JP2024503249A - 部位特異的変異導入のための組成物及び方法 - Google Patents

部位特異的変異導入のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、二本鎖ＤＮＡ標的部位を編集するための改善されたゲノム編集組成物及び方法を提供する。本開示は、記載される組成物及び方法によって産生されたゲノム編集細胞を更に提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／１２８，３９１号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張するものであり、それは、参照よりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＢＬＵＥ－１３２ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは５４１ＫＢであり、２０２１年１２月１５日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
本開示は、改善されたゲノム編集組成物に関する。より具体的には、本開示は、細胞内のｄｓＤＮＡの部位特異的変異導入のための、ＤＮＡ結合ドメインと、エクソヌクレアーゼに連結されたホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含む融合ポリペプチド、組成物、及びそれらを使用する方法に関する。
関連分野に関する記載
ゲノム編集技術の比較的最近の急増により、ほぼ全ての真核細胞及び哺乳動物において、ゲノム配列を直接標的化及び修飾する可能性が開かれている。かかる技術には、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、クラスター化された規則的な間隔の短い回分配列（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ関連ヌクレアーゼ、及びホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの編集技術の全てに共通する点は、それらが標的ヌクレオチド配列にブレイクポイントを作る一方で、天然細胞修復機構は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同性指向修復（ＨＤＲ）のいずれかによってヌクレオチド配列を再ライゲーションするように残されることである。しかしながら、修復は必ずしも完璧ではない。したがって、最終産物は、様々な遺伝的病変のうちのいずれか１つを含むヌクレオチド配列である。
遺伝子編集ヌクレアーゼの適用から生じる最も頻繁に観察される遺伝子病変は、挿入及び欠失（通例、「インデル」と称される）である。インデルは、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）が、ＮＨＥＪ ＤＮＡ修復機構によって処理され、再密封されたときに生じる。ＮＨＥＪインデルは、典型的には、送達された過剰な相同ＤＮＡ配列の不在下で遺伝子編集イベントを優勢にし、これはＤＳＢを様々な相同組換えアウトカムに転換することができる。
各遺伝子病変の具体的な特性は、異なる表現型転帰につながり得る。例えば、任意の所与の遺伝的病変は、遺伝子の総ノックアウトから、機能の獲得又は喪失、表現型の影響の全くない範囲に及ぶ、幅広い表現型アウトカムをもたらし得る。したがって、遺伝子編集の際に異なる変異につながる機序を更に理解すること、及び治療上意義のある遺伝子編集を実施するための組成物及び方法を開発することの必要性が増大している。
本開示は概して、部分的に、ＤＮＡ結合ドメイン、ヒト遺伝子中の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、リンカードメイン、及びエクソヌクレアーゼを含む融合ポリペプチド、並びにそれを使用する方法に関する。
一態様では、細胞において選択された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的部位に結合して切断するＤＮＡ結合ドメイン及びホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントと、リンカードメインと、エクソヌクレアーゼ又はその生物学的に活性な断片と、を含む融合ペプチドが提供される。
特定の実施形態では、エクソヌクレアーゼは、Ｔｒｅｘ２、ＥｘｏＩ、若しくはＥｘｏＸ、又はその生物学的に活性な断片である。いくつかの実施形態では、エクソヌクレアーゼは、ＥｘｏＸ又はその生物学的に活性な断片である。いくつかの実施形態では、エクソヌクレアーゼは、ＥｘｏＩ又はその生物学的に活性な断片である。いくつかの実施形態では、エクソヌクレアーゼは、Ｔｒｅｘ２又はその生物学的に活性な断片である。
様々な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼは、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼである。
様々な実施形態では、選択されたｄｓＤＮＡ標的部位は、非天然ホーミングエンドヌクレアーゼ標的部位である。
様々な実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、エンドヌクレアーゼｄｓＤＮＡ標的部位の上流のｄｓＤＮＡ標的部位に結合する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位～約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡドメインは、１１．５個のＴＡＬＥ反復単位又は１２．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、又は８個のジンクフィンガーモチーフを含む。
様々な実施形態では、リンカードメインは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、自己切断ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約４～約３０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約１０～約１６個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約１２個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）１－４リンカー（配列番号１１７、１５０～１５２）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）２リンカー（配列番号１５０）を含む。
様々な実施形態では、ＨＥバリアントは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである。いくつかの実施形態では、ＨＥバリアントは、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のＮ末端アミノ酸を欠く。いくつかの実施形態では、ＨＥバリアントは、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠く。いくつかの実施形態では、ＨＥバリアントは、対応する野生型ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠く。いくつかの実施形態では、ＨＥバリアントは、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、又は５個のＣ末端アミノ酸を欠く。いくつかの実施形態では、ＨＥバリアントは、対応する野生型ＨＥと比較して、Ｃ末端アミノ酸を欠く。いくつかの実施形態では、ＨＥバリアントは、対応する野生型ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠く。
特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、及びＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。いくつかの実施形態では、ＨＥバリアントは、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、及びＩ－ＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。好ましい実施形態では、ＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントである。
様々な実施形態では、ＨＥ標的部位は、免疫系チェックポイント遺伝子、グロビン遺伝子、γ－グロビン遺伝子発現及びＨｂＦの抑制に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子、又は免疫抑制シグナル伝達遺伝子内にある。いくつかの実施形態では、ＨＥ標的部位は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＣＲ５、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＴＣＲβ、ＩＬ１０Ｒα、ＩＬ１０Ｒβ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＣＳＫ９、ＡＨＲ、ＢＴＫ、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＳＯＸ６、ＧＡＴＡ１、ＬＳＤ１、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレイクポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、ＴＥＭ５、ＴＥＭ８、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、並びにウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）遺伝子からなる群から選択される遺伝子内にある。いくつかの実施形態では、ＨＥ標的部位は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＣＲ５、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＩＬ１０Ｒα、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＣＳＫ９、ＡＨＲ、ＢＴＫ、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、及びＢＣＬ１１Ａ遺伝子からなる群から選択される遺伝子内にある。いくかの実施形態では、ＨＥ標的部位は、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）遺伝子、ＣＢＬ－Ｂ遺伝子、又はＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）遺伝子内にある。特定の実施形態では、ＴＣＲα遺伝子標的部位は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＢＬ－Ｂ遺伝子標的部位は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＰＤ－１遺伝子標的部位は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。
様々な実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号４に示される標的部位を有するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。
様々な実施形態では、ＥｘｏＸ又はその生物学的に活性な断片は、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＥｘｏＸ又はその生物学的に活性な断片は、配列番号１０９に示されるアミノ酸アミノ酸配列を含む。
様々な実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号４６、６４、７３、及び８２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号４６、６４、７３、及び８２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
様々な実施形態では、ＥｘｏＩ又はその生物学的に活性な断片は、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＥｘｏＩ又はその生物学的に活性な断片は、配列番号１１２に示されるアミノ酸アミノ酸配列を含む。
様々な実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む。
様々な実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４４、６２、７１、及び８０のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４４、６２、７１、及び８０のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列を含む。
様々な実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４５、６３、７２、及び８１のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＲＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４５、６３、７２、及び８１のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４２に示されるＲＮＡ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＲＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４２のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含む。
様々な実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドをコードするベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書で企図される融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
様々な実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドをコードする融合ポリペプチドを含む細胞が提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書で企図される融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書で企図されるベクターを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の修飾を含む。
様々な実施形態では、細胞は、造血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞又は前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ１３３＋細胞である。
様々な実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、又はヘルパーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。
様々な実施形態では、本明細書で企図される細胞集団が提供される。
様々な実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で企図されるポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で企図されるｍＲＮＡを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で企図されるベクターを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で企図される細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で企図される細胞集団を含む組成物が提供される。特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
別の態様では、部位特異的変異導入の方法が提供され、方法は、（ａ）二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的部位を選択することと、（ｂ）本明細書で企図される融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ、又はベクターを細胞内に導入することとを含み、融合ペプチドは、細胞における選択されたｄｓＤＮＡ標的切断部位の近くに欠失中心位置を有する、方向バイアスされた欠失を生成する。
様々な実施形態では、方向バイアスされた欠失の５０％超、５１％超、５２％超、５３％超、５４％超、５５％超、５６％超、５７％超、５８％超、５９％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、又は８０％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。
様々な実施形態では、欠失中心位置は、ＨＥ標的部位の中心位置に対して、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位と同じ側にある。特定の実施形態では、欠失中心位置は、ＨＥ標的部位の中心位置に対して５’にある。
様々な実施形態では、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％の欠失は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。
様々な実施形態では、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、又は少なくとも３５％の欠失は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。
様々な実施形態では、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５０％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％の欠失は、６ｂｐ以上の長さである。
様々な実施形態では、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％の欠失は、１２ｂｐ以上の長さである。
様々な実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０個のヌクレオチドの長さを含む。
様々な実施形態では、欠失は、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位内に延在する。いくつかの実施形態では、欠失の中心位置は、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位内にある。
様々な実施形態では、方法は、末端プロセシング酵素、又は又はその生物学的に活性な断片を細胞に導入することを更に含む。いくつかの実施形態では、末端プロセシング酵素、又はその生物学的に活性な断片は、Ｔｒｅｘ２、Ｔｒｅｘ１、膜貫通型ドメインを含まないＴｒｅｘ１、Ａｐｏｌｌｏ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ２、ＥｘｏＩ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＩＩＩ、ＥｘｏＸ、Ｆｅｎ１、Ｆａｎ１、ＭｒｅＩＩ、Ｒａｄ２、Ｒａｄ９、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ＰＮＫＰ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ、ラムダエクソヌクレアーゼ、Ｓｏｘ、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼ、エクソヌクレアーゼＩ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、エクソヌクレアーゼＶＩＩ、ＮＤＫ１、ＮＤＫ５、ＮＤＫ７、ＮＤＫ８、ＷＲＮ、Ｔ７－エクソヌクレアーゼ遺伝子６、トリ骨髄芽球症ウイルス組み込みタンパク質（ＩＮ）、Ｂｌｏｏｍ、南極ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＡｐｅＩ、緑豆ヌクレアーゼ、Ｈｅｘ１、ＴＴＲＡＰ（ＴＤＰ２）、Ｓｇｓ１、Ｓａｅ２、ＣＵＰ、Ｐｏｌミュー、Ｐｏｌラムダ、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＥＭＥ２、ＳＬＸ１、ＳＬＸ４、及びＵＬ－１２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、末端プロセシング酵素は、エクソヌクレアーゼ、又はその生物学的に活性な断片である。特定の実施形態では、エクソヌクレアーゼは、Ｔｒｅｘ２、又はその生物学的に活性な断片である。
様々な実施形態では、方法は、インビトロ法である。様々な実施形態では、方法は、エクスビボ法である。様々な実施形態では、方法は、インビボ法である。
別の態様では、疾患又はそれに関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、又は改善する方法が提供され、方法は、対象から細胞集団を採取することと、本明細書で企図される方法に従って細胞集団を編集することと、編集された細胞集団を対象に投与することとを含む。
別の態様では、疾患又はそれに関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、又は改善するための、本明細書で企図される細胞の使用が提供される。
別の態様では、疾患又はそれに関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、又は改善するための、本明細書で企図される集団の使用が提供される。
別の態様では、疾患又はそれに関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、又は改善するための、本明細書で企図される組成物の使用が提供される。
様々な実施形態では、疾患又は状態は、免疫障害又はがんである。
ＴＣＲαヌクレオチド配列（ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ）を標的とするように再プログラムされたホーミングエンドヌクレアーゼに連結されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの絵を示す。 ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によるインデル活性を示す。遺伝子編集イベントに特徴的なインデルを含むＮＧＳデータ読み取りを、それらの長さに従って表にする。 ２つの異なるドナーにおける、低活性及び高活性ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬの両方について、ＮＧＳによって評価されたインデル位置分布（フィンガープリント）を示す。ＮＧＳデータは、それらの長さ、及びｍｅｇａＴＡＬに起因するブレイクポイント中心に対するそれらの長手方向位置の両方に従って表にされる。挿入はこの分析から除外される。 ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ（図３Ａ）、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合（図３Ｂ）、及びＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ＋Ｔｒｅｘ２共発現（図３Ｃ）のＮＧＳによるインデル活性を示す。遺伝子編集イベントに特徴的なインデルを含むＮＧＳデータ読み取りを、それらの長さに従って表にする。 同上。 同上。 ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合体、及びＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ＋Ｔｒｅｘ２共発現について、ＮＧＳによって評価されたインデル位置分布（「フィンガープリント」）を示す。ＮＧＳデータは、それらの長さ、及びｍｅｇａＴＡＬに起因するブレイクポイント中心に対するそれらの長手方向位置の両方に従って表にされる。挿入はこの分析から除外される。 細胞表面上のＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖と組み合わさるＣＤ３成分の染色、続いて、フローサイトメトリー分析によって評価された、様々なＴｒｅｘ２ホモログに融合されたＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬの編集効率を示す。 Ｔｒｅｘ２ホモログに融合されたＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬのＮＧＳによるインデル活性を示す。遺伝子編集イベントに特徴的なインデルを含むＮＧＳデータ読み取りを、それらの長さに従って表にする。 Ｔｒｅｘ２カモノハシ、オポッサム、ヒト、及びマウスのホモログに融合されたＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬについて、ＮＧＳによって評価されたインデル位置分布（「フィンガープリント」）を示す。ＮＧＳデータは、それらの長さ、及びｍｅｇａＴＡＬに起因するブレイクポイント中心に対するそれらの長手方向位置の両方に従って表にされる。挿入はこの分析から除外される。 マウスＴｒｅｘ２の共発現あり又はなしの、エクソヌクレアーゼＲＡＤ１、ＲＡＤ９Ａ、ＥｘｏＩ、ＥｘｏＸ、Ｔ５ＦＥＮ、ｌａｎｂｄａＥｘｏ、及びＲｅｃＪに融合されたＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬの編集効率を示す。ＣＤ３発現に対する染色、続いて、フローサイトメトリー分析によって評価されるＴｒｅｘ２ホモログ。 Ｔｒｅｘ２の共発現あり又はなしの、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ単独、及びエクソヌクレアーゼＥｘｏＩ又はＥｘｏＸに融合されたＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬについて、ＮＧＳによって評価されたインデル位置分布（「フィンガープリント」）を示す。ＮＧＳデータは、それらの長さ、及びｍｅｇａＴＡＬに起因するブレイクポイント中心に対するそれらの長手方向位置の両方に従って表にされる。挿入はこの分析から除外される。 高活性ＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬ単独、又はＴｒｅｘ２若しくはＥｘｏＸと融合したものについて、ＮＧＳによって評価されたインデル位置分布（「フィンガープリント」）を示す。ＮＧＳデータは、それらの長さ、及びｍｅｇａＴＡＬに起因するブレイクポイント中心に対するそれらの長手方向位置の両方に従って表にされる。挿入はこの分析から除外される。 低活性ＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬ単独、又はＴｒｅｘ２若しくはＥｘｏＸと融合したものについて、ＮＧＳによって評価されたインデル位置分布（「フィンガープリント」）を示す。ＮＧＳデータは、それらの長さ、及びｍｅｇａＴＡＬに起因するブレイクポイント中心に対するそれらの長手方向位置の両方に従って表にされる。挿入はこの分析から除外される。 ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ単独、又はＴｒｅｘ２若しくはＥｘｏＸと融合したものについて、ＮＧＳによって評価されたインデル位置分布（「フィンガープリント」）を示す。ＮＧＳデータは、それらの長さ、及びｍｅｇａＴＡＬに起因するブレイクポイント中心に対するそれらの長手方向位置の両方に従って表にされる。挿入はこの分析から除外される。 図１２に示される実験からのＰＤＣＤ１遺伝子、２２塩基対のＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ標的部位、及び１３塩基のＴＡＬＥアレイ結合部位（配列番号１５４及び１５９）、並びに４つの代表的な欠失種（配列番号１５５～１５８及び１６０～１６２）を示す。 ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ単独、又はＴｒｅｘ２若しくはＥｘｏＸと融合したものについて、ＮＧＳによって評価されたインデル位置分布（「フィンガープリント」）を示す。欠失種は、得られたリーディングフレームカテゴリーを示すようにコードされる。ＮＧＳデータは、それらの長さ、及びｍｅｇａＴＡＬに起因するブレイクポイント中心に対するそれらの長手方向位置の両方に従って表にされる。挿入はこの分析から除外される。 図１４に示される４つの欠失種カテゴリーの各々の正規化された割合を定量化する積み上げヒストグラムを示す。 トランスフェクション効率を追跡するためのシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、及び３つの可能性のあるリーディングフレームの各々における野生型若しくはモック編集されたＰＤ－１対立遺伝子のいずれか又は両方をコードするポリアデニル化ｍＲＮＡでエレクトロポレーションされた活性化初代ヒトＴ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 低編集ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ、高編集ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ（ＴＣＲα ２．２）、及びＴｒｅｘ２又はＥｘｏＸに対する各々の直接的な融合について、ＮＧＳによって評価されたインデル位置分布（「フィンガープリント」）を示す。ＮＧＳデータは、それらの長さ、及びｍｅｇａＴＡＬに起因するブレイクポイント中心に対するそれらの長手方向位置の両方に従って表にされる。挿入はこの分析から除外される。 Ｔｒｅｘ２又はＥｘｏＸへの直接融合あり又はなしの、低編集ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬの既知のＫＡＴ２Ｂオフターゲット部位におけるインデル位置分布（「フィンガープリント」）を示す。ＮＧＳデータは、それらの長さ、及びｍｅｇａＴＡＬに起因するブレイクポイント中心に対するそれらの長手方向位置の両方に従って表にされる。挿入はこの分析から除外される。 ＥｘｏＸへの直接融合あり又はなしの、高編集ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ（ＴＣＲα ２．２）の既知のＡＣ０１６７００．３オフターゲット部位（配列番号１６３及び１６４）におけるインデル位置分布（「フィンガープリント」）を示す。ＮＧＳデータは、それらの長さ、及びｍｅｇａＴＡＬに起因するブレイクポイント中心に対するそれらの長手方向位置の両方に従って表にされる。挿入はこの分析から除外される。
配列番号に関する簡単な説明
配列番号１～３は、例示的なホーミングエンドヌクレアーゼ標的部位である。
配列番号４は、ＰＤ－１ ＴＡＬＥアレイ標的部位である。
配列番号５～７は、低活性ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質配列である。
配列番号８～１０は、高活性ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質配列である。
配列番号１１～１３は、低活性ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２ ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質配列である。
配列番号１４～１６は、Ｔｒｅｘ２エクソヌクレアーゼＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質配列である。
配列番号１７～５５は、Ｔｒｅｘ２ホモログに融合された低活性ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬのＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質配列である。
配列番号５６～６４は、Ｔｒｅｘ２又はＥｘｏＸへの融合を伴う、又は伴わない、高活性ＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬのＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質配列である。
配列番号６５～７３は、Ｔｒｅｘ２又はＥｘｏＸへの融合を伴う、又は伴わない、低活性ＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬのＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質配列である。
配列番号７４～８２は、Ｔｒｅｘ２又はＥｘｏＸへの融合を伴う、又は伴わないＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬのＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質配列である。
配列番号８３は、ＰＤ－１をコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号８４は、コドン３で１ｂｐの欠失を含むモック編集されたＰＤ－１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号８５は、コドン３で２ｂｐの欠失を含むモック編集されたＰＤ－１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号８６は、コドン３で３ｂｐの欠失を含むモック編集されたＰＤ－１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号８７～１０１は、ＴＣＲα、ＣＢＬ－Ｂ、及びＰＤ－１ホーミングエンドヌクレアーゼのＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質配列である。
配列番号１０２～１０６は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩエンドヌクレアーゼ及びその部分である。
配列番号１０７～１０９は、ＥｘｏＸエクソヌクレアーゼＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質配列である。
配列番号１１０～１１２は、ＥｘｏＩエクソヌクレアーゼＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質配列である。
配列番号１１３～１２３は、様々なリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２４～１４８は、プロテアーゼ切断部位及び自己切断ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。
前述の配列において、Ｘは、存在する場合、任意のアミノ酸又はアミノ酸の不在を指す。
［発明を実施するための形態］
Ａ．概説
本開示は概して、部分的に、改善されたゲノム編集組成物及びその使用方法に関する。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、１）遺伝子編集によって誘発される欠失のサイズを特定の標的サイズに増加させ、かつ２）欠失中心位置をバイアスするために使用される。特定の実施形態では、欠失中心位置は、元のブレイクポイント中心又はエンドヌクレアーゼ標的部位中心に対して、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位と同じ側にあるのが優勢である。特定の実施形態では、欠失中心位置は、元のブレイクポイント中心又はエンドヌクレアーゼ標的部位中心の５’側に対してバイアスされる。ブレイクポイントで、又はブレイクポイントに近位で遺伝子病変のサイズ及び位置を制御することによって、ゲノム編集の表現型アウトカム、例えば、調節ＤＮＡ配列の破壊及び／又は標的遺伝子発現をより正確に制御することができることが更に企図される。
遺伝子編集ヌクレアーゼの適用から生じる最も頻繁に観察される遺伝子病変は、ＮＨＥＪインデルである。ＮＨＥＪ機構が、再密封され、かつ更なるＤＮＡ切断に抵抗性である所与のインデルにどのようにして到達するかに関してはほとんど知られておらず、したがって、遺伝子編集された対立遺伝子のプール内の永続的な遺伝子型として安置されるようになっている。しかしながら、インデルイベントは、ヌクレアーゼが生成したブレイクポイントが発生するＤＮＡ配列で、及びその直接近位で、ほぼ排他的に観察されることが知られている。様々なヌクレアーゼプラットフォーム（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲ）を用いた過去の研究は、遺伝子編集された対立遺伝子が、観察されたインデルの定性的特性に関してある程度の一貫性を示すと示唆している。これは、遺伝子編集のアウトカムを決定する決定的な生物物理学的及び／又は生化学的プロセスがあることを示唆している。しかしながら、異なるＤＮＡ標的部位にわたる異なる遺伝子編集ヌクレアーゼから生じる、編集された対立遺伝子の観測されたスペクトルにはいくつかの微妙な差異があるが、インデル特性に影響を与える能力はとらえどころがないままである。
所与のインデルを定義する定性的特性は、（ｉ）挿入又は削除された塩基の数におけるその長さ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ標的部位又はブレイクポイントに対して通常示される、染色体に沿ったその長手方向位置、及び（ｉｉｉ）挿入に関して、挿入された配列の長さ及び組成物である。欠失は最も顕著なアウトカムであり、典型的には、観察されたイベントの９０～９５％を含む。それらの最も一般的に報告されるサイズ特性は、小さい傾向があり（すなわち、１～２０塩基対の長さ、その範囲の低端に向かってバイアスされた頻度）、それらの位置分布は、均等に分布していることが見出され、ＤＮＡブレイクポイントを網羅し、有意なバイアスなしにいずれかの方向で外側に発散する。これらの特性に対する例外は、ＤＮＡブレイクポイントのいずれかの側に位置するマイクロホモロジー（およそ３～６塩基対の長さの小さな重複した経路）によって駆動されると頻繁に仮定される。ゲノム編集ツールの適用中にはるかに低い頻度で生じる挿入の特性に関してはほとんど報告されていない。更に、各インデル種を表現型に関連付ける遺伝子型の特徴（例えば、それがオープンリーディングフレームにどのような影響を与えるか、又はそれが転写因子結合モチーフを破壊するかどうか）は、潜在的に広大であり、所与の各用途に特有である。
ゲノム編集の表現型アウトカムを正確に制御するのに有用な、別個の編集パターン（例えば、欠失）を有する固有の融合ポリペプチドが本明細書で企図される。様々な実施形態では、融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、及び末端プロセシング酵素（例えば、エクソヌクレアーゼ）を含む。ある特定の実施形態では、エクソヌクレアーゼは、ＥｘｏＸ、ＥｘｏＩ、又はその生物学的に活性な断片である。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、元の編集／ブレイクポイントに対して、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位と同じ側、すなわち５’上に方向バイアスされた欠失中心を有する伸長した遺伝子欠失を誘導する。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位によって包含される欠失中心位置を生成する。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位内に延在する（又はそれによって包含される）欠失を生成する。
特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインと、細胞、ポリペプチドリンカー、及びエクソヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＸ又はＥｘｏＩ）、又はその生物学的に活性な断片において選択された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的部位を結合して切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントとを含む。
様々な実施形態では、融合ポリペプチドをコードするベクター、ポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡが企図される。様々な実施形態では、ゲノム編集された細胞が企図される。様々な実施形態では、融合ポリペプチド、ベクター、ポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又は細胞を含む組成物が企図される。
様々な実施形態では、ゲノム編集、部位特異的変異導入、部位特異的変異導入欠失の長さの増加、欠失の位置のバイアス、及びそれを必要とする対象の治療の方法が企図される。
したがって、本明細書で企図される組成物及び方法は、所望の変異原性アウトカムの戦略的制御及び選択を可能にするため、既存の遺伝子編集戦略と比較して著しい改善を表す。
組換え（すなわち、操作された）ＤＮＡ、ペプチド及びオリゴヌクレオチド合成、免疫アッセイ、組織培養、形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）、酵素反応、精製、並びに関連する技術及び手順は、本明細書を通じて引用され、議論される、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学、及び免疫学における様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されるように一般的に行われてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００８年７月に更新）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ ＵＳＡ，１９８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ ２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｕｌｉｅ Ｌｏｇａｎ，Ｋｉｒｓｔｉｎ Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｎｉｃｋ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００９，Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８ Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ ＣＣ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）、Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、並びにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの専門誌の研究論文を参照されたい。
Ｂ．定義
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書で使用されるべきある特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ち得る。
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載するものと類似した、又は均等の方法及び材料を、特定の実施形態の実施又は検証に使用することができるが、本明細書においては好ましい組成物、方法及び材料の実施形態を開示している。本開示の目的に対し、以下の用語を、以下に規定する。追加の定義は、本開示全体を通じて記載されている。
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」といった冠詞は、本明細書において、冠詞の文法上の対象の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ、又は１以上）を指すために使用される。例示として、「要素」とは、１つの要素、又は１つ以上の要素を意味する。
選択肢（例、「又は」）の使用は、いずれか１つ、両方、又はその選択肢の任意の組み合わせを意味すると理解されたい。
「及び／又は」という用語は、いずれか１つ、又はその選択肢の両方を意味すると理解されたい。
本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さに対し、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％までも変化する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さを指す。一実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さに関し、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さの範囲を指す。
一実施形態では、例えば、１～５、約１～５、又は約１～約５といった範囲は、その範囲に包含される各数値を指す。例えば、１つの非限定的かつ単に例示的な実施形態では、範囲「１～５」は、表現１、２、３、４、５、又は１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、若しくは５．０、又は１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、若しくは５．０と同等である。
