JP6138047B2 - サイトメガロウイルスgB抗原 - Google Patents
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Description
配列番号1-CMV AD169株由来の全長gBポリペプチドのアミノ酸配列。
本発明は、優れた免疫原性及び良好な加工特徴を示す新規CMV gBポリペプチドに関する。本発明のgBポリペプチドは、ワクチンなどの免疫原性組成物への包含のための抗原として特に適切である。詳細には、本発明のgBポリペプチドは、改善された均一な生成物プロファイルを示す。実際、本発明者らは発現において、膜貫通ドメインを欠いているgBポリペプチド(gB-DeltaTM)などの先行技術のgBポリペプチドが高分子量多量体を含む、集団を不均一にするさまざまなサイズの多量体に会合したことを認めた。本発明者らは多量体プロファイルが安定でなく、所与のサイズの多量体の割合が実験ごとに変化したことも認めた。この種の可変性と不安定性はワクチン製剤の観点においては許容されない。したがって改善された均一かつ安定な生成物プロファイルを表すCMV gBポリペプチドに対する必要性は残っている。同様に高分子量多量体への凝集も(詳細には凝集がポリペプチドの低溶解性形態をもたらす場合があることから)組換えポリペプチドの続く精製のプロセスに悪影響を有する場合がある。したがって改善された加工特徴を表すCMV gBポリペプチドに対する必要性は残っている。
性度は、カイト及びドーリトルスケールなどの疎水性スケールを用いて決定され得る(Kyte et al.1982.J.Mol.Bio.157:105-132)。アミノ酸155Y.I.Y157を包含するFL1ドメインは、そのスケールで+1.9を達成する。一実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドにおいて、配列番号1に記載の配列の位置155〜157に、又は他のCMV gBポリペプチドの対応する位置にあるアミノ酸Y.I.Yのストレッチは、カイト及びドーリトルスケール(Kyte and Doolittle scale)を用いて測定された疎水性スコア-3未満、詳細には-7未満、より詳細には-8未満を有する3アミノ酸のストレッチで置換される。アミノ酸のストレッチ全体でのスコアが上に記載の値に達する限り三つすべてのアミノ酸が同時に置換されなくてもよい。例えば3アミノ酸長のストレッチの一つだけの又は二つのアミノ酸が置換される場合があり、スコアは、置換されたアミノ酸(すなわち一つ又は二つ)の性質に元(二つ又は一つ)の性質をそれぞれ足したものに基づいて算出される。
れら二つの刊行物は、AD169 CMV gBの推定膜貫通ドメインが少なくともアミノ酸751-771及び場合によりアミノ酸714-771を含むことを示唆する。本発明の意味では、CMV gBポリペプチドの膜貫通ドメインは、配列番号1に記載の配列の少なくともアミノ酸701-775又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置のアミノ酸を包含し、したがって74アミノ酸長である。
OM174(2-デオキシ-6-o-[2-デオキシ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラ-デカノイルアミノ]-4-o-ホスホノ-□-D-グルコピラノシル]-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-□-D-グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート)(WO 95/14026)
OM 294 DP(3S,9 R)-3--[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9(R)-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1,10-ビス(ジヒドロゲノホスフェート)(WO 99/64301及びWO 00/0462)
OM 197 MP-Ac DP(3S-,9R)-3-□(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1-ジヒドロゲノホスフェート10-(6-アミノヘキサノエート)(WO 01/46127)
を含む。
a)N末端からC末端への方向で、融合ループ1(FL1)ドメイン及び融合ループ2(FL2)ドメインを含む細胞外ドメインの少なくとも一部分、場合により膜貫通ドメイン(TM)の少なくとも一部分、並びに細胞質ドメインの少なくとも一部分を含み、FL1ドメインの少なくとも一つのアミノ酸が置換又は欠失されており、存在する場合はTMドメイン又はその部分が非機能性である、サイトメガロウイルス(CMV) gBポリペプチド。
(1)融合ループ1(FL1)ドメイン及び融合ループ2(FL2)ドメインを含むgBタンパク質細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むサイトメガロウイルス(CMV)gBポリペプチドであって、前記FL1及びFL2ドメインの少なくとも一つが少なくとも一つのアミノ酸欠失又は置換を含む、前記サイトメガロウイルス(CMV)gBポリペプチド。
(2)前記細胞外ドメインのアミノ酸の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%を含むか又は前記細胞外ドメイン全体を含む、(1)に記載のCMV gBポリペプチド。
(3)非機能性膜貫通(TM)ドメインを含む、(1)又は(2)に記載のCMV gBポリペプチド。
(4)前記TMドメインの少なくとも一部分の欠失を含む、(3)に記載のCMV gBポリペプチド。
(5)前記TMドメインのアミノ酸の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%が欠失されている、(4)に記載のCMV gBポリペプチド。
