JP6142973B1 - 糖タンパク質の糖鎖を調製する方法、キット及び装置 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]容器内で、固相に固定された糖タンパク質を含む試料に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含む、糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[2]前記遊離工程の前に、前記試料に界面活性剤を含む前処理剤を接触させる前処理工程を更に備える、[1]に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[3]前記遊離工程を、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤の存在下で行う、[1]又は[2]に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[4]前記酸由来型陰イオン性界面活性剤が、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤及びリン酸エステル型陰イオン性界面活性剤からなる群より選ばれる、[3]に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[5]前記遊離工程を開放系かつ加熱条件下で行う、[1]〜[4]のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[6]前記糖タンパク質が抗体、ホルモン、酵素又はこれらを含む複合体である、[1]〜[5]のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[7]前記固相が、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体及び無機担体からなる群より選ばれる、[1]〜[6]のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[8]前記糖タンパク質が抗体であり、前記固相が、プロテインA、プロテインG、プロテインL、プロテインH、プロテインD、プロテインArpからなる群より選ばれるリガンドを表面に有する、[1]〜[7]のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[9]前記標識試薬が、2−アミノベンズアミド、還元剤及び溶媒を含む、[1]〜[8]のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[10]前記還元剤がピコリンボランである、[9]に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[11]前記溶媒がプロトン性化合物を含む、[9]又は[10]に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[12]前記溶媒が、前記プロトン性化合物よりも沸点が高い非プロトン性化合物を更に含む、[11]に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[13]前記遊離工程の後に、固液分離によって前記遊離生成物を含む分離液を得る分離工程を更に含む、[1]〜[12]のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[14]前記標識工程の後に、固液分離によって前記糖鎖の標識体を含む分離液を得る分離工程を更に含む、[1]〜[12]のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
[15]糖タンパク質を固定するための固相、前記固相を保持し糖鎖の遊離及び標識を行うための容器、並びに糖鎖遊離酵素を備える、糖タンパク質の糖鎖を調製するキット。
[16]界面活性剤を含む前処理剤、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤又は標識試薬を更に備える、[15]に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製するキット。
[17]前記標識試薬が、2−アミノベンズアミド、還元剤及び溶媒を含む、[16]に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製するキット。
