JP6143218B2

JP6143218B2 - 腱および靱帯機能改善剤ならびにこれを含む医薬組成物、食品および飼料

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Publication number: JP6143218B2
Application number: JP2012286104A
Authority: JP
Inventors: 宮本　啓一; 啓一宮本; 直紀水谷; 絵理白土
Original assignee: Mie University NUC; Hayashikane Sangyo Co Ltd
Current assignee: Mie University NUC; Hayashikane Sangyo Co Ltd
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2012-12-27
Publication date: 2017-06-07
Anticipated expiration: 2032-12-27
Also published as: JP2014125482A

Description

本発明は、新規な腱および靱帯機能改善剤ならびにこれを含む医薬組成物、食品および飼料に関する。

エラスチンは、大動脈、項靭帯、皮膚、肺など、生体内の様々な弾性組織に広く分布している弾性線維の主要な構成成分である不溶性タンパク質である。皮膚や血管におけるエラスチンは、加齢と共に減少や機能低下を起こすことが知られている。皮膚中のエラスチンを産生する皮膚線維芽細胞におけるエラスチン産生を促進する物質には、皮膚改善剤としての可能性が考えられる。例えば、特許文献１〜３では植物抽出物を含むエラスチン産生促進剤が提案されている。

また、ブタおよびウマ由来のエラスチンが皮膚に対して改善効果と美白効果をもたらしたという報告（特許文献４参照）や、動物由来（ウシの項靱帯）エラスチンが血管の状態を改善したという報告（特許文献５参照）等がある。また、特許文献６には、エラスチンを構成するアミノ酸の７９〜８４％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、０．７〜１．３％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、０．２〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量が約１〜３万の低分子量水溶性エラスチンを有効成分とする動脈硬化抑制剤が開示されている。

特許文献７には、魚類の動脈球より抽出されたエラスチンペプチドを有効成分として含み、１０００残基あたりのグリシン、アラニン、バリンおよびプロリン含量の合計が６５０残基以上であり、アスパラギン酸およびアスパラギン含量の合計が１０〜３５残基であり、グルタミン酸およびグルタミン含量の合計が２０〜５０残基であり、リジン、ヒスチジンおよびアルギニン含量の合計が２０残基〜５０残基であり、デスモシンおよびイソデスモシン含量の合計が０．３残基以上であり、ヒドロキシプロリン含量が１０残基以下である皮膚改善剤および血管改善剤が開示されている。

エラスチンは項靱帯や膝靱帯を始めとする靱帯や腱にも多く存在しており、例えば、膝靭帯においても、力学的機能や生理学的機能に重要な役割を果たすことが予想される。皮膚等と同様に、腱や靭帯についても、加齢等によるエラスチンの含有量の減少に伴う機能低下が、膝等の関節痛の一因になっていると考えられる。そのため、腱細胞および靱帯細胞の増殖能の増大や、腱や靭帯を構成するタンパク質の遺伝子発現の促進が、膝関節症等のロコモティブシンドロームや、スポーツ等による腱および靭帯損傷の予防、腱や靱帯の強化等の腱および靱帯機能の改善に繋がることが期待される。

腱または靭帯の損傷等に対する改善、治癒促進または予防、腱または靭帯の改善または強化を目的とする組成物として、例えば、コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼにより分解して得られる分解物であって、アミノ酸配列が（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_ｎ（式中、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、ＸおよびＹはグリシン以外の任意のアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す）で表されるペプチドを含むものを有効成分とするもの（例えば、特許文献８参照）が提案されている。また、特許文献９には、薬学的に許容可能な液体担体中約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度での血小板由来成長因子及び薬学的に許容可能な固体担体を含む組成物を、骨、歯周組織、靱帯または軟骨へ適用させることにより、骨、歯周組織、靱帯または軟骨の成長を促進させる方法が開示されている。