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さを指す。一実施形態では、「実質的に同一」とは、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さとおよそ同じである、例えば、生理学的効果などの効果を生じさせる数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さを指す。
本明細書全体を通じて、文脈が別段要求しない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含むこと」は、規定される工程若しくは構成要素又は工程若しくは構成要素の群を含むことを暗示するが、任意の他の工程若しくは構成要素又は工程若しくは構成要素の群を除外することを暗示しないことは理解されるだろう。「～からなる」とは、語句「からなる」に先行するもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。このように、文言「～からなる」は、列記される要素が必要又は義務であり、他の要素は存在し得ないことを示す。「本質的に～からなる」とは、当該文言の後に列記される任意の要素、及び列記される要素に関して本開示中に特定される活性若しくは作用に干渉しない、又は寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。したがって、「本質的に～からなる」という文言は、列記される要素が必須又は義務であるが、列記される要素の活性又は作用に実質的に影響を与える他の要素は存在しないことを示す。
本明細書全体を通じて「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、若しくは「更なる実施形態」、又はそれらの組み合わせに対する参照は、当該実施形態と関連付けて記載される特定の性質、構造又は特徴が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。このように、本明細書全体の様々な箇所での前述の文言の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。更に、特定の性質、構造、又は特徴は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされ得る。また、一実施形態でのある性質の肯定的な列挙は、特定の実施形態では当該性質の除外の根拠として機能することを理解されたい。
用語「生体外での」は、一般的に、生物の外側の、好ましくは、自然条件の最小限の変化を伴う、人工環境で行われる実験若しくは測定又は生きている組織での実験若しくは測定などの、生物の外側の場所で生じる活動を指す。特定の実施形態では、「生体外での」手法は、生物から採取され、実験装置で、通常、無菌条件下で、典型的には、数時間又は最大約２４時間であるが、状況に応じて最大４８時間又は７２時間培養されるか、又は調節される生きた細胞又は組織を含む。ある特定の実施形態では、このような組織又は細胞は、収集され、凍結され、その後、生体外での処置のため融解することができる。生きた細胞又は組織を使用して数日以上継続する組織培養実験又は手法は、典型的には、「インビトロ」であるとみなされるが、ある特定の実施形態では、この用語は、生体外と互換的に使用され得る。
用語「インビボ」は、一般的に、生物の内部で生じる活動を指す。一実施形態では、細胞ゲノムは、インビボで操作されるか、編集されるか、又は修飾される。
「強化」又は「促進」又は「増加」又は「拡大」又は「増強」は、概して、ビヒクル又は対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より大きな応答（すなわち、生理学的応答）を生じさせるか、誘発するか、又は引き起こす本明細書で企図される融合ポリペプチド、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、又はゲノム編集された細胞の能力を指す。測定可能な応答は、編集イベント（例えば、インデル）、欠失、挿入、欠失長さ、及び／又は標的遺伝子発現の増加を含んでもよく、特に当該技術分野及び本明細書の説明の理解から明らかである。「増加した」又は「増強した」量は、典型的には、「統計上有意な」量であり、ビヒクル又は対照により生じる応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上（例えば、５００、１０００倍）（間で１より上の全ての整数及び小数点を含む、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）である増加を含み得る。
「減少させる」又は「低下させる」又は「減らす」又は「低減する」又は「減弱させる」又は「切除する」又は「阻害する」又は「弱める」は、概して、ビヒクル又は対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より少ない応答（すなわち、生理学的応答）を生じさせるか、誘発するか、又は引き起こす本明細書で企図される融合ポリペプチド、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、又はゲノム編集された細胞の能力を指す。測定可能な応答は、編集イベント（例えば、インデル）、欠失、挿入、欠失長さ、標的遺伝子発現、及び／又は疾患に関連する１つ以上の症状の減少を含み得る。「減少」又は「低減された」量は、典型的には、「統計上有意な」量であり、ビヒクル又は対照により生じる応答（参照応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上（例えば、５００、１０００倍）（間で１より上の全ての整数及び小数点を含む、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）である減少を含み得る。
「維持する」又は「保存する」又は「維持」、又は「変化なし」又は「実質的な変化なし」又は「実質的な減少なし」は、概して、ビヒクル又は対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、実質的に類似又は同等の生理学的応答（すなわち、下流の効果）を生じさせるか、誘発するか、又は引き起こす本明細書で企図される融合ポリペプチド、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、又はゲノム編集された細胞の能力を指す。同等の反応は、基準反応と実質的に違わない、又は測定可能な程度に違わない反応である。
本明細書において使用される、用語「特異的結合親和性」又は「特異的に結合する」又は「特異的に結合した」又は「特異的結合」又は「特異的に標的となる」は、１つの分子の別の分子、例えば、バックグラウンド結合よりも高い結合親和性で、ＤＮＡに結合するポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインへの結合を説明する。結合ドメインは、例えば、約１０５Ｍ－１以上の親和性又はＫａ（すなわち、１／Ｍの単位で特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的部位に結合するか、又は標的部位と会合する場合、標的部位に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態では、結合ドメインは、約１０６Ｍ－１、１０７Ｍ－１、１０８Ｍ－１、１０９Ｍ－１、１０１０Ｍ－１、１０１１Ｍ－１、１０１２Ｍ－１、又は１０１３Ｍ－１以上のＫａで標的部位に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１、少なくとも１０１３Ｍ－１、又はそれ以上のＫａを有する結合ドメインを指す。
あるいは、親和性は、Ｍ単位（例えば、１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ、又はそれ未満）での特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義されてもよい。特定の実施形態において企図されるＤＮＡ標的部位に対する１つ以上のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼバリアントの親和性は、従来技術、例えば、酵母細胞表面表示を使用して、又は結合会合、若しくは標識リガンドを使用した置換アッセイによって容易に決定することができる。
一実施形態では、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合より約２倍高いか、バックグラウンド結合より約５倍高いか、バックグラウンド結合より約１０倍高いか、バックグラウンド結合より約２０倍高いか、バックグラウンド結合より約５０倍高いか、バックグラウンド結合より約１００倍高いか、又はバックグラウンド結合より約１０００倍高いか、又はそれ以上である。
用語「選択的に結合する」又は「選択的に結合された」又は「選択的結合」又は「選択的に標的化する」は、複数のオフターゲット分子の存在下で、標的分子に１つの分子が優先的に結合すること（オンターゲット結合）を説明する。特定の実施形態では、ＨＥ又はｍｅｇａＴＡＬは、標的上のＤＮＡ結合部位に、ＨＥ又はｍｅｇａＴＡＬがオフターゲットのＤＮＡ標的結合部位に結合するより約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、又は１０００倍高い頻度で選択的に結合する。
「オンターゲット」は、標的部位配列を指す。
「オフターゲット」は、標的部位配列と類似するが、同一ではない配列を指す。
「標的部位」又は「標的配列」は、結合及び／又は切断に十分な条件が存在するという条件で、結合分子が結合し、かつ／又は切断する核酸の一部分を定義する染色体又は染色体外核酸配列である。標的部位又は標的配列の１つの鎖のみを参照するポリヌクレオチド配列又は配列番号に言及するとき、ヌクレアーゼバリアントによって結合され、かつ／又は切断される標的部位又は標的配列は、二本鎖であり、参照配列及びその相補鎖を含むことは理解される。様々な実施形態では、標的部位は、免疫系チェックポイント遺伝子、グロビン遺伝子、γ－グロビン遺伝子発現及び／若しくはＨｂＦの抑制に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子、又は免疫抑制性シグナル伝達遺伝子中にある。ある特定の実施形態では、標的部位は、ヒトＴＲＡＣ遺伝子、ＣＢＬ－Ｂ遺伝子、又はＰＤＣＤ１遺伝子における配列である。
「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換えによるドナー捕捉を含むが、これらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間の遺伝子情報の交換プロセスを指す。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を介した細胞内の二本鎖切断の修復中に生じる、このような交換の特定の形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、鋳型として「ドナー」分子を使用して、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験したもの）を修復し、ドナーから標的への遺伝情報の伝達につながるため、「非クロスオーバー遺伝子変換」又は「ショートトラクト遺伝子変換」として多様に知られている。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、かかる導入は、破壊された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、及び／又はドナーが、標的の一部となる遺伝的情報を再合成するために使用される「合成依存性鎖アニーリング」、及び／又は関連するプロセスに関与し得る。かかる特定されたＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部又は全てが、標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の変化をもたらす。
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素又は化学加水分解を含むが、これらに限定されない、様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が、可能である。二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端又はねじれ型末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される、ポリペプチド及びヌクレアーゼバリアント、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、関連する融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断に使用される。エンドヌクレアーゼ切断認識部位は、いずれかのＤＮＡ鎖上にあってもよい。
「方向バイアスされた」又は「方向バイアスされた欠失」は、エンドヌクレアーゼによって誘導された二本鎖ＤＮＡ切断に応答して、細胞の内因性修復機構によって作られる欠失の位置を指す。欠失が方向バイアスされている場合、それらは、標的切断部位又は二本鎖ＤＮＡ切断（ブレイクポイント又はブレイクポイント中心）に対して、５’又は３’のいずれかで優勢に生じるであろう。すなわち、ブレイクポイント中心又は標的部位の中心位置と比較して、実質的により多くの欠失が一方の側で他方の側よりも生じる。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ブレイクポイント中心又はＨＥ標的部位の中心位置に対して、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位と同じ側で発生する方向バイアス欠失を有する遺伝子欠失を誘導する。更なる実施形態では、融合ポリペプチドは、元のブレイクポイント中心又はＨＥ標的部位の中心位置のものに対して５’の方向バイアスされた欠失中心を有する遺伝子欠失を誘導する。好ましい実施形態では、方向バイアスされた欠失も伸長される。更に、本明細書で企図される融合タンパク質によって誘導される方向バイアスされた欠失又は伸長の量は、同じエクソヌクレアーゼの共発現によって産生される欠失の分布又は欠失の長さ、並びに同じＤＮＡ結合ドメイン及び同じホーミングエンドヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドと比較することができる。
「外来」分子は、細胞に通常存在しないが、１つ以上の遺伝的、生化学的、又は他の方法によって細胞に導入される分子である。例示的な外来分子としては、小有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記分子の任意の修飾された誘導体、又は上記分子の１つ以上を含む任意の複合体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞への外来分子の導入方法は、当業者に既知であり、脂質により媒介される伝達（すなわち、中性脂質及びカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストランにより媒介される伝達、及びウイルスベクターにより媒介される伝達が挙げられるが、これらに限定されない。
「内在」分子は、特定の環境条件下での特定の発生段階で、特定の細胞に通常存在する分子である。追加の内在分子には、タンパク質が含まれ得る。
「遺伝子」とは、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、並びに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を指し、かかる調節配列がコード配列及び／又は転写された配列に隣接しているか否かを問わない。遺伝子には、プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、ターミネーター、ポリアデニル化配列、転写後応答エレメント、リボソーム結合部位及び内部リボソーム侵入部位などの翻訳制御配列、複製起源、基質結合部位、並びに座位制御領域が挙げられるが、これらに限定されない。
「遺伝子発現」は、遺伝子内に含まれる情報を遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、又は任意の他のタイプのＲＮＡ）の直接転写産物であり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、並びに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化、及びグリコシル化によって修飾されるタンパク質を含む。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子操作された」又は「遺伝子修飾された」は、細胞中の総遺伝物質へのＤＮＡ又はＲＮＡの形態の余分な遺伝物質の染色体又は染色体外付加を指す。遺伝子修飾は、細胞のゲノム中の特定の部位を標的とするか、又は非標的とすることができる。一実施形態では、遺伝子修飾は、部位特異的である。一実施形態では、遺伝子修飾は、部位特異的ではない。
本明細書において使用される、用語「ゲノム編集」は、細胞のゲノム中の標的部位における遺伝物質の置換、欠失、及び／又は導入を指し、これは、遺伝子又は遺伝子産物の発現を回復させ、修正し、破壊し、かつ／又は修飾する。特定の実施形態で企図されるゲノム編集は、１つ以上のヌクレアーゼバリアントを細胞に導入して、任意選択で、ドナー修復鋳型の存在下で、細胞のゲノム中の標的部位に、又は標的部位の近位にＤＮＡ病変を生成することを含む。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子療法」は、遺伝子若しくは遺伝子産物の発現を回復するか、修正するか、若しくは修飾する細胞において、又は治療用ポリペプチドを発現させる目的で、過剰な遺伝物質を総遺伝物質に導入することを指す。特定の実施形態では、遺伝子若しくは遺伝子産物の発現を回復させるか、修正するか、破壊するか、若しくは修飾するゲノム編集によって、又は治療用ポリペプチドを発現させる目的で、遺伝物質を細胞のゲノムに導入することは、遺伝子療法とみなされる。
Ｃ．融合ポリペプチド
標的部位の編集に好適である本明細書の特定の実施形態で企図される融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼ、及び末端プロセシングドメイン（例えば、エクソヌクレアーゼ）を含む。様々な実施形態では、融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン及びホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドリンカー、並びにエクソヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＸ）、又はその生物学的に活性な断片を含む。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端への順に、ＤＮＡ結合ドメイン、第１のリンカードメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、第２のリンカードメイン、及びエクソヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＸ）、又はその生物学的に活性な断片を含む。
様々な実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン又はジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインである。
様々な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼは、操作されたヌクレアーゼである。用語「再プログラム化されたヌクレアーゼ」、「操作されたヌクレアーゼ」、又は「ヌクレアーゼバリアント」は、互換的に使用され、１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン及び１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼ又はホーミングエンドヌクレアーゼ）を指し、ヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ標的配列又は部位に結合して切断するために、親又は天然発生型ヌクレアーゼから設計され、かつ／又は修飾されている。ヌクレアーゼバリアントは、天然発生型ヌクレアーゼから、又は以前のヌクレアーゼバリアントから設計され、かつ／又は修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼバリアントは、非天然標的配列又は部位に結合して切断するように設計される。
標的配列に結合して切断する融合ポリペプチドの例には、限定されないが、リンカードメイン（例えば、ポリペプチドリンカー）によってエクソヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＸエクソヌクレアーゼ）に連結されたｍｅｇａＴＡＬ、又はその生物学的に活性な断片が含まれるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、一緒に細胞に導入されるときに、類似の非融合／連結ポリペプチド、例えば、別個のｍｅｇａＴＡＬ及びエクソヌクレアーゼによって誘導された欠失と比較して、位置的にバイアスされた欠失及び／又は伸長した欠失を作製するのに有用である。特定の実施形態では、欠失は、類似の非融合／連結ポリペプチドによって誘導された欠失と比較して、より方向バイアスされている。より特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドは、ブレイクポイントの一方の側に他方よりも実質的により多くの欠失を生じさせる。例えば、記載される融合ポリペプチドは、ブレイクポイント又はヌクレアーゼ標的部位の中心位置に対して５’に欠失中心を有する実質的により多くの変異原性欠失を誘導する。
１．ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）バリアント
様々な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ又はメガヌクレアーゼは、標的遺伝子内の標的部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するように再プログラムされる。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」及び「メガヌクレアーゼ」は、互換的に使用され、１２～４５塩基対の切断部位（例えば、標的部位）を認識し、かつ配列及び構造モチーフ：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ－ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓ ｂｏｘ、及びＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫに基づく５つのファミリーに一般にグループ化される、天然発生型ヌクレアーゼを指す。
「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」又は「参照メガヌクレアーゼ」は、自然界に見出される野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ又はホーミングエンドヌクレアーゼを指す。一実施形態では、「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、基礎活性を増加させるように修飾された野生型ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
「操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ」「再プログラム化されたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント」、「操作されたメガヌクレアーゼ」、「再プログラム化されたメガヌクレアーゼ」、又は「メガヌクレアーゼバリアント」は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン及び１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むホーミングエンドヌクレアーゼを指し、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列又は部位に結合して切断するように、親又は天然発生型ホーミングエンドヌクレアーゼから設計され、かつ／又は修飾されている。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、天然発生型ホーミングエンドヌクレアーゼから、又は別のホーミングエンドヌクレアーゼバリアントから設計され、かつ／又は修飾されてもよい。
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントは、自然界には存在せず、組換えＤＮＡ技術によって、又はランダム変異導入によって得ることができる。ＨＥバリアントは、天然発生型ＨＥ又はＨＥバリアントにおいて、１つ以上のアミノ酸変化を作ること、例えば、１つ以上のアミノ酸を変異させるか、置換するか、付加するか、又は欠失させることによって得られてもよい。特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースに対して１つ以上のアミノ酸変化を含む。
特定の実施形態で企図されるＨＥバリアントは、１つ以上のリンカー及び／又は追加の機能ドメイン、例えば、５’～３’のエクソヌクレアーゼ、５’～３’のアルカリ性エクソヌクレアーゼ、３’～５’のエクソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２、ＥｘｏＩ、又はＥｘｏＸ）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、又は鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを更に含んでもよい。様々な実施形態では、リンカードメイン（例えば、ポリペプチドリンカー）によって末端プロセシング酵素に連結されたＨＥバリアントを含むポリペプチドが提供される。様々な実施形態では、末端保有酵素は、３’～５’のエクソヌクレアーゼ活性を呈する。特定の実施形態では、末端プロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２、ＥｘｏＩ、又はＥｘｏＸである。ＨＥバリアント及び末端プロセシング酵素は、例えば、異なるベクター若しくは別個のｍＲＮＡに別々に、又は例えば、融合タンパク質として一緒に、又はウイルス自己切断ペプチド若しくはＩＲＥＳエレメントによって分離されるポリシストロニック構築物に導入されてもよい。
「ＤＮＡ認識インターフェース」は、核酸標的塩基と相互作用するＨＥアミノ酸残基並びに隣接する残基を指す。各ＨＥについて、ＤＮＡ認識インターフェースは、側鎖と側鎖及び側鎖とＤＮＡ接触の広範なネットワークを含み、そのほとんどは、特定の核酸標的配列を認識するのに必然的に固有である。したがって、特定の核酸配列に対応するＤＮＡ認識インターフェースのアミノ酸配列は、大きく変化し、任意の天然又はＨＥバリアントの特性である。非限定的な例として、特定の実施形態で企図されるＨＥバリアントは、天然ＨＥ（又は以前に生成されたＨＥバリアント）のＤＮＡ認識インターフェースに局在化された１つ以上のアミノ酸残基が変化するＨＥバリアントのライブラリーを構築することによって誘導され得る。ライブラリーは、切断アッセイを使用して、予測される各ＢＴＫ標的部位に対する標的切断活性についてスクリーニングされてもよい（例えば、Ｊａｒｊｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７（２０）：６８７１－６８８０を参照されたい）。
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）は、ホーミングエンドヌクレアーゼの最もよく研究されたファミリーであり、主に、古細菌において、及び緑藻類及び真菌類における細胞小器官ＤＮＡにおいてコードされ、最も高い全体的なＤＮＡ認識特異性を示す。ＬＨＥは、タンパク質鎖当たり１つ又は２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ触媒モチーフを含み、それぞれ、ホモ二量体又は単鎖単量体として機能する。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質の構造研究により、高度に保存されたコア構造が同定され（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ２００５）、これは、このフォールドの第１のヘリックスに属するＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するαββαββαフォールドによって特徴付けられる。ＬＨＥの非常に効率的で特異的な切断は、新規で高度に特異的なエンドヌクレアーゼを誘導するためのタンパク質足場を表す。しかしながら、非天然又は非正規の標的部位に結合して切断するようにＬＨＥを操作することは、標的部位における塩基対位置の最大３分の２で、適切なＬＨＥ足場の選択、標的座位の調査、推定標的部位の選択、並びにそのＤＮＡ接触点及び切断特異性を改変させるためのＬＨＥの広範な改変を必要とする。
一実施形態では、再プログラムされたＬＨＥ又はＬＨＥバリアントが設計され得るＬＨＥには、Ｉ－ＣｒｅＩ及びＩ－ＳｃｅＩが含まれるが、これらに限定されない。
再プログラムされたＬＨＥ又はＬＨＥバリアントが設計され得るＬＨＥの例示的な例には、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、及びＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、再プログラムされたＬＨＥ又はＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＣｐａＭＩバリアント、Ｉ－ＨｊｅＭＩバリアント、Ｉ－ＯｎｕＩバリアント、Ｉ－ＰａｎＭＩバリアント、及びＩ－ＳｍａＭＩバリアントからなる群から選択される。
一実施形態では、標的遺伝子を標的とする再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥ又はＩ－ＯｎｕＩバリアントは、天然のＩ－ＯｎｕＩ又はその生物学的に活性な断片（配列番号１０２～１０６）から生成され得る。
様々な実施形態では、標的遺伝子は、免疫系チェックポイント遺伝子、グロビン遺伝子、γ－グロビン遺伝子発現及び／若しくはＨｂＦの抑制に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子、又は免疫抑制性シグナル伝達遺伝子である。
一実施形態では、標的遺伝子は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＣＲ５、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＴＣＲβ、ＩＬ１０Ｒα、ＩＬ１０Ｒβ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＣＳＫ９、ＡＨＲ、ＢＴＫ、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＳＯＸ６、ＧＡＴＡ１、ＬＳＤ、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレイクポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、ＴＥＭ５、ＴＥＭ８、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、並びにウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）遺伝子からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＣＲ５、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＩＬ１０Ｒα、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＣＳＫ９、ＡＨＲ、ＢＴＫ、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、及びＢＣＬ１１Ａ遺伝子からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＣＢＬ－Ｂ、又はＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）遺伝子である。
一実施形態では、標的遺伝子は、ＴＲＡＣ遺伝子、ＣＢＬ－Ｂ遺伝子、又はＰＤ－１遺伝子である。特定の実施形態では、標的遺伝子／部位は、配列番号１、２、又は３に示されるヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ヒトＴＲＡＣ（ＴＣＲα）遺伝子を標的とする再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥ又はＩ－ＯｎｕＩバリアントは、既存のＩ－ＯｎｕＩバリアントから生成された。いくつかの実施形態では、再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、配列番号１に示されるヒトＴＲＡＣ遺伝子標的部位に対して生成された。
別の実施形態では、ヒトＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）遺伝子を標的とする再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥ又はＩ－ＯｎｕＩバリアントは、既存のＩ－ＯｎｕＩバリアントから生成された。いくつかの実施形態では、再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、配列番号２に示されるヒトＰＤ－１遺伝子標的部位に対して生成された。
別の実施形態では、ヒトＣＢＬ－Ｂ遺伝子を標的とする再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥ又はＩ－ＯｎｕＩバリアントは、既存のＩ－ＯｎｕＩバリアントから生成された。いくつかの実施形態では、再プログラム化されたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、配列番号３に示されるヒトＣＢＬ－Ｂ遺伝子標的部位に対して生成された。
特定の実施形態では、標的遺伝子に結合して切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号８９、９２、９５、９８、１０１、又は１０２～１０６のうちのいずれか１つに示されるＩ－ＯｎｕＩ、その生物学的に活性な断片、及び／又はその更なるバリアントのＤＮＡ認識インターフェースにおいて１つ以上のアミノ酸置換又は修飾を含む。
特定の実施形態では、標的遺伝子に結合して切断する再プログラムされたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥ又はＩ－ＯｎｕＩバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、標的遺伝子に結合して切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、配列番号８９、９２、９５、９８、１０１、若しくは１０２～１０６に示されるＩ－ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１ Ａｕｇ ９；１０８（３２）：１３０７７－１３０８２）若しくはＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアント、又はその更なるバリアントのＤＮＡ認識インターフェースと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む。
一実施形態では、標的遺伝子に結合して切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、配列番号８９、９２、９５、９８、１０１、若しくは１０２～１０６に示されるＩ－ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１ Ａｕｇ ９；１０８（３２）：１３０７７－１３０８２）若しくはＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアント、又はその更なるバリアントのＤＮＡ認識インターフェースと少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を含む。
特定の実施形態では、標的遺伝子に結合して切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースにおいて、特に、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１０２～１０６）、配列番号８９、９２、９５、９８、及び１０１に示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、並びに／又はその更なるバリアントの２４～５０、６８～８２、１８０～２０３、及び２２３～２４０位に位置するサブドメインにおいて、１つ以上のアミノ酸置換又は修飾を含む。
特定の実施形態では、標的遺伝子に結合して切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１０３～１０７）若しくは配列番号８９、９２、９５、９８、及び１０１に示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、並びに／又はその更なるバリアントの２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、及び２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置でＤＮＡ認識インターフェースにおける１つ以上のアミノ酸置換又は修飾を含む。
一実施形態では、標的遺伝子に結合して切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ配列全体内の任意の場所に位置する追加位置に１つ以上のアミノ酸置換又は修飾を含む。置換及び／又は修飾され得る残基は、直接的に又は水分子を介して、核酸標的と接触するか、又は核酸骨格若しくはヌクレオチド塩基と相互作用するアミノ酸を含む。１つの非限定的な例では、標的遺伝子に結合して切断する本明細書で企図されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ配列番号１０２～１０６若しくは配列番号８９、９２、９５、９８、及び１０１に示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、並びに／又はその更なるバリアントの位置：２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６１、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、８５、１１６、１３５、１３８、１４３、１４７、１５９、１６４、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２１０、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、及び２４６からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に、１つ以上の置換及び／又は修飾を含み、好ましくは、少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２０個、より好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３０個、更により好ましくは、少なくとも３５個、又は更により好ましくは、少なくとも４０個を含む。
特定の実施形態では、標的遺伝子に結合して切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ配列番号１０２～１０６若しくは配列番号８９、９２、９５、９８、及び１０１に示されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、並びに／又はその更なるバリアントの２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６１、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、８５、１１６、１３５、１３８、１４３、１４７、１５９、１６４、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２１０、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、及び２４６からなる群から選択されるアミノ酸位置で少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、又は更により好ましくは、少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む。
特定の実施形態では、標的遺伝子に結合して切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号８９、９２、９５、９８、及び１０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、又はその生物学的に活性な断片と少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、又は更により好ましくは、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号８９、９２、９５、９８、及び１０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、又はその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号８９に示されるアミノ酸配列、又はその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号９２に示されるアミノ酸配列、又はその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号９５に示されるアミノ酸配列、又はその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号９８に示されるアミノ酸配列、又はその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号１０１に示されるアミノ酸配列、又はその生物学的に活性な断片を含む。
２．ＤＮＡ結合ドメイン
様々な実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼのものに対してＮ末端に位置する。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、末端プロセシングドメイン（例えば、エクソヌクレアーゼ）のものに対してＮ末端である、ホーミングエンドヌクレアーゼのものに対してＮ末端に位置付けられたＤＮＡ結合ドメインを含む。換言すると、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメインとエクソヌクレアーゼとの間にサンドイッチされる。したがって、Ｎ末端からＣ末端の順に、本明細書で企図される例示的な融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン、第１のポリペプチドリンカー、ホーミングエンドヌクレアーゼ、第２のポリペプチドリンカー、及びエクソヌクレアーゼを含む。
一態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ｍｅｇａＴＡＬを含む。「ｍｅｇａＴＡＬ」は、標的遺伝子におけるＤＮＡ標的配列に結合して切断し、かつ１つ以上のリンカー及び／又は追加の機能的ドメイン、例えば、５’～３’のエクソヌクレアーゼ、５’～３’のアルカリ性エクソヌクレアーゼ、３’～５’のエクソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２、ＥｘｏＩ、又はＥｘｏＸ）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ又は鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及びホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含む、ポリペプチドを指す。