[18]前記固相が、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体及び無機担体からなる群より選ばれる、[15]〜[17]のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製するキット。
[19]前記固相が、プロテインA、プロテインG、プロテインL、プロテインH、プロテインD、プロテインArpからなる群より選ばれるリガンドを表面に有する、[15]〜[18]のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製するキット。
[20]固相に固定された糖タンパク質を含む試料が収容される容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬を導入する試薬導入部と、を備え、前記試薬導入部が、前記容器に糖鎖遊離酵素を導入する糖鎖遊離酵素導入部と、前記容器に標識試薬を導入する標識試薬導入部とを含む、糖タンパク質の糖鎖を調製する装置。
[21]前記容器の収容物を固液分離する固液分離部を更に備える、請求項20に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する装置。
[22]前記容器の収容物の温度を調節する温度調節部を更に備える、請求項20又は21に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する装置。
遊離工程では、固相に固定された糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させて糖鎖を遊離し、遊離生成物を得る。好ましくは、脱糖鎖促進剤の存在下で糖鎖遊離酵素を作用させる。本工程は、化学的断片化又は酵素学的断片化等によるタンパク質の断片化工程を実質的に含まない。
《糖タンパク質》
糖タンパク質は、少なくとも糖鎖を複合成分として含むタンパク質であればよい。糖タンパク質の糖鎖部分は、N−結合型であってもよく、O−結合型であってもよい。また、糖鎖部分は、天然の構造を有していてもよいし、人工的に改変されていてもよい。また、糖鎖部分は、中性糖鎖であってもよいし、酸性糖鎖であってもよい。また、糖タンパク質における糖鎖結合部位は、天然物と同じ部位であってもよいし、天然物では糖鎖が結合していない部位であってもよい。
本実施形態の方法において、糖タンパク質は、固相に固定されている。固定の態様としては、特異的結合による非共有結合(水素結合及びイオン結合)、並びに共有結合が含まれ、例えば泳動ゲルにアプライ又はブロッティングメンブレンに転写されることより単に保持されるに過ぎない態様は含まれない。非共有結合による固定である場合、結合速度定数ka(単位M−1s−1)が、例えば103以上、例えば104以上、例えば103〜105、例えば104〜105の親和性を有することが好ましい。
固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、例えば、糖タンパク質を含む試料を上記の固相に接触させて捕捉することにより得ることができる。固相に接触させるべき糖タンパク質を含む試料は、糖鎖調製を迅速に行う観点から、糖タンパク質の精製(糖タンパク質をその夾雑物から分離すること)が行われていないものであってもよい。例えば、血液(例えば、血清、血漿)、リンパ液、腹腔浸出液、組織間液、脳脊髄液、腹水等の体液;B細胞、ハイブリドーマ、CHO細胞等の抗体産生細胞の培養上清;抗体産生細胞を移植した動物の腹水等が挙げられる。試料は、培養上清等の細胞培養工学的な糖タンパク質の調製物のように、タンパク質部分が均一であり、かつ糖鎖部分が非均一である、糖タンパク質のバリエーションの混合物であってもよい。
固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、容器内に用意される。固相に固定された糖タンパク質は、当該容器内で調製されることが効率的で好ましい。容器は、液体及び固相の保持並びに固相を保持した状態での液体の分離(通液)が可能な容器であれば特に限定されず、例えば、カラム、マルチウェルプレートの各ウェル、フィルタープレートの各ウェル、マイクロチューブ等が挙げられる。
糖タンパク質に作用させる糖鎖遊離酵素としては、ペプチドN−グリカナーゼ(PNGase F、PNGase A)、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ(Endo−H、Endo−F、Endo−A、Endo−M)等が挙げられる。