特開２００２−２９３７４７号公報特開２００５−２２９９３号公報特開２００５−６０３４１号公報特開２００２−２０５９１３号公報特開２００７−０４５７２２号公報特開２００７−０４５７２２号公報（請求項６等）特開２０１０−１５５８２０号公報特開２００５−２８１１８６号公報特開２００９−１９５７３９号公報

しかしながら、現在まで、腱細胞および靱帯細胞におけるエラスチン産生を促進させることによる靱帯機能の改善については知られていない。

本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、安全性が高く、長期間にわたる摂取による健康被害のリスクが低く、かつ低コストで提供可能な腱および靱帯機能改善剤およびこれを含む医薬組成物、食品および飼料を提供することを目的とする。

本発明者らは、魚類由来のエラスチンまたはそのポリペプチド鎖を断片化させることにより得られるペプチド（以下、本発明において「エラスチンペプチド」と総称する。）について、腱細胞および靱帯細胞の増殖を促進し、靱帯の機能を改善する活性を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、前記目的に沿う本発明の第１の態様は、魚類の動脈球から、脂質、可溶性タンパク質およびコラーゲンを除去して得られる不溶性タンパク質の加水分解物、ジペプチドのプロリン−グリシン（Pro-Gly ）およびそれらの塩からなる群より選択される１または複数を有効成分として含み、腱細胞および靱帯細胞の増殖を促進させ、腱細胞および靱帯細胞における、エラスチンｍＲＮＡ、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡ、III型コラーゲンｍＲＮＡおよびテノモジュリンｍＲＮＡの発現を促進する活性を有し、腱細胞および靱帯細胞におけるアルカリホスファターゼを阻害し、かつ／または腱細胞および靱帯細胞におけるアルカリホスファターゼの発現を抑制する活性を有することを特徴とする腱および靱帯機能改善剤を提供することにより上記課題を解決するものである。

なお、「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸残基が縮重合し、ペプチド結合で結合したアミノ酸の重合体を意味する。

本発明の第１の態様に係る腱および靱帯機能改善剤において、前記不溶性タンパク質がエラスチンであることが好ましい。

本発明の第１の態様に係る腱および靱帯機能改善剤において、前記ペプチドのうち、７０重量％以上が分子量１０００以下であることが好ましい。
なお、本発明において、特に断らない限り「％」は「重量％」を意味する。

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に係る腱および腱および靱帯機能改善剤を含む腱および靱帯機能改善用医薬組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。

本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様に係る腱および靱帯機能改善剤を含む腱および靱帯機能改善用食品を提供することにより上記課題を解決するものである。

本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様に係る腱および靱帯機能改善剤を含む腱および靱帯機能改善用飼料を提供することにより上記課題を解決するものである。

本発明によると、魚類の弾性組織である動脈球に由来するエラスチンペプチドを有効成分とする腱および靱帯機能改善剤およびこれを含む医薬組成物、食品および飼料を提供できる。本発明の腱および靱帯機能改善剤は、家畜疫病の感染リスクのある動物の弾性組織由来のタンパク質を原料として用いないと共に、ペプチドからなるため安全性が高く、長期間にわたる摂取による健康被害のリスクが低いと共に、低コストで提供できる。また、本発明の腱および靱帯機能改善剤は、腱細胞および靱帯細胞の増殖を促進させることにより、膝関節症等のロコモティブシンドロームやスポーツ等による靭帯損傷の予防や靱帯の強化等の靱帯機能の改善に有用であることが期待される。

膝前十字靱帯由来培養細胞の増殖率に及ぼすエラスチンペプチドおよびPro-Gly の効果を示す図である。膝前十字靱帯由来培養細胞におけるエラスチンｍＲＮＡの発現レベルに及ぼすエラスチンペプチドおよびPro-Gly の効果を示す図である。膝前十字靱帯由来培養細胞におけるＩ型コラーゲンｍＲＮＡの発現レベルに及ぼすエラスチンペプチドおよびPro-Gly の効果を示す図である。膝前十字靱帯由来培養細胞におけるIII型コラーゲンｍＲＮＡの発現レベルに及ぼすエラスチンペプチドおよびPro-Glyの効果を示す図である。膝前十字靱帯由来培養細胞におけるテノモジュリンｍＲＮＡの発現レベルに及ぼすエラスチンペプチドおよびPro-Gly の効果を示す図である。膝前十字靱帯由来培養細胞におけるアルカリホスファターゼの活性に及ぼすエラスチンペプチドおよびPro-Gly の効果を示す図である。