(6)配列番号1に記載の配列の位置725〜775の又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置のアミノ酸の欠失を含む、(4)又は(5)に記載のCMV gBポリペプチド。
(7)配列番号1に記載の配列の位置701〜775の又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置のアミノ酸の欠失を含む、(4)又は(5)に記載のCMV gBポリペプチド。
(8)前記FL1ドメインに少なくとも一つのアミノ酸欠失又は置換を含む、(1)〜(7)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド。
(9)前記FL2ドメインに少なくとも一つのアミノ酸欠失又は置換を含む、(1)〜(8)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド。
(10)前記FL1及びFL2ドメインの両方に少なくとも一つのアミノ酸欠失又は置換を含む、(1)〜(7)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド。
(11)細胞質ドメインの少なくとも一部分の欠失を含む、(1)〜(10)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド。
(12)前記細胞質ドメインの少なくとも一つの疎水性アミノ酸領域の欠失を含む、(11)に記載のCMV gBポリペプチド。
(13)配列番号1に記載の配列のアミノ酸825〜877の又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置のアミノ酸の欠失を含む、(12)に記載のCMV gBポリペプチド。
(14)前記細胞質ドメインのアミノ酸の少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の欠失又は前記細胞質ドメイン全体の欠失を含む、(11)に記載のCMV gBポリペプチド。
(15)前記融合ループFL1ドメインにおける少なくとも一つのアミノ酸置換が、配列番号1に記載の配列の位置155〜157に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるY.I.Yから選択される少なくとも一つのアミノ酸の、芳香族アミノ酸以外の極性アミノ酸での置換を含む、(1)〜(14)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド。
(16)前記置換が、配列番号1に記載の配列の位置155〜157又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるY.I.Yから選択される少なくとも二つのアミノ酸の、芳香族アミノ酸以外の極性アミノ酸での置換を含む、(15)に記載のCMV gBポリペプチド。
(17)前記極性アミノ酸がリシン(K)、ヒスチジン(H)及びアルギニン(R)から成る正に荷電したアミノ酸の群から選択される、(15)又は(16)に記載のCMV gBポリペプチド。
(18)配列番号1に記載の配列の位置156に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるイソロイシン(I)がヒスチジン(H)で置換されている、(17)に記載のCMV gBポリペプチド。
(19)配列番号1に記載の配列の位置157に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるチロシン(Y)がアルギニン(R)で置換されている、(17)又は(18)に記載のCMV gBポリペプチド。
(20)配列番号1に記載の配列の位置155に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるチロシン(Y)がグリシン(G)で置換されている、(15)〜(19)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド。
(21)配列番号1に記載の配列の融合ループFL1ドメインにおける位置155〜157に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるアミノ酸Y.I.Yがアミノ酸G.H.Rでそれぞれ置換されている、(1)〜(14)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド。
(22)配列番号1に記載の配列の融合ループFL1ドメインにおける位置155〜157に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるアミノ酸Y.I.Yがカイト及びドーリトルスケール(Kyte and Doolittle scale)で測定される疎水性スコア-3未満、-7未満、-8未満を有するアミノ酸のストレッチで置換されている、(1)〜(14)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド。
(23)前記融合ループFL2ドメインにおける少なくとも一つのアミノ酸置換が、配列番号1に記載の配列の位置240〜242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるW.L.Yから選択される少なくとも一つのアミノ酸の、リシン(K)、ヒスチジン(H)及びアルギニン(R)から成る群から選択される正に荷電したアミノ酸での置換を含む、(1)〜(22)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド。
(24)配列番号1に記載の配列の位置240〜242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるW.L.Yから選択されるアミノ酸が、ヒスチジン(H)で置換されている、(23)に記載のCMV gBポリペプチド。