遊離工程は、脱糖鎖促進剤の存在下で行われてもよい。これによって、糖タンパク質からの糖鎖試料の回収率を向上させることができる。脱糖鎖促進剤は、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。酸由来型陰イオン性界面活性剤により、糖タンパク質のタンパク質部分が変性して三次構造が変化し、糖鎖遊離酵素が分解標的部位に作用しやすくなる。これによって、糖部分が容易に分解されて遊離する。
カルボン酸型陰イオン性界面活性剤としては、R1−COOX(ここで、R1は有機基を表し、Xは水素原子又は陽イオンを表す。)で表されるカルボン酸及びカルボン酸塩、並びに、R1CON(R2)−R3−COOX(ここで、R1は有機基を表し、−N(R2)−R3−COO−はアミノ酸残基を表し、Xは水素原子又は陽イオンを表す。)で表されるアミノ酸及びその塩(N−アシルアミノ酸系界面活性剤)等が挙げられる。中でも、R1CON(R2)−R3−COOX(ここで、R1は有機基を表し、−N(R2)−R3−COO−はアミノ酸残基を表し、Xは水素原子又は陽イオンを表す。)で表されるアミノ酸及びその塩(N−アシルアミノ酸系界面活性剤)が好ましい。
R1−COOXで示されるカルボン酸塩において、有機基R1は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基が挙げられる。
R1CON(R2)−R3−COOXで示されるアミノ酸又はその塩において、有機基R1及び陽イオンXは、上記のカルボン酸又はカルボン酸塩における有機基R1及び陽イオンXと同様である。
スルホン酸型陰イオン性界面活性剤は、R1−SO3X(ここで、R1は有機基を表し、Xは水素原子又は陽イオンを表す。)で表されるスルホン酸又はスルホン酸塩である。有機基R1は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基、置換又は無置換のアリール基、二価の連結基(例えば、−O−、−CO−、−CONH−、−NH−等)が介在した高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基等が挙げられる。
硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤は、R1−OSO3X(ここで、R1は有機基を表し、Xは陽イオンを表す。)で表される硫酸エステル塩である。有機基R1は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基であり、それぞれ、上述のカルボン型界面活性剤におけるR1と同じである。陽イオンXとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。
リン酸エステル型陰イオン性界面活性剤は、R1−OSO3X(ここで、R1は有機基を表し、Xは水素原子又は陽イオンを表す。)で表されるリン酸エステル又はリン酸エステル塩である。有機基R1は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基であり、それぞれ、上述のカルボン型界面活性剤におけるR1と同様である。陽イオンXとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。
脱糖鎖促進剤は、水又は緩衝液中に酸由来型陰イオン性界面活性剤が溶解又は分散された状態で用意されてもよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩;トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤;リン酸塩等が挙げられる。緩衝液は、pHが5〜10であるものが好ましい。緩衝液のpHがこの範囲内であると、糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。脱糖鎖促進剤において、水又は緩衝液中に含まれる酸由来型陰イオン性界面活性剤以外の成分としては、界面活性剤以外の金属塩等の塩類が挙げられる。
遊離工程では、糖鎖遊離酵素の至適条件(温度及びpH)が満たされた、糖タンパク質と糖鎖遊離酵素とを含む遊離反応液が調製されればよい。
遊離工程によって得られる遊離生成物は、遊離した糖鎖と、固相に結合したタンパク質とを含む。固相に結合したタンパク質は、糖タンパク質を構成していたタンパク質部分におけるアミノ酸残基間のペプチド結合が切断されていない。遊離生成物は、溶媒を含む状態で得てもよいし、特に遊離工程において開放系かつ加熱条件に供する場合には、溶媒が完全に蒸発した蒸発乾固物の状態で得てもよい。
本実施形態の方法において、遊離工程の前に前処理工程を更に備えていてもよい。これにより、タンパク質部分の分解処理を行うことなく、糖タンパク質からの糖鎖の遊離が容易になる。その結果、糖鎖遊離処理に要する時間を大幅に短縮することができる。