続いて、本発明を具体化した実施の形態について説明し、本発明の理解に供する。
本発明の一実施の形態に係る腱および靱帯機能改善剤は、魚類の動脈球から、脂質、可溶性タンパク質およびコラーゲンを除去して得られる不溶性タンパク質の加水分解物である１または複数種のペプチド（以下、「エラスチンペプチド」と略称する場合がある。）、ジペプチドのプロリン−グリシン（Pro-Gly ）、それらの塩およびそれらの誘導体からなる群より選択される１または複数の化合物を有効成分として含んでいる。
上記の有効成分のうち、まず、エラスチンペプチドについて説明する。

エラスチンペプチドの原料として用いられる動脈球とは、魚類に特有の器官であり、弁を介して心室と結合しており、心室から大動脈へ送り出される血液の血流調節に関与している。原料として使用される動脈球の起源に特に制限はなく、任意の魚種由来の動脈球を使用することができるが、心臓から動脈球を採取するためにある程度の大きさを有する必要がある。そのため、原料として用いる動脈球は、カツオ、マグロ、カジキ、タラ、ハマチ、ブリ、サケ、マス等の大型魚に由来するものであることが好ましく、大量かつ安定的に入手できる魚種であるカツオ、マグロ、タラ、ハマチ、サケに由来するものであることがより好ましい。

エラスチンペプチドは、例えば、以下の方法により調製される。
まず、原料として使用する動脈球から血液を除去するために流水で洗浄後、粉砕する。粉砕は、ホモジナイザー、フードカッター等の任意の公知の手段により行うことができる。次いで、粉砕した動脈球から、脂質、可溶性タンパク質、コラーゲンを除去することにより、エラスチンを主成分とする不溶性タンパク質が得られるが、原料のさらなる洗浄および以後の処理を容易にするための前処理として、アルカリ溶液を用いた浸漬処理を行うことが好ましい。

アルカリ溶液による処理条件は魚種により異なるため、事前に検討の上決定することが好ましいが、カツオ由来の動脈球を使用した場合、使用されるアルカリ溶液は、水酸化ナトリウムまたは水酸化カルシウム、好ましくは水酸化ナトリウムの溶液である。アルカリ溶液の濃度は０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌである。浸漬温度は２０℃以下、浸漬期間は数日〜２週間、好ましくは１週間である。また、浸漬中は、アルカリ溶液を１日につき２回以上取り替えることが好ましい。浸漬後、流水洗浄により過剰のアルカリを除去後、必要に応じて中和処理を行う。中和には、当該技術分野において使用される任意の酸を使用することができる。

アルカリ処理した原料からの脂質およびコラーゲンの除去は、例えば、蒸留水を添加し高温（例えば、９５℃）で加熱する方法により行うことができる。高温で加熱することにより、コラーゲンのらせん構造が崩壊して三量体が解離し、水溶性のトロポコラーゲン（ゼラチン）が遊離する。ろ過、遠心分離、デカンテーション等の任意の公知の方法により上清を分離除去すると、不溶性タンパク質が得られる。

こうして得られた不溶性タンパク質に対して、ポリペプチド鎖を断片化させ、水溶性を向上させる可溶化処理を行うことにより、エラスチンペプチドを得ることができる。この際、可溶化処理に先立ち、不溶性タンパク質をさらに細片化してもよい。