様々な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むｍｅｇａＴＡＬは、標的遺伝子に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するように再プログラムされる。いくつかの実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むｍｅｇａＴＡＬは、免疫系チェックポイント遺伝子、グロビン遺伝子、γ－グロビン遺伝子発現及び／若しくはＨｂＦの抑制に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子、又は免疫抑制シグナル伝達遺伝子における標的配列において二重鎖切断を導入するように再プログラムされる。いくつかの実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むｍｅｇａＴＡＬは、ヒトＴＲＡＣ遺伝子、ＰＤ－１遺伝子、又はＣＢＬ－Ｂ遺伝子（例えば、それぞれ、配列番号１～３）における標的配列において二重鎖切断を導入するように再プログラムされる。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」は、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ又はＴＡＬエフェクター）のＤＮＡ結合部分であり、それは、植物転写活性化因子を模倣して、植物トランスクリプトームを操作する（例えば、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８－６５１を参照されたい）。特定の実施形態で企図されるＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、デノボで操作されるか、又は天然発生型ＴＡＬＥ、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｇａｒｄｎｅｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｌｆａｌｆａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、及びＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＡｖｒＢｓ３、並びにＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来のｂｒｇ１１及びｈｐｘ１７に由来する。ＤＮＡ結合ドメインを導き、設計するためのＴＡＬＥタンパク質の例示的な例は、米国特許第９，０１７，９６７号、及びそこで引用される参考文献に開示されており、その全てが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、その対応する標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの結合に関与する、１つ以上の反復単位を含む。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３～３５アミノ酸長である。各ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位は、典型的には、反復の１２位及び／又は１３位で、反復可変二残基（ＲＶＤ）を構成する１つ又は２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ認識のための天然（正準）コードは、１２位及び１３位のＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合を導き、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧ又はＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように決定されている。ある特定の実施形態では、非正準（非定型）ＲＶＤが企図される。
特定の実施形態で企図される特定のｍｅｇａＴＡＬでの使用に好適な非正準ＲＶＤの例示的な例には、グアニン（Ｇ）の認識については、ＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、ＳＳ、ＮＮ、ＳＮ、ＫＮ；アデニン（Ａ）の認識については、ＮＩ、ＫＩ、ＲＩ、ＨＩ、ＳＩ；チミン（Ｔ）の認識については、ＮＧ、ＨＧ、ＫＧ、ＲＧ；シトシン（Ｃ）の認識については、ＲＤ、ＳＤ、ＨＤ、ＮＤ、ＫＤ、ＹＧ；Ａ又はＧの認識については、ＮＶ、ＨＮ；及びＡ又はＴ又はＧ又はＣの認識については、Ｈ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、Ｓ＊が含まれるが、これらに限定されず、（＊）は、１３位のアミノ酸が不在であることを意味する。特定の実施形態で企図される特定のｍｅｇａＴＡＬでの使用に好適なＲＶＤの更なる例示的な例には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６１４，０９２号に開示されるものが更に含まれる。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、３～３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、５～１５個の反復単位、より好ましくは、７～１５個の反復単位、より好ましくは、９～１５個の反復単位、より好ましくは、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の反復単位を含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、３～３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及びＴＡＬＥ反復単位のセットのＣ末端に位置する２０個のアミノ酸を含む追加の単一切断ＴＡＬＥ反復単位、すなわち、追加のＣ末端半ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位（上記、本明細書の別の場所で開示されるＣキャップのアミノ酸－２０～－１）を含む。したがって、特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、３．５～３０．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、又は３０．５個のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、５．５～１５．５個の反復単位、より好ましくは、７．５～１５．５個の反復単位、より好ましくは、９．５～１５．５個の反復単位、より好ましくは、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、又は１５．５個の反復単位を含む、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチド、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチド、及びホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むＴＡＬエフェクター構築物を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ反復、及び／又はＣＴＤドメインは、同じ種由来である。他の実施形態では、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ反復、及び／又はＣＴＤドメインの１つ以上は、異なる種由来である。
本明細書で使用される、用語「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドは、天然発生型ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分又は断片に隣接する配列を指す。ＮＴＤ配列が、存在する場合、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さであってもよい。特定の実施形態では、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに対する少なくとも１２０～少なくとも１４０個以上のアミノ酸のＮ末端を含む（０は、最もＮ末端の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態では、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに対して、少なくとも約１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、又は少なくとも１４０個のアミノ酸のＮ末端を含む。一実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、キサントモナスＴＡＬＥタンパク質の少なくとも約アミノ酸＋１～＋１２２から少なくとも約＋１～＋１３７のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態では、ＮＴＤポリペプチドは、キサントモナスＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに対して、少なくとも約１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、又は１３７個のアミノ酸のＮ末端を含む。一実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、ラルストニアＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸＋１～＋１２１のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態では、ＮＴＤポリペプチドは、ラルストニアＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに対して、少なくとも約１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、又は１３７個のアミノ酸のＮ末端を含む。
本明細書で使用される場合、用語「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドは、天然発生型ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分又は断片に隣接する配列を指す。ＣＴＤ配列が、存在する場合、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さであってもよい。特定の実施形態では、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全な反復にＣ末端の、少なくとも２０～少なくとも８５個以上のアミノ酸を含む（最初の２０個のアミノ酸は、最後のＣ末端完全反復単位までの、Ｃ末端の半反復単位である）。特定の実施形態では、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復にＣ末端の、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、又は少なくとも８５個のアミノ酸を含む。一実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、キサントモナスＴＡＬＥタンパク質の少なくとも約アミノ酸－２０～－１のＣＴＤポリペプチドを含む（－２０は、Ｃ末端の完全反復単位Ｃ末端の半反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態では、ＣＴＤポリペプチドは、キサントモナスＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復のＣ末端の、少なくとも約２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸を含む。一実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、ラルストニアＴＡＬＥタンパク質の少なくとも約アミノ酸－２０～－１のＣＴＤポリペプチドを含む（－２０は、Ｃ末端の完全反復単位Ｃ末端の半反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態では、ＣＴＤポリペプチドは、ラルストニアＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復のＣ末端の、少なくとも約２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸を含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、標的配列に結合するように操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、標的配列／部位に結合して切断するように再プログラム化されたホーミングエンドヌクレアーゼ、並びに任意選択で、本明細書において他の箇所で企図される１つ以上のリンカーポリペプチドと互いに結合されたＮＴＤ及び／又はＣＴＤポリペプチドを含む。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、並びに任意選択でＮＴＤ及び／又はＣＴＤポリペプチドを含む融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬが、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントに更に融合されるリンカーポリペプチドに融合され得ることが更に企図される。したがって、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントのＤＮＡ結合ドメインによって結合される標的配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチド離れたＤＮＡ標的配列に結合する。このように、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、ゲノム編集の特異性及び効率を増加させる。
一実施形態では、融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントと、再プログラム化されたホーミングエンドヌクレアーゼの結合／標的部位の上流約４、５、又は６ヌクレオチド、好ましくは、６ヌクレオチド以内のヌクレオチド／標的配列／部位に結合するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとを含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、１つ以上のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合反復単位、並びにＩ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、Ｉ－Ｖｄｉ１４１Ｉ、及びそれらのバリアント、又は好ましくは、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、及びそれらのバリアント、又は好ましくは、Ｉ－ＯｎｕＩ及びそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥから設計又は再プログラムされたＬＨＥバリアントを含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤ、１つ以上のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合反復単位、ＣＴＤ、並びにＩ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、Ｉ－Ｖｄｉ１４１Ｉ、及びそれらのバリアント、又は好ましくは、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、及びそれらのバリアント、又は好ましくは、Ｉ－ＯｎｕＩ及びそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥバリアントを含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤ、約９．５～約１５．５のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合反復単位、並びにＩ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、Ｉ－Ｖｄｉ１４１Ｉ、及びそれらのバリアント、又は好ましくは、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、及びそれらのバリアント、又は好ましくは、Ｉ－ＯｎｕＩ及びそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥバリアントを含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、約１２２個のアミノ酸～１３７個のアミノ酸、約９．５個、約１０．５個、約１１．５個、約１２．５個、約１３．５個、約１４．５個、又は約１５．５個の結合反復単位のＮＴＤ、約２０個のアミノ酸～約８５個のアミノ酸のＣＴＤ、及びＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントを含む。特定の実施形態では、ＮＴＤ、ＤＮＡ結合ドメイン、及びＣＴＤのうちのいずれか１つ、２つ、又は全ては、任意の好適な組み合わせで、同じ種又は異なる種から設計することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、約９．５、約１０．５、約１１．５、約１２．５、約１３．５、約１４．５、又は約１５．５の結合反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、本明細書の他の箇所で企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、及び本明細書の他の箇所で企図される末端プロセシングドメイン（例えば、エクソヌクレアーゼ）、又はその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、約９．５、約１０．５、約１１．５、約１２．５、約１３．５、約１４．５、又は約１５．５の結合反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、第１のリンカードメイン、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアント、第２のリンカードメイン、及び末端プロセシング酵素（例えば、３’から５’のエクソヌクレアーゼ）、又はその生物学的に活性な断片を含む。特定の実施形態では、ＴＡＬＥ結合反復のうちのいずれか１つ、２つ、又は全ては、任意の好適な組み合わせで、同じ種又は異なる種から設計することができる。好ましい実施形態では、エクソヌクレアーゼは、ＥｘｏＸエクソヌクレアーゼ、又はその生物学的に活性な断片である。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、配列番号７、１０、５８、６７、又は７６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、配列番号７、１０、５８、６７、又は７６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合タンパク質は、配列番号１３、６１、７０、又は７９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合タンパク質は、配列番号１３、６１、７０、又は７９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合タンパク質は、配列番号４６、６４、７３、又は８２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合タンパク質は、配列番号４６、６４、７３、又は８２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＩ融合タンパク質は、配列番号４３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＩ融合タンパク質は、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、配列番号６、９、５７、６６、又は７５のうちのいずれか１つに示されるｍＲＮＡ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するｍＲＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、配列番号６、９、５７、６６、又は７５のうちのいずれか１つに示されるｍＲＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２は、配列番号１２、６０、６９、又は７８のうちのいずれか１つに示されるｍＲＮＡ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するｍＲＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２は、配列番号１２、６０、６９、又は７８のうちのいずれか１つに示されるｍＲＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸは、配列番号４５、６３、７２、又は８１のうちのいずれか１つに示されるｍＲＮＡ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するｍＲＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸは、配列番号４５、６３、７２、又は８１のうちのいずれか１つに示されるｍＲＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＩは、配列番号４２に示されるｍＲＮＡ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するｍＲＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＩは、配列番号４２に示されるｍＲＮＡ配列によってコードされる。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、配列番号５、８、５６、６５、又は７４のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬは、配列番号５、８、５６、６５、又は７４のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２は、配列番号１１、５９、６８、又は７７のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２は、配列番号１１、５９、６８、又は７７のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸは、配列番号４４、６２、７１、又は８０のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸは、配列番号４４、６２、７１、又は８０のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＩは、配列番号４１に示されるＤＮＡ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド又はｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＩは、配列番号４１に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。
ある特定の実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、配列番号１～３のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に結合して切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントとを含む。
別の態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む。特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、本明細書の他の箇所で企図されるホーミングエンドヌクレアーゼドメイン、及び本明細書の他の箇所で企図される末端プロセシングドメイン（例えば、エクソヌクレアーゼ）を含む。
特定の実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、又は８個以上のジンクフィンガーモチーフを有する。典型的には、単一のジンクフィンガーモチーフは、約３０アミノ酸長である。ジンクフィンガーのモチーフは、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー、並びに例えば、Ｃ３Ｈジンクフィンガー及びＣ４ジンクフィンガーなどの非標準ジンクフィンガーの両方を含む。
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、任意のＤＮＡ配列を結合するように操作され得る。所与の３ｂｐのＤＮＡ標的配列に対する候補ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが特定されており、対応する複合ＤＮＡ標的配列を標的としたマルチフィンガーペプチドに複数のドメインを連結するためのモジュラーアセンブリ戦略が考案されている。当該技術分野で既知の他の好適な方法を使用して、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸を設計して構築することができ、例えば、ファージディスプレイ、ランダム変異導入、コンビナトリアルライブラリー、コンピュータ／合理的設計、親和性選択、ＰＣＲ、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーからのクローニング、合成構築などである。（例えば、米国特許第５，７８６，５３８号、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ９２：３４４－３４８（１９９５）、Ｊａｍｉｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：５６８９－５６９５（１９９４）、Ｒｅｂａｒ ＆ Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１－６７３（１９９４）、Ｃｈｏｏ ＆ Ｋｌｕｇ，ＰＮＡＳ ９１：１１１６３－１１１６７（１９９４）、Ｃｈｏｏ ＆ Ｋｌｕｇ，ＰＮＡＳ ９ １：１１１６８－１ １１７２（１９９４）、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９０：２２５６－２２６０（１９９３）、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ８９：７３４５－７３４９（１９９２）、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：９３－９６（１９９５）、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ９２：９７５２－９７５６（１９９５）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ９４：５５２５－５５３０（１９９７）、Ｇｒｉｅｓｍａｎ ＆ Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：６５７－６６１（１９９７）、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９１：１ １－９９－１ １１０３（１９９４）を参照されたい）。
個々のジンクフィンガーモチーフは、３つ又は４つのヌクレオチド配列に結合する。ジンクフィンガー結合ドメインが結合するように操作される配列（例えば、標的配列）の長さは、操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン中のジンクフィンガーモチーフの数を決定する。例えば、ジンクフィンガーモチーフが重複亜部位に結合しない場合、６ヌクレオチド標的配列は、２フィンガーＤＮＡ結合ドメインによって結合され、９ヌクレオチド標的配列は、３フィンガーＤＮＡ結合ドメインなどによって結合される。特定の実施形態では、標的部位中の個々のジンクフィンガーモチーフのＤＮＡ結合部位は、連続的である必要はないが、マルチフィンガー結合ドメイン中のジンクフィンガーモチーフ間のリンカー配列の長さ及び性質に応じて、１つ又はいくつかのヌクレオチドによって分離することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドは、１つ以上のジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、リンカー、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、リンカー、及び末端プロセシングドメイン（例えば、エクソヌクレアーゼ）を含む。特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＬＨＥバリアントを含み、ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、Ｉ－Ｖｄｉ１４１Ｉ、及びそれらのバリアント、又は好ましくは、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、及びそれらのバリアント、又は好ましくは、Ｉ－ＯｎｕＩ及びそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥから設計又は再プログラムされる。
ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、又は８個以上のジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、本明細書の別の箇所で企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、及び本明細書の別の箇所で企図される末端プロセシングドメイン（例えば、エクソヌクレアーゼ）、又はその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、約２、３、４、５、６、７、又は８個以上のジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、第１のリンカードメイン、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアント、第２のリンカードメイン、及び末端プロセシングドメイン（例えば、エクソヌクレアーゼ）、又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態では、ジンクフィンガーモチーフのうちのいずれか１つ、２つ、又は全ては、任意の好適な組み合わせで、同じ種又は異なる種から設計することができる。好ましい実施形態では、エクソヌクレアーゼは、ＥｘｏＸエクソヌクレアーゼ、又はその生物学的に活性な断片である。
３．末端プロセシング酵素
特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物（例えば、融合ポリペプチド）及び方法は、ＤＮＡ結合ドメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、及び末端プロセシング酵素を使用して細胞ゲノムを編集することを含む。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、及び１つ以上の末端プロセシング酵素（例えば、エクソヌクレアーゼ）をコードし、各々がリンカードメイン（例えば、ペプチドリンカー）によって分離される。
用語「末端プロセシング酵素」は、ポリヌクレオチド鎖の露出した末端を修飾する酵素を指す。ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖ハイブリッド、及び合成ＤＮＡ（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ以外の塩基を含む）であってもよい。末端プロセシング酵素は、１つ以上のヌクレオチドを付加すること、１つ以上のヌクレオチドを除去すること、リン酸基を除去若しくは修飾すること、及び／又はヒドロキシル基を除去若しくは修飾することによって、露出したポリヌクレオチド鎖末端を修飾し得る。末端プロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位で、又はせん断によって（例えば、微細ゲージ針を通すこと、加熱すること、超音波処理すること、ミニビーズタンブリングすること、及び噴霧によって）、電離放射線、紫外線放射、酸素ラジカル、化学加水分解及び化学療法剤などの他の化学的又は機械的手段によって生成される端部で、端部を修飾し得る。
特定の実施形態では、特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物及び方法は、ＤＮＡ結合ドメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、及びＤＮＡ末端プロセシング酵素を含む融合ポリペプチドを使用して細胞ゲノムを編集することを含む。
用語「ＤＮＡ末端プロセシング酵素」は、ＤＮＡの露出した末端を修飾する酵素を指す。ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、平滑末端又はねじれ型末端（５’又は３’オーバーハングを有する末端）を修飾し得る。ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを修飾し得る。ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位で、又はせん断によって（例えば、微細ゲージ針を通過させること、加熱すること、超音波処理すること、ミニビーズタンブリングすること、及び噴霧することによって）、電離放射線、紫外線放射、酸素ラジカル、化学加水分解、及び化学療法剤などの他の化学的又は機械的手段によって生成される末端で、末端を修飾し得る。ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、１つ以上のヌクレオチドを付加すること、１つ以上のヌクレオチドを除去すること、リン酸基を除去若しくは修飾すること、及び／又はヒドロキシル基を除去若しくは修飾することによって、露出したＤＮＡ末端を修飾し得る。
本明細書で企図される特定の実施形態での使用に好適なＤＮＡ末端プロセシング酵素の例示的な例には、５’～３’のエクソヌクレアーゼ、５’～３’のアルカリ性エクソヌクレアーゼ、３’～５’のエクソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、加水分解酵素及び鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において企図される特定の実施形態での使用に適したＤＮＡ末端プロセシング酵素の追加の実例には、Ｔｒｅｘ２、Ｔｒｅｘ１、膜貫通型ドメインを含まないＴｒｅｘ１、Ａｐｏｌｌｏ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ２、ＥｘｏＩ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＩＩＩ、ＥｘｏＸ、Ｆｅｎ１、Ｆａｎ１、ＭｒｅＩＩ、Ｒａｄ２、Ｒａｄ９、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ＰＮＫＰ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ、ラムダエクソヌクレアーゼ、Ｓｏｘ、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼ、エクソヌクレアーゼＩ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、エクソヌクレアーゼＶＩＩ、ＮＤＫ１、ＮＤＫ５、ＮＤＫ７、ＮＤＫ８、ＷＲＮ、Ｔ７－エクソヌクレアーゼ遺伝子６、トリ骨髄芽球症ウイルス組み込みタンパク質（ＩＮ）、Ｂｌｏｏｍ、南極ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＡｐｅＩ、緑豆ヌクレアーゼ、Ｈｅｘ１、ＴＴＲＡＰ（ＴＤＰ２）、Ｓｇｓ１、Ｓａｅ２、ＣＵＰ、Ｐｏｌミュー、Ｐｏｌラムダ、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＥＭＥ２、ＳＬＸ１、ＳＬＸ４、及びＵＬ－１２が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本明細書で企図される細胞ゲノムを編集するためのゲノム編集組成物及び方法は、ＤＮＡ結合ドメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、及びエクソヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドを含む。用語「エクソヌクレアーゼ」は、３’末端又は５’末端のいずれかでホスホジエステル結合を切断する加水分解反応を介してポリヌクレオチド鎖の末端でホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。特定の実施形態では、エクソヌクレアーゼは、３’～５’エクソヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、エクソヌクレアーゼは、ＥｘｏＸエクソヌクレアーゼ、又はその生物学的に活性な断片である。いくつかの実施形態では、エクソヌクレアーゼは、ＥｘｏＩエクソヌクレアーゼ、又はその生物学的に活性な断片である。いくつかの実施形態では、エクソヌクレアーゼは、Ｔｒｅｘ２エクソヌクレアーゼ、又はその生物学的に活性な断片である。
ＥｘｏＸは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の３’～５’の分配型エクソヌクレアーゼであり、ＤｎａＱスーパーファミリーのメンバーである。ＥｘｏＸはまた、エクソデオキシリボヌクレアーゼ１０、エクソデオキシリボヌクレアーゼＸ、エクソヌクレアーゼＸ、及びエクソＸとも称される。特定の実施形態で使用される例示的なＥｘｏＸ参照配列番号には、ＮＰ＿４１６３５８．１、ＮＣ＿０００９１３．３、ＷＰ＿０００９４４２５６．１、ＮＺ＿ＳＴＥＢ０１０００００９．１ＡＡＣ７４９１４が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で企図される好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、及びＥｘｏＸエクソヌクレアーゼ、又はその生物学的に活性な断片を含む。様々な実施形態では、融合ポリペプチドは、ＥｘｏＸエクソヌクレアーゼにリンカードメイン（例えば、ポリペプチドリンカー）によって連結された、ＤＮＡ結合ドメイン及びホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、又はその生物学的に活性な断片を含む。
様々な実施形態では、ＥｘｏＸは、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＸは、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＸは、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＸは、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＸは、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＸは、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＸは、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＸは、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、ＥｘｏＸ又はその生物学的に活性な断片は、配列番号１０９に示されるアミノ酸アミノ酸配列を含む。
ＥｘｏＩは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の３’～５’の前進型エクソヌクレアーゼであり、ＤｎａＱスーパーファミリーのメンバーである。ＥｘｏＩはまた、エクソデオキシリボヌクレアーゼＩ、エクソヌクレアーゼＩ、ＤＮＡデオキシリボホスホジエステラーゼ、及びｄＲＰａｓｅとも称される。特定の実施形態で使用される例示的なＥｘｏＩ参照配列番号には、ＮＰ＿４１６５１５．１、ＮＣ＿０００９１３．３、ＷＰ＿０００９８０５８９．１、ＮＺ＿ＬＮ８３２４０４．１が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で企図される好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、及びＥｘｏＩエクソヌクレアーゼ、又はその生物学的に活性な断片を含む。様々な実施形態では、融合ポリペプチドは、ＥｘｏＩエクソヌクレアーゼにリンカードメイン（例えば、ポリペプチドリンカー）によって連結された、ＤＮＡ結合ドメイン及びホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、又はその生物学的に活性な断片を含む。
様々な実施形態では、ＥｘｏＩは、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＩは、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＩは、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＩは、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＩは、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＩは、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＩは、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｘｏＩは、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、ＥｘｏＩ又はその生物学的に活性な断片は、配列番号１１２に示されるアミノ酸アミノ酸配列を含む。
Ｄ．標的部位
特定の実施形態で企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、任意の好適な標的配列（例えば、ヒトゲノム内の配列）に結合するように設計され得、天然発生型ヌクレアーゼと比較して、新規の結合特異性を有し得る。特定の実施形態では、標的部位は、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーエレメントなどを含むがこれに限定されない、遺伝子の調節領域である。特定の実施形態では、標的部位は、遺伝子又はスプライス部位のコード領域である。特定の実施形態では、ヌクレアーゼバリアント及びドナー修復鋳型は、治療用ポリヌクレオチドを挿入するように設計され得る。特定の実施形態では、ヌクレアーゼバリアント及びドナー修復鋳型は、内因性遺伝子調節エレメント又は発現制御配列の制御下で治療用ポリヌクレオチドを挿入するように設計され得る。様々な実施形態では、ヌクレアーゼバリアントは、免疫系チェックポイント遺伝子、グロビン遺伝子、γ－グロビン遺伝子発現及び／若しくはＨｂＦの抑制に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子、又は免疫抑制シグナル伝達遺伝子における標的配列に結合して切断する。
免疫系チェックポイント遺伝子の例示的な例には、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、及びＫＩＲが挙げられるが、これらに限定されない。
免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子の例示的な例には、ＩＬ－１０Ｒα、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＡＨＲ、ＳＧＫ１、ＴＳＣ２、ＶＨＬ、Ａ２ＡＲ、及びＣＢＬ－Ｂが挙げられるが、これらに限定されない。
γ－グロビン遺伝子発現及びＨｂＦを抑制するポリペプチドの例示的な例には、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＳＯＸ６、ＧＡＴＡ１、及びＬＳＤ１が挙げられるが、これらに限定されない。
様々な実施形態では、ヌクレアーゼバリアントは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＣＲ５、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＴＣＲβ、ＩＬ１０Ｒα、ＩＬ１０Ｒβ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＣＳＫ９、ＡＨＲ、ＢＴＫ、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＳＯＸ６、ＧＡＴＡ１、ＬＳＤ、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレイクポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、ＴＥＭ５、ＴＥＭ８、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、並びにウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）遺伝子からなる群から選択される遺伝子における標的配列に結合して切断する。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＣＲ５、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＩＬ１０Ｒα、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＣＳＫ９、ＡＨＲ、ＢＴＫ、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、及びＢＣＬ１１Ａ遺伝子からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＣＢＬ－Ｂ、又はＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）遺伝子である。
様々な実施形態では、ヌクレアーゼバリアントは、ＴＲＡＣ遺伝子における標的配列に結合して切断する。Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子座は、ヒトにおいてＴＲＡ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＴＲＡＣはまた、ＴＲＡ、ＩＭＤ７、ＴＣＲＡ、ＴＲＡ＠、ＴＲＡＣ、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子座、ＴＣＲＤ、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子座、ＴＣＲαとも称される。それは、より大きなＴＣＲタンパク質（Ｔ細胞受容体）にアルファ鎖を寄与する。アルファ－ベータＴ細胞受容体は、免疫応答に必須であり、かつＴリンパ球の細胞表面に存在する抗原特異的受容体である。これらは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示されるペプチド主要組織適合（ＭＨ）（ｐＭＨ）複合体を認識し、病原体に対する効率的なＴ細胞適応免疫の必要条件である。