(25)配列番号1に記載の配列の位置242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるチロシン(Y)が、ヒスチジン(H)で置換されている、(23)又は(24)に記載のCMV gBポリペプチド。
(26)配列番号1に記載の配列の融合ループFL2ドメインにおける位置240〜242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるアミノ酸W.L.Yが、アミノ酸A.F.Hでそれぞれ置換されている、(1)〜(22)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド。
(27)リーダー配列の少なくとも一部分の欠失を含む、(1)〜(26)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド。
(28)リーダー配列のアミノ酸の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又はリーダー配列全体の欠失を含む、(27)に記載のCMV gBポリペプチド。
(29)リーダー配列のアミノ酸の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又はリーダー配列全体の欠失を含むCMV gBポリペプチド。
(30)(1)〜(26)のいずれか1に記載の一つ以上の特徴をさらに含む、(29)に記載のCMV gBポリペプチド。
(31)配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号19、配列番号20及び配列番号21に記載の配列から成る群から選択される配列を有するCMV gBポリペプチド。
(32)CMV gBポリペプチドの集団を含む調製物であって、前記集団の少なくとも50%、少なくとも60%又は少なくとも70%が三量体形態である、前記調製物。
(33)適切な薬学的担体と混合した(1)〜(31)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物。
(34)pUL131、gL、gH、pUL128、pUL130又はこれらのいずれかの組合せから成る群から選択される少なくとも1個以上のCMV抗原をさらに含む、(33)に記載の免疫原性組成物。
(35)アジュバントをさらに含む、(33)又は(34)に記載の免疫原性組成物。
(36)アジュバントがリポソーム製剤中の3D-MPL及びQS21を含む、(35)に記載の免疫原性組成物。
(37)アジュバントが水中油型乳剤を含む、(35)に記載の免疫原性組成物。
(38)(1)〜(31)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(39)配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15及び配列番号17に記載の配列から成る群から選択される配列を有するポリヌクレオチド。
(40)(38)又は(39)に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
(41)(40)に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
(42)CMV感染の予防及び/又は治療における使用のための、(1)〜(31)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド又は(33)〜(37)のいずれか1に記載の組成物。
(43)CMV感染を予防及び/又は治療するための医薬の調製における(1)〜(31)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチド又は(33)〜(37)のいずれか1に記載の組成物の使用。
(44)新生児における先天性CMV感染を予防するための(42)又は(43)に記載の使用。
(45)(1)〜(31)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチドを含む組成物又は(33)〜(37)のいずれか1に記載の組成物の免疫学的有効量を対象に投与するステップを含む、CMVに対する免疫応答を誘発するための方法。
(46)(1)〜(31)及び(33)〜(37)のいずれか1に記載のCMV gBポリペプチドを含む組成物の免疫学的有効量を対象に投与するステップを含む、新生児においてCMVの先天性感染を予防するための方法。
(47)対象がCMV血清陰性対象である、(42)〜(44)のいずれか1に記載の使用又は(45)若しくは(46)に記載の方法。
(48)前記CMV血清陰性対象が出産年齢の女性である、(47)に記載の使用又は方法。
(49)前記CMV血清陰性対象が青年期の女子である、(47)に記載の使用又は方法。
本発明は続く非限定的実施例を参照することによってさらに記載される。
CMV gBポリペプチド
下に示すすべてのgBポリペプチド変異体(模式的表示について図1及び2を参照されたい)は、CMV株AD169由来のgBのアミノ酸配列に由来する。したがって突然変異の位置を特定する場合のアミノ酸の番号付けは配列番号1に記載のAD169 CMV gBの配列に関連する。同様に下に記載のそれらそれぞれが含有する特定の突然変異に加えて、続く構築物は(i)すべて膜貫通ドメインが除去(欠失)されている(アミノ酸701から775の欠失)及び(ii)すべて次の点突然変異:アミノ酸Sで置換されたアミノ酸R50及びR357を含む。
gB-SLP12変異体は、gBの推定融合ループ、FL1及びFL2それぞれを標的化する2系列の点突然変異を含む。FL1は、アミノ酸155Y.I.Y157をアミノ酸155G.H.R157で置換することによって突然変異させ、一方FL2はアミノ酸240W.L.Y242をアミノ酸240A.F.H242で置換することによって突然変異させた。この構築物は830アミノ酸長のタンパク質をコードする。gB-SLP12の完全アミノ酸配列は配列番号3に示される。