可溶化処理は任意の公知の方法を用いて行うことができるが、具体例としては、タンパク質分解酵素による酵素分解が挙げられる。酵素分解には、食品、医薬品および化粧品製造に使用される任意のタンパク質分解酵素を使用することができるが、力価の大きなもの、たとえばAlcalase2.4L FG（Novoenzyme製）、プロチンAC-10F（大和化成製）、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、ペプシン（天野エンザイム製）が好ましい。分解条件は、使用される酵素および動脈球、所望の分子量分布等に応じて適宜決定される。酵素の添加量（酵素と基質の重量比）は、当業界でタンパク質分解に用いられる通常の量であり、たとえば１：５０〜１：１００００である。また、これらの酵素は単独で用いることもできるが、２種類以上を組み合わせて使用することが好ましい。酵素分解反応は、タンパク質分解酵素が失活しない温度（例えば、室温〜３７℃）で、所定の時間（３０分間〜９６時間）かけて行う。反応後、酵素の加熱失活により酵素分解反応を終了させる。

また、可溶化処理は、不溶性タンパク質を無機酸溶液中で加熱処理する酸分解法によっても行うことができる。使用する酸の例としては任意の無機酸が挙げられるが、シュウ酸が好ましく、濃度および加熱温度は、０．２５Ｎ、９０℃が好ましい。可溶化処理後、アルカリにより中和を行うが、このとき使用するアルカリとしては水酸化ナトリウムおよび水酸化カルシウムが好ましい。特に、シュウ酸を使用した場合には、これを完全に除去するために水酸化カルシウムでの中和が必須となる。

或いは、不溶性タンパク質をアルカリ性含水エタノール溶液で処理するアルカリ−エタノール法によっても可溶化処理を行うことができる。この際使用する溶液は、１Ｎ水酸化ナトリウム８０％エタノール溶液であることが好ましく、処理温度は室温であることが好ましい。

以上のようにして得られたエラスチンペプチドを溶液のまま使用する場合には、溶液を所望の用途に好適なｐＨに調整し、必要であれば脱塩を行う。脱塩は、限外ろ過法、イオン交換法等の任意の方法により行うことができる。
また、不溶物が存在する場合には、ろ過、遠心分離、デカンテーション等の任意の方法を用いて除去することができる。ろ過による除去の場合には、必要に応じて、溶液中に含まれる不溶物以外の不純物（エラスチンペプチド以外の着色成分等）を除去するために活性炭、ベントナイト、セライト等の吸着剤やろ過助剤を添加してもよい。特に溶液のまま使用する場合には、メンブレンフィルター等による除菌ろ過を併せて行うことが好ましい。
このようにして得られるエラスチンペプチドは、そのまま溶液として用いてもよく、或いは、更に濃縮後噴霧乾燥または凍結乾燥を行うことにより得られる粉末の形態で用いてもよい。

以上のようにして得られるエラスチンペプチドのうち、分子量が１０００以下のものが占める割合は、７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上である。上記の条件を具備する腱および靱帯機能改善剤は、それぞれ、高い活性を示すと共に、投与時の吸収特性等においても優れている。エラスチンペプチドの分子量およびその存在比（重量比）は、サイズ排除クロマトグラフィー（ゲルろ過クロマトグラフィー）法、質量分析法等の任意の公知の方法を用いて決定することができる。エラスチンペプチドのうち、分子量１０００以下のものが占める割合が７０％を下回ると、吸収効率の低下や変異原性の発現等の問題を生じるおそれがある。

このようにして得られるエラスチンペプチドは、腱細胞および靱帯細胞の増殖を促進する作用を有している。それにより、靱帯損傷の回復の促進、膝関節症等のロコモティブシンドロームやスポーツ等による靭帯損傷の予防、高齢者、スポーツ選手、競走馬等の靱帯の機能強化等に有効であると考えられる。