特定の実施形態では、ヌクレアーゼバリアントは、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１に、好ましくはヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１における配列番号１で、及びより好ましくはヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１における配列番号１における配列「ＡＴＴＣ」に、ＤＳＢを導入する。好ましい実施形態では、ＴＣＲα遺伝子は、ヒトＴＣＲα遺伝子である。
様々な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、プログラム死受容体１（ＰＤ－１）遺伝子における標的配列に結合して切断する。ＰＤ－１はまた、プログラム細胞死１（ＰＤＣＤ１）、全身性エリテマトーデス感受性２（ＳＬＥＢ２）、ＣＤ２７９、ＨＰＤ１、ＰＤ１、ＨＰＤ－Ｌ、及びＨＳＬＥ１とも称される。ＰＤ－１は、共刺激受容体のＢ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバーである。ＰＤ－１分子は、細胞外リガンド結合ＩｇＶドメイン、膜貫通ドメイン、並びに免疫チロシンベース阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体阻害性チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）と位置する潜在的なリン酸化部位を有する細胞内ドメインからなる。ＰＤ－１は、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、疲弊Ｔ細胞、Ｂ細胞、活性化単球、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞に発現される阻害性共受容体である。ＰＤ－１は、そのリガンド、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、及びプログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）への結合により、Ｔ細胞活性化を負に調節する。ＰＤ－１結合は、Ｔ細胞の増殖、及びインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α、及びＩＬ－２産生を阻害し、Ｔ細胞生存を低減する。ＰＤ－１発現は、高レベルの刺激を経験した「疲弊」Ｔ細胞の特徴である。慢性感染及びがんの間に起こるこの疲弊状態は、Ｔ細胞機能不全によって特徴付けられ、結果として感染及び腫瘍の準最適な制御をもたらす。
特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、ＰＤ－１遺伝子のエクソン１、好ましくは、ＰＤ－１遺伝子のエクソン１における配列番号２で、及びより好ましくは、ＰＤ－１遺伝子のエクソン１における配列番号２における配列「ＡＴＣＣ」で二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。好ましい実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント又はｍｅｇａＴＡＬは、二本鎖ＤＮＡを切断し、配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列にＤＳＢを導入する。好ましい実施形態では、ＰＤ－１遺伝子は、ヒトＰＤ－１遺伝子である。
様々な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、ヒトカシタスＢ系統（Ｃｂｌ）リンパ腫がん原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）遺伝子における標的配列に結合して切断する。ＣＢＬは、ＣＢＬ２；若年性骨髄単球性白血病（ＮＳＬＬ）を伴う、又は伴わない、ヌーナン症候群様障害；Ｃ－ＣＢＬ；ＲＩＮＧフィンガータンパク質５５（ＲＮＦ５５）；脆弱部位、葉酸型、希少、ｆｒａ（１１）（ｑ２３．３）（ＦＲＡ１１Ｂ）；Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＣＢＬ；Ｃａｓ－Ｂｒ－Ｍ（マウス）エコトロピックレトロウイルス形質転換配列；Ｃｂｌがん原遺伝子、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ；ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチントランスフェラーゼＣＢＬ；カシタスＢ系統リンパ腫がん原遺伝子；がん遺伝子ＣＢＬ２；がん原遺伝子ｃ－Ｃｂｌ；及びシグナル伝達タンパク質ＣＢＬとも称される。
この遺伝子は、ＲＩＮＧフィンガーＥ３ユビキチンリガーゼをコードするがん原遺伝子である。コードされたタンパク質は、プロテアソームによる分解のために基質を標的化するために必要な酵素のうちの１つである。このタンパク質は、ユビキチンコンジュゲート化酵素（Ｅ２）から特定の基質へのユビキチンの伝達を媒介する。このタンパク質はまた、Ｎ末端ホスホチロシン結合ドメインを含み、これは、多数のチロシン－リン酸化基質と相互作用し、かつプロテアソーム分解のためにそれらを標的とすることを可能にする。ＣＢＬＢは、Ｔ細胞の活性化及び持続性を含む、多くのシグナル伝達経路の負の調節因子として機能する。
特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント又はｍｅｇａＴＡＬは、ＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６、好ましくは、ＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６における配列番号３で、及びより好ましくは、ＣＢＬＢ遺伝子のエクソン６における配列番号３における配列「ＡＴＣＣ」でＤＳＢを導入する。好ましい実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、二本鎖ＤＮＡを切断し、配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列にＤＳＢを導入する。好ましい実施形態では、ＣＢＬＢ遺伝子は、ヒトＣＢＬＢ遺伝子である。
Ｅ．ドナー修復鋳型
ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含む融合ポリペプチドを使用して、標的配列にＤＳＢを導入してもよく、ＤＳＢは、１つ以上のドナー修復鋳型の存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を介して修復されてもよい。特定の実施形態では、ドナー修復鋳型を使用して、配列をゲノムに挿入される。特に好ましい実施形態では、ドナー修復鋳型を使用して、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を挿入する。特に好ましい実施形態では、ドナー修復鋳型を使用して、ポリペプチドの発現が内因性プロモーター及び／又はエンハンサーの制御下にあるように、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を挿入する。
様々な実施形態では、ドナー修復鋳型は、ドナー修復鋳型を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、ＩＤＬＶなど、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、又はワクシニアウイルスベクターを用いて細胞を形質導入することによって、造血細胞、例えば、造血幹細胞若しくは前駆細胞、又はＣＤ３４＋細胞に導入される。
特定の実施形態では、ドナー修復鋳型は、ＤＳＢ部位に隣接する１つ以上の相同アームを含む。
本明細書で使用される場合、用語「相同アーム」は、標的部位においてヌクレアーゼによって導入されるＤＮＡ切断に隣接するＤＮＡ配列と同一、又はほぼ同一である、ドナー修復鋳型中の核酸配列を指す。一実施形態では、ドナー修復鋳型は、ＤＮＡ切断部位の５’のＤＮＡ配列と同一又はほぼ同一である核酸配列を含む５’相同アームを含む。一実施形態では、ドナー修復鋳型は、ＤＮＡ切断部位の３’のＤＮＡ配列と同一又はほぼ同一である核酸配列を含む３’相同アームを含む。好ましい実施形態では、ドナー修復鋳型は、５’相同アーム及び３’相同アームを含む。ドナー修復鋳型は、ＤＳＢ部位にすぐ隣接するゲノム配列に対する相同性、又はＤＳＢ部位からの任意の数の塩基対内のゲノム配列に対する相同性を含み得る。一実施形態では、ドナー修復鋳型は、相同配列の任意の介在する長さを含む、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２５ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約５０００ｂｐ、約１００００ｂｐ又はそれ以上のゲノム配列に対して相同である核酸配列を含む。
特定の実施形態で企図される相同アームの好適な長さの例示的な例は、独立して選択されてもよく、相同アームの全ての介在する長さを含む、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約２６００ｂｐ、約２７００ｂｐ、約２８００ｂｐ、約２９００ｂｐ、若しくは約３０００ｂｐ、又はそれ以上の相同アームを含むが、これらに限定されない。
好適な相同アーム長の追加の例示的な例は、相同アームの全ての介在する長さを含む、約１００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約２００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約３００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約４００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ～約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ～約１５００ｂｐ、又は約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐを含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、５’及び３’相同アームの長さは、独立して、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐから選択される。一実施形態では、５’相同アームは、約１５００ｂｐであり、３’相同アームは、約１０００ｂｐである。一実施形態では、５’相同アームは、約２００ｂｐ～約６００ｂｐであり、３’相同アームは、約２００ｂｐ～約６００ｂｐである。一実施形態では、５’相同アームは、約２００ｂｐであり、３’相同アームは、約２００ｂｐである。一実施形態では、５’相同アームは、約３００ｂｐであり、３’相同アームは、約３００ｂｐである。一実施形態では、５’相同アームは、約４００ｂｐであり、３’相同アームは、約４００ｂｐである。一実施形態では、５’相同アームは、約５００ｂｐであり、３’相同アームは、約５００ｂｐである。一実施形態では、５’相同アームは、約６００ｂｐであり、３’相同アームは、約６００ｂｐである。
Ｆ．ポリペプチド
ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント及び／又はｍｅｇａＴＡＬを含む融合ポリペプチドを含むがこれに限定されない、様々なポリペプチドが本明細書で企図される。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７、１０、１３、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８９、９２、９５、９８、及び１０１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」「ポリペプチド断片」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、反対であることが明記されない限り、従来的な意味、すなわち、アミノ酸配列として相互交換可能に使用される。一実施形態では、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチド及び他のバリアントを含む。ポリペプチドは、様々な周知の組換え技術及び／又は合成技術のいずれかを使用して調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、又は融合タンパク質を含み得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、並びに天然発生型及び非天然発生型の両方の、当該技術分野において既知の他の修飾を含み得る。
本明細書で使用される場合、「単離されたタンパク質」、「単離されたペプチド」、又は「単離されたポリペプチド」などは、細胞環境からの、及び細胞の他の成分との関連からの、すなわち、インビボで物質と有意に関連していない、ペプチド又はポリペプチド分子のインビトロ合成、単離、及び／又は精製を指す。
特定の実施形態で企図されるポリペプチドの例示的な例には、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、末端プロセシングヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、融合ポリペプチド、及びそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加及び／又は挿入において天然発生型ポリペプチドとは異なってもよい。かかるバリアントは、天然発生型であってもよく、又は合成的に生成されてもよく、例えば、上記ポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって生成されてもよい。例えば、特定の実施形態では、１つ以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入をポリペプチドに導入することによって、標的部位に結合して切断する融合ポリペプチド、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬなどの生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で企図される参照配列のうちのいずれかと少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、バリアントは、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。生物学的に活性なポリペプチド断片の例示的な例には、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、エンドプロセシングドメイン（例えば、エクソヌクレアーゼ）などが含まれる。本明細書で使用される場合、用語「生物学的に活性な断片」又は「最小限の生物学的に活性な断片」は、天然発生型ポリペプチド活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％を保持するポリペプチド断片を指す。好ましい実施形態では、生物学的活性は、標的配列に対する結合親和性及び／又は切断活性である。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５～約１７００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００又はそれ以上のアミノ酸長であると考えられる。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、「Ｘ」として示される１つ以上のアミノ酸を含み得る。「Ｘ」は、アミノ酸配列番号中に存在する場合、任意のアミノ酸を指す。１つ以上の「Ｘ」残基は、本明細書で企図される特定の配列番号に記載されるアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端に存在してもよい。「Ｘ」アミノ酸が存在しない場合、配列番号に記載される残りのアミノ酸配列は、生物学的に活性な断片とみなされてもよい。
特定の実施形態では、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、例えば、配列番号８９、９２、９５、９８、若しくは１０１、又はｍｅｇａＴＡＬ（例えば、配列番号７、１０、５８、６７、及び７６）の生物学的に活性な断片を含む。生物学的に活性な断片は、Ｎ末端切断及び／又はＣ末端切断を含んでもよい。特定の実施形態では、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、５、６、７、又は８個のＮ末端アミノ酸を欠くか、又はその欠失を含み、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む。特定の実施形態では、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、又は５個のＣ末端アミノ酸を欠くか、又はその欠失を含み、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの２個のＣ末端アミノ酸の欠失を含む。特定の好ましい実施形態では、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４個のＮ末端アミノ酸及び２個のＣ末端アミノ酸を欠くか、又はその欠失を含む。
特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８個の以下のＮ末端アミノ酸の欠失：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅ、及び／又は以下の１、２、３、４、若しくは５個のＣ末端アミノ酸の欠失：Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖを含む。
特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８個の以下のＮ末端アミノ酸の欠失若しくは置換：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅ、及び／又は以下の１、２、３、４、若しくは５個のＣ末端アミノ酸の欠失若しくは置換：Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖを含む。
特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８個の以下のＮ末端アミノ酸の欠失：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅ、及び／又は以下の１若しくは２個のＣ末端アミノ酸の欠失：Ｆ、Ｖを含む。
特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８個の以下のＮ末端アミノ酸の欠失若しくは置換：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅ、及び／又は以下の１若しくは２個のＣ末端アミノ酸の欠失若しくは置換：Ｆ、Ｖを含む。
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含む、様々な方法で改変されてもよい。そうした操作のための方法は、当該技術分野において一般的に既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の変異により作製され得る。変異導入及びヌクレオチド配列改変のための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８－４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７－３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、及びその中で引用されている参考文献を参照されたい。対象のタンパク質の生物学的活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出され得る。
ある特定の実施形態では、バリアントは、１つ以上の保存的置換を含む。「保存的置換」は、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸に置換されるものであり、そのため、ペプチド化学分野の当業者は、ポリペプチドの二次構造及び水治療の性質が実質的に変化しないと予想する。修飾は、特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造において行われてもよく、ポリペプチドは、所望の特徴を有するバリアント又は誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を少なくともほぼ有し、なおも取得するポリペプチドを含む。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更し、同等な、又は改善されたバリアントポリペプチドを生成することが望ましい場合、当業者は、例えば、表１に従って、コードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変えることができる。
どのアミノ酸残基が、生物学的活性を無効化することなく置換、挿入又は欠失され得るかを決定するガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒ、又はＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアなどの当該技術分野で周知のコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。本明細書に開示されるタンパク質バリアント中のアミノ酸の変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、類似した荷電アミノ酸、又は非荷電アミノ酸の置換であることが好ましい。保存的アミノ酸変化には、その側鎖で関連付けられているアミノ酸ファミリーの１つの置換を含む。天然発生型アミノ酸は一般的に以下の４つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、合わせて芳香族アミノ酸として分類される場合もある。ペプチド又はタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は当業者に既知であり、一般的に得られる分子の生物学的活性を変化させることなく行うことができる。当業者であれば、ポリペプチドの非必須領域中の単一アミノ酸置換は概して、生物学的活性を大きくは変化させないと認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。
２つ以上のポリペプチドの発現が望ましい一実施形態では、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の他の場所で開示されるように、ＩＲＥＳ配列によって分けることができる。
特定の実施形態において企図されるポリペプチドは、融合ポリペプチド、例えば、配列番号７、１０、１３、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、及び８２を含む。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号４６、６４、７３、及び８２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、融合ポリペプチド、及び融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチド及び融合タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。
別の実施形態では、２つ以上のポリペプチドは、本明細書の他の箇所に開示されるように、１つ以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
一実施形態では、本明細書で企図される融合タンパク質は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン及び１つ以上のヌクレアーゼ、並びに１つ以上のリンカー及び／又は自己切断ポリペプチドを含む。
一実施形態では、本明細書で企図される融合タンパク質は、ヌクレアーゼバリアントと、リンカー又は自己切断ペプチドと、５’～３’のエクソヌクレアーゼ、５’～３’のアルカリ性エクソヌクレアーゼ、及び３’～５’のエクソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２、ＥｘｏＩ、又はＥｘｏＸ）を含むが、これらに限定されない、末端プロセシング酵素と、を含む。
融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、細胞透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなど、エピトープタグ（例えば、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＩＳ６、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、及びＨＡ）、ポリペプチドリンカー、並びにポリペプチド切断シグナルを含むが、これらに限定されない、１つ以上のポリペプチドドメイン又はセグメントを含み得る。融合ポリペプチドは、典型的には、Ｃ末端からＮ末端に結合されているが、それらは、Ｃ末端からＣ末端に、Ｎ末端からＮ末端に、又はＮ末端からＣ末端に結合されてもよい。特定の実施形態では、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であってもよい。融合ポリペプチド又は融合タンパク質は、保存的に修飾されたバリアント、多型バリアント、アレル、変異体、下位配列、及び種間ホモログを含み得るが、但し、融合ポリペプチドの所望の活性は保存されるものとする。融合ポリペプチドは、化学合成法により、又は２つの部分の間の化学的結合により作製されてもよく、又は他の標準的な方法を使用して一般的に調製されてもよい。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書の別の箇所に開示されるように好適な転写制御因子又は翻訳制御因子に作動可能に連結される。
融合ポリペプチドは、任意選択で、ポリペプチド内の１つ以上のポリペプチド又はドメインを結合するために使用することができるリンカーを含み得る。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮できるように、各ポリペプチドが、その適切な二次構造及び三次構造に折り畳まれるのを確実とするのに十分な距離で、任意の２つ以上のポリペプチド成分を分けるように利用され得る。かかるペプチドリンカー配列は、当該技術分野の標準的な技術を使用して融合ポリペプチドへと組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、以下の要因に基づいて選択され得る：（１）可撓性の伸長された立体配座を採用するそれらの能力、（２）第１及び第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を採用できないこと、並びに（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性又は荷電残基の欠如。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基、及びＳｅｒ残基を含む。Ｔｈｒ及びＡｌａなどの他の中性に近いアミノ酸も、リンカー配列に使用され得る。リンカーとして有用に採用され得るアミノ酸配列には、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４０：３９－４６，１９８５、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８－８２６２，１９８６、米国特許第４，９３５，２３３号、及び米国特許第４，７５１，１８０号に記載されるものが挙げられる。リンカー配列は、特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能性ドメインを分離し、立体的な干渉を防止するために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を含有する場合、必要とされない。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性のアミノ酸部分配列である。リンカーポリペプチドは、１～２００アミノ酸長、１～１００アミノ酸長、又は１～５０アミノ酸長であってもよく、当該数値の間の全ての整数値が含まれる。
例示的なリンカーには、以下のアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない：グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（Ｇ１－５Ｓ１－５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、又は５の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、ＧＧＧ（配列番号１１３）、ＤＧＧＧＳ（配列番号１１４）、ＴＧＥＫＰ（配列番号１１５）（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ５５２５－５５３０（１９９７）を参照されたい）、ＧＧＲＲ（配列番号１１６）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９５、上記）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４、又は５（配列番号１１７及び１５０～１５３））（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９３，１１５６－１１６０（１９９６．））、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号１１８）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６－１０７０）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号１１９）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号１２０）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号１２１）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号１２２）、ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号１２３）。あるいは、可塑性リンカーを、ＤＮＡ結合部位とペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９０：２２５６－２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ ９１：１１０９９－１１１０３（１９９４））を使用して、又はファージディスプレイ法により合理的に設計することができる。
融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドドメインの各々の間、又は内在性オープンリーディングフレームとドナー修復鋳型によってコードされるポリペプチドの間にポリペプチド切断シグナルを更に含み得る。更に、ポリペプチド切断部位を、任意のリンカーペプチド配列に挿入することができる。例示的なポリペプチド切断シグナルとしては、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位）、及び自己切断ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が挙げられる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ ａｎｄ Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６－２６を参照されたい）。
好適なプロテアーゼ切断部位及び自己切断ペプチドは、当業者に既知である（例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９－７２２、Ｓｃｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９－５９４を参照されたい）。プロテアーゼ切断部位の例としては、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えばタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ－２－コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（ワイカウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、及びエンテロキナーゼの切断部位が挙げられるが、これらに限定されない。その高い切断ストリンジェンシーにより、ＴＥＶ（タバコエッチングウイルス）プロテアーゼ切断部位は、一実施形態では、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号１２１）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１２２）及びＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号１２３）（Ｘは、任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧ又はＱとＳの間で生じる）が好ましい。
ある特定の実施形態では、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａ又は２Ａ様部位、配列又はドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。特定の実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、又はカルジオウイルス２Ａペプチドである。
一実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、***ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾセアアシグナウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテスコウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、及び脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。
２Ａ部位の例示的な例を表２に提供する。
Figure 2024503249000003
Ｇ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態では、本明細書で企図される１つ以上の融合ポリペプチド、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、末端プロセシング酵素、及びエクソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。
様々な実施形態では、１つ以上の融合ポリペプチド、例えば、配列番号５、８、１１、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、及び８０をコードするポリヌクレオチド。いくつかの実施形態では、１つ以上の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、１つ以上の融合ポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６、９、１２、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、及び８１のうちのいずれか１つに示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７、１０、１３、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、及び８２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする。
ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよく、かつ組換え、合成、又は単離のいずれかであってもよい。ポリヌクレオチドには、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、合成ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、及び組換えＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、又は少なくとも１５０００以上のヌクレオチド長のヌクレオチドの多量体型を指し、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかタイプのヌクレオチドの修飾型、並びに全ての中間の長さのものを指す。本文脈において、「中間の長さ」とは、例えば、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などの引用されている値の間の任意の長さを意味すると、容易に理解されるであろう。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又はバリアントは、参照配列に対して、少なくとも若しくは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化」は、ポリペプチドの発現、安定性、及び／又は活性を増加させるためにポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中のコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響を及ぼす因子には、以下のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）２つ以上の生物体又は遺伝子又は合成構築されたバイアステーブルの間のコドンバイアスの変動、（ｉｉ）生物体、遺伝子又は遺伝子セット内のコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）コンテキストを含むコドンの体系的変動、（ｉｖ）その解読ｔＲＮＡに伴うコドンの変動、（ｖ）３つ組全体又は３つ組の１つの位置のいずれかのＧＣ％に伴うコドンの変動、（ｖｉ）例えば、天然配列などの参照配列に対する類似性における変動、（ｖｉｉ）コドン頻度のカットオフにおける変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造的性質、（ｉｘ）コドン置換セットの設計の基礎となるＤＮＡ配列の機能に関する予備知識、及び／又は（ｘ）各アミノ酸に対するコドンセットの合成的変動、及び／又は（ｘｉ）誤った翻訳開始位置の単離された除去。
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、リン酸化糖とＮ－グリコシド結合した複素環式窒素塩基を指す。ヌクレオチドは、天然塩基、及び当該技術分野で認識される広範な修飾塩基を含むと理解される。かかる塩基は一般的に、ヌクレオチド糖部分の１’位に配置される。ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖及びリン酸基を含む。リボ核酸（ＲＮＡ）では、糖はリボースであり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）では、糖はデオキシリボースであり、すなわち、デオキシリボースは、リボース中に存在するヒドロキシル基を欠いた糖である。天然の窒素含有塩基の例としては、プリン類のアデノシン（Ａ）及びグアニジン（Ｇ）、そしてピリミジン類のシチジン（Ｃ）とチミジン（Ｔ）（又はＲＮＡの場合には、ウラシル（Ｕ））が挙げられる。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１、又はプリンのＮ－９に結合される。ヌクオチドは通常、一、二又は三リン酸塩である。ヌクレオチドは、非修飾であっても、又は糖部分、リン酸部分、及び／若しくは塩基部分で修飾されてもよい（ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド誘導体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、及び非標準ヌクレオチドと相互交換可能に言及される。例えば、ＷＯ９２／０７０６５及びＷＯ９３／１５１８７を参照されたい）。修飾核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３－２１９６）によって要約されている。
ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルとみなすこともでき、エステル化は、糖のＣ－５に結合したヒドロキシル基上で発生する。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」は、糖とＮ－グリコシド結合した複素環の窒素含有塩基を指す。ヌクレオシドは当該技術分野において、天然塩基を含むと認識されており、また周知の修飾塩基も含むと認識されている。かかる塩基は一般的に、ヌクレオシド糖部分の１’位に配置される。ヌクレオシドは一般的に塩基と糖類を含む。ヌクレオシドは、非修飾であっても、又は糖部分及び／若しくは塩基部分で修飾されてもよい（ヌクレオシドアナログ、ヌクレオシド誘導体、修飾ヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、又は非標準ヌクレオシドと相互交換可能に言及される）。上述のように、修飾核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３－２１９６）によって要約されている。
ポリヌクレオチドの例示的な例には、配列番号７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８９、９２、９５、９８、及び１０１、並びに配列番号５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５３、５４、５６、５７、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、７２、７４、７５、７７、７８、８０、８１、８７、８８、９０、９１、９３、９４、９６、９７、９９、及び１００に示されるポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
様々な例示的な実施形態では、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、本明細書で企図されるポリヌクレオチドを含む、融合ポリペプチド、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、末端プロセシング酵素、エクソヌクレアーゼ、及び発現ベクター、ウイルスベクター、及び導入プラスミドをコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」などは、参照ポリヌクレオチド配列と相当の配列同一性を呈するポリヌクレオチド、又は本明細書において規定されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語には、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、又は修飾によって参照ポリヌクレオチドと識別されるポリヌクレオチドも包含される。したがって、用語「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」には、１つ以上のヌクレオチドが付加若しくは欠失、又は修飾され、又は別のヌクレオチドと置換されたポリヌクレオチドが含まれる。この点に関して、当該技術分野において、参照ポリヌクレオチドに対し、変異、付加、欠失、及び置換を含むある特定の改変がなされ、改変されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能又は生物学的活性を保持し得ると十分に理解されている。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズするために、互いに少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列がハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションプロトコルを記載する。一般的に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下）である。標的配列は、一般的に、過剰に存在するため、Ｔｍで、プローブの５０％が平衡で占有される。