標識工程は、遊離工程を行った容器と同じ容器を用いて行われる。したがって、標識工程では、遊離工程を行った容器中の遊離生成物に標識化合物を含む標識試薬(標識反応液)を加え、糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る。
標識化合物は、糖鎖に対する反応性基と、糖鎖に付すべき修飾基とを有するものであれば特に限定されない。糖鎖に対する反応性基としては、オキシルアミノ基、ヒドラジド基、アミノ基等が挙げられる。修飾基は、糖鎖の分析手法に応じて当業者が適宜選択することができる。
標識工程では、遊離生成物に対して標識試薬(標識反応液)を加える。還元アミノ化による修飾を行う場合、標識試薬は、アミノ基及び芳香族基を有する標識化合物、還元剤、及び溶媒を含んでいてもよい。標識工程においては、遊離工程が行われた容器を引き続いて用いるが、標識試薬を加える際に、遊離生成物に対して洗浄等、その相対的組成(溶媒以外の成分比)を変化させる処置は行われない。なお、遊離生成物に対して、水、緩衝液及び/又は有機溶媒を加えて溶解又は希釈することは許容される。
標識工程後の容器内には、糖鎖の標識体及び固相に結合したタンパク質が存在する。したがって、標識工程によって得られる標識生成物は、糖鎖の標識体及び固相に結合したタンパク質を含むということもできる。固相に結合したタンパク質は、糖タンパク質を構成していたタンパク質部分におけるアミノ酸残基間のペプチド結合が依然として切断されていない。標識生成物は、水、緩衝液及び/又は有機溶媒中に含まれていてよい。
(糖鎖標識体の溶出)
標識工程の後、標識生成物から固液分離によって糖鎖の標識体を含む分離液を得る分離工程を行ってもよい。これにより、糖鎖の標識体を容易に分離することができる。例えば、標識生成物に溶離液を通液することで、糖鎖の標識体を溶出することができる。この場合に用いる溶離液は、水、水溶液、コロイド溶液等の水系溶液であってよい。溶離液として、固相とタンパク質部分との結合に対する切断能を有する性質を具備するものを選択してもよい(標識糖鎖の分析を例えばクロマトグラフィーによって行う場合等)し、そのような性質を具備しないものを選択してもよい(標識糖鎖の分析を例えば質量分析によって行う場合等)。これによって、糖鎖の標識体を含む分離液が得られる。
糖鎖の分析手法によっては、分離液から不要物を除去することで標識糖鎖を精製してもよい。不要物の除去は、分離液を精製用固相に通液して糖鎖の標識体を捕捉し、捕捉された糖鎖の標識体を再溶出することで行われてよい。
本実施形態の方法によって調製された糖鎖の標識体は、質量分析法(例えば、MALDI−TOF MS)、クロマトグラフィー(例えば、高速液体クロマトグラフィーやHPAE−PADクロマトグラフィー)、電気泳動(例えば、キャピラリ電気泳動)等の公知の方法により、定性的及び/又は定量的に分析することができる。糖鎖の分析においては、各種データベース(例えば、GlycoMod、Glycosuite、SimGlycan(登録商標)等)を利用することができる。
1実施形態において、本発明は、糖タンパク質を固定するための固相、前記固相を保持し糖鎖の遊離及び標識を行うための容器、並びに糖鎖遊離酵素を備える、糖タンパク質の糖鎖を調製するキットを提供する。
1実施形態において本発明は、固相に固定された糖タンパク質を含む試料が収容される容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬を導入する試薬導入部と、を備え、前記試薬導入部が、前記容器に糖鎖遊離酵素を導入する糖鎖遊離酵素導入部と、前記容器に標識試薬を導入する標識試薬導入部とを含む、糖タンパク質の糖鎖を調製する装置を提供する。なお、以下で説明する装置の構成はあくまで一例であり、本発明の権利範囲はこの構成に拘束されるものではない。
(トリプシン消化による糖鎖遊離及び遊離糖鎖精製後の糖鎖標識)
水中に1mg/mLのヒトIgG(シグマ社製)を含む抗体液10μLに、1M重炭酸アンモニウム水溶液1μLと、120mMジチオスレイトール水溶液1μLとを加え、60℃で30分間静置した。続いて、120mMヨードアセトアミド水溶液2μLを加え、室温(25℃)、遮光下で60分間静置した。続いて、3mg/mLのトリプシン液(シグマ社製)4μLを加え、37℃で16時間トリプシン消化を行った。続いて、100℃で5分間処理してトリプシンを失活させた。
(Protein A−Sepharose上での糖鎖遊離及び糖鎖標識)
リン酸緩衝液(PBS)に20μgのヒトIgG(シグマ社製)を溶解させた液を、25μLのProtein A−Sepharose(GEヘルスケア社製)に供し、PBSで洗浄した。