エラスチンペプチドは、腱細胞および靱帯細胞における、エラスチンｍＲＮＡ、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡ、III型コラーゲンｍＲＮＡおよびテノモジュリンｍＲＮＡの発現を促進する活性を有している。エラスチン、Ｉ型コラーゲンおよびIII型コラーゲンは、靱帯の主要な構成成分であり、それらの産生が促進されることで、靱帯機能の強化、靱帯の損傷の回復の促進等の効果が得られる。テノモジュリンは、靱帯、腱等に発現する３１７アミノ酸の糖タンパク質であり、コンドロモジュリン−Ｉと相同性を有するシステインリッチな機能ドメインを含んでいる。タンパク分解により切断されたテノモジュリンの１６ｋＤのＣ末端ドメインが腱細胞増殖活性を示すことが知られており、テノモジュリンは靱帯や腱の機能強化に何らかの役割を果たしていると考えられている。したがって、テノモジュリンの産生を促進することも、靱帯の機能強化等に有利な役割を果たしていると思われる。

また、エラスチンペプチドは、腱細胞および靱帯細胞におけるアルカリホスファターゼを阻害し、かつ／または腱細胞および靱帯細胞におけるアルカリホスファターゼの発現を抑制する活性を有している。アルカリホスファターゼは骨形成に必要な酵素であるが、加齢等によって靭帯細胞からのアルカリホスファターゼ発現が増加し、腱細胞および靱帯細胞が骨芽細胞様に分化してしまうとの報告がある。このようなアルカリホスファターゼ活性の増大が、加齢に伴う靱帯の硬直化につながるとも考えられるため、腱細胞および靱帯細胞におけるアルカリホスファターゼ活性の阻害およびアルカリホスファターゼの発現の抑制は、靱帯機能の低下の防止に有用である。

カラムクロマトグラフィー等の公知の方法を用いてエラスチンペプチドを分画し、個々のフラクションについて各活性のアッセイを行うことにより、上述の活性のうち１つまたは複数を有するフラクションを単独で、または任意の２以上のフラクションを組み合わせて用いてもよく、あるいはエラスチンペプチドの分離精製を行うことなく、混合物のまま用いてもよい。

エラスチンペプチドを医薬用途に通常用いられる任意の担体等と混合することにより、腱細胞および靱帯細胞の増殖を促進させる作用を有する腱および靱帯機能改善用医薬組成物として用いることができる。医薬組成物のヒトあるいは動物に対する投与形態としては、経口、経直腸、非経口（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与など）等が挙げられ、投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定され一義的に決定することは困難であるが、ヒトの場合、一般には製剤中に含有される有効成分の量で、成人一人1日あたり０．１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは０．５〜５００ｍｇ程度、より好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇであり、これを１回〜数回に分けて投与する。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。

経口投与製剤として調製する場合は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤等の形態に調製することができ、非経口投与製剤にする場合には、注射剤、点滴剤、座薬等の形態に調製することができる。製剤化には、任意の公知の方法を用いることができる。例えば、エラスチンペプチドと、製薬学的に許容し得る担体または希釈剤、安定剤、およびその他の所望の添加剤を配合して、上記の所望の剤形とすることができる。

腱および靱帯機能改善剤を含む腱および靱帯機能改善用食品としては、エラスチンペプチドをそのまま食品として調製したもの、他の食品に添加したもの、あるいは、カプセル、錠剤等、食品または健康食品に通常用いられる任意の形態をとることができる。

食品中に配合して摂取あるいは投与する場合には、適宜、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等と混合し、用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。また、適宜、食品原料中に混合して食品を調製し、腱細胞および靱帯細胞の増殖を促進する活性を有する機能性食品として用いることができる。

腱および靱帯機能改善剤を含む腱および靱帯機能改善用飼料としては、エラスチンペプチドをそのまま調製したもの、あるいは飼料に配合したもの等、様々な形態をとることができる。飼料中に混合して、家畜などの動物に投与する場合には、予め飼料の原料中に混合して、機能性を付与した飼料として調製することができる。また、飼料に添加して投与することもできる。すなわち、エラスチンペプチドを有効成分として含む腱および靱帯機能改善剤は、ブタ、ニワトリ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜や、魚類、ペット（イヌ、ネコ、鳥類）等の飼料に添加することにより、安全で、腱細胞および靱帯細胞の増殖を促進する活性を有する機能性飼料として用いることができる。