「配列同一性」、又は例えば「～に対して５０％同一の配列」を含む、という文章は、本明細書において使用される場合、比較ウィンドウ上で配列が、ヌクレオチドごとで同一である、又はアミノ酸ごとで同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）又は同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔ）が、両方の配列で生じ、一致した位置の数を得る位置の数を決定すること、一致した位置の数を、比較ウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割ること、及び結果に１００をかけて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算されてもよい。本明細書に記載される参照配列のいずれかと少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド及びポリペプチドが含まれ、典型的には、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列関係を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、及び「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、長さが、少なくとも１２個の単量体単位であり、多くの場合、１５～１８個の単量体単位であり、多くの場合、少なくとも２５個の単量体単位である、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含む。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、及び（２）２つのポリヌクレオチド間で発散する配列を含んでもよく、２つの（又はそれ以上の）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」で比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、少なくとも６個の連続する位置、通常は、約５０～約１００、より一般的には約１００～約１５０の概念セグメントを指し、配列は、２つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較される。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアライメントのため、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して約２０％以下の付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを整列するための配列の最適なアライメントは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡにおけるアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化実行によって、又は選択された様々な方法のいずれかによって生成される検査及び最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたり最も高い相同性をもたらす）によって行われ得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９により開示されるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーへの参照もなされ得る。配列解析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，１９９４－１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ１５のＵｎｉｔ １９．３に見出され得る。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然発生の状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常、断片に隣接する配列から除去されたＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態では、「単離ポリヌクレオチド」は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、又は自然には存在せず、人の手により作製された他のポリヌクレオチドを指す。
様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、融合ポリペプチド、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、末端プロセシング酵素、及びエクソヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ、１つ以上のヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチド、並びにポリ（Ａ）テールを含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるｍＲＮＡは、エクソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護し、ｍＲＮＡを安定化し、翻訳を促進するのを助けるためのポリ（Ａ）テールを含む。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。
特定の実施形態では、ポリ（Ａ）テールの長さは、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは少なくとも約５００個以上のアデニンヌクレオチド、又は任意の介在する数のアデニンヌクレオチドである。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）テールの長さは、少なくとも約１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、若しくは２７５個以上のアデニンヌクレオチドである。
特定の実施形態では、ポリ（Ａ）テールの長さは、約１０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約１００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約２００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約３００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約５０～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約５０～約４００個のアデニンヌクレオチド、約５０～約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約１００～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約１００～約４００個のアデニンヌクレオチド、約１００～約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１００～約３００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約４００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約３００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約２５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約２００個のアデニンヌクレオチド、約２００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約２００～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約２００～約４００個のアデニンヌクレオチド、約２００～約３５０個のアデニンヌクレオチド、約２００～約３００個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約４００個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約３５０個のアデニンヌクレオチド、若しくは約２５０～約３００個のアデニンヌクレオチド、又は任意の介在する範囲のアデニンヌクレオチドである。
ポリヌクレオチドの配向を記載する用語には、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）及び３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の配向又は３’から５’の配向で注釈付けされ得る。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについて、５’から３’の鎖は、その配列が、プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるために、「センス」鎖、「プラス」鎖、又は「コード」鎖と指定される［ＤＮＡ中のチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡ中のウラシル（Ｕ）を除く］。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写された鎖である相補的な３’から５’鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、又は「非コード」鎖として指定される。本明細書で使用される場合、用語「逆配向」は、３’から５’の配向に書かれた５’から３’の配列、又は５’から３’の配向に書かれた３’から５’の配列を指す。
用語「相補的」及び「相補性」は、塩基対形成規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ ３’の相補鎖は、３’Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ ５’である。後者の配列は、しばしば、５’末端が左に、３’末端が右にある、５’Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ ３’、逆相補体として記載される。その逆相補鎖と等しい配列は、パリンドローム配列であると言われる。相補性は、核酸塩基の一部のみが塩基対合規則に従って一致する、「部分」であり得る。あるいは、核酸間には、「完全」又は「総合的な」相補性が存在し得る。
本明細書で使用される場合、用語「核酸カセット」又は「発現カセット」は、ＲＮＡを発現し、その後にポリペプチドを発現することができるベクター中の遺伝子配列を指す。一実施形態では、核酸カセットは、対象となる遺伝子、例えば、対象となるポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、核酸カセットは、１つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、及び例えば。対象となるポリヌクレオチドなどの対象となる遺伝子を含む。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、ベクター内で位置的に、及び連続的に配向され、それにより、カセット中の核酸はＲＮＡに転写されることができ、必要な場合にはタンパク質又はポリペプチドへと翻訳され、形質転換細胞での活動に必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画に標的化されることで生物活性に適した区画へと移行され、又は細胞外区画へと分泌されることができる。好ましくは、カセットは、ベクターへの挿入準備に適合した、その３’及び５’末端を有し、例えば、それは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態では、核酸カセットは、遺伝的障害を治療するか、予防するか、又は改善するために使用される治療遺伝子の配列を含む。カセットは取り出され、単一ユニットとしてプラスミド又はウイルスベクター内に挿入されることができる。
ポリヌクレオチドは、対象となるポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、用語「対象となるポリヌクレオチド」は、本明細書で企図される、ポリペプチド若しくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は阻害性ポリヌクレオチドの転写用の鋳型としての役割を果たすポリヌクレオチドを指す。
更に、当業者であれば、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書で企図される、ポリペプチド又はそのバリアントの断片をコードし得る多くのヌクレオチド配列があることを理解するであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用における差異に起因して変化するポリヌクレオチド、例えば、ヒト及び／又は霊長類のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチドが、特定の実施形態で具体的に企図される。一実施形態では、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、及び／又は置換など、１つ以上の変異の結果として改変される内在性ポリヌクレオチド配列である。
ある特定の実施形態では、対象となるポリヌクレオチドは、ドナー修復鋳型を含む。
特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さに関係なく、他のＤＮＡ配列と結合してもよく、プロモーター及び／又はエンハンサーなど、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、制限酵素部位、複数のクローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、及びＡｔｔ部位）終止コドン、転写終結シグナル、転写後応答エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後応答エレメント（ＷＰＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルス転写後応答エレメント（ＨＰＲＥ）、及び自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、エピトープタグ、本明細書の他の箇所に開示されているか又は当該技術分野で既知のものであり、それにより、全長は大きく変化し得る。したがって、特定の実施形態では、ほぼ任意の長さのポリヌクレオチド断片が使用されてもよく、全長は、企図される組換えＤＮＡプロトコルにおける調製及び使用の容易さによって制限されることが好ましい。
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知であり利用可能な様々な確立された技術のうちのいずれかを使用して調製され、操作され、発現され、かつ／又は送達されてもよい。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクター内に挿入することができる。所望のポリペプチドは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを細胞内に送達することによっても発現され得る。
ベクターの例示的な例としては、プラスミド、自己複製配列、及び転移性因子、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃなどが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターの追加的な例示的な例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージ又はＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターとして有用なウイルスの例示的な例には、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
発現ベクターの例示的な例には、哺乳類細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス介在性の遺伝子導入及び発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳類細胞でのポリペプチドの発現のために、かかる発現ベクター内にライゲーションされてもよい。
特定の実施形態では、ベクターは、エピソームベクター、又は染色体外で維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、用語「エピソーム」は、宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込むことなしに、及び宿主細胞の***により徐々に失われることなく複製することができるベクターを指し、当該ベクターは染色体外又はエピソームで複製することも意味する。
発現ベクターに存在する「発現制御配列」、「制御エレメント」、又は「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写及び翻訳を行う、ベクターの複製起源、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列又はＫｏｚａｋ配列）イントロン、転写後調節エレメント、ポリアデニル化配列、５’及び３’非翻訳領域の非翻訳領域である。かかるエレメントは、その強度及び特異性が変化し得る。利用されるベクターシステム及び宿主に応じて、ユビキタスプロモーター及び誘導性プロモーターをはじめとする任意の数の好適な転写エレメント及び翻訳エレメントを使用してもよい。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現ベクター及びウイルスベクターをはじめとするベクターを含むが、これらに限定されない。ベクターは、１つ以上の外因性、内因性、又は異種の制御配列、例えば、プロモーター及び／又はエンハンサーを含んでもよい。「内因性制御配列」は、ゲノム中で所与の遺伝子と本来連結される配列である。「外因性制御配列」は、遺伝子操作手段（すなわち分子生物学的技術）により、遺伝子に並置して置かれる配列であり、当該遺伝子の転写は、その連結したエンハンサー／プロモーターにより誘導される。「異種制御配列」は、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。「合成」制御配列は、特定の療法に対し最適なプロモーター活性及び／又はエンハンサー活性を提供する、１つ以上の内因性及び／又は外因性の配列の因子、並びに／又はインビトロ若しくはインシリコで決定された配列の因子を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始及び転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞において作動されるプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴが豊富な領域を含み、かつ／又は転写の開始から７０～８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、式中、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る。
用語「エンハンサー」は、転写の増強を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指し、いくつかの場合では、別の制御配列に対する配向に関係なく機能することができる。エンハンサーは、プロモーター及び／又は他のエンハンサーエレメントと協働して、又は相加的に機能することができる。用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指す。
用語「作動可能に連結した」は、記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある並置を意味する。一実施形態では、用語は、核酸発現制御配列（プロモーター及び／又はエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、対象のポリヌクレオチドとの間の機能的結合を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指向する。
本明細書で使用される場合、用語「構造的発現制御配列」は、作動可能に連結された配列の継続的な、又は連続的な転写を可能にするプロモーター、エンハンサー、又はプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、幅広い多様な細胞及び組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、若しくはプロモーター／エンハンサーであり得るか、又は制限された多様な細胞及び組織型それぞれにおける発現を可能にする、「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系統」、若しくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、若しくはプロモーター／エンハンサーであり得る。
特定の実施形態における使用に好適なユビキタス発現制御配列の例示としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば初期又は後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５及びＰ１１プロモーター、短い伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ－短）プロモーター、長い伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ－長）プロモーター、初期増殖応答タンパク質１（ＥＧＲ１：ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、真核細胞翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、ヒートショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、ヒートショックタンパク質９０ｋＤａ ベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、ヒートショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（β－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ ２６座位（Ｉｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７－１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーター及び骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、ネガティブ制御領域欠失型、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８－５５（１９９５））が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、細胞、細胞型、細胞系譜、又は組織に特異的な発現制御配列を使用して、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、細胞系譜特異的、又は組織特異的な発現を実現することが望ましい場合もある（例えば特定のポリペプチドをコードする核酸を、細胞型、細胞系譜、又は組織のサブセットにおいてのみ、又は発生の特定のステージでのみ発現させる）。
本明細書で使用される場合、「条件付き発現」は、誘導性発現、抑制性発現、特定の生理学的状態、生物学的状態若しくは疾患状態を有する細胞又は組織における発現などを含むがこれらに限定されない、任意のタイプの条件付き発現を指す場合がある。この定義は、細胞型特異的又は組織特異的な発現を除外することは意図されない。ある特定の実施形態は、例えば、細胞、組織、生物などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理若しくは条件、又は対象となるポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現の増加若しくは減少を引き起こす処理若しくは条件に供することによって発現が制御される、対象となるポリヌクレオチドの条件発現を提供する。
誘導性プロモーター／システムの例示的な例としては、ステロイド誘導性プロモーター、例えばグルココルチコイド受容体又はエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター（対応するホルモンの処理で誘導可能）、メタロチオネインプロモーター（様々な重金属の処理で誘導可能）、ＭＸ－１プロモーター（インターフェロンで誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン制御性システム（Ｓｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クミン酸塩（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性制御システムなどが挙げられるが、これらに限定されない。
条件付き発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによっても達成され得る。ある特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えについて少なくとも１つの（典型的には２つの）部位を含む。本明細書で使用される場合、用語「リコンビナーゼ」又は「部位特異的リコンビナーゼ」は、１つ以上の組換え部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）を含む組換え反応に関与する 除去又は組込タンパク質、酵素、補助因子又は関連タンパク質を含み、野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９－７０７（１９９３）を参照のこと）、又は変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列又はその断片を含む融合タンパク質）、断片及びそのバリアントであってもよい。特定の実施形態での使用に好適なリコンビナーゼの例示的な例には、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、及びＰａｒＡが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチドは、広範囲の部位特異的リコンビナーゼのいずれかに対して１つ以上の組換え部位を含んでもよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターの統合に必要とされる任意の部位に追加されることが理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「組換え配列」、「組換え部位」、又は「部位特異的組換え部位」は、リコンビナーゼが認識及び結合する特定の核酸配列を指す。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の対象となるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断ポリペプチドをコードする１つ以上のＩＲＥＳ配列又はポリヌクレオチド配列によって分離され得る。
本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」又は「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質コード領域）の、ＡＴＧなどの開始コドンに内部リボソームが直接侵入することを促進し、キャップ非依存性の遺伝子翻訳を生じさせるエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７－８３）及びＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ １（１０）：９８５－１０００を参照されたい。当業者によって一般に用いられるＩＲＥＳの例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されるものを含む。当該技術分野で既知の「ＩＲＥＳ」の更なる例としては、ピコルナウイルスから取得可能なＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、及び例えば免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などのウイルスｍＲＮＡ又は細胞ｍＲＮＡを源として取得可能なＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８－６１９０）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）、及びインスリン様増殖因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子のｅＩＦ４Ｇ、並びに酵母転写因子のＴＦＩＩＤ及びＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されている脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６６（３）：１６０２－９）及びＶＥＧＦ ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８（１１）：６１７８－９０）が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳは、ピコルナウイルス科、ジシストロウイルス科、及びフラビウイルス科の種のウイルスゲノム、並びにＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）、及びモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）においても報告されている。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を有し、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、用語「Ｋｏｚａｋ配列」は、リボソームの小サブユニットへのｍＲＮＡの初期結合を大きく促進し、かつ翻訳を増加させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号１４９）であり、式中、Ｒはプリン（Ａ又はＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３－９２、及びＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５－４８）。
異種核酸転写物の効率的な終止とポリアデニル化を指向するエレメントは、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは、概して、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態では、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される場合、「ポリＡ部位」又は「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって発生期のＲＮＡ転写物の終止及びポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリＡテールをコード配列の３’末端に付加することによってｍＲＮＡ安定性を促進することができ、したがって、翻訳効率の向上に寄与する。切断及びポリアデニル化は、ＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列によって指向される。哺乳類プレｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識エレメントを有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡ六量体が、Ｕ残基又はＧＵ残基が豊富な、より可変性であるエレメントの上流２０～５０ヌクレオチドに存在する。初期転写物の切断はこれら２つのエレメントの間で発生し、５’切断産物に最大で２５０個のアデノシンが付加される。特定の実施形態では、コアポリ（Ａ）配列は、最良のポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０のポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、それらのバリアント、又は当該技術分野で既知の別の好適な異種又は内因性ポリＡ配列である。
特定の実施形態では、１つ以上の融合ポリペプチド、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、末端プロセシング酵素、又はエクソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルス方法及びウイルス方法の両方によって、造血細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞に導入されてもよい。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ及び／又はドナー修復鋳型をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの送達は、同じ方法によって、若しくは異なる方法によって、及び／又は同じベクターによって、若しくは異なるベクターによって提供され得る。
用語「ベクター」は、本明細書において、別の核酸分子を移送又は輸送することができる核酸分子を指すために使用される。伝達された核酸は、一般的に、例えば、ベクター核酸分子に挿入される。ベクターは、細胞内で自己複製を指向する配列を含んでもよく、又は宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態では、非ウイルスベクターを使用して、本明細書企図される１つ以上のポリヌクレオチドをＣＤ３４＋細胞に送達する。
非ウイルス性ベクターの例示的な例には、プラスミド（例えばＤＮＡプラスミド又はＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、及び細菌人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス性の送達の例示的な方法には、エレクトロポレーション法、ソノポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、バイオリステック法、ウイロゾーム法、リポソーム法、免疫リポソーム法、ナノ粒子法、ポリカチオン又は脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ法、人工ビリオン、ＤＥＡＥ－デキストラン介在移送、遺伝子銃、及びヒートショックが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態に企図される特定の実施形態での使用に好適なポリヌクレオチド送達システムの例示的な例には、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．により提供されるシステムが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体－認識リポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０－１８７、及びＢａｌａｚｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１－１２を参照されたい。抗体標的化送達、細菌誘導送達、非生物ナノセル系送達も特定の実施形態に企図される。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、例えば、エレクトロポレーションによって、細胞に直接導入され得る。エレクトロポレーション法では、ポリヌクレオチド、又は部位特異的ポリペプチド及びポリヌクレオチドの複合体を、エレクトロポレーション緩衝液中で標的細胞と混合して、懸濁液を形成する。次いで、この懸濁液を最適化された電圧で電気パルスに供し、これが細胞膜のリン脂質二重層に一時的な細孔を生成し、ＤＮＡ及びタンパク質などの荷電分子を細孔を通して細胞内に駆動することを可能にする。エレクトロポレーションを行うための試薬及び装置は、市販されている。エレクトロポレーション媒体は、当該技術分野で既知の任意の好適な媒体であり得る。エレクトロポレーションの好適な方法は利用可能であり、当業者に既知である。
特定の実施形態に企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、個々の患者に投与することにより、典型的には以下に記載されるように全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は頭蓋内点滴）又は局所適用することによりインビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、動員された末梢血、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検等）又はユニバーサルドナーの造血幹細胞などの細胞に生体外で送達されてもよく、その後、患者に細胞を再移植してもよい。
一実施形態では、ヌクレアーゼバリアント及び／又はドナー修復鋳型を含むウイルスベクターは、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与される。あるいは、ネイキッドＤＮＡ又はｍＲＮＡが投与されてもよい。投与は、これらに限定されないが、注射、注入、局所適用、及びエレクトロポレーションを含む、血液又は組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常使用される任意の経路による。そのような核酸を投与する好適な方法は、利用可能でかつ当業者に周知であり、１つを超える経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、別の経路よりもより即時的かつより有効な反応を提供し得る場合が多い。
本明細書で企図される特定の実施形態での使用に好適なウイルスベクターシステムの例示的な例には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｈ．ゲノム編集された細胞
特定の実施形態で企図される方法によって製造及び／又は編集されたゲノム編集された細胞が提供される。特定の実施形態で企図されるゲノム編集された細胞は、自家／自己（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）（自己（ｓｅｌｆ））又は非自家（「非自己」、例えば、同種、同系、又は異種）であってもよい。本明細書で使用される場合、「自家」は、同じ対象に由来する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同種」は、比較した細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同系」は、比較した細胞と遺伝的に同一である、異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「異種」は、比較した細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、細胞は、哺乳類対象から得られる。より好ましい実施形態では、細胞は、霊長類対象、任意で、非ヒト霊長類から得られる。最も好ましい実施形態では、細胞は、ヒト対象から得られる。
「単離細胞」は、インビボ組織又は器官から得られ、細胞外基質が実質的に存在しない、天然で存在しない細胞、例えば、自然界に存在しない細胞、修飾された細胞、操作された細胞などを指す。
特定の実施形態では、細胞は、本明細書で企図される融合ポリペプチド、例えば、ＤＮＡ結合ドメインと、細胞、ポリペプチドリンカー、及びエクソヌクレアーゼ、又はその生物学的に活性な断片において選択された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的部位を結合して切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントとを含む融合ポリペプチドによって編集される。
様々な実施形態では、細胞は、本明細書で企図される融合ポリペプチドによって誘導される方向バイアスされた欠失を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％の方向バイアスされた欠失は、ＨＥ標的部位中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、欠失中心位置は、ＨＥ標的部位の中心位置に対して、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位と同じ側にある。いくつかの実施形態では、欠失中心位置は、ＨＥ標的部位の中心位置に対して５’にある。
様々な実施形態において、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％の欠失が、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。様々な実施形態では、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、又は少なくとも３５％の欠失は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。
様々な実施形態では、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％の欠失は、６ｂｐ以上の長さである。様々な実施形態では、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％の欠失は、１２ｂｐ以上の長さである。特定の実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０個のヌクレオチドの長さを含む。
様々な実施形態では、欠失は、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位内に延在する。いくつかの実施形態では、欠失の中心位置は、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位内にある。
本明細書で企図される組成物及び方法を使用してそのゲノムが編集され得る細胞型の例示的な例には、細胞株、初代細胞、幹細胞、前駆細胞、及び分化細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「幹細胞」は、（１）長期間の自己再生、又は元の細胞の少なくとも１つの同一コピーを生成する能力、（２）単一細胞レベルでの複数への分化、及びいくつかの例では、１つの特殊化した細胞型、並びに（３）インビボでの組織の機能的再生が可能である未分化細胞である細胞を指す。幹細胞は、その発生能に応じて、全能性、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）、及びオリゴ／単能性として亜分類される。「自己再生」は、改変されていない娘細胞を産生し、かつ特殊化した細胞型（能力）を生成する固有の能力を有する細胞を指す。自己再生は、２つの方法で達成され得る。非対称細胞***は、親細胞と同一である１つの娘細胞と、親細胞とは異なっており、かつ前駆細胞又は分化細胞である１つの娘細胞とを産生する。対称細胞***は、２つの同一の娘細胞を産生する。細胞の「増殖」又は「拡大」は、対称的に***する細胞を指す。
本明細書で使用される場合、用語「前駆」又は「前駆細胞」は、自己再生能力を有し、かつより成熟した細胞に分化する能力を有する細胞を指す。多くの前駆細胞は、単一系統に沿って分化するが、かなり広範な増殖能力を有し得る。
特定の実施形態では、細胞は、初代細胞である。本明細書で使用される場合、用語「初代細胞」は、組織から単離され、かつインビトロ又はエクスビボでの成長のために確立された細胞を指すことが当該技術分野で既知である。対応する細胞は、存在する場合、集団の重複を非常に少なく受け、したがって、連続細胞株と比較して、それらが誘導される組織の主要機能成分のより代表的なものであり、したがって、インビボ状態に対するより代表的なモデルを表す。種々の組織から試料を得る方法、及び初代細胞株を確立するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｗｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９７を参照されたい）。本明細書で企図される方法で使用するための初代細胞は、臍帯血、胎盤血、動員された末梢血、及び骨髄に由来する。一実施形態では、初代細胞は、造血幹細胞又は前駆細胞である。
一実施形態では、ゲノム編集された細胞は、胚性幹細胞である。一実施形態では、ゲノム編集された細胞は、成体幹細胞又は前駆細胞である。一実施形態では、ゲノム編集された細胞は、初代細胞である。
好ましい実施形態では、ゲノム編集された細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、例えば、Ｂ細胞前駆細胞、又は造血細胞を含む細胞集団である。
本明細書で使用される場合、用語「細胞集団」は、本明細書の他の箇所に記載されるように、均質又は異種の細胞型の任意の数及び／又は組み合わせからなってもよい複数の細胞を指す。例えば、造血幹細胞又は前駆細胞の形質導入のために、細胞集団が、臍帯血、胎盤血、骨髄、又は動員された末梢血から単離又は取得されてもよい。細胞集団は、編集される標的細胞型の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％を含み得る。ある特定の実施形態では、造血幹細胞又は前駆細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して、不均一な細胞集団から単離又は精製されてもよい。
造血細胞を得るための例示的な供給源としては、脊髄血液、骨髄、又は動員された末梢血が挙げられるが、これらに限定されない。