(Protein A結合モノリスシリカ上での糖鎖遊離及び糖鎖標識)
固相を、Protein Aを結合させたモノリスシリカ(使用体積は約25μL)に変更した点以外は実施例1と同様の操作を行った。
(前処理されたProtein A結合モノリスシリカ上での脱糖鎖促進剤を用いた糖鎖遊離及び糖鎖標識)
固相を、Protein Aを結合させたモノリスシリカ(使用体積は約5μL)に変更した点と、PNGase Fを作用させる前に500μLの0.4質量%N−ラウロイルサルコシンナトリウム(以下、「NLS」という場合がある。)水溶液を通液させた点と、糖鎖遊離時に用いた9μLのPNGase F溶液及び1μLの1M重炭酸アンモニウム水溶液を、2μLのPNGase F溶液及びNLSを含む2μLの0.2M重炭酸アンモニウム水溶液(PNGase F溶液と混合された後のNLSの終濃度は0.2質量%)に変更した点と、を除いて、実施例1と同様の操作を行った。
(Protein A結合モノリスシリカ上での脱糖鎖促進剤を用いた糖鎖遊離及び糖鎖精製後の糖鎖標識)
固相を、Protein Aを結合させたモノリスシリカ(使用体積は約5μL)に変更し、糖鎖遊離時に用いた9μLのPNGase F溶液及び1μlの1M重炭酸アンモニウム水溶液を、2μLのPNGase F溶液及びNLSを含む2μLの0.2M重炭酸アンモニウム水溶液(PNGase F溶液と混合された後のNLSの終濃度は0.2質量%)に変更した点以外は、実施例1と同様の操作により、糖鎖の遊離まで行った。
(粗抗体からの前処理Protein A結合モノリスシリカ上での脱糖鎖促進剤を用いた糖鎖遊離及び糖鎖標識)
PBSに20μgのヒトIgG(シグマ社製)を溶解させた液の代わりに、細胞培養液に20μgのヒトIgG(シグマ社製)を溶解させた粗抗体液を用いた点以外は実施例3と同様の操作を行った。
実施例4を3回行い、番号1から番号7のピーク面積及び面積比率の変動係数CV(100×(標準偏差/平均値))を導出した。その結果を表6に示す。表6により、実施例の調製方法の再現性が良好であることが示された。つまり実施例の調製方法の信頼性が高いことが示された。
比較例1(全工程30時間)、参考例1(全工程7時間)、実施例3(3時間)の番号1から番号6のピーク面積比を比較したグラフを図7に示す。図7において、横軸はピーク番号を表し、縦軸はピーク面積比率を表す。図7により、比較例1からみて実施例3は驚異的な時間短縮を達成しているにもかかわらず、良好なピークパターンが維持されたことが示された。
2AB溶液を、48mgのsodium cyanoborohydride、80mgの2−aminobenzamide、240μLの酢酸、及び560μLのDimethyl sulfoxideを混合した溶液にした点以外は、実施例1と同様の操作を行った。得られたHPLCスペクトルを図8に示す。
2AB溶液を、48mgのsodium cyanoborohydride、80mgの2−aminobenzamide、120μLの酢酸、及び40μLのDimethyl sulfoxideを混合した溶液とし、かつ、2AB標識にかかる反応時間を40分とした点以外は、実施例1と同様の操作を行った。得られたHPLCスペクトルを図9に示す。
2AB溶液を、40mgの2−ピコリンボラン、80mgの2−aminobenzamide、120μLの酢酸、及び40μLのDimethyl sulfoxideを混合した溶液(酢酸濃度75体積%)とし、かつ、2AB標識にかかる反応時間を40分とした点以外は、実施例1と同様の操作を行った。得られたHPLCスペクトルを図10に示す。
実施例5(反応時間2時間、低濃度NaBH3CN)、実施例6(反応時間40分、高濃度NaBH3CN)及び実施例7(反応時間40分、高濃度ピコリンボラン)のHPLCスペクトルにおける番号1から番号6(図1参照)のピーク面積値の合計を比較したグラフを図11に示す。図11において、縦軸はピーク面積値の合計を示す。さらに、それぞれのグラフには、実施例7のピーク面積値合計を100%とした場合の相対的なピーク面積値合計の比率も示している。図11により、還元剤NaBH3CNを高濃度とすることで反応速度の向上がみられた。さらに、還元剤としてNaBH3CNを用いた場合と比較して、還元剤としてピコリンボランを用いた場合の反応速度の向上効果が極めて高いことが示された。
2AB溶液を、40mgの2−ピコリンボラン、80mgの2−aminobenzamide、64μLの酢酸、及び96μLのDimethyl sulfoxideを混合した溶液(酢酸濃度40体積%)とし、かつ、2AB標識にかかる反応時間を40分とした点以外は実施例1と同様の操作を行った。