エラスチンペプチドは、塩、誘導体または溶媒和物の形で腱および靱帯機能改善剤に含まれていてもよい。エラスチンペプチドの塩としては、エラスチンペプチド中の各アミノ酸残基中のアミノ基およびカルボキシル基が、それぞれ生体に対し無害な酸および塩基と塩を形成した任意の塩を使用することができる。アミノ基の塩の具体例としては、（１）塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩等の無機酸塩、（２）酢酸塩、プロピオン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、シュウ酸塩、ステアリン酸塩、アスコルビン酸塩、リンゴ酸塩、アジピン酸塩、グルコン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。カルボキシル基の塩の具体例としては、（１）ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等の金属塩、（２）アンモニウム塩、ピリジニウム塩、塩基性アミノ酸との塩等の有機塩基との塩が挙げられる。或いは、いわゆる分子内塩（双性イオン：Zwitter ion）を形成していてもよい。

エラスチンペプチドの誘導体としては、エラスチンペプチド中の各アミノ酸残基中のアミノ基およびカルボキシル基と、生体に対し無害な他の化合物との反応生成物であり、生体において酵素分解を受け遊離のPro-Gly を生成することができるものであれば、任意の誘導体を使用することができる。誘導体の具体例としては、Ｎ−アシルアミド、Ｏ−アルキルエステル等が挙げられる。

なお、本実施の形態では、有効成分としてエラスチンペプチドを用いたが、腱細胞および靱帯細胞の増殖を促進する活性を有することがわかっている他のペプチドを用いてもよい。このようなペプチドのうち、アミノ酸配列が既知のものとしては、Pro-Gly （L-プロリルグリシン）が挙げられる。エラスチンペプチドの代謝産物のうち、エラスチンペプチドを経口摂取後、血中濃度が上昇するペプチドが確認されたが（第６３回日本栄養・食糧学会大会予稿集１３１ページ、2G-18P、重村泰毅他、「ヒト末梢血における食事由来エラスチンペプチドの検出」）、そのうちアミノ酸配列が既知で、かつ腱細胞および靱帯細胞の増殖を促進する活性を有することが確認されたジペプチドの１つがPro-Gly である。

Pro-Gly は、エラスチンペプチドの経口摂取により血中濃度が増大するペプチドであることから、エラスチンペプチドの経口摂取は腱細胞および靱帯細胞の増殖促進等に有効であることが強く示唆されると共に、Pro-Gly および部分アミノ酸配列としてPro-Gly を含み、消化吸収過程でPro-Gly を生成するペプチドは、腱および靱帯機能改善剤において高い活性を有する有効成分の１つであると考えられる。

Pro-Gly としては、エラスチンペプチドまたは消化酵素による分解産物からPro-Gly のみを単離して用いることもできるが、任意の公知の方法を用いて合成したものを用いてもよい。同様に、エラスチンペプチドに含まれ、腱細胞および靱帯細胞の増殖を促進する活性を有し、靱帯の損傷を治癒または予防し、靱帯機能を改善し、かつ靱帯を強化する機能を有する他のペプチドについても、エラスチンペプチドから単離したものを使用することもできるし、アミノ酸配列を明らかにした上で化学的または生物学的手法を用いて合成したものを用いてもよい。また、Pro-Gly 、Pro-Gly の塩およびその誘導体（塩および誘導体の具体例については上記参照。）からなる群より選択される１または複数の化合物を任意の割合で組み合わせたものを用いてもよい。

次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。

実施例１：カツオ由来エラスチンペプチド粉末の製造
新鮮なカツオより動脈球（１００ｇ）を採取し、流水洗浄後粉砕した。原料の前処理として０．０２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に冷蔵庫中で１週間浸漬した。浸漬後、流水洗浄により過剰のアルカリを除去し、排出液が中性となるまで流水洗浄した。これに３倍容の蒸留水を加え、９５℃に加熱後、上清を取り除くことにより、脂質およびコラーゲン質を除去した。残留物をフードカッターで細片化し、プロチンAC-10F（大和化成製、０．５％）およびプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム製、０．１％）を基質量の１％添加し、１０時間分解を行った。８５℃以上の温度で加熱失活を行い、ろ過および遠心分離により残渣を分離した。その後精密ろ過によって清澄化した抽出液を噴霧乾燥し、水溶性のエラスチンペプチド粉末（８ｇ）を得た。