gB-SLP12遺伝子配列(配列番号6)はGeneart companyによって合成された。コード配列をCHO細胞での発現のためにコドン最適化した。HindIII及びBamHI制限部位を5'末端(開始コドンの前)及び3'末端(終止コドンの直後)にそれぞれ導入した。コドン最適化遺伝子配列は、第一推定融合ループ(155G.H.R157で置き換えられた155Y.I.Y157)及び第二推定融合ループ(240A.F.H242で置き換えられた240W.L.Y242)の両方において突然変異を保有する。合成DNA断片は、KpnI及びSacIクローニング部位を用いてAD169-gB-SLP12-pMAプラスミドを生成するようにpMAベクター(GeneArt所有plasmid)にクローン化された2558bp長DNA挿入物として受け取った。AD169-gB-SLP12-pMAプラスミドをHindIII及びBamHIで制限した。gB-SLP12遺伝子を含有する2530bp DNA断片をゲル精製し、哺乳動物発現ベクターpMax(AmaxaのpMaxCloning vectorの改変バージョン)にライゲーションした。pMaxCloning vector骨格は、Amaxa商業的ベクターの多重クローニング部位(KpnIとHindIIIとの間)に存在するATG開始コドンを除くために改変されている。自動化DNA配列決定機による配列検証後、pMax-AD169-gB-SLP12組換えプラスミドをCHO-S細胞を一過的に形質移入するために用いた。
アミノ酸Pro825からLys877を包含する一つの疎水性領域の欠失をgB-SLP12変異体に導入し、gB-SLP12-Del2変異体を生成した。この構築物は777アミノ酸長のタンパク質をコードする。gB-SLP12-Del2変異体の完全なアミノ酸配列を配列番号4に示す。gB-SLP12-Del2をコードするヌクレオチド配列を配列番号8に示す。
AD169-gB-SLP12コード配列中に存在する特有の制限部位HindIII及びClaIを包含する2159bp DNA断片を、AD169-gB-SLP12-pMAプラスミドを鋳型として並びにプライマーSLP-Fw(配列番号22)(5'-GAAAGCGGGCAGTGAGCGGAAGGC-3')及びSLP-Rv(配列番号23)(5'-TGTCCTCCACGTACTTCACGCGCTGC-3')を用いてPCRによって増幅した。AD169-gB-SLP12-Del2遺伝子のC末端部分もClaI及びSacI制限部位を包含する745bp断片として、Del2-pMAベクターを鋳型として並びにプライマーDel-Fw(配列番号24)(5'-CCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCA-3')及びDel-Rv(配列番号25)(5'-CCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGC-3')を用いてPCR増幅した。gB-SLP12-Del2遺伝子のC末端部分をコードする合成DNA断片を保有しているDel2-pMAベクターは、GeneArt companyによって構築された。適切な酵素での制限後、PCR断片をHindIII及びSacIで制限したpMaxベクターにクローン化した。自動化DNA配列決定機による配列検証後、pMax-AD169-gB-SLP12組換えプラスミドをCHO-S細胞を一過的に形質移入するために用いた。
アミノ酸Pro825からLys877を包含する一つの疎水性領域の欠失をgB-SLP1変異体に導入し、gB-SLP1-Del2変異体を生成した。この変異体は、777アミノ酸長タンパク質をコードする。gB-SLP1-Del2変異体の完全なアミノ酸配列を配列番号5に示す。
gB-SLP1遺伝子は、GeneArtによって最初に合成された。コドン最適化遺伝子配列は、第一推定融合ループ(155G.H.R157で置き換えられた155Y.I.Y157)に突然変異を保有する。この合成遺伝子は、KpnI及びSacIクローニング部位を用いてAD169-gB-SLP1-pMAプラスミドを生成するようにpMAベクターにクローン化された2558bp DNA断片として受け取った。発現ベクターpMax-AD169-gB-SLP1-Del2をAD169-gB-SLP1-pMA及びベクタープラスミドDel2-pMAから構築した。pMA-gB-SLP21ベクターをHindIII及びClaIで制限し、SLP1-Del2タンパク質のN末端部分をコードする1964bp DNA断片をゲル精製によって単離した。ベクタープラスミドDel2-pMAをClaI及びSacIで消化し、gB-SLP1-Del2タンパク質のC末端部分をコードする420bp DNA断片をゲル精製によって単離した。これら二つの断片をHindIII及びSacIで制限したpMax発現ベクターに一緒にライゲーションし、最終的発現ベクターpMax-AD169-gB-SLP1-Del2を生成した。自動化DNA配列決定機による配列検証後、pMax-AD169-gB-SLP1-Del2組換えプラスミドをCHO-S細胞を一過的に形質移入するために用いた。gB-SLP1-Del2をコードするヌクレオチド配列を配列番号7に示す。
アミノ酸793で始まる細胞質ドメインのC末端部分の欠失及び膜貫通ドメインのアミノ酸701-775の欠失をgB-SLP12-Delta113変異体で実施した。変異体は717アミノ酸長タンパク質をコードする。gB-SLP12-Delta113変異体の完全なアミノ酸配列を配列番号12に示す。