2AB溶液を、40mgの2−ピコリンボラン、80mgの2−aminobenzamide、80μLの酢酸、及び80μLのDimethyl sulfoxideを混合した溶液(酢酸濃度50体積%)とし、かつ、2AB標識にかかる反応時間を40分とした点以外は実施例1と同様の操作を行った。
2AB溶液を、40mgの2−ピコリンボラン、80mgの2−aminobenzamide、96μLの酢酸、及び64μLのDimethyl sulfoxideを混合した溶液(酢酸濃度60体積%)とし、かつ、2AB標識にかかる反応時間を40分とした点以外は実施例1と同様の操作を行った。
2AB溶液を、40mgの2−ピコリンボラン、80mgの2−aminobenzamide、112μLの酢酸、及び48μLのDimethyl sulfoxideを混合した溶液(酢酸濃度70体積%)とし、かつ、2AB標識にかかる反応時間を40分とした点以外は実施例1と同様の操作を行った。
2AB溶液を、40mgの2−ピコリンボラン、80mgの2−aminobenzamide、128μLの酢酸、及び32μLのDimethyl sulfoxideを混合した溶液(酢酸濃度80体積%)とし、かつ、2AB標識にかかる反応時間を40分とした点以外は実施例1と同様の操作を行った。
2AB溶液を、40mgの2−ピコリンボラン、80mgの2−aminobenzamide、144μLの酢酸、及び16μLのDimethyl sulfoxideを混合した溶液(酢酸濃度90体積%)とし、かつ、2AB標識にかかる反応時間を40分とした点以外は実施例1と同様の操作を行った。
2AB溶液を、40mgの2−ピコリンボラン、80mgの2−aminobenzamide、152μLの酢酸、及び8μLのDimethyl sulfoxideを混合した溶液(酢酸濃度95体積%)とし、かつ、2AB標識にかかる反応時間を40分とした点以外は実施例1と同様の操作を行った。
実施例8(酢酸濃度40体積%)〜実施例14(酢酸濃度95体積%)で得られたHPLCスペクトルを、実施例7(酢酸濃度75体積%)のHPLCスペクトルとともに図12及び図13に示す。さらに、実施例7〜14のHPLCスペクトルにおける番号1から番号6(図1参照)のピーク面積値の合計を比較したグラフを図14に示す。図14において、縦軸はピーク面積値の合計を示し、横軸は酢酸濃度を示す。さらに、それぞれのグラフには、実施例7のピーク面積値合計を100%とした場合の相対的なピーク面積値合計の比率も示している。
実施例7と同じ2AB溶液(40mgの2−ピコリンボラン、80mgの2−aminobenzamide、120μLの酢酸、及び40μLのDimethyl sulfoxideを混合した溶液(酢酸濃度75体積%))を用い、2AB標識にかかる反応時間を5分、10分、15分、20分、25分、30分及び40分として場合それぞれについて、HPLCスペクトルを得た。得られたHPLCスペクトルを図15に示す。
実施例15で得られたHPLCスペクトルにおける番号1から番号6(図1参照)のピーク面積値の合計を比較したグラフを図16に示す。図16において、縦軸はピーク面積値の合計を示し、横軸は反応時間を示す。さらに、それぞれのグラフには、反応時間40分の場合のピーク面積値合計を100%とした場合の相対的なピーク面積値合計の比率も示している。
(トリプシン消化による糖鎖遊離)
水中に1mg/mLのヒトIgG(シグマ社製)を含む抗体液10μLに1M重炭酸アンモニウム水溶液1μLと120mMジチオスレイトール水溶液1μLを加え、60℃で30分間静置した。続いて、120mMヨードアセトアミド水溶液2μLを加え、室温(25℃)、遮光下で60分間静置した。続いて、3mg/mLのトリプシン液(シグマ社製)4μLを加え、37℃で16時間トリプシン消化を行った。続いて100℃で5分間処理してトリプシンを失活させた。
(前処理なし、脱糖鎖促進剤の非存在下での糖鎖遊離)
PBSに20μgのヒトIgG(シグマ社製)を溶解させた液を、Protein Aカラム(モノリスシリカの表面にProtein Aが固定された担体。担体の体積:約5μL。なお、体積には、シリカ自体の体積に、メソ孔及びマクロ孔の体積も含む。)に供し、PBSで洗浄した。続いて、0.5mU/mLのPNGase F溶液(Takara社製)1.5μL、0.1M重炭酸アンモニウム1.5μLをProtein Aカラムに加え、50℃で10分間、糖鎖遊離反応を行い、糖鎖を遊離させた。
得られた溶出液1μLについて、上述した表1に示す条件でHPLC測定を行った。得られたHPLCスペクトルを図18に示す。図18に示すように、図17において矢印で示されるバイセクティングGlcNAcを有するシアロ糖鎖及びさらにジシアロ糖鎖を含むピーク(図8中矢印で示されるピーク)が検出されなかった。