実施例２：ハマチ由来エラスチンペプチド粉末の製造
原料として新鮮なハマチより採取した動脈球を用い、実施例１と同様の操作により、エラスチンペプチド粉末を得た。

実施例３：マグロ由来エラスチンペプチド粉末の製造
原料として新鮮なマグロより採取した動脈球を用い、実施例１と同様の操作により、エラスチンペプチド粉末を得た。

実施例１〜３により得られたエラスチンペプチドのアミノ酸分析結果を、下記の表１に示す。

いずれのエラスチンペプチドについても、１０００残基あたりのグリシン、アラニン、バリンおよびプロリン含量の合計が６５０残基以上であり、アスパラギン酸およびアスパラギン含量の合計が１０〜３５残基であり、グルタミン酸およびグルタミン含量の合計が２０〜５０残基であり、リジン、ヒスチジンおよびアルギニン含量の合計が２０残基〜５０残基であり、デスモシンおよびイソデスモシン含量の合計が０．３残基以上であり、ヒドロキシプロリン含量が１０残基以下であることがわかる。

実施例１〜３により得られたエラスチンペプチドのタンパク質、脂質、水分、および灰分分析結果を、下記の表２に示す。

実施例１〜３により得られたエラスチンペプチドの分子量測定結果（財団法人日本食品分析センター：TSKgel G2500PWXLカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより測定）を、下記の表３に示す。なお、表３において「％」は重量％を意味する。

いずれのエラスチンペプチドについても、分子量１０００以下のものが占める割合が７０％以上であることがわかる。

実施例４：ヒト由来前十字靭帯細胞増殖試験
本実施例および以下に示す実施例における各試験には、関節リウマチ患者または変形性膝関節症患者より摘出した前十字靱帯を組織培養後、単離した細胞を使用した。培養フラスコにて培養したヒト由来膝前十字靭帯由来細胞を９６ウェルプレートに５，０００
ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように播種した(培地：１０％ＦＢＳＤＭＥＭ)。３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した後、ウェル中の培養液を除去し、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを添加して同条件下で更に２４時間培養した。ウェル中の培養液を除去し、ＤＰＢＳにより洗浄後、ＤＰＢＳを除去した。０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにて０、５、５０、５００、５０００、５００００ｎｇ／ｍＬの濃度となるようにカツオ由来エラスチンペプチドおよびPro-Gly （カツオ由来エラスチンペプチドより単離した）を調製しウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ_２の条件化で２日間培養を行い、cell counting kit-8により細胞数を確認した。

得られた結果を図１に示す。コントロールとの比較より、カツオ由来エラスチンペプチドおよびPro-Gly の両者とも、５ｎｇ／ｍＬ以上の濃度でヒト膝前十字靱帯由来細胞の増殖を有意に増大させることが確認された。ハマチ、マグロ由来エラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。

実施例５：遺伝子発現定量試験
培養フラスコにて培養した膝前十字靭帯由来細胞を６ウェルプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように播種した（培地：１０％ＦＢＳＤＭＥＭ）。３７℃、５％ＣＯ_２条件下でプレコンフルエントになるまで３日間培養した後、ウェル中の培養液を除去し、ＤＰＢＳにより洗浄、ＤＰＢＳを除去した。１．０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにて０、５０、５００
ｎｇ／ｍＬの濃度となるようにカツオ由来エラスチンペプチドおよびPro-Gly を調製しウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ_２の条件化で５日間培養を行い、ＲＴ−ＰＣＲにより各遺伝子発現定量を行った。その際、GAPDH（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）を内部標準とした。検証した遺伝子は、エラスチンｍＲＮＡ、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡ、III型コラーゲンｍＲＮＡおよびテノモジュリンｍＲＮＡである。

エラスチンｍＲＮＡ、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡ、III型コラーゲンｍＲＮＡおよびテノモジュリンｍＲＮＡについて得られた結果を、それぞれ、図２〜５に示す。コントロールとの比較より、カツオ由来エラスチンペプチドおよびPro-Gly の両者とも、５０ｎｇ／ｍＬ以上の濃度でヒト膝前十字靱帯由来細胞における上記各遺伝子の発現を有意に増大させることが確認された。ハマチ、マグロ由来エラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。

実施例６：アルカリホスファターゼ活性測定による靭帯細胞の骨分化抑制検討
培養フラスコにて培養したヒト膝前十字靭帯由来細胞（Ｐ８）を４８ウェルプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにて０、５０、５００
ｎｇ／ｍＬの濃度となるようにカツオ由来エラスチンペプチドおよびPro-Gly を調製しウェルに添加。３７℃、５％ＣＯ_２条件下で、１０日間培養した。各ウェルの培養液上清を除去し、ＰＢＳでプレートを洗浄、次いで０．０５％トリトンＸを各ウェルに１５０μＬ添加した。ウェルからエッペンチューブに移し遠心分離（４Ｃ、１５，０００ｒｐｍ、１５分）を行った。上清を回収し、これを測定サンプルとした。各サンプルのアルカリホスファターゼ活性を、キットにより活性測定を行うことで確認した。

得られた結果を図６に示す。コントロールとの比較より、カツオ由来エラスチンペプチドおよびPro-Gly の両者とも、５０ｎｇ／ｍＬ以上の濃度でヒト膝前十字靱帯由来細胞におけるアルカリホスファターゼの活性を有意に低減させることが確認された。ハマチ、マグロ由来エラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。

以上の結果より、カツオ由来エラスチンペプチドおよびPro-Gly には、ヒト前十字靭帯由来細胞の増殖、各遺伝子の発現を促進する作用、またアルカリホスファターゼの活性阻害または発現を抑制する作用があることが確認でき、膝靭帯の強化、損傷予防に有効である可能性が示唆された。

本発明により提供される腱および靱帯機能改善剤は、腱および靱帯損傷の回復の促進、膝関節症等のロコモティブシンドロームやスポーツ等による腱および靭帯損傷の予防、高齢者、スポーツ選手、競走馬等の腱および靱帯の機能強化等の効果を有する医薬品、食品、飼料等への利用が可能である。

Claims

魚類の動脈球から、脂質、可溶性タンパク質およびコラーゲンを除去して得られる不溶性タンパク質の加水分解物、ジペプチドのプロリン−グリシン（Pro-Gly ）およびそれらの塩からなる群より選択される１または複数を有効成分として含み、腱細胞および靱帯細胞の増殖を促進させ、腱細胞および靱帯細胞における、エラスチンｍＲＮＡ、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡ、III型コラーゲンｍＲＮＡおよびテノモジュリンｍＲＮＡの発現を促進する活性を有し、腱細胞および靱帯細胞におけるアルカリホスファターゼを阻害し、かつ／または腱細胞および靱帯細胞におけるアルカリホスファターゼの発現を抑制する活性を有することを特徴とする腱および靱帯機能改善剤。
前記不溶性タンパク質がエラスチンであることを特徴とする請求項１記載の腱および靱帯機能改善剤。
前記ペプチドのうち、７０重量％以上が分子量１０００以下であることを特徴とする請求項１または２記載の腱および靱帯機能改善剤。
請求項１から３のいずれか１項記載の腱および靱帯機能改善剤を含む腱および靱帯機能改善用医薬組成物。
請求項１から３のいずれか１項記載の腱および靱帯機能改善剤を含む腱および靱帯機能改善用食品。
請求項１から３のいずれか１項記載の腱および靱帯機能改善剤を含む腱および靱帯機能改善用飼料。