しては、図24、配列番号35および図25、配列番号36を参照されたい)。
Bcl11aが制御する胎性ヘモグロビン(HbF)サイレンシング領域を破壊するためのCas9に基づくエンドヌクレアーゼ系
[00173]細菌が適応免疫のために使用するクラスター化された規則的間隔の短いパリンドロームリピート(CRISPR)系の機構が最近、理解されてきたことによって、哺乳動物細胞のゲノム編集を可能にする強力なツールの開発が導かれてきており:(a)Bcl11aコード領域を破壊し;(b)HbFサイレンシングDNA制御要素または経路、例えばBcl11a制御HbFサイレンシング領域を破壊し;(c)1またはそれより多いγ−グロビン遺伝子プロモーター(単数または複数)を突然変異させて、γ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し;(d)1またはそれより多いδ−グロビン遺伝子プロモーター(単数または複数)を突然変異させて、δ−グロビン遺伝子の発現増加を達成し;そして/または(e)1またはそれより多いβ−グロビン遺伝子突然変異(単数または複数)を修正するため、これを本明細書に開示する異常ヘモグロビン症の治療のための組成物および方法で使用することも可能である。細菌CRISPR系は、Jinekら, Science 337:816−821(2013); Congら, Science(Jan. 3, 2013)(印刷前のEpub);およびMaliら, Science(Jan. 3, 2013)(印刷前のEpub)に記載される。
一般的Cas9ガイドRNAの配列要素
例示的Cas9ガイドRNAに関するターゲット特異的配列
エンドヌクレアーゼを発現するためのベクター系
[00177]NSG、鎌状赤血球およびサラセミア・マウスモデルのため、移植前に、ヒトCD34細胞またはマウス骨髄有核細胞を、蛍光マーカーとともに形質導入して、フローサイトメトリーに基づく細胞の濃縮を可能にする。適切な形質導入法には、以下が含まれる:
[00178]AAV6ベクター。AAV6血清型組換えAAVベクターは、小さい組換えテンプレートに加えて、プロモーター−HE−エクソヌクレアーゼまたはプロモーター−TAL−HE融合−エクソヌクレアーゼカセットを送達するのに十分な4.5kbペイロードを提供する。あるいは、これらは、Cas9およびガイドRNAを所持可能である。さらに、本発明者らは、すべての既知のAAVキャプシドのヒトCD34+臍帯血細胞の最も効率的な形質導入を提供し、そしてHSCにおける一過性遺伝子発現の有意なレベルを仲介することが可能である。
効率的な遺伝子ターゲティングのためのホーミングおよびCas9エンドヌクレアーゼの性質決定
[00185]臨床的影響に関して、個々のターゲティング化細胞における、および細胞集団における、グロビン遺伝子発現レベル、赤血球形成および幹細胞機能に対するターゲティングの効果、ならびにモデル生物における血液学的パラメータおよび臓器機能に対する影響を評価することによって、効率的な遺伝子ターゲティングが立証される。
臨床等級CD34+造血幹細胞
[00196]正常ヒトドナー由来のCD34+細胞を、フィブロネクチンペプチドCH−296を含む培養プレートに接着させて、そして20のMOIで、8時間離れて2回、G−CSF、SCF、IL−3、IL−6、FLT−3、およびTPOを含有する培地中、上述のRSCS−MCS−PG−WZに基づくレンチウイルスベクターに感染させた。これは、〜80%の細胞感染を生じる。Douyのプロトコルを用いて、形質導入細胞を赤血球細胞に分化させる。Giarratanaら, Nat. Biotechnol. 23(1):69−74(2005)。上記のqRT−PCRアッセイは、4%の□−グロビン/□−+β−グロビン比を生じる。この低い比は、ゲノム編集に続く増加の高感度の検出を可能にする。
Claims (13)
- TALエフェクター(TALE)DNA結合ドメインに融合したホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)をコードするポリヌクレオチドであって、該HEが、Bcl11a遺伝子制御領域、胎性ヘモグロビン(HbF)サイレンシング領域、Bcl11a制御HbFサイレンシング領域、γ−グロビン遺伝子プロモーター、およびδ−グロビン遺伝子プロモーターからなる群より選択されるヌクレオチド配列に結合する、前記ポリヌクレオチド。
- HEが、
(a)前記Bcl11a遺伝子制御領域に結合するHE;
(b)I−Onu1ホーミングエンドヌクレアーゼ、I−HjeMIホーミングエンドヌクレアーゼ、およびI−CpaMIホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるHE;
(c)胎性ヘモグロビン(HbF)サイレンシング領域に特異的に結合可能なHE;
(d)I−Onu1ホーミングエンドヌクレアーゼ;
(e)胎性ヘモグロビン(HbF)サイレンシング領域に特異的に結合可能なI−Onu1ホーミングエンドヌクレアーゼをコードする配列番号34のヌクレオチド配列の変異体にコードされるアミノ酸配列を含むI−Onu1ホーミングエンドヌクレアーゼ;
(f)配列番号34のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に1またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の各々が、L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80、およびT82からなる群より選択される、I−Onu1ホーミングエンドヌクレアーゼ;または