pTT5-gB-SLP12-Delta113発現ベクターを構築するために用いた戦略は続くとおりである。最初にpMax-AD169-gB-SLP1ベクター(1.1.1節を参照されたい)をHindIII及びClaIで制限した。得られた1970bp gB断片(gB-SLP12-Delta113構築物のN末端部分に対応する)をゲル精製で単離した。ClaI及びBamHI部位(終止コドンの直後)を包含するgB-SLP12-Delta113構築物のC末端はGeneartによって合成され、pMAベクター(GeneArt所有plasmid)にクローン化された230bp長DNA挿入物(new-2と名付けた)として受け取った。New-2-pMAベクターをClaI及びBamHIで制限し、230bp挿入物をゲル精製した。二つのゲル精製DNA断片を、予めHindIII及びBamHIで制限したpMax発現ベクターに一緒にライゲーションし、pMax-AD169-gB-SLP12-Delta113プラスミドを生成した。次いでAD169-gB-SLP12-Delta113構築物の位置50及び357のセリンをStratagene(No. 200513)からの「QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis」キットを用いて両方とも天然のアルギニンに復帰させた。得られたプラスミドを(配列検証後)制限酵素HindIII及びBamHIで消化した。2200bp gB断片をゲル精製し、予めHindIII及びBamHIで制限したpTT5ベクター(NRC、カナダ)にライゲーションし、最終pTT5-gB-SLP12-Delta113発現ベクターを生成した。このベクターをCHO-S細胞を一過的に形質移入するために用いた。gB-SLP12-Delta113をコードするヌクレオチド配列を配列番号11に示す。
アミノ酸725で始まる膜貫通ドメインの部分の欠失及び細胞質ドメイン全体の欠失をgB-SLP12-Delta725で実施した。この変異体は724アミノ酸長タンパク質をコードする。gB-SLP12-Delta725変異体の完全なアミノ酸配列を配列番号10に示す。
最初にgB-SLP12-Del2構築物(1.2節を参照されたい)の位置50及び357のセリンをStratagene(No. 200513)からの「QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis」キットを用いて両方とも天然のアルギニンに復帰させた。得られたプラスミドを(配列確認後)制限酵素HindIII及びClaIで消化し、得られた1970-bp gB断片をゲル精製によって単離した。ClaI及びBamHI制限部位(配列番号26)を包含し、続く配列:
ATCGATCCCCTGGAGAACACCGACTTCAGGGTGCTGGAGCTGTACTCCCAGAAGGAACTGAGGTCCAGCAACGTGTTCGACCTGGAGGAAATCATGAGAGAGTTCAACAGCTACAAGCAGCGCGTGAAGTACGTGGAGGACAAGGTGGTGGACCCCCTGC CCCCCTACCT GAAGGGCCTGGACGACCTGA TGAGCGGACTCGGGGCTGCTGGAAAGGCCTGAGGATCC
を含むPCR断片も生成した。1970bp HindIII-ClaI断片並びにClaI及びHindIIIで制限したPCR DNAを一緒にpTT5ベクター(NRC、カナダ)のHindIIIとBamHIとのクローニング部位の間に最終pTT5-gB-SLP12-Delta725発現ベクターを生成するためにライゲーションした。自動化DNA配列決定機による配列確認後、pTT5-gB-SLP12-Delta725組換えプラスミドをCHO-S細胞を一過的に形質移入するために用いた。gB-SLP1-Delta725をコードしているヌクレオチド配列を配列番号9に示す。
この変異体は683アミノ酸長タンパク質をコードしている。gB-SLP12-Delta725-LVL759の完全なアミノ酸配列を配列番号14に示す。
pTT5-gB-SLP12-Delta725-RR-leader2プラスミドをStratagene (No.200522)からのQuickChange II XL Site-Directed Mutagenesisキット並びにプライマーCAN1498 5'-gtgcatcgtgtgcctgggatccgaggccgtgagccacagg-3'及びCAN1499 5'-cctgtggctcacggcctcggatcccaggcacacgatgcac-3'を用いて突然変異させ、中間体プラスミドpTT5-649-13を得た。この中間体プラスミドを同じQuickChange II XL Site-Directed Mutagenesisキット並びにプライマーCAN1650 5'-gtgaacctgtgcatcgtgtgcctggccctggccagccaccgggccaacgagacaa-3'及びCAN1651 5'-ttgtctcgttggcccggtggctggccagggccaggcacacgatgcacaggttcac-3'を用いて突然変異させ、最終発現ベクターpTT5-SLP12-725-LVL759を得た。gB-SLP12-Delta725-LVL759をコードするヌクレオチド配列を配列番号13に示す。
この変異体は683アミノ酸長タンパク質をコードしている。gB-SLP12-Delta725-LVL776変異体の完全なアミノ酸配列を配列番号16に示す。
上の中間体プラスミドpTT5-694-13を同じQuickChange II XL Site-Directed Mutagenesisキット並びにプライマーCAN1648 5'-cctgtgcatcgtgtgcctgggagccctggccagccaccgggccaacgagacaatc-3'及びCAN1649 5'-gattgtctcgttggcccggtggctggccagggctcccaggcacacgatgcacagg-3'を用いて突然変異させ、さらなる中間体プラスミドpTT5-LVL758-1を得た。この中間体プラスミドを同じQuickChange II XL Site-Directed Mutagenesisキット並びにプライマーCAN1697 5'-tggtgtgcgtgaacctgtgcatcgtgctcctgggagccctggcccaccgggccaacgagacaatctac-3'及びCAN1698 5'-gtagattgtctcgttggcccggtgggccagggctcccaggagcacgatgcacaggttcacgcacacca-3'を用いて突然変異させ、最終発現ベクターpTT5-gB-SLP12-Delta725-LVL776を得た。gB-SLP12-Delta725-LVL759をコードするヌクレオチド配列を配列番号15に示す。