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生物の生涯にわたって成熟血液細胞のレパートリー全体を生成することが可能である決定された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）造血前駆細胞（ＨＰＣ）を生じさせる。用語「造血幹細胞」又は「ＨＳＣ」は、生物の全ての血液細胞型を生じさせる多能性幹細胞を指し、骨髄系（例えば、単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、及びリンパ系（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、及び当該技術分野で既知の他のもの（Ｆｅｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６３５，３８７号；ＭｃＧｌａｖｅ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，４６０，９６４号；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６７７，１３６号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，７５０，３９７号；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，７５９，７９３号；ＤｉＧｕｉｓｔｏ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６８１，５９９号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，７１６，８２７号を参照されたい）。致死的放射線量を浴びた動物又はヒトに移植されたとき、造血幹細胞及び前駆細胞は、赤血球、好中球－マクロファージ、巨核球及びリンパ造血細胞プールを再増殖することができる。
本明細書で企図される方法及び組成物での使用に好適な造血幹細胞又は前駆細胞の追加の例示的な例としては、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－である造血細胞、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８Ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、及びＬｉｎ（－）である造血細胞、並びにＣＤ１３３＋である造血細胞が挙げられる。
好ましい実施形態では、ＣＤ１３３＋ＣＤ９０＋である造血細胞。好ましい実施形態では、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋である造血細胞。好ましい実施形態では、ＣＤ１３３＋ＣＤ９０＋ＣＤ３４＋である造血細胞。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４」とは、細胞－細胞接着因子として作用することが多く、リンパ節へのＴ細胞の侵入に関与する細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含み、ＨＳＣは患者に投与されたときに分化し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、及び単球／マクロファージ系統の細胞を含む全ての造血系に寄与する。
造血階層を特徴付けるための様々な方法が存在する。特徴付けの１つの方法は、ＳＬＡＭコードである。ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）ファミリーは、＞１０分子の群であり、その遺伝子は、主に１番染色体（マウス）上の単一の遺伝子座に縦列で位置しており、全てが免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのサブセットに属し、元々Ｔ細胞刺激に関与すると考えられる。このファミリーには、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４などが含まれ、ＣＤ１５０は創設メンバーであり、したがって、ｓｌａｍＦ１、すなわち、ＳＬＡＭファミリーメンバー１とも称される。造血階層に関するシグネチャーＳＬＡＭコードは、造血幹細胞（ＨＳＣ）－ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＣＤ２４４－、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）－ＣＤ１５０－ＣＤ４８－ＣＤ２４４＋、系統制限前駆細胞（ＬＲＰ）－ＣＤ１５０－ＣＤ４８＋ＣＤ２４４＋；共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）－ｌｉｎ－ＳＣＡ－１－ｃ－ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｍｉｄ；顆粒球－マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）－ｌｉｎ－ＳＣＡ－１－ｃ－ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｈｉ；及び巨核球－赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）－ｌｉｎ－ＳＣＡ－１－ｃ－ｋｉｔ＋ＣＤ３４－ＣＤ１６／３２ｌｏｗである。
本明細書で企図される組成物及び方法を用いて編集される好ましい標的細胞型としては、造血細胞、好ましくは、ヒト造血細胞、より好ましくは、ヒト造血幹及び前駆細胞、並びに更により好ましくは、ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４」とは、細胞－細胞接着因子として作用することが多い細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋は、造血幹細胞及び前駆細胞の両方の細胞表面マーカーである。
一実施形態では、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＣＤ２４４－細胞である。一実施形態では、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞である。一実施形態では、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ１３３＋細胞である。一実施形態では、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチドは、免疫エフェクター細胞に導入され、発現される。「免疫エフェクター細胞」は、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性の細胞殺傷活性、サイトカイン分泌、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣの誘導など）を有する免疫系の任意の細胞である。本明細書で企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、及びヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）を含むがこれらに限定されない、Ｔリンパ球である。特定の実施形態では、細胞は、αβ Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、細胞は、γδ Ｔ細胞を含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。
免疫エフェクター細胞は、自家／自己（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）（自己（ｓｅｌｆ））又は非自家（「非自己（ｎｏｎ－ｓｅｌｆ）」、例えば、同種、同系、又は異種）であり得る。本明細書で使用される場合、「自家」は、同じ対象に由来する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同種」は、比較した細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同系」は、比較した細胞と遺伝的に同一である、異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「異種」は、比較した細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、細胞は、自家である。
特定の実施形態において企図される融合ポリペプチドとともに使用される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含む。用語「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球」は、当該技術分野において認識されており、胸腺細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、又は活性化Ｔリンパ球を含むことが意図される。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）又はＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞、又はＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。特定の実施形態での使用に好適な他の例示的なＴ細胞の集団としては、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、Ｔメモリー幹細胞（ＴＳＣＭ）、中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、及びエフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）が挙げられる。
当業者によって理解されるように、他の細胞も、本明細書において融合ポリペプチドを有する免疫エフェクター細胞として使用され得る。特に、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球及びマクロファージも含む。免疫エフェクター細胞は、エフェクター細胞の前駆体も含み、かかる前駆細胞は、インビボ又はインビトロで免疫エフェクター細胞に分化するように誘導されてもよい。したがって、特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、例えば、臍帯血、骨髄、又は動員された末梢血に由来する細胞のＣＤ３４＋集団内に含まれる造血幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆体を含み、それらは対象に投与されたときに成熟免疫エフェクター細胞へと分化するか、又はインビトロで誘導されて成熟免疫エフェクター細胞へと分化してもよい。
本明細書で企図されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製するための方法は、特定の実施形態において提供される。一実施形態では、方法は、免疫エフェクター細胞が本明細書で企図される１つ以上のＣＡＲを発現するように個体から単離された免疫エフェクター細胞をトランスフェクト又は形質導入することを含む。ある実施形態では、免疫エフェクター細胞は、インビトロでの更なる操作を伴わずに個体から単離され、遺伝子修飾される。次いで、かかる細胞を個体に直接再投与してもよい。更なる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾される前に、インビトロで増殖するように最初に活性化及び刺激される。これに関して、免疫エフェクター細胞は、遺伝子修飾される（すなわち、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するように形質導入又はトランスフェクトされる）前及び／又は後に培養され得る。
特定の実施形態では、本明細書で企図される免疫エフェクター細胞のインビトロ操作又は遺伝子修飾の前に、細胞の供給源は対象から得られる。特定の実施形態では、修飾された免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
特定の実施形態では、ＰＢＭＣはＣＡＲを発現するために、本明細書で企図される方法を使用して直接遺伝子修飾されてもよい。ある特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、Ｔリンパ球を更に単離し、ある特定の実施形態では、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝子修飾及び／又は拡大の前又は後のいずれかに、ナイーブ、メモリー、及びエフェクターＴ細胞亜集団に保存することができる。
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、既知の方法を使用して単離後に遺伝子修飾され得るか、又は遺伝子修飾される前に、インビトロで免疫エフェクター細胞を活性化及び拡張（又は前駆細胞の場合に分化）させることができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書で企図されるキメラ抗原受容体で遺伝子修飾され（例えば、ＣＡＲをコードする核酸又はＣＡＲをコードするポリシストロニックメッセージを含むウイルスベクターで形質導入され）、次いで、インビトロで活性化及び拡張される。様々な実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号、及び米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号に記載されるような方法を使用して、ＣＡＲを発現するための遺伝子修飾の前又は後に活性化及び拡張することができる。
一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、本明細書で企図される核酸構築物で形質導入される。ある特定の実施形態では、形質導入されたＣＤ３４＋細胞は、対象、一般に細胞が最初に単離された対象に投与された後、インビボで成熟免疫エフェクター細胞に分化する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、本明細書で企図されるＣＡＲで遺伝子修飾される前又は後に、前述の方法に従って（Ａｓｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｉｍｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００４）、以下のサイトカイン：Ｆｌｔ－３リガンド（ＦＬＴ３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球増殖分化因子（ＴＰＯ）、ＩＬ－３及びＩＬ－６のうちの１つ以上を用いてインビトロで刺激され得る。
特定の実施形態において、がんの治療のための修飾された免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書で企図されるＣＡＲを含む。例えば、修飾された免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍と診断された患者（自己ドナー）から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋であり得るＴリンパ球の異種集団を形成する。
ＰＢＭＣはまた、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞などの他の細胞傷害性リンパ球を含み得る。特定の実施形態で企図されるＣＡＲのコード配列を担持する発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞の集団に導入される。特定の実施形態では、発現ベクターを担持する首尾よく形質導入されたＴ細胞は、フローサイトメトリーを用いてＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、次いで、抗ＣＤ３抗体及び又は抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ－２又は本明細書の他の箇所に記載されるような当該技術分野で既知の任意の他の方法を用いた細胞活性化に加えて、Ｔ細胞を発現するこれらのＣＡＲタンパク質の数を増加させるように更に増殖させることができる。標準的な手順は、ヒト対象で使用するための保存及び／又は調製のためのＣＡＲタンパク質Ｔ細胞を発現するＴ細胞の凍結保存に使用される。一実施形態では、Ｔ細胞のインビトロ形質導入、培養、及び／又は拡大は、胎児仔ウシ血清及び胎児ウシ血清などの非ヒト動物由来産物の不在下で実施される。ＰＢＭＣの不均一な集団が遺伝子修飾されるため、結果として生じる形質導入細胞は、本明細書で企図されるようなＣＡＲを標的とするＢＣＭＡを含む修飾された細胞の不均一な集団である。
更なる実施形態では、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の異なる発現ベクターの混合物を、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝子修飾する際に使用することができ、各ベクターは、本明細書で企図される異なるキメラ抗原受容体タンパク質をコードする。結果として生じる修飾された免疫エフェクター細胞は、修飾された細胞の混合集団を形成する。
Ｔ細胞を含む遺伝子操作された細胞は、当該技術分野で既知の様々な方法を用いて製造することができ、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０９４３０４を参照されたい。
Ｉ．組成物及び製剤
特定の実施形態で企図される組成物は、本明細書で企図される、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、並びにゲノム編集組成物及びゲノム編集された細胞組成物を含んでもよい。特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物及び方法は、細胞又は細胞集団中の標的部位の編集に有用である。
様々な実施形態では、本明細書に企図される組成物は、ＤＮＡ結合ドメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、及び末端プロセシング酵素、例えば、３’～５’のエクソヌクレアーゼ（ＥｘｏＸ）を含む融合ポリペプチドを含む。ヌクレアーゼバリアントは、上記で開示されたポリヌクレオチド送達方法、例えば、エレクトロポレーション、脂質ナノ粒子などを介して細胞内に導入されるｍＲＮＡの形態であってもよい。一実施形態では、融合ポリペプチド、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、及び３’～５’のエクソヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＸ）を含む組成物は、上記で開示されるポリヌクレオチド送達方法を介して細胞に導入される。
特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物は、細胞集団、ヌクレアーゼバリアント、及び任意選択で、ドナー修復鋳型を含む。特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物は、細胞集団、ヌクレアーゼバリアント、末端プロセシング酵素、及び任意選択で、ドナー修復鋳型を含む。ヌクレアーゼバリアント及び／又は末端プロセシング酵素は、上記で開示されたポリヌクレオチド送達方法を介して細胞内に導入されるｍＲＮＡの形態であってもよい。ドナー修復鋳型はまた、別個の組成物によって細胞内に導入されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書に企図される組成物は、細胞集団と、ＤＮＡ結合ドメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、３’～５’のエクソヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＸ）を含む融合ポリペプチドと、任意選択で、ドナー修復鋳型とを含む。ＤＮＡ結合ドメイン、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、及び３’～５’のエクソヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドは、上記に開示されるポリヌクレオチド送達方法を介して細胞内に導入されるｍＲＮＡの形態であってもよい。ドナー修復鋳型はまた、別個の組成物によって細胞内に導入されてもよい。
特定の実施形態では、細胞集団は、造血幹細胞、造血前駆細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ３４＋細胞、及び免疫エフェクター細胞を含むがこれらに限定されない、遺伝子修飾された造血細胞を含む。
組成物には、薬学的組成物が含まれるが、これらに限定されない。「薬学的組成物」とは、細胞又は動物への投与に対し、薬学的に許容される溶液又は生理学的に許容される溶液中で、単独で、又は１つ以上の他の治療モダリティと併用されて製剤化される組成物を指す。所望の場合には、組成物は、例えば、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、低分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬剤、抗体、又は他の様々な薬学的に活性な薬剤などの他の薬剤も同様に併用されて投与され得ることも理解されたい。事実上、組成物に含まれ得る他の構成要素に制限はないが、追加される薬剤は、組成物に有害な影響を与えないものとする。
本明細書において、語句「薬学的に許容される」は、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触して使用することに適し、合理的な利益／リスク比に見合った、それら化合物、物質、組成物及び／又は剤型を指すために採用される。
用語「薬学的に許容される担体」は、治療用細胞が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。薬学的担体の例示的な例は、例えば、細胞培養培地、水及び油などの滅菌された液体であってもよく、石油、動物、植物又は合成を起源とするものが挙げられ、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ごま油などがある。生理食塩水及びブドウ糖液及びグリセロール溶液も、特に注射用溶液に関して液性担体として採用され得る。特定の実施形態における好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白墨、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。任意の従来的な培地又は薬剤が、活性成分と不適合である場合を除き、治療用組成物中でのその使用が企図される。補足的な活性成分も、組成物に組み込まれ得る。
一実施形態では、薬学的に許容される担体を含む組成物は、対象への投与に好適である。特定の実施形態では、担体を含む組成物は、例えば、血管内（静脈内又は動脈内）投与、腹腔内投与又は筋肉内投与などの非経口投与に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される担体を含む組成物は、脳室内投与、髄腔内投与、又はくも膜腔内投与に好適である。薬学的に許容される担体としては、滅菌水溶液、細胞培養培地、又は分散液が挙げられる。薬学的に活性な物質に対する、かかる培地及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来的な培地又は薬剤が、形質導入された細胞と不適合である場合を除き、薬学的組成物中でのその使用が企図される。
特定の実施形態では、本明細書に企図される組成物は、遺伝子修飾された造血幹細胞及び／若しくは前駆細胞、又は本明細書に企図される融合ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む免疫エフェクター細胞、並びに薬学的に許容される担体を含む。
本明細書で企図される細胞ベースの組成物を含む組成物は、非経口投与方法により投与され得る。
薬学的に許容される担体は、十分に高い純度のものでなくてはならず、治療されているヒト対象への投与に好適となるよう、十分に毒性が低いものでなければならない。更に組成物の安定性を維持又は増加させなければならない。薬学的に許容される担体は、液体又は固体であってもよく、予定される投与様式を踏まえ、組成物の他の構成要素と混合されたときに、望ましい体積、一貫性を提供するよう選択される。例えば、薬学的に許容される担体は、限定するものではないが、結合剤（例えば、前ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えばラクトース及び他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、コロイド状二酸化シリコン、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、グリコール酸ナトリウムデンプンなど）、又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）であってもよい。本明細書で企図される組成物に好適な他の薬学的に許容される担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
かかる担体溶液はまた、緩衝剤、希釈剤、及び他の好適な添加剤を含み得る。本明細書で使用される場合、用語「緩衝剤」は、その化学組成が、ｐＨに大きな変化を与えることなく酸又は塩基を中和する溶液又は液体を指す。本明細書で企図される緩衝剤の例としては、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル溶液、５％ブドウ糖溶液（Ｄ５Ｗ）、正常／生理学的生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的に許容される担体は、組成物のｐＨを約７に維持するために十分な量で存在してもよい。あるいは、組成物は、約６．８～約７．４の範囲のｐＨ、例えば６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、及び７．４のｐＨを有する。更に別の実施形態では、組成物は、約７．４のｐＨを有する。
本明細書で企図される組成物は、非毒性の薬学的に許容される培地を含み得る。組成物は、懸濁液であってもよい。本明細書で使用される場合、用語「懸濁液」は、細胞が固形支持体に結合しない非接着性の状態を指す。例えば、懸濁液として維持される細胞は、撹拌されるか又はかき混ぜられてもよく、例えば、培養皿などの支持体に接着しない。
特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物は、懸濁液中で製剤化され、ここで、ゲノム編集された造血幹細胞及び／又は前駆細胞は、静脈注射用（ＩＶ）袋などの中で、許容される液体培地又は溶液、例えば、生理食塩水又は血清不含培地内に分散される。許容される希釈剤としては、水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム溶液（生理食塩水）、無血清細胞培養培地、及び極低温保存に適した培地、例えばＣｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）培地が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ヒト又は動物を起源とする天然タンパク質を実質的に含まず、ゲノム編集された細胞、例えば、造血幹細胞及び前駆細胞を含む組成物の保存に好適である。治療用組成物は、ヒト患者への投与が意図されており、そのため、例えば、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、及びウシ胎児血清などの細胞培養成分を実質的に含まない。
いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地中で製剤化される。かかる組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清培地である。
無血清培地は、血清含有培地を超える利点をいくつか有し、単純でより明確な組成物、汚染物質量の低下、感染性実体の源となる可能性の排除、及びコスト低下が挙げられる。様々な実施形態では、無血清培地は、動物質を含まず、任意選択で無タンパク質であってもよい。任意選択で、培地は、バイオ医薬品的に許容される組換えタンパク質を含み得る。「動物質を含まない」培地とは、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中で天然動物性タンパク質を置き換え、その栄養素は合成、植物又は微生物の源から得られる。「タンパク質を含まない」培地は、対照的に、実質的にタンパク質を含まないと規定される。
特定の組成物において使用される無血清培地の例示的な例としては、ＱＢＳＦ－６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＸ－ＶＩＶＯ １０が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、ゲノム編集された造血幹細胞及び／又は前駆細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ中で製剤化される。
様々な実施形態では、造血幹細胞及び／又は前駆細胞を含む組成物は、凍結保存培地中で製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地を使用して、融解後の高い細胞活性成績を維持してもよい。特定の組成物において使用される凍結保存培地の例示的な例としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、組成物は、５０：５０のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ ＡとＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む溶液中で製剤化される。
特定の実施形態では、組成物は、マイコプラズマ、エンドトキシン、及び微生物汚染を実質的に含まない。エンドトキシンに関して「実質的に含まない」とは、生物製剤に関してＦＤＡにより許可されるよりも低い細胞用量当たりのエンドトキシンであることを意味し、１日当たり、５ＥＵ／体重ｋｇの総エンドトキシンであり、平均７０ｋｇのヒトに対し、細胞総用量当たり３５０ＥＵである。特定の実施形態では、本明細書で企図されるレトロウイルスベクターで形質導入された造血幹細胞又は前駆細胞を含む組成物は、約０．５ＥＵ／ｍＬ～約５．０ＥＵ／ｍＬ、又は約０．５ＥＵ／ｍＬ、１．０ＥＵ／ｍＬ、１．５ＥＵ／ｍＬ、２．０ＥＵ／ｍＬ、２．５ＥＵ／ｍＬ、３．０ＥＵ／ｍＬ、３．５ＥＵ／ｍＬ、４．０ＥＵ／ｍＬ、４．５ＥＵ／ｍＬ、若しくは５．０ＥＵ／ｍＬを含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドの送達に好適な組成物及び製剤が企図され、１つ以上の再プログラムヌクレアーゼをコードする１つ以上のｍＲＮＡ、及び任意選択で、末端プロセシング酵素を含むがこれらに限定されない。
エクスビボ送達のための例示的な製剤はまた、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、熱ショック、及び様々なリポソーム製剤（すなわち、脂質媒介性トランスフェクション）など、当該技術分野で既知の様々なトランスフェクション剤の使用を含み得る。リポソームは、以下により詳細に記載されるように、水性流体の画分を包囲する脂質二重層である。ＤＮＡは、カチオン性リポソームの外表面と（その電荷により）自発的に会合し、これらのリポソームは、細胞膜と相互作用する。
特定の実施形態では、薬学的に許容される担体溶液の製剤は、当該技術分野で周知であり、例えば、腸内及び非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、脳室内、大脳内、頭蓋内、髄腔内、くも膜下腔内、及び髄内の投与並びに製剤を含む様々な治療レジメンにおける、本明細書に記載される特定の組成物の使用に関する好適な投薬レジメン及び治療レジメンの開発も同様である。当業者であれば、本明細書で企図される特定の実施形態は、例えば、薬学分野で周知であり、かつ例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌｕｍｅ Ｉ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ．２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ Ｊｒ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；２０１２に記載される製剤などの他の製剤を含み得ることを理解するであろう。
Ｊ．部位特異的変異導入方法
所与の欠失又は挿入（インデル）を定義する定性的特性は、（ｉ）挿入又は削除された塩基の数におけるその長さ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ標的部位又はブレイクポイントに対して通常示される、染色体に沿ったその長手方向位置、及び（ｉｉｉ）挿入に関して、挿入された配列の長さ及び組成物である。欠失は最も顕著なアウトカムであり、典型的には、観察されたイベントの９０～９５％を含む。それらの最も一般的に報告されるサイズ特性は、小さい傾向があり（すなわち、１～２０塩基対の長さ、その範囲の低端に向かってバイアスされた頻度）、それらの位置分布は、均等に分布していることが見出され、ＤＮＡブレイクポイントを網羅し、有意なバイアスなしにいずれかの方向で外側に発散する。これらの特性に対する例外は、ＤＮＡブレイクポイントのいずれかの側に位置するマイクロホモロジー（およそ３～６塩基対の長さの小さな重複した経路）によって駆動されると頻繁に仮定される。ゲノム編集ツールの適用中にはるかに低い頻度で生じる挿入の特性に関してはほとんど報告されていない。更に、各インデル種を表現型に関連付ける遺伝子型の特徴（例えば、それがオープンリーディングフレームにどのような影響を与えるか、又はそれが転写因子結合モチーフを破壊するかどうか）は、潜在的に広大であり、所与の各用途に特有である。
操作されたｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼ、並びにＤＮＡ結合ドメイン及びホーミングエンドヌクレアーゼを含む他の融合ポリペプチドは、他の遺伝子編集プラットフォームとは異なる特徴を有する。例えば、ｍｅｇａＴＡＬは、再プログラムされたホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）に融合したモジュール式にアセンブリされた転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）アレイを含む単量体、ハイブリッド分子である。標的部位でＨＥを固定するＴＡＬＥアレイは、およそ６～１８塩基対の結合部位を認識するようなサイズにすることができる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、２２塩基対の標的部位を認識して切断する。２つの標的部位は、０～およそ１２塩基対の長さの任意の場所であり得るスペーサー領域によって分離される。ｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼの２つの固有の特性は、それらの別個の組成物から生じる：（ｉ）ＴＡＬＥアレイの固定機構は、標的部位の片側に対する全体的な結合親和性の高度にバイアスされた分布を提供し、（ｉｉ）ホーミングエンドヌクレアーゼにより触媒されるＤＮＡ切断反応の産物は、４塩基対の長さの３’オーバーハングを有するＤＮＡ末端である。逆に、ジンクフィンガー又はＴＡＬＥアレイがそれぞれＦｏｋＩヌクレアーゼによって操作されるＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、結合親和性の比較的均一な分布を有し、４塩基対の長さの５’オーバーハング末端を生み出す。ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡ認識及び切断の機序は、ＤＮＡ配列認識及び親和性の点で根本的に異なるが、しかしながら、ＤＮＡ切断の産物は、平滑末端ＤＮＡ末端（Ｃａｓ９）又は５’オーバーハング末端（Ｃｐｆ１）のいずれかである。
遺伝子編集イベントの定量的及び定性的な態様を評価するために、本明細書で企図される融合ポリペプチドの発明者らは、編集された対立遺伝子への影響を特徴付けるために、様々な末端プロセシング酵素の同時送達を試験した。更に、発明者らは、多数の多部構成ｍｅｇａＴＡＬ融合タンパク質を設計し、インライン酵素機能によって編集アウトカムをどのように操作できるかを評価した。
したがって、発明者らは驚くべきことに、リンカードメイン（例えば、ポリペプチドリンカー）によってエクソヌクレアーゼ、特にＴｒｅｘ２、ＥｘｏＩ、又はＥｘｏＸに連結された、ＤＮＡ結合ドメイン及びホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含む融合ポリペプチドが、細胞において発現されたときに、エクソヌクレアーゼに連結されていない、すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン／ホーミングエンドヌクレアーゼ融合及びエクソヌクレアーゼが別々に発現されたときに、ＤＮＡ結合ドメイン及びホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含む融合ポリペプチドと比較した場合、伸長した、方向バイアスされた欠失を作成したことを発見した。
したがって、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的部位を選択することと、細胞内に融合ポリペプチド、又は本明細書に企図される融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ、若しくはベクターを導入することとを含む、細胞内の部位特異的変異導入の方法が提供され、融合ペプチドは、細胞内で選択されたｄｓＤＮＡ標的切断部位の近くに欠失中心を有する、方向バイアスされた欠失を生成する。
様々な実施形態では、方法は、細胞において選択された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的部位に結合して切断するＤＮＡ結合ドメイン及びホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントと、リンカードメインと、エクソヌクレアーゼ又はその生物学的に活性な断片と、を含む融合ペプチドを導入することを含む。いくつかの実施形態では、エクソヌクレアーゼは、Ｔｒｅｘ２、ＥｘｏＩ、又はＥｘｏＸである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｍｅｇａＴＡＬ）又はジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む。
様々な実施形態では、ＥｘｏＸ又はその生物学的に活性な断片は、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
様々な実施形態では、ＥｘｏＩ又はその生物学的に活性な断片は、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸アミノ酸配列を含む。
様々な実施形態では、リンカードメインは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、自己切断ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約４～約３０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）１－４リンカー（配列番号１１７及び１５０～１５２）である。
様々な実施形態では、ＨＥバリアントは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである。いくつかの実施形態では、ＨＥバリアントは、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、及びＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。
様々な実施形態では、企図される方法は、免疫系チェックポイント遺伝子、グロビン遺伝子、γ－グロビン遺伝子発現及びＨｂＦの抑制に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子、又は免疫抑制シグナル伝達遺伝子内の部位を標的とする融合ポリペプチドを導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的部位は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＣＲ５、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＴＣＲβ、ＩＬ１０Ｒα、ＩＬ１０Ｒβ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＣＳＫ９、ＡＨＲ、ＢＴＫ、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＳＯＸ６、ＧＡＴＡ１、ＬＳＤ１、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレイクポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、ＴＥＭ５、ＴＥＭ８、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、並びにウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）遺伝子からなる群から選択される遺伝子内にある。
いくつかの実施形態では、標的部位は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＣＲ５、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＩＬ１０Ｒα、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＣＳＫ９、ＡＨＲ、ＢＴＫ、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、及びＢＣＬ１１Ａ遺伝子からなる群から選択される遺伝子内にある。
様々な実施形態では、標的部位は、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）遺伝子、ＣＢＬ－Ｂ遺伝子、又はＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）遺伝子内にある。特定の実施形態では、ＴＣＲα遺伝子標的部位は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＢＬ－Ｂ遺伝子標的部位は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＰＤ－１遺伝子標的部位は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。
本開示全体を通して企図されるように、融合ポリペプチド及び関連する方法は、選択されたｄｓＤＮＡ標的部位の細胞において、方向バイアスされた欠失を生成する。様々な実施形態では、欠失中心位置は、ＨＥ標的部位の中心位置に対して、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位と同じ側にある。特定の実施形態では、欠失中心位置は、ＨＥ標的部位の中心位置に対して５’にある。
様々な実施形態では、方向バイアスされた欠失の５０％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の５１％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の５２％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の５３％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の５４％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の５５％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の５６％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の５７％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の５８％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の５９％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の６０％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の６５％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の７０％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の７５％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失の８０％超は、ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する。
様々な実施形態では、欠失の少なくとも５０％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５１％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５２％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５３％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５４％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５５％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５６％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５７％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５８％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５９％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも６０％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも６５％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも７０％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも７５％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも８０％は、ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。