(g)配列番号34のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に1またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、F182、N184、I186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238、およびT240からなる群より選択される、I−Onu1ホーミングエンドヌクレアーゼ
である、請求項1のポリヌクレオチド。 - TREX2ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1または2のポリヌクレオチド。
- ベクター、ならびに請求項1から3のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター系。
- 前記ベクターが、AAV6、修飾アデノウイルスベクター、組込み不全レンチウイルスベクター(IDLV)、および組込み不全泡沫状ウイルスベクター(IDFV)からなる群より選択される、請求項4のベクター系。
- 請求項1から3のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
- 以下の(a)、(b)または(c):
(a)請求項1から3のいずれかに記載のポリヌクレオチド;
(b)請求項4または5に記載のベクター系;
(c)請求項6に記載のポリペプチド
を含む、異常ヘモグロビン症を治療するための組成物。 - 請求項1から3のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項4または5に記載のベクター系、または請求項6に記載のポリペプチドを含む細胞。
- 前記細胞が
(a)幹細胞;
(b)造血幹細胞(HSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、胚性幹(ES)細胞、および赤血球前駆細胞からなる群より選択される幹細胞;または
(c)造血幹細胞(HSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、および赤血球前駆細胞からなる群より選択される幹細胞
である、請求項8の細胞。 - ゲノム編集幹細胞であって、請求項1で定義されるTALエフェクター(TALE)DNA結合ドメインに融合したホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)および修正テンプレートの導入によって生成される、前記ゲノム編集幹細胞。
- ホーミングエンドヌクレアーゼが
(a)前記Bcl11a遺伝子制御領域に結合するHE;
(b)I−Onu1ホーミングエンドヌクレアーゼ、I−HjeMIホーミングエンドヌクレアーゼ、およびI−CpaMIホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるHE;
(c)胎性ヘモグロビン(HbF)サイレンシング領域に特異的に結合可能なHE;
(d)I−Onu1ホーミングエンドヌクレアーゼ;
(e)胎性ヘモグロビン(HbF)サイレンシング領域に特異的に結合可能なI−Onu1ホーミングエンドヌクレアーゼをコードする配列番号34のヌクレオチド配列の変異体にコードされるアミノ酸配列を含むI−Onu1ホーミングエンドヌクレアーゼ;
(f)配列番号34のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に1またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の各々が、L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80、およびT82からなる群より選択される、I−Onu1ホーミングエンドヌクレアーゼ;または
(g)配列番号34のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内に1またはそれより多いアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、F182、N184、I186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238、およびT240からなる群より選択される、I−Onu1ホーミングエンドヌクレアーゼ
である、請求項10に記載のゲノム編集幹細胞。 - ホーミングエンドヌクレアーゼが、TREX2ヌクレアーゼドメインに融合されている、請求項10または11に記載のゲノム編集幹細胞。
- 請求項10から12のいずれかに記載のゲノム編集幹細胞であって、
(a)修正テンプレートが、グロビン遺伝子座内の重要な制御配列またはコード配列の修飾を可能にするヌクレオチド配列を含む;
(b)幹細胞が、造血幹細胞(HSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、胚性幹(ES)細胞、および赤血球前駆細胞からなる群より選択される;または
(c)幹細胞が、造血幹細胞(HSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、および赤血球前駆細胞からなる群より選択される、前記ゲノム編集幹細胞。
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