gB-SLP12-Delta725-CD33変異体は677アミノ酸長タンパク質をコードする。この構築物は、ヌクレオチド1から192(シグナル配列及び成熟gBタンパク質の最初の64アミノ酸)を包含するgB遺伝子のN末端部分がCD33のシグナル配列で置き換えられたことを除いてgB-SLP12-Delta725構築物とほとんど同一である(Taylor et al.1999,Vol.274,No.17:p11505-11512)。gB-SLP12-Delta725-CD33変異体の完全なアミノ酸配列を配列番号18に示す。
gB-SLP12-Delta725-CD33遺伝子を、pTT5-gB-SLP12-Delta725プラスミドを鋳型として、並びにプライマーCD33(配列番号27)(5'-AATCAAAAGCTTACTAGTGCCGCCACCATGGCCCCCCTGCTGCTTCTGCTGCCCCTGCTTTGGGCAGGGGCCCTGGCCCACCGGGGCAACG-3')及びCMO578(配列番号28)(5'-GTAATAGGATCCGGTACCTCATCAGGCCTTTCCAGCAG-3')を用いるPCR増幅によって構築した。フォワードプライマーはHindIII部位及びCD33シグナル配列を含有する。リバースプライマーは終止コドン及びBamHI部位を含有する。適切な酵素での制限後、PCR断片をHindIII及びBgIIIで制限したpEE14ベクターにクローン化した。pEE14-gB-SLP12-Delta725-CD33組換えプラスミドを配列検証後に選択した。最終的にgB-SLP12-Delta725-CD33遺伝子を次のとおりpTT5ベクターにサブクローン化した。コード配列をpEE14-gB-SLP12-Delta725-CD33ベクターを鋳型として、並びにプライマーCD33F(配列番号29)(5'-AATCAAAAGCTTACTAGTGCCGCCACCATGGCCCCCCTGCTG-3')及びEcto-Rv(配列番号30)(5'-GACTTATAGGATCCTCATCAGTGGTGGTGATGATGGTGGCCGCCGGCCTTTCCAGCAGC-3')を用いてPCR増幅した。フォワード及びリバースプライマーはHindIII及びBamHIクローニング部位をそれぞれ含有する。増幅されたDNA及びpTT5ベクターをライゲーションの前にHindIII及びBamHIで制限した。得られたpTT5-gB-SLP12-Delta725-CD33発現ベクターを配列検証後にCHO-S細胞を一過的に形質移入するために用いた。gB-SLP12-Delta725-CD33をコードするヌクレオチド配列を配列番号17に示す。
CMV gBポリペプチドの発現
上に記載のさまざまなDNA構築物をInvitrogenのFreeStyle(商標)MAX CHO発現システムを用いてCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞に一過的に形質移入した。ポリペプチドgB-DeltaTMをコードする構築物を対照として用いた。gB-DeltaTMのアミノ酸配列を配列番号2に示す。gB-DeltaTMを発現するために用いた発現ベクターはpMax-AD169であった。FreeStyle(商標)MAX CHOシステムは、CHO-S細胞系(懸濁に適応させた一般的CHO-K1細胞系の分離サブクローン)及び形質移入試薬としての合成カチオン性脂質に基づくポリマーを用いる。形質移入のためのプラスミドDNAをQiagen Maxiprepキット(Qiagen、Valencia、CA)を製造者のプロトコールに従って用いて単離した。形質移入複合体をInvitrogenによって推奨されるとおり調製した。簡潔には、37.5μgのプラスミド及び37.5μlのFreeStyle MAX形質移入試薬を別々に0.6mlのOpti-Pro(商標)SFM培地中に希釈した。直後に希釈したFreeStyle MAX形質移入試薬を希釈したDNA溶液に添加した。DNA-FreeStyle MAX混合物を細胞培養物に添加する前に10分間、室温でインキュベートした。形質移入した培養物を37℃で3日間インキュベートした。次いで培養物を29℃でさらに3日間維持した。形質移入後6日目に、懸濁液中の形質移入された細胞及び細胞培養培地を含む細胞培養物各1mlを回収した。細胞培養上清を12,000gでの遠心分離によって懸濁された細胞から分離した。上清を回収し、細胞性ペレットを溶解緩衝液(1%Triton-X100を補充したPBS)1mlに溶解した。12,000g、4℃、5分間の遠心分離によって細胞可溶化液から不溶性物質を除去した。培養上清及び可溶化した細胞性画分の一定分量(15μl)をMOPS緩衝液を用いてCriterion XT 4-12% Bis Tris gel(Biorad)にかけた。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、膜を抗gB抗体MAb 27-156で探索した(Spaete et al., 1990)。代替的に発現及び分泌レベルを抗gB抗体を用いるElisaアッセイによって検出した。アッセイは96ウエルプレートで実施した。プレートをポリクローナル抗gB抗体(抗体はポリペプチドgB**-EP0759995に記載-をウサギに注射することによって産生した)でコートした。3%スキムミルク、1時間、37℃での飽和ステップ後、抗体を一晩4℃でインキュベートした。次いでウエルを4回洗浄した。検査する各試料の2倍希釈系列の一連の10個(所与のgB構築物で形質移入した上清及び細胞性画分)を、コートしたプレートにビオチンコンジュゲートしたモノクローナル抗gB抗体(抗体はCMVウイルス全体をマウスに注射することによって産生した)の存在下で2時間、37℃で添加した。PBS/0.1% Tween 20で4回洗浄後、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ100μlを添加し、30分間、37℃でインキュベートした。プレートをPBS/0.1% Tween 20で4回及び水で1回洗浄した。次いでプレートを0.1Mクエン酸緩衝液pH5.8(25%)中の75%テトラ-メチル-ベンジジン(TMB)の100μlで10分間、37℃でインキュベートした。この反応を100μlの0.4N H2SO4で停止し、比色定量を分光光度計450/620nmで読み取った。濃度が既知である精製gB-DeltaTMの以前のロットをこの実験において標準として用いた。ソフトウエアSoftMax Proを用いて検査した各試料の濃度を定量した。