様々な実施形態では、欠失の少なくとも１０％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも１１％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも１２％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも１３％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも１４％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも１５％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも１６％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも１７％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも１８％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも１９％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも２０％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも２５％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも３０％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも３５％は、ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する。
様々な実施形態では、欠失の少なくとも５０％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５１％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５２％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５３％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５４％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５５％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５６％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５７％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５８％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５９％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも６０％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも６５％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも７０％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも７５％は、６ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも８０％は、６ｂｐ以上の長さである。
様々な実施形態では、欠失の少なくとも３０％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも３１％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも３２％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも３３％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも３４％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも３５％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも３６％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも３７％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも３８％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも３９％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも４０％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも４５％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５０％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも５５％は、１２ｂｐ以上の長さである。いくつかの実施形態では、欠失の少なくとも６０％は、１２ｂｐ以上の長さである。
様々な実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約１０ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約１１ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約１２ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約１３ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約１４ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約１５ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約１６ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約１７ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約１８ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約１９ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、方向バイアスされた欠失は、約２０ヌクレオチドの長さを含む。
様々な実施形態では、欠失は、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位内に延在する。様々な実施形態では、欠失の中心位置は、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位内にある。
様々な実施形態では、方法は、融合ポリペプチドに加えて、又は、末端プロセシング酵素若しくはその生物学的に活性な断片、又は末端プロセシング酵素（例えば、エクソヌクレアーゼ）をコードするポリヌクレオチド、ＲＮＡ、若しくはベクターを細胞内に導入することを更に含む。いくつかの実施形態では、末端プロセシング酵素、又はその生物学的に活性な断片は、Ｔｒｅｘ２、Ｔｒｅｘ１、膜貫通型ドメインを含まないＴｒｅｘ１、Ａｐｏｌｌｏ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ２、ＥｘｏＩ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＩＩＩ、ＥｘｏＸ、Ｆｅｎ１、Ｆａｎ１、ＭｒｅＩＩ、Ｒａｄ２、Ｒａｄ９、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ＰＮＫＰ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ、ラムダエクソヌクレアーゼ、Ｓｏｘ、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼ、エクソヌクレアーゼＩ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、エクソヌクレアーゼＶＩＩ、ＮＤＫ１、ＮＤＫ５、ＮＤＫ７、ＮＤＫ８、ＷＲＮ、Ｔ７－エクソヌクレアーゼ遺伝子６、トリ骨髄芽球症ウイルス組み込みタンパク質（ＩＮ）、Ｂｌｏｏｍ、南極ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＡｐｅＩ、緑豆ヌクレアーゼ、Ｈｅｘ１、ＴＴＲＡＰ（ＴＤＰ２）、Ｓｇｓ１、Ｓａｅ２、ＣＵＰ、Ｐｏｌミュー、Ｐｏｌラムダ、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＥＭＥ２、ＳＬＸ１、ＳＬＸ４、及びＵＬ－１２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、末端プロセシング酵素は、エクソヌクレアーゼである。特定の実施形態では、エクソヌクレアーゼは、Ｔｒｅｘ２、又はその生物学的に活性な断片である。
特定の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的部位を選択することと、細胞内に融合ポリペプチド、又は本明細書に企図される融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ、若しくはベクターを導入することとを含む、細胞内の部位特異的変異導入の方法が提供され、融合ペプチドは、細胞内で選択されたｄｓＤＮＡ標的切断部位の近くに欠失中心を有する、方向バイアスされた欠失を生成する。
特定の実施形態では、方法は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的部位を選択することと、細胞において選択された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的部位に結合して切断するＤＮＡ結合ドメイン及びホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアント、リンカードメイン、及びＥｘｏＩ、又はその生物学的に活性な断片を含む融合ポリペプチドを細胞内に導入することと、エクソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）を導入することとを含み、方法は、細胞における選択されたｄｓＤＮＡ標的切断部位の近くに欠失中心を有する、方向バイアスされた欠失を生成する。
様々な実施形態では、方法は、インビトロ法である。様々な実施形態では、方法は、エクスビボ法である。様々な実施形態では、方法は、インビボ法である。
Ｋ．治療方法
本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、疾患若しくは障害の予防、治療、及び改善、又はそれに関連する疾患状態若しくは症状の改善に使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、疾患（例えば、がん、虚血、糖尿病網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、乾癬、ＨＩＶ感染、鎌状赤血球症、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、神経変性疾患、血管疾患、嚢胞性線維症、脳卒中、高ＩＧＥ症候群、血友病）を治療、予防、若しくは阻害する方法、又はがん、虚血、糖尿病網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、乾癬、ＨＩＶ感染、鎌状赤血球症、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、神経変性疾患、血管疾患、嚢胞性線維症、脳卒中、高ＩＧＥ症候群、血友病などの疾患に関連する、疾患状態若しくは症状を改善する方法において使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、軟骨無形成症、偽性軟骨無形成症、多発性骨端異形成症、軟骨異形成症、骨形成不全症、マルファン症候群、多指症、遺伝性運動感覚ニューロパチーＩ及びＩＩ（シャルコー・マリー・トゥース病）、筋強直性ジストロフィー、並びに神経線維腫症などの常染色体優性疾患を治療、予防、若しくは阻害するか、又は軟骨無形成症、偽性軟骨無形成症、多発性骨端異形成症、軟骨異形成症、骨形成不全症、マルファン症候群、多指症、遺伝性運動感覚ニューロパチーＩ及びＩＩ（シャルコー・マリー・トゥース病）、筋強直性ジストロフィー、並びに神経線維腫症などの常染色体優性疾患に関連する、疾患状態若しくは症状を改善するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、遺伝子の誤った制御によって引き起こされる疾患を治療、予防、又は阻害するのに有用である。
好ましい実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、免疫障害又はがんに関連する少なくとも１つの症状を予防、治療、及び／又は改善するために使用され得る。
「免疫障害」は、免疫系からの反応を引き起こす疾患を指す。特定の実施形態では、用語「免疫障害」は、がん、移植片対宿主病、自己免疫疾患、又は免疫不全を指す。一実施形態では、免疫障害は、感染性疾患を包含する。
本明細書で使用される場合、用語「がん」は概して、異常な細胞が制御されずに***し、近傍組織へと浸潤し得る、ある種の疾患又は状態に関連する。
本明細書で使用される場合、用語「悪性」は、腫瘍細胞群が制御不能な増殖（すなわち、正常限界を超える***）、浸潤（すなわち、隣接組織への侵入と破壊）、及び転移（すなわち、リンパ又は血液を介して身体の他の場所へ拡散）のうちの１つ以上を呈するがんを指す。
本明細書で使用される場合、用語「転移する」は、身体の一部分から、別の部分へとがんが拡散することを指す。拡散された細胞により形成された腫瘍は、「転移腫瘍」又は「転移がん」と称される。転移腫瘍は、元の腫瘍（原発腫瘍）の細胞と似た細胞を含む。
本明細書で使用される場合、用語「良性」又は「非悪性」は、大きく成長し得るが、身体の他の部分に拡散しない腫瘍を指す。良性腫瘍は自己限定的であり、多くの場合、浸潤しないか、又は転移しない。
「がん細胞」又は「腫瘍細胞」とは、がん性増殖又はがん性組織の個々の細胞を指す。「腫瘍」は概して、細胞の異常な増殖による膨張、又は細胞の異常な増殖により形成された病変を指し、良性、前がん性、又は悪性であり得る。ほとんどのがんは腫瘍を形成するが、いくつかは必ずしも腫瘍を形成するわけではない。腫瘍を形成するがんについて、がん（細胞）という用語、及び腫瘍（細胞）という用語は相互交換可能に使用される。個体中の腫瘍の量は、「腫瘍負荷」であり、腫瘍の数、体積、又は重量として測定することができる。
「移植片対宿主病」又は「ＧＶＨＤ」は、細胞、組織、又は固形臓器移植後に起こり得る合併症を指す。ＧＶＨＤは、移植されたドナー細胞が移植レシピエントの身体を攻撃する幹細胞又は骨髄移植後に起こり得る。ヒトにおける急性ＧＶＨＤは、移植後約６０日以内に発生し、細胞溶解性リンパ球の作用によって皮膚、肝臓、及び腸に損傷をもたらす。慢性ＧＶＨＤは後に起こり、主に皮膚に影響を及ぼす全身性自己免疫疾患であり、結果としてＢ細胞のポリクローナル活性化並びにＩｇ及び自己抗体の過剰産生がもたらされる。固形臓器移植移植片対宿主病（ＳＯＴ－ＧＶＨＤ）は、２つの形態で起こる。より一般的なタイプは、抗体媒介型であり、血液型Ｏを有するドナーからの抗体は、血液型Ａ、Ｂ、又はＡＢを有するレシピエントにおいてレシピエントの赤血球を攻撃し、軽度の一過性の溶血性貧血をもたらす。ＳＯＴ－ＧＶＨＤの第２の形態は、高い死亡率に関連する細胞型であり、ドナー由来Ｔ細胞は、免疫学的に異種の宿主組織に対して、最も頻繁には皮膚、肝臓、消化管、及び骨髄において免疫学的攻撃を産生し、これらの臓器における合併症をもたらす。
「移植片対白血病」又は「ＧＶＬ」は、骨髄又は末梢血などのドナーの移植された組織中に存在する免疫細胞による、人の白血病細胞に対する免疫反応を指す。
「自己免疫疾患」は、身体が、自身の組織の構成物質の一部に対し、免疫原性（すなわち、免疫系）反応を生じさせる疾患を指す。換言すると、免疫系は、身体内の組織又はシステムの一部を「自己」として認識する能力を失い、それが外来性であるかのように攻撃する。自己免疫疾患の例示的な例には、関節炎、炎症性腸疾患、橋本甲状腺炎、バセドウ病、ループス、多発性硬化症、関節リウマチ、溶血性貧血、自己免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などが挙げられるが、これらに限定されない。
「免疫不全」とは、疾患又は化学物質投与によって免疫系が機能障害となった患者の状態を意味する。この状態により、外来性物質に対する防御に必要とされる血液細胞の数とタイプにおいて免疫系が不完全な状態となる。免疫不全状態又は疾患は、当該技術分野で既知であり、例えば、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）、選択的ＩｇＡ欠損症、分類不能型免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫症、高ＩｇＭ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、及び糖尿病が挙げられる。
「感染性疾患」とは、ヒトからヒトへと伝達され得る、又は生物から生物へと伝達され得る疾患を指し、微生物又はウイルスにより発生する（例えば、一般的な風邪）。感染性疾患は、当該技術分野で既知であり、例えば、肝炎、性感染症（例えば、クラミジア、淋病）、結核、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、及びインフルエンザが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「個体」及び「対象」は、しばしば交換可能に使用され、本明細書の別の箇所に企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法で治療され得る免疫障害の症状を呈する任意の動物を指す。好適な対象（例えば、患者）としては、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、又はモルモットなど）、家畜動物（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、及び家畜動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、又はペット（ネコ又はイヌなど）が挙げられる。非ヒト霊長類、及び好ましくはヒト対象も含まれる。典型的な対象には、免疫障害を有するか、免疫障害と診断されたか、又は免疫障害を有するリスクがあるヒト患者が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「患者」は、本明細書の別の箇所に企図される融合ポリペプチド、遺伝編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法で治療され得る免疫障害と診断された対象を指す。
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」には、疾患の症状若しくは病理、又は病理学的状態に対する何らかの有益な効果又は望ましい効果が含まれ、治療されている疾患又は状態、例えば、がん、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び免疫不全の１つ以上の測定可能なマーカーの最小の低減さえも含まれ得る。治療は、任意選択で、疾患又は状態の進行の遅延を含み得る。「治療」は必ずしも、疾患若しくは状態、又はその関連症状の完全な排除又は治癒を示すものではない。
本明細書で使用される場合、「予防する」、及び「予防」、「予防される」、「予防すること」などの類似の文言は、疾患若しくは状態、例えば、がん、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び免疫不全の予防、阻害、又は発生若しくは再発の可能性の低減のためのアプローチを示す。更に、疾患若しくは状態の発生又は再発の遅延、又は疾患若しくは状態の症状の発生又は再発の遅延も指す。本明細書で使用される場合、「予防」及びその類似文言も、疾患若しくは症状の発生又は再発の前の、疾患若しくは状態の強度、作用、症状、及び／又は負荷量の低下を含む。
本明細書で使用される場合、語句「～の少なくとも１つの症状の改善」対象が治療されている疾患若しくは状態、例えば、がん、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び免疫不全の１つ以上の症状の減少を指す。特定の実施形態では、治療される疾患又は状態は、がんであり、この場合において改善される１つ以上の症状としては限定されないが、脱力、疲労、息切れ、あざができやすい、及び出血しやすい、頻発する感染、リンパ節の拡張、腹部膨張又は腹部疼痛（膨張した腹部臓器が原因）、骨又は関節の疼痛、骨折、予期せぬ体重減少、食欲低下、寝汗、持続性の微熱、及び排尿減少（腎機能の障害が原因）が挙げられる。
一実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、がんを治療する方法で使用される。特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、固体腫瘍又はがんを治療する方法で使用される。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、副腎がん、副腎皮質がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫様腫瘍／非定型横紋筋様腫瘍、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、乳がん、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸がん、胆管がん、軟骨肉腫、脊索腫、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管がん（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、上位腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼がん、卵管がん、線維性組織肉腫、線維肉腫、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、グリア芽腫、頭頚部がん、血管芽細胞腫、肝細胞がん、下咽頭がん、眼内黒色腫、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、平滑筋肉腫、舌がん、脂肪肉腫、肝がん、肺がん、非小細胞肺がん、胚カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様がん、髄芽腫、髄膜腫、黒色腫、メルケル細胞がん、正中線がん、口腔がん（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、鼻腔及び副鼻腔のがん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口腔がん（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ、ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、膵島細胞腫瘍、乳頭がん、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性胸膜腫、前立腺がん、直腸がん、網膜芽腫、腎細胞がん、腎盂及び尿管のがん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮脂腺がん、皮膚がん、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、小腸がん、胃がん、汗腺がん、滑液腫瘍、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、血管がん、外陰がん、及びウィルムス腫瘍を含むがこれらに限定されない、固体腫瘍又はがんの治療に使用される。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、限定されるものではないが、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、骨がん、甲状腺がん、腎臓がん、又は皮膚がんを含む固体腫瘍又はがんの治療に使用される。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、膵臓、膀胱、及び肺を含むがこれらに限定されない、様々ながんの治療に使用される。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、液体がん又は血液がんの治療に使用される。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫を含むがこれらに限定されない、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に使用される。
特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞性白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）及び真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、並びに髄外性形質細胞腫を含むがこれらに限定されない、液体がんの治療に使用される。
特定の実施形態では、方法は、治療有効量の融合ポリペプチド、組成物、及び／又は遺伝子編集された細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で企図される融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、組成物、及び／又は関連する遺伝子編集の方法は、がんを発症するリスクがある患者の治療に使用される。したがって、特定の実施形態は、がんの少なくとも１つの症状の治療又は予防又は改善を含み、それを必要とする患者に、本明細書で企図される治療有効量の融合ポリペプチド、遺伝子編集された細胞、及び／又は組成物を投与することを含む。
特定の実施形態では、疾患又はそれに関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、又は改善する方法が提供され、方法は、対象から細胞集団を採取することと、本明細書に提供される遺伝子編集／変異導入の方法に従って細胞集団を編集することと、編集された細胞集団を、それを必要とする対象（例えば、がんを有する対象）に投与することとを含む。
投与の量並びに頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプ及び重大度といった因子により決定されるが、適切な投与量は、臨床試験により決定されてもよい。
一実施形態では、対象に投与される組成物中の遺伝子編集された細胞の量は、少なくとも０．１×１０５細胞、少なくとも０．５×１０５細胞、少なくとも１×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも０．５×１０７細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも０．５×１０８細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも０．５×１０９細胞、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも３×１０９細胞、少なくとも４×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞、又は少なくとも１×１０１０細胞である。
特定の実施形態では、約１×１０７細胞～約１×１０９細胞、約２×１０７細胞～約０．９×１０９細胞、約３×１０７細胞～約０．８×１０９細胞、約４×１０７細胞～約０．７×１０９細胞、約５×１０７細胞～約０．６×１０９細胞、又は約５×１０７細胞～約０．５×１０９細胞が対象に投与される。
一実施形態では、対象に投与される組成物中の遺伝子編集された細胞の量は、少なくとも０．１×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０７細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０７細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０８細胞／ｋｇ体重、又は少なくとも１×１０９細胞／ｋｇ体重である。
特定の実施形態では、約１×１０６細胞／ｋｇ体重～約１×１０８細胞／ｋｇ体重、約２×１０６細胞／ｋｇ体重～約０．９×１０８細胞／ｋｇ体重、約３×１０６細胞／ｋｇ体重～約０．８×１０８細胞／ｋｇ体重、約４×１０６細胞／ｋｇ体重～約０．７×１０８細胞／ｋｇ体重、約５×１０６細胞／ｋｇ体重～約０．６×１０８細胞／ｋｇ体重、又は約５×１０６細胞／ｋｇ体重～約０．５×１０８細胞／ｋｇ体重が対象に投与される。
当業者であれば、所望の治療効果を発揮させるために、特定の実施形態で企図される組成物の複数回の投与が必要とされる場合があることを認識するであろう。例えば、組成物は、１週、２週、３週、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年、２年、５年、１０年、又はそれ以上の期間にわたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回以上投与される場合がある。
特定の実施形態で企図される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植、又は移植を含む、任意の都合の良い方法で実施され得る。好ましい実施形態では、組成物は、鼻に、経口的に、経腸的に、又は非経口的に投与される。本明細書で使用される場合、語句「非経口投与」及び「非経口的に投与」は、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を指し、通常は注射によって、限定するものではないが、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内の、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。一実施形態では、本明細書で企図される組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染部位への直接注射によって対象に投与される。
一実施形態では、対象のがんに対する細胞性免疫反応を増加させる有効量の組成物がそれを必要とする対象に投与される。免疫応答は、感染細胞を殺傷することができる細胞傷害性Ｔ細胞、制御Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞応答によって媒介される細胞免疫応答を含んでもよい。主にＢ細胞を活性化することができるヘルパーＴ細胞によって媒介され、したがって抗体産生をもたらす液性免疫応答も誘発され得る。様々な技術を使用して、組成物によって誘導される免疫応答のタイプを分析してもよく、それら技術は当該技術分野において、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．において十分に記載されている。
本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、及び登録された特許は、あたかも個々の刊行物、特許出願、又は登録された特許が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示したかのように、参照により本明細書中に組み込まれる。
前述の実施形態は、明確性及び理解を目的として、図及び実施例により詳細に記載されているが、本明細書で企図される教示に照らし、特定の変化及び修飾が、添付の請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく実施され得ることが当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、説明の目的のみで提供され、限定の目的で提供されるものではない。当業者であれば、本質的に類似した結果をもたらすために変更又は修正され得る様々な非臨界パラメータを容易に認識するであろう。
実施例１
ｍｅｇａＴＡＬによって誘導されるインデル長さ及び分布の再現性
ＴＲＡＣ遺伝子座（配列番号１）での遺伝子編集を、モデルシステムとして使用して、ｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼによって生成されたインデルイベントの特性を評価した。低／中程度の効率のｍｅｇａＴＡＬ（例えば、配列番号５～７）をこれらの研究に使用して、編集速度を変えると仮定された任意の下流の操作に対するダイナミックレンジを提供した。いくつかの独立した実験を、別個のＰＢＭＣドナーから活性化され拡張された初代ヒトＴ細胞を使用して行った。３～４日間の期間のＰＢＭＣの解凍、活性化、及び培養後、ＴＲＡＣ遺伝子座（ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ）のエクソン１を標的とするｍｅｇａＴＡＬをコードする、インビトロ転写され、キャッピングされ、ポリ－アデニル化されたｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。得られた細胞を、送達されたｍＲＮＡの希釈及び分解、並びに編集プロセスの完了を可能にするために、７～１０日間の追加の成長期間にわたって培養した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＴＲＡＣ遺伝子座を増幅し、ＰＣＲアンプリコンのその後の深層シーケンシングにより、ｍｅｇａＴＡＬによって引き起こされるバルク編集イベントの特徴付けを可能にした。編集イベントのサイズを集計する頻度ヒストグラムを図１Ｂに示す。最も頻繁に観察されたインデル長は、２塩基対長（累積でイベントの全集団の約４０～４５％を表す）であり、一方、１塩基対の欠失（約２０％）並びに３、８、及び９塩基対の欠失（それぞれ５～１０％）も高頻度で観察された。これらのインデルサイズ集団の相対頻度は、技術的複製及び独立した実験にわたって高度に再現性があり、ｍｅｇａＴＡＬ遺伝子編集中のインデル長さ分布の一貫性が示されている。
図１Ｂに示示されるヒストグラムの各バーは、ｍｅｇａＴＡＬ標的部位に対して同じインデル長さであるが、異なる位置である可能性がある、編集された対立遺伝子の集団を表す。図２は、ｍｅｇａＴＡＬ標的部位ブレイクポイント中心に対するその位置の位置に従ってプロットされた、各固有の編集された種を示す。これらの「フィンガープリント」は、その長さ（ｙ軸）、位置（ｘ軸）、及び頻度（円サイズ）に従って、各編集された種をプロットし、それによって、各編集された種の定量的及び定性的特性の両方を捕捉する。欠失の位置を、２２塩基対のホーミングエンドヌクレアーゼ標的部位の中心へのその中間点５’（陰性）又は３’（陽性）の位置として計算した。このようにして、ブレイクポイント中心に対する欠失種の分布を、頻度及び位置の両方の変化についてモニタリングすることができた。別個のＰＢＭＣドナーを使用する、並びに低い（例えば、配列番号５～７）又は高い（配列番号８～１０）編集効率のいずれかでＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ構築物を使用する独立した実験は、個々の欠失種、すなわち、特定の組成物の各反復欠失イベントが、再現性のある頻度で起こることを示す。したがって、全体的なｍｅｇａＴＡＬ欠失種集団は、エンドヌクレアーゼ反応の酵素速度と非常に一貫性があり、かつそれとは無関係である相対的な定性的及び定量的特性を有する。
実施例２
Ｔｒｅｘ２は、ｍｅｇａＴＡＬ編集対立遺伝子を定性的に変化させる
３プライム修復エクソヌクレアーゼ－２（Ｔｒｅｘ２）と遺伝子編集ヌクレアーゼの同時送達は、特に３’オーバーハングエンドヌクレアーゼ反応産物によるｍｅｇａＴＡＬで、遺伝子編集効率を増強することが示されている。しかしながら、Ｔｒｅｘ２の同時送達が編集アウトカムに及ぼす定性的影響は、完全には評価されていない。したがって、２つの異なる同時送達モードのインデル特性の評価を実施した；Ｔｒｅｘ２のｍｅｇａＴＡＬのＣ末端への直接融合；並びに独立したポリペプチドとしてＴｒｅｘ２とｍｅｇａＴＡＬとの共発現。
活性化された初代ヒトＴ細胞試料を、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬをコードする、インビトロで転写され、キャッピングされ、ポリ－アデニル化されたｍＲＮＡ（図３Ａ）、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合をコードするｍＲＮＡ（図３Ｂ）、又はＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬをコードするものとＴｒｅｘ２をコードするものの２つの別個のｍＲＮＡ（図３Ｃ）でエレクトロポレーションした。得られた細胞を、送達されたｍＲＮＡの希釈及び分解、並びに編集プロセスの完了を可能にするために、７～１０日間の追加の成長期間にわたって培養した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＴＲＡＣ遺伝子座を増幅し、ＰＣＲアンプリコンのその後の深層シーケンシングにより、ｍｅｇａＴＡＬによって引き起こされるバルク編集イベントの特徴付けを可能にした。編集イベントのサイズを集計する頻度ヒストグラムを図３Ａ～３Ｃに示す。Ｔｒｅｘ２エクソヌクレアーゼをＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ（例えば、配列番号１１～１３）に直接融合させることにより、欠失長さ分布の変化がもたらされ、インデル種のかなりの割合を含む最大１２塩基対の長さの欠失が生じた。ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ及びＴｒｅｘ２エクソヌクレアーゼ（例えば、配列番号１４～１６）の独立した共発現は、一本鎖３’オーバーハングを優先して分配型エクソヌクレアーゼ活性のモデルと一致する、１～４塩基対の長さの欠失に対するインデル種の狭窄をもたらした。各Ｔｒｅｘ２送達シナリオでは、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ単独の送達と比較して、全体的な編集速度及び欠失対挿入の比率が増加した。
図４は、図３Ａ～３Ｃの各試料の欠失フィンガープリントのプロットを示し、各編集された種の定量的特性及び定性的特性の両方を捕捉する。図２にあるように、欠失の位置を、２２塩基対のホーミングエンドヌクレアーゼ標的部位の中心へのその中間点５’（陰性）又は３’（陽性）の位置として計算した。ブレイクポイント中心に対する欠失種の分布は、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合、及びＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ＋Ｔｒｅｘ２共送達編集アウトカムの間の顕著な差異を示した（表３～５を参照されたい）。ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合では、その位置が５’方向に大きく傾斜した欠失種の出現が観察された。このパターンは、ＤＮＡブレイクポイント末端で、ＴＡＬＥアレイとともにシスで、又はＴＡＬＥアレイとブレイクポイントの同じ側に留まっている優先的なエクソヌクレアーゼ活性があることを示唆している。
更に、ＴＡＬＥアレイ結合部位の３’エッジに対応する欠失長さ及び位置の大幅な低下を観察した。それにもかかわらず、驚くべきことに、ＴＡＬＥ結合部位に拡張した欠失長さを観察した。これは更に、エクソヌクレアーゼ活性と、その結合部位におけるＴＡＬＥの存在との間には、相互に排他的な関係があることを示唆し、そのエクソヌクレアーゼ機能を実施するためにＴｒｅｘ２を位置付けるＴＡＬＥアレイの役割を更に強固にする。しかしながら、欠失中心は、ＴＡＬＥ結合部位の外側に留まった。逆に、別個のポリペプチドとしてのＴｒｅｘ２の共発現は、ＤＮＡブレイクポイントを中心とした１～４ｂｐの範囲のサイズの欠失集団に向かって種組成物を変化させたにもかかわらず、いかなる実質的な方向の歪みを引き起こさなかった。
Figure 2024503249000004
Figure 2024503249000005
Figure 2024503249000006
実施例３
Ｔｒｅｘ２ホモログ編集対立遺伝子の評価
ＤＮＡ修復機構との潜在的交絡相互作用に対し、Ｔｒｅｘ２の酵素活性が、編集アウトカムにおける観察された変化に直接関与していたことを確認するために、いくつかのＴｒｅｘ２ホモログＯＲＦを、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ（例えば、配列番号１７～３４）に融合させた。活性化された初代ヒトＴ細胞試料を、これらの融合タンパク質をコードするインビトロ転写され、キャッピングされ、ポリアデニル化されたｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、次いで、ＴＣＲ複合体の発現のフローサイトメトリー分析によって、及びインデル特性を特徴付けることによって、標的部位編集をモニタリングした。
図５は、Ｔｒｅｘ２ホモログ融合タンパク質の多くが、ヒトＴｒｅｘ２ ＯＲＦと同様の程度に全体的な編集を増強したことを示す。細胞表面上のＴＣＲアルファ及びベータ鎖と組み合わさるＣＤ３成分に対するフローサイトメトリー染色を使用して、編集効率を評価した。したがって、ＣＤ３染色を失った細胞の頻度は、ＴＣＲα遺伝子座での編集速度と相関する。図６に示されるように、インデル種の分布の分析は、更に、カモノハシ、オポッサム、アルマジロ、及びマウスＴｒｅｘ２タンパク質が、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬに融合したときに、ヒトＴｒｅｘ２ ＯＲＦによって引き起こされる特性と一致する特性で、編集アウトカムを引き起こすことを確認する。注目すべきことに、ヒツジＴｒｅｘ２は、１～４ｂｐの欠失、及び驚くべきことに、１ｂｐの挿入の高頻度について濃縮された固有のインデルスペクトルを引き起こした。
図７に示されるフィンガープリントのプロットに示されるように、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２ホモログ融合タンパク質の欠失特性は、ヒトＴｒｅｘ２タンパク質について観察されたものを反映している。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、このデータは、Ｔｒｅｘ２エクソヌクレアーゼ活性が、観察された欠失特性の主要な決定因子であることを示唆している。したがって、伸長した欠失長さのアウトカムは、他のＤＮＡ修復機構との相互作用とは無関係である可能性が高い。ヒツジＴｒｅｘ２ホモログについて観察された挿入の増加した発生は、このバリアントが、潜在的に、残留鋳型非依存性ポリメラーゼ活性などの固有の酵素機構を有し得ることを示す。最後に、欠失サイズ及び位置における非常に一貫性があり、かつ明確な境界線は、塩基の方向除去が、その結合部位とのＴＡＬＥアレイの相互作用の会合及び解離の動態並びに／又は立体特性によって制限され得ることを更に示唆する。
実施例４
ｍｅｇａＴＡＬ編集に固有の影響を与えるエクソヌクレアーゼの特定
別個の基質特異性及び／又は処理特性を有する他のエクソヌクレアーゼが、遺伝子編集アウトカムを固有に改変することができるかどうかを判定するために、選択したエクソヌクレアーゼ又はエクソヌクレアーゼドメインＯＲＦを、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ（例えば、配列番号３５～５５）に融合させ、それらの遺伝子編集アウトカムへの影響を調べた。独立して動作するＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ融合タンパク質としての、並びにＴｒｅｘ２との共発現中の編集速度を調べた。両方のシナリオにおける試験の論理的根拠は、（ｉ）Ｔｒｅｘ２活性が、試験エクソヌクレアーゼに対して異なる、かつ潜在的に優先的な基質を産生することを可能にすること、及び（ｉｉ）試験エクソヌクレアーゼによって有意に処理されている末端のプロキシとしてのＴｒｅｘ２媒介性編集速度増強における損失を探すことの２通りであった。図８は、エクソヌクレアーゼスクリーニングの結果を示しており、各試料は、２つ組で実行され、Ｔｒｅｘ２共発現の不在下（左）又は存在下（右）で試験された。
試験されたエクソヌクレアーゼのうち、ほとんどが、Ｔｒｅｘ２による編集速度又は編集速度増強を明らかに変化させなかった（ｍｅｇａＴＡＬエクソヌクレアーゼ融合単独の送達に対するＴｒｅｘ２試料中のＣＤ３陰性細胞の比率として測定される）。いくつかは、全体的な編集を著しく低減し、それらがタンパク質の安定性及び／又は発現に著しく影響を与えた可能性があることを示す。ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬのＥｘｏＩへの融合は、Ｔｒｅｘ２増強比の控えめな増加をもたらし、これら２つのエクソヌクレアーゼが、おそらく相乗効果によりＤＮＡ切断処理イベントを修飾していたこと示唆する。特に、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬのＥｘｏＸへの融合により、Ｔｒｅｘ２増強の完全な損失がもたらされた。
実施例５
ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＩ及びｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ編集プロファイルの評価
図８に記載される遺伝子編集イベントの定性的側面を更に理解するために、アンプリコンシーケンシング及び欠失フィンガープリント分析を、以前に記載されるように行った。ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ編集速度のパターンに影響を与えなかったこれらのエクソヌクレアーゼも、フィンガープリントの変化を示さなかった（データには示さず）。しかしながら、図９は、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬのＥｘｏＩへの融合が、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ単独と比較して欠失プロファイルを変化させなかったが、Ｔｒｅｘ２が共発現されたとき、一連の長い、方向バイアスされた欠失イベントが出現したことを示す。
ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＩ融合は、ＴＡＬＥアレイの方向がバイアスされた欠失イベントを生成する。境界明瞭なｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合欠失イベントとは対照的に、ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＩ欠失イベントは、より長いものであり、したがって、ＴＡＬＥアレイ結合部位を超えて伸長するように見えた。
ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬのＥｘｏＸへの融合により、ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＩ融合で観察されたものとは異なる欠失プロファイルがもたらされた。Ｔｒｅｘ２の不在下で、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合は、高い効率で、長い、方向バイアスされた欠失を生成する。ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合タンパク質とは異なり、観察された欠失中心は、それらが相当な頻度でＴＡＬＥアレイ結合部位を超えて進行するように、より大きいものであった。ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合は、ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合タンパク質と比較して、切断部位から更に離れて欠失中心を有するより長い欠失をもたらす、固有のエクソヌクレアーゼ機構を有することが可能である。
図９では、Ｔｒｅｘ２がＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合と共発現すると、編集イベントはほぼ検出不能なほど稀となり、ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合で明らかであった長い、方向バイアスされた欠失が枯渇した。
実施例６
ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合タンパク質編集プロファイルの更なる評価
ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合が評価されたときに出現した欠失の観察されたパターンを考慮して、異なる遺伝子座位を標的とするいくつかの追加のｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合タンパク質を試験した。活性化された初代ヒトＴ細胞試料を、高活性ＣＢＬ－Ｂ標的化ｍｅｇａＴＡＬ、高活性ＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合、又は高活性ＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合（例えば、配列番号５６～６４）のいずれかをコードする、インビトロ転写され、キャッピングされ、ポリアデニル化されたｍＲＮＡでエレクトロポレーションした。得られた細胞を、送達されたｍＲＮＡの希釈及び分解、並びに編集プロセスの完了を可能にするために、７～１０日間の追加の成長期間にわたって培養した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＣＢＬ－Ｂ遺伝子座を増幅し、ＰＣＲアンプリコンのその後の深層シーケンシングにより、ＣＢＬ－Ｂ標的部位（配列番号３）の近位の編集速度及びインデル特性の特徴付けを可能にした。図１０は、これら３つの高活性ＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬフォーマットの各々について観察された欠失フィンガープリントを示す（表６～８も参照されたい）。高活性ＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬと類似した欠失種の分布を生成し、最も頻繁なイベントは１～５ｂｐの欠失であり、有意な方向性バイアスはない。同様に、高活性ＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合は、欠失種を長くし、それらを５’方向に大きく歪め、直交ｍｅｇａＴＡＬが、ＴＡＬＥアレイとともにシスで、又はＴＡＬＥアレイとブレイクポイントの同じ側に留まっているＤＮＡブレイクポイント末端で発生する優先的なエクソヌクレアーゼ活性を標的とすることを確認する。また、高活性ＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合における再発は、ＴＡＬＥアレイ結合部位の３’エッジに対応する欠失長さ及び位置の大幅な低下であった。
Figure 2024503249000007
Figure 2024503249000008
Figure 2024503249000009
図１１は、類似の一連のＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬ、ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２、及びｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合タンパク質で処理されたＴ細胞からの代表的な欠失フィンガープリントを示すが、しかしながら、これらは数倍低い活性ｍｅｇａＴＡＬ（例えば、配列番号６５～７３）を用いる。表９～１１も参照されたい。これらの低活性ＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬ及びｍｅｇａＴＡＬ融合タンパク質と、図１０に示されるそれらの高活性の対応するものとの間で比較すると、観察された欠失種のスペクトルには実質的な類似性がある。これは、これら２つのエクソヌクレアーゼがｍｅｇａＴＡＬに融合されたときに観察される固有の欠失アウトカムが、エンドヌクレアーゼ反応の酵素速度とは無関係であることを示す。これらの結果は、エンドヌクレアーゼ生成ブレイク当たりの高い効率のエクソヌクレアーゼ処理速度の両方を示しており、Ｔｒｅｘ２及びＥｘｏＸが、質的に異なる機序を介して遺伝子編集アウトカムに明確に影響を与えており、単に異なる効率で同一の機序が起こっているわけではないことを、更に示している。
Figure 2024503249000010
Figure 2024503249000011
Figure 2024503249000012
ＰＤ－１遺伝子座を標的とする第３の一連の酵素を構築した。図１２は、ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ、ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合、又はＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合（例えば、配列番号７４～８２）のいずれかをコードする、Ｔ細胞エレクトロポレーションｍＲＮＡからの代表的な欠失フィンガープリントを示す。表１２～１４も参照されたい。ＴＣＲα及びＣＢＬ－Ｂ ｍｅｇａＴＡＬ並びにエクソヌクレアーゼ融合タンパク質について記載されるように、３つのＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ試料の各々について観察された欠失種は、独立して動作するＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬにおいて、非方向性の小さな欠失種を有するという一貫した傾向に従い、標的がＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合タンパク質に曝露され、より長かったときに出現した５’方向のより長い種は依然として、ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸの処理から生じた種であった。試験したいくつかのｍｅｇａＴＡＬにわたるこれらの観察されたパターンの持続性は、異なるエクソヌクレアーゼドメインへのｍｅｇａＴＡＬ融合で発生する、異なる編集アウトカムのロバスト性を示す。
Figure 2024503249000013
Figure 2024503249000014
Figure 2024503249000015
実施例７
ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合タンパク質編集プロファイルの評価
図１３は、ＰＤＣＤ１遺伝子のＡＴＧ開始コドンの近位にあるＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ標的部位を示す。２２ｂｐのＰＤ－１ ＨＥ標的部位（配列番号２）は、血漿膜上での発現のためにＰＤ－１を標的とするシグナル配列の一部であるイソロイシン残基をコードする第３のコドンにほぼ中心を置いている。ＴＡＬＥアレイ結合部位（配列番号４）は、ＡＴＧ開始コドンの５’にある。この標的部位の配向は、異なるｍｅｇａＴＡＬ又はｍｅｇａＴＡＬ－エクソヌクレアーゼ融合組成物が、それらの欠失種のそれぞれの分布に応じてＰＤ－１の発現に差次的に影響を与える可能性を増大させる。
欠失種のカテゴリーを、ＰＤ－１ ＯＲＦ対するそれらの影響に従って割り当てた：ＡＴＧ欠失；インフレーム；フレーム２；又はフレーム３。各々の欠失タイプの例を図１３に示す。図１２に記載されるＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ及びｍｅｇａＴＡＬ－エクソヌクレアーゼ融合タンパク質試料については、各欠失種のフレーム特性を生物情報学的に分析した。図１４は、遺伝子編集種のフレームカテゴリーを欠失フィンガープリントプロット上にオーバーレイすることによる、この分析の結果を示す。ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬは、広範な欠失種のスペクトルを作成するため、フレーム特性は、欠失フィンガープリント分析にわたって多少均一に分布し、ＡＴＧ欠失種は、長い欠失が表されるプロットの上部のレベルを占める。逆に、ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合タンパク質は、インフレーム、フレーム２、及びフレーム３の種の位置のシフトを引き起こす。種の各カテゴリーの正規化された割合を比較すると、図１５に示されるように、ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ及びＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合は著しくは異なっていない。これは、ＡＴＧ開始コドンを通って到達する長い方向性欠失の発生が、増加しながら、ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬで生じる少数の長い（しかし、非方向性）欠失を効果的に置き換えたためである。
逆に、ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合タンパク質によって引き起こされる欠失長さの増加は、ＡＴＧ開始コドンを排除する欠失種のわずかな割合を実質的に増加させる。このＡＴＧ欠失対立遺伝子の増加は、他の３つのカテゴリーに分類される種を産生する欠失を犠牲にして生じ、更に、ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ－ＥｘｏＸ融合が、ＰＤ－１表面発現又は機能にも影響を与えない場合があるシグナル配列のＮ末端へのインフレーム単一アミノ酸欠失など、所望でないＰＤ－１遺伝子編集対立遺伝子を不釣合いに消去し得ることを示唆している。インフレーム欠失がＰＤＣＤ１遺伝子座を機能的に無効にしない可能性を評価するために、活性化された初代ヒトＴ細胞試料を、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）のいずれか又は両方をコードする、インビトロ転写され、キャッピングされ、ポリアデニル化されたｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、トランスフェクション効率を追跡し、３つの可能なリーディングフレームの各々において野生型又はモック編集ＰＤ－１対立遺伝子を追跡した。次いで、フローサイトメトリーを実施して、図１６に示されるトランスフェクション効率及びＰＤ－１タンパク質発現を評価した。野生型ＰＤ－１ ｍＲＮＡ（配列番号８３）エレクトロポレーションは、高レベルのタンパク質発現をもたらしたが、フレーム２又はフレーム３の欠失種をそれぞれ模倣する、１又は２塩基対の欠失（配列番号８４及び８５）をコードする人工ｍＲＮＡは、アウトオブフレームタンパク質転写物をコードするｍＲＮＡに期待されるように、ＰＤ－１タンパク質発現を促進しなかった。対照的に、ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ標的部位（配列番号８６）における３塩基対の欠失をコードする人工ｍＲＮＡは、高レベルのＰＤ－１表面発現を産生し、原理的には、一部のＰＤ－１遺伝子編集対立遺伝子種が表現型非浸透性であることを確認した。
実施例８
オフターゲット遺伝子座における編集の評価
オフターゲット部位における遺伝子編集イベントの定性的な側面を更に理解するために、アンプリコンシーケンシング及び欠失フィンガープリント分析を、低及び高編集ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬに特異的なオフターゲット部位で実施した。ＰＢＭＣから活性化及び拡張した初代ヒトＴ細胞を、低編集ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ、高編集ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ（ＴＣＲα ２．２）をコードする１．５ｕｇのｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、Ｔｒｅｘ２への各々の直接融合、及びＥｘｏＸへの各々の直接融合を行った。各構築物を、オンターゲット遺伝子座（図１７、複製中、１つの複製のみ示す）、又はそのオフターゲット遺伝子座（複製中、１つの複製のみ示す）で評価した。７～１０日間の成長期間の後、ゲノムＤＮＡ単離のために細胞を採取した。ＰＣＲは、ＫＡＴ２Ｂオフターゲット部位（低編集ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬによる編集に感受性である、図１８）又は２．２オフターゲット部位ＡＣ０１６７００．３（高編集ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬによる編集に感受性である、図１９）を包含するおよそ３００塩基対の領域にわたって実施した。次いで、ＰＣＲアンプリコンを次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、ブレイクポイント（ｘ軸）を引き起こしたｍｅｇａＴＡＬに対する、それらの頻度（円サイズ）並びにそれらの長さ（ｙ軸）及びそれらの長手方向位置の両方に従って欠失イベントを表にすることによって分析した。挿入はこの解析から除外された。Ｔｒｅｘ２へのＴＣＲα ２．２の融合は編集できなかったため、フィンガープリントは示されていない。各ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ編集のパターンに影響を与えたこれらのエクソヌクレアーゼは、各ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬのオンターゲット編集効率と比較して非常に低い編集速度をもたらし、フィンガープリントの変化を示した。ＴＡＬＥアレイの基質が不在であるため、試験されたｍｅｇａＴＡＬ融合物のうちのいずれかとのバイアスされた親和性分布のいずれもないように思われる。

Claims (124)

  1. 細胞において選択された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的部位に結合して切断するＤＮＡ結合ドメイン及びホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントと、リンカードメインと、エクソヌクレアーゼ又はその生物学的に活性な断片と、を含む、融合ポリペプチド。
  2. 前記エクソヌクレアーゼが、Ｔｒｅｘ２、ＥｘｏＩ、若しくはＥｘｏＸ、又はその生物的に活性な断片である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  3. 前記エクソヌクレアーゼが、ＥｘｏＸ又はその生物的に活性な断片である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  4. 前記エクソヌクレアーゼが、ＥｘｏＩ又はその生物的に活性な断片である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  5. 前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  6. 前記選択されたｄｓＤＮＡ標的部位が、非天然ホーミングエンドヌクレアーゼ標的部位である、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  7. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、前記エンドヌクレアーゼｄｓＤＮＡ標的部位の上流のｄｓＤＮＡ標的部位に結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  8. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  9. ＴＡＬＥ ＤＮＡドメインが、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位～約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  10. 前記ＴＡＬＥ ＤＮＡドメインが、１１．５個のＴＡＬＥ反復単位又は１２．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  11. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  12. 前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、２、３、４、５、６、７、又は８個のジンクフィンガーモチーフを含む、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
  13. 前記リンカードメインが、ペプチドリンカーである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  14. 前記ペプチドリンカーが、自己切断ペプチドリンカーである、請求項１３に記載の融合ポリペプチド。
  15. 前記ペプチドリンカーが、約４～約３０個のアミノ酸を含む、請求項１３又は１４に記載の融合ポリペプチド。
  16. 前記ペプチドリンカーが、約１０～約１６個のアミノ酸を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  17. 前記ペプチドリンカーが、約１２個のアミノ酸を含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  18. 前記ペプチドリンカーが、（ＧＧＧＧＳ）１－４リンカー（配列番号１１７及び１５０～１５２）である、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  19. 前記ペプチドリンカーが、（ＧＧＧＧＳ）２リンカー（配列番号１５０）を含む、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  20. 前記ＨＥバリアントが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  21. ＨＥバリアントが、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のＮ末端アミノ酸を欠く、請求項１～２０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  22. 前記ＨＥバリアントが、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠く、請求項１～２１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  23. 前記ＨＥバリアントが、対応する野生型ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠く、請求項１～２１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  24. 前記ＨＥバリアントが、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、又は５個のＣ末端アミノ酸を欠く、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  25. 前記ＨＥバリアントが、対応する野生型ＨＥと比較して、Ｃ末端アミノ酸を欠く、請求項１～２４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  26. 前記ＨＥバリアントが、対応する野生型ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠く、請求項１～２４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  27. 前記ＨＥバリアントが、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、及びＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  28. 前記ＨＥバリアントが、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、及びＩ－ＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  29. 前記ＨＥバリアントが、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントである、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  30. 前記ＨＥ標的部位が、免疫系チェックポイント遺伝子、グロビン遺伝子、γ－グロビン遺伝子発現及びＨｂＦの抑制に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子、又は免疫抑制シグナル伝達遺伝子内にある、請求項１～２９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  31. 前記ＨＥ標的部位が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＣＲ５、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＴＣＲβ、ＩＬ１０Ｒα、ＩＬ１０Ｒβ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＣＳＫ９、ＡＨＲ、ＢＴＫ、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＳＯＸ６、ＧＡＴＡ１、ＬＳＤ１、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレイクポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、ＴＥＭ５、ＴＥＭ８、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、並びにウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）遺伝子からなる群から選択される遺伝子内にある、請求項１～２９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  32. 前記ＨＥ標的部位が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＣＲ５、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＩＬ１０Ｒα、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＣＳＫ９、ＡＨＲ、ＢＴＫ、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、及びＢＣＬ１１Ａ遺伝子からなる群から選択される遺伝子内にある、請求項１～２９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  33. 前記ＨＥ標的部位が、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）遺伝子、ＣＢＬ－Ｂ遺伝子、又はＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）遺伝子内にある、請求項１～２９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  34. 前記ＴＣＲα遺伝子標的部位が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むか、前記ＣＢＬ－Ｂ遺伝子標的部位が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記ＰＤ－１遺伝子標的部位が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の融合ポリペプチド。
  35. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号４に示される標的部位を有するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  36. 前記ＥｘｏＸ又はその生物学的に活性な断片が、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸アミノ酸配列を含む、請求項３～３５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  37. 前記ＥｘｏＸ又はその生物学的に活性な断片が、配列番号１０９に示されるアミノ酸アミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の融合ポリペプチド。
  38. 配列番号４６、６４、７３、及び８２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の融合ポリペプチド。
  39. 配列番号４６、６４、７３、及び８２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の融合ポリペプチド。
  40. 前記ＥｘｏＩ又はその生物学的に活性な断片が、配列番号１１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸アミノ酸配列を含む、請求項４～３５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  41. 前記ＥｘｏＩ又はその生物学的に活性な断片が、配列番号１１２に示されるアミノ酸アミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の融合ポリペプチド。
  42. 配列番号４３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の融合ポリペプチド。
  43. 配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の融合ポリペプチド。
  44. 請求項１～４３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  45. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号４４、６２、７１、及び８０のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
  46. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号４４、６２、７１、及び８０のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
  47. 請求項１～４３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ｍＲＮＡ。
  48. 前記ｍＲＮＡが、配列番号４５、６３、７２、及び８１のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＲＮＡ配列を含む、請求項４７に記載のｍＲＮＡ。
  49. 前記ｍＲＮＡが、配列番号４５、６３、７２、及び８１のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含む、請求項４８に記載のｍＲＮＡ。
  50. 前記ｍＲＮＡが、配列番号４２に示されるＲＮＡ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＲＮＡ配列を含む、請求項４７に記載のｍＲＮＡ。
  51. 前記ｍＲＮＡが、配列番号４２のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含む、請求項５０に記載のｍＲＮＡ。
  52. 請求項１～４３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ベクター。
  53. 請求項４４～４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  54. 請求項１～４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、細胞。
  55. 請求項４４～４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
  56. 請求項４７～５１のいずれか一項に記載のｍＲＮＡを含む、細胞。
  57. 請求項５２又は５３に記載のベクターを含む、細胞。
  58. １つ以上のゲノム修飾を含む、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の細胞。
  59. 前記細胞が、造血細胞である、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の細胞。
  60. 前記細胞が、造血幹細胞又は前駆細胞である、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の細胞。
  61. 前記細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項５４～６０のいずれか一項に記載の細胞。
  62. 前記細胞が、ＣＤ１３３＋細胞である、請求項５４～６１のいずれか一項に記載の細胞。
  63. 前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の細胞。
  64. 前記免疫エフェクター細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、又はヘルパーＴ細胞である、請求項６３に記載の細胞。
  65. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞である、請求項６３に記載の細胞。
  66. 前記免疫エフェクター細胞が、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項６３に記載の細胞。
  67. 請求項５４～６６のいずれか一項に記載の細胞を含む、細胞集団。
  68. 請求項１～４３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、請求項４４～４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項４７～５１のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ、請求項５２若しくは５３に記載のベクター、請求項５４～６６のいずれか一項に記載の細胞、又は請求項６７に記載の細胞集団を含む、組成物。
  69. 薬学的に許容される担体を更に含む、請求項６８に記載の組成物。
  70. 部位特異的変異導入の方法であって、
    ａ）二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的部位を選択することと、
    ｂ）請求項１～４３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、請求項４４～４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項４７～５１のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ、又は請求項５２若しくは５３に記載のベクターを、前記細胞に導入することと、を含み、
    前記融合ペプチドが、前記細胞における選択された前記ｄｓＤＮＡ標的切断部位の近くに欠失中心を有する、方向バイアスされた欠失を生成する、方法。
  71. 前記方向バイアスされた欠失の５０％超、５１％超、５２％超、５３％超、５４％超、５５％超、５６％超、５７％超、５８％超、５９％超、又は６０％超が、前記ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記方向バイアスされた欠失の５０％超が、前記ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する、請求項７０に記載の方法。
  73. 前記方向バイアスされた欠失の５５％超が、前記ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する、請求項７０に記載の方法。
  74. 前記方向バイアスされた欠失の６０％超が、前記ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する、請求項７０に記載の方法。
  75. 前記方向バイアスされた欠失の６５％超が、前記ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する、請求項７０に記載の方法。
  76. 前記方向バイアスされた欠失の７０％超が、前記ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する、請求項７０に記載の方法。
  77. 前記方向バイアスされた欠失の７５％超が、前記ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する、請求項７０に記載の方法。
  78. 前記方向バイアスされた欠失の８０％超が、前記ＨＥ標的部位の中心位置の片側に欠失中心位置を有する、請求項７０に記載の方法。
  79. 前記欠失中心位置が、前記ＨＥ標的部位の中心位置に対して、前記ＤＮＡ結合ドメインの標的部位と同じ側にある、請求項７０～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記欠失中心位置が、前記ＨＥ標的部位の中心位置に対して５’にある、請求項７０～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 欠失の少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、又は少なくとも６０％が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 欠失の少なくとも５０％が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 欠失の少なくとも５５％が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８１のいずれか一項に記載の方法。
  84. 欠失の少なくとも６５％が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８１のいずれか一項に記載の方法。
  85. 欠失の少なくとも７０％が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８１のいずれか一項に記載の方法。
  86. 少なくとも７５％の欠失が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８１のいずれか一項に記載の方法。
  87. 少なくとも８０％の欠失が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から４ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８１のいずれか一項に記載の方法。
  88. 欠失の少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、又は少なくとも２０％が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 欠失の少なくとも１０％が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８７のいずれか一項に記載の方法。
  90. 欠失の少なくとも１５％が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８７のいずれか一項に記載の方法。
  91. 欠失の少なくとも２０％が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８７のいずれか一項に記載の方法。
  92. 欠失の少なくとも２５％が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８７のいずれか一項に記載の方法。
  93. 欠失の少なくとも３０％が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８７のいずれか一項に記載の方法。
  94. 欠失の少なくとも３５％が、前記ＨＥ標的部位の中心位置から８ヌクレオチド超離れた欠失中心を有する、請求項７０～８７のいずれか一項に記載の方法。
  95. 欠失の少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５０％、少なくとも５９％、又は少なくとも６０％が、６ｂｐ以上の長さである、請求項７０～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 欠失の少なくとも５０％が、６ｂｐ以上の長さである、請求項７０～９４のいずれか一項に記載の方法。
  97. 欠失の少なくとも５５％が、６ｂｐ以上の長さである、請求項７０～９４のいずれか一項に記載の方法。
  98. 欠失の少なくとも６０％が、６ｂｐ以上の長さである、請求項７０～９４のいずれか一項に記載の方法。
  99. 欠失の少なくとも６５％が、６ｂｐ以上の長さである、請求項７０～９４のいずれか一項に記載の方法。
  100. 欠失の少なくとも７０％が、６ｂｐ以上の長さである、請求項７０～９４のいずれか一項に記載の方法。
  101. 欠失の少なくとも７５％が、６ｂｐ以上の長さである、請求項７０～９４のいずれか一項に記載の方法。
  102. 欠失の少なくとも８０％が、６ｂｐ以上の長さである、請求項７０～９４のいずれか一項に記載の方法。
  103. 欠失の少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、又は少なくとも４０％が、１２ｂｐ以上の長さである、請求項７０～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 欠失の少なくとも３５％が、１２ｂｐ以上の長さである、請求項７０～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  105. 欠失の少なくとも４０％が、１２ｂｐ以上の長さである、請求項７０～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  106. 欠失の少なくとも４５％が、１２ｂｐ以上の長さである、請求項７０～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  107. 欠失の少なくとも５０％が、１２ｂｐ以上の長さである、請求項７０～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  108. 欠失の少なくとも５５％が、１２ｂｐ以上の長さである、請求項７０～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  109. 欠失の少なくとも６０％が、１２ｂｐ以上の長さである、請求項７０～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記方向バイアスされた欠失が、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０個のヌクレオチドの長さを含む、請求項７０～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記欠失が、前記ＤＮＡ結合ドメインの標的部位内に延在する、請求項７０～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記欠失の中心位置が、前記ＤＮＡ結合ドメインの標的部位内にある、請求項７０～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  113. 前記方法が、末端プロセシング酵素、又はその生物学的に活性な断片を前記細胞に導入することを更に含む、請求項７０～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記末端プロセシング酵素、又はその生物学的に活性な断片が、Ｔｒｅｘ２、Ｔｒｅｘ１、膜貫通型ドメインを含まないＴｒｅｘ１、Ａｐｏｌｌｏ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ２、ＥｘｏＩ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＩＩＩ、ＥｘｏＸ、Ｆｅｎ１、Ｆａｎ１、ＭｒｅＩＩ、Ｒａｄ２、Ｒａｄ９、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ＰＮＫＰ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ、ラムダエクソヌクレアーゼ、Ｓｏｘ、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼ、エクソヌクレアーゼＩ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、エクソヌクレアーゼＶＩＩ、ＮＤＫ１、ＮＤＫ５、ＮＤＫ７、ＮＤＫ８、ＷＲＮ、Ｔ７－エクソヌクレアーゼ遺伝子６、トリ骨髄芽球症ウイルス組み込みタンパク質（ＩＮ）、Ｂｌｏｏｍ、南極ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＡｐｅＩ、緑豆ヌクレアーゼ、Ｈｅｘ１、ＴＴＲＡＰ（ＴＤＰ２）、Ｓｇｓ１、Ｓａｅ２、ＣＵＰ、Ｐｏｌミュー、Ｐｏｌラムダ、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＥＭＥ２、ＳＬＸ１、ＳＬＸ４、及びＵＬ－１２からなる群から選択される、請求項７０～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記末端プロセシング酵素が、エクソヌクレアーゼ、又はその生物学的に活性な断片である、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記エクソヌクレアーゼが、Ｔｒｅｘ２、又はその生物学的に活性な断片である、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記方法が、インビトロ法である、請求項７０～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記方法が、エクスビボ法である、請求項７０～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記方法が、インビボ法である、請求項７０～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  120. 疾患又はそれに関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、又は改善する方法であって、対象から細胞集団を採取することと、請求項７０～１１９のいずれか一項に記載の方法に従って前記細胞集団を編集することと、前記編集された細胞集団を前記対象に投与することと、を含む、方法。
  121. 疾患又はそれと関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、又は改善するための、請求項５４～６６のいずれか一項に記載の細胞の使用。
  122. 疾患又はそれと関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、又は改善するための、請求項６７に記載の細胞集団の使用。
  123. 疾患又はそれと関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、又は改善するための、請求項６８又は６９に記載の組成物の使用。
  124. 前記疾患又は状態が、免疫障害又はがんである、請求項１２０～１２３のいずれか一項に記載の方法又は使用。
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