(前処理なし及び脱糖鎖促進剤存在下での糖鎖遊離)
PBSに20μgのヒトIgG(シグマ社製)を溶解させた液を、Protein Aカラム(モノリスシリカの表面にProtein Aが固定された担体。担体の体積:約5μL)に供し、PBSで洗浄した。
(前処理あり及び脱糖鎖促進剤存在下での糖鎖遊離)
PBSに20μgのヒトIgG(シグマ社製)を溶解させた液を、Protein Aカラム(モノリスシリカの表面にProtein Aが固定された担体。担体の体積:約5μL)に供し、PBSで洗浄した。
(前処理剤濃度の変動による回収率の検討)
前処理に用いたNLSの濃度を0.4重量%又は0.8重量%に変更したことを除いて、実施例16と同様の操作を行い、糖鎖をHPLCで検出した。
(前処理剤量の変動による回収率の検討)
前処理に用いたNLS溶液のNLS濃度を0.4質量%とし、NLS溶液の量を10μL、50μL、200μL又は500μLとしたことを除いて、実施例16と同様の操作を行い、糖鎖をHPLCで検出した。
Claims (12)
- 容器内で、固相に固定された糖タンパク質を含む試料に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、
前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、
前記糖タンパク質が抗体であり、前記固相が、プロテインA、プロテインG、プロテインL、プロテインH、プロテインD、プロテインArpからなる群より選ばれるリガンドを表面に有する、糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。 - 前記遊離工程を開放系かつ加熱条件下で行う、請求項1に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
- 前記標識試薬が、2−アミノベンズアミド、還元剤及び溶媒を含む、請求項1又は2に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
- 前記還元剤がピコリンボランである、請求項3に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
- 前記溶媒がプロトン性化合物を含む、請求項3又は4に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
- 前記溶媒が、前記プロトン性化合物よりも沸点が高い非プロトン性化合物を更に含む、請求項5に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
- 前記遊離工程の後に、固液分離によって前記遊離生成物を含む分離液を得る分離工程を更に含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
- 前記標識工程の後に、固液分離によって前記糖鎖の標識体を含む分離液を得る分離工程を更に含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
- 糖タンパク質を固定するための固相、前記固相を保持し糖鎖の遊離及び標識を行うための容器、並びに糖鎖遊離酵素を備え、前記固相が、プロテインA、プロテインG、プロテインL、プロテインH、プロテインD、プロテインArpからなる群より選ばれるリガンドを表面に有する、糖タンパク質の糖鎖を調製するキット。
- 固相に固定された糖タンパク質を含む試料が収容される容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬を導入する試薬導入部と、を備え、
前記糖タンパク質が抗体であり、前記固相が、プロテインA、プロテインG、プロテインL、プロテインH、プロテインD、プロテインArpからなる群より選ばれるリガンドを表面に有し、
前記試薬導入部が、前記容器に糖鎖遊離酵素を導入する糖鎖遊離酵素導入部と、前記容器に標識試薬を導入する標識試薬導入部とを含む、糖タンパク質の糖鎖を調製する装置。 - 前記容器の収容物を固液分離する固液分離部を更に備える、請求項10に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する装置。
- 前記容器の収容物の温度を調節する温度調節部を更に備える、請求項10又は11に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する装置。
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