図3に示すのは、独立して実施した3回の実験からの代表的ウエスタンブロットである。レーンA、B、C及びDは、gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP1-Del2及びgB-SLP12-Del2で形質移入した培養物の細胞性画分をそれぞれ表す。前記細胞性画分中に存在するgBのレベルは、細胞内にあるgBのレベルを示す。レーンE、F、G及びHは、gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP1-Del2及びgB-SLP12-Del2で形質移入した培養物の上清をそれぞれ表す。前記上清中に存在するgBのレベルは、分泌されたgBのレベルを示す。レーンB、C及びDに存在するgBのレベルをレーンAに存在するgBのレベルと比較すると、細胞内gBのレベルが融合ループを突然変異させても変化しないままであることが示される、すなわち本発明のポリペプチドは、インタクトな融合ループを有するgB-DeltaTM(すなわち先行技術のポリペプチド)と比較して融合ループ内の突然変異が分泌に影響しないことを示唆している。実際にレーンF、G及びHに存在するgBのレベルをレーンEに存在するgBのレベルと比較すると、本発明のgBポリペプチド(突然変異した融合ループを有する)の発現及びそれらの分泌は、先行技術のgBポリペプチド(インタクトな融合ループを有するgB-DeltaTM)の発現及び分泌と少なくとも同様に効率的であることが認められる。
Elisaアッセイによって得られた結果の定量及びグラフの形態での表示を図4に示す-黒色バーはそれぞれgB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113及びgB-Delta725で形質移入した培養物の細胞性画分を表し、灰色バーは同じ培養物の上清を表す。したがって発現された変異体ごとの灰色バーと黒色バーとの合計は、CHO細胞への形質移入後に達成された総発現レベルを表す。gB-DeltaTMに関して、発現されたポリペプチド集団内で、ポリペプチドのおよそ半分が細胞内(灰色バー)に保持され、ポリペプチドのおよそ半分が分泌された(黒色バー)ことを認めた。驚くべきことにgB-SLP12が発現された場合、総発現レベルがgB-DeltaTMよりも顕著に(およそ2倍)高かったことが認められた。さらに細胞内形態及び分泌形態のそれぞれのレベルを比較すると、80%を超えるポリペプチドが分泌された一方で10-20%だけが細胞内に残ったことが認められ、gB-SLP12もgB-DeltaTMよりもより効率的に分泌されたことを示唆している。この結果は、融合ループの突然変異は発現及び分泌に肯定的な影響を有することを示唆している。gB-DeltaTMを超える高い発現及び分泌レベルは、ポリペプチドgB-SLP12-Delta113及びgB-SLP12-Delta725でも同様に認められた。しかし驚くべきことにこれら二つのポリペプチドは、gB-SLP12よりもさらにより顕著に、2倍を超えて及びおよそ1.6倍でそれぞれ発現され、細胞質ドメインの少なくとも一部の欠失を融合ループ突然変異と組み合わせることが発現を及びしたがって得られる分泌されたポリペプチドの最終収量をさらに改善することを示唆している。
ウエスタンブロットを図5に示す。図5Aは、gB-SLP12がgB-SLP12-Delta725と同様に効率的に分泌されることを示し、両方ともgB-DeltaTM(レーンF及びJをレーンBと比較されたい)よりも高い分泌レベルを示しており、Elisaアッセイによって認められた結果を確認している。レーンM及びNは、インタクトな融合ループFL1及びFL2を有するgB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物の細胞性画分及び上清を表している。培養物上清中のgBの検出の欠如(レーンNを参照されたい)は、gBの良い発現/分泌レベルは融合ループが突然変異することを必要とすることを示唆しており、同様の観察が図5B(インタクトな融合ループFL1及びFL2を有するgB-Delta725で形質移入した培養物の上清において(gB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物の上清と比較して)gBタンパク質が検出できなかった(レーン6と2とをそれぞれ比較されたい))においてなされた。gB-DeltaTMよりも良い分泌を達成するための融合ループFL1及びFL2の突然変異の必要性は、ポリペプチドgB-SLP12-Delta113について同様に観察された。gBは、インタクトな融合ループFL1及びFL2を有するgB-SLP12-Delta113で形質移入した培養物の上清において、gB-SLP12-Delta113で形質移入した培養物の上清と比較してほとんど観察されなかった(レーン6'と4'とをそれぞれ比較されたい)。
ウエスタンブロットを図5Cに示す。gB-SLP12-Delta725-LVL759で形質移入した培養物の上清に存在するgBのレベルは、gB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物の上清に存在するgBのレベルと少なくとも同様である(レーンf及びhをレーンb及びdとそれぞれ比較されたい)。gB-SLP12-Delta725-LVL776で形質移入した培養物の上清に存在するgBのレベルは、gB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物の上清に存在するgBのレベルよりわずかに低い(レーンj及びlをレーンb及びdとそれぞれ比較されたい)。これらの結果は、本発明のポリペプチドのN末端部分における突然変異(図2を参照されたい)が前記ポリペプチドの分泌レベルに顕著な影響を与えないことを示す。
CMV gBポリペプチドの生成物プロファイル
gB-DeltaTM、gB-SLP12及びgB-SLP1-Del2を実施例2に記載のとおりCHO細胞において一過的に発現させ、培養上清を形質移入後6日目に回収した。清澄化後、上清に350mM NaCl及び0.4% Empigenを補充し、次いで0.22μmろ過した。ニッケルカラムを細胞に対応する培養上清から形質移入及び分泌されたポリペプチドを精製するために用いた。XK 16カラム(Qiagen)を10mM TRIS-HCl、350mM NaCl、10mMイミダゾール及び0.4% Empigenを含む緩衝液pH 8.0で平衡化した。予め清澄化、補充及びろ過した細胞培養上清を流速4ml/分でロードし、保持されたタンパク質を平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は流速4ml/分で、10mM TRIS-HCl、350mM NaCl、350mMイミダゾール及び0.4% Empigenを含む緩衝液pH 8.0で実施した。次いで溶出された画分を、10mMリン酸(K)緩衝液及び0.4% Empigenを含む緩衝液pH 7.2で平衡化したXK 26カラム(GE)に流速2ml/分で注入した。最初のタンパク質ピークをさらなる分析のために回収した。次いでこのピークに対応する溶出画分を、10mMリン酸(K)及び0.4% Empigenを含む緩衝液pH 7.2で平衡化したセルファインサルフェートカラム(チッソ株式会社)にロードした。溶出は流速3ml/分で、5mMリン酸(K)、1M NaCl及び0.1% プルロニック(Pluronic) F68を含む緩衝液pH 7.2で実施した。次いで上の精製プロセスから得られた精製ポリペプチドを続く実験に供した。
グルタルアルデヒドの最終濃度0.5%及び1%となるように各精製ポリペプチドの15μl(総タンパク量およそ7μgに相当する)にグルタルアルデヒドを直接添加した。対照として各精製ポリペプチドの試料をグルタルアルデヒドを添加しないままにした。混合物を150分間インキュベートし、次いでグルタルアルデヒド反応をNaBH4(Aldrich)を添加することによって停止し、試料を氷上、20分間インキュベートした。次いで試料をMOPS緩衝液を用いてCriterion XT 4-12% Bis Trisゲル(Biorad)にかけた。ゲルをCoomassie blue R-250で染色し、図9に示す。
ポリペプチドの多量体がグルタルアルデヒドで処置するより前に試料中に存在した場合、任意の所与のサイズの多量体が(二量体、三量体又は任意の他のより高分子量の多量体であるかにかかわらず)架橋結合され、次いで変性条件でゲル上を移動する場合にそのように維持される。したがって前記多量体はそれらの分子量に応じて移動した。反対に、グルタルアルデヒドで処置しなかった対照試料では、前記試料中に存在する任意の多量体は、変性条件でゲル上を移動する際に単量体に変性され、対照試料中のポリペプチドはポリペプチドの単量体と等しい分子量に応じて移動した(レーンA、D及びGの150kDaよりわずかに低い単一バンドを参照されたい)。gB-DeltaTM(レーンA、B及びC)の多量体プロファイルを考慮すると、グルタルアルデヒドで処置した試料中に非常に高分子量の二つのバンド(矢印で示す)を認める。これらの二つのバンドが同じ強度であることが認められ、gB-DeltaTM試料が主に2種類の多量体を含み、試料中の各多量体の割合がほぼ同じであることが示唆される。反対に試料がグルタルアルデヒドで処置されたgB-SLP12のプロファイル、詳細にはレーンE及びFを考慮すると、二つの高分子量バンドが同様に認められたが、各バンドの強度は顕著に異なっている。実際に低分子量バンドの強度は、最も高分子量のものより少なくとも3〜5倍強く、gB-SLP12試料中の低分子量多量体集団は、高分子量多量体の集団よりも大きいことを示唆している。同様の観察が、低い方のバンドの強度が高い方のバンドの強度よりもおよそ2〜3倍強いgB-SLP2-Del2試料を考慮する場合になされた(レーンG、H及びI)。これは、gB-SLP12とgB-SLP1-Del2とが、先行技術のポリペプチドgB-DeltaTMとは異なる低分子量多量体に富んだ割合を有する類似の多量体プロファイルを有することを示唆している。この実験で用いたゲルは、gB-DeltaTMに関するレーンにおいて認められた低分子量バンドがgB-SLP12及びgB-SLP1-Del2に関するレーンにおいて認められたものと同じサイズであるかどうかを決定するために十分な分解能を提供しないことを指摘する。同じ理由で、各バンドの実際のサイズを正確に決定することは不可能であり、認められた多量体を二量体又は三量体などに同定することはこの実験からは困難である。この情報を入手するために、続く二つの実験を精製ポリペプチドで実施した。
分析的超遠心分離法(AUC)を、遠心力に反応して分子が移動する速度を測定することによって、精製ポリペプチド試料中のさまざまな分子種(例えば凝集している精製ポリペプチドのさまざまなサイズの多量体)の溶液中での均一性及びサイズ分布を決定するために用いた。これは、沈降速度実験によって得られるさまざまな分子種の沈降係数の算出に基づく(それらの分子の形状及び質量に依存する)。精製後、10mMリン酸ナトリウム、1M NaCl、0.1% Pluronic、pH 7.2に再懸濁したgB-DeltaTM、gB-SLP12及びgB-SLP1-Del2をAN-60Tiローターを15°Cに平衡化させた後に、Beckman-Coulter ProteomeLab XL-1 分析的超遠心分離機にて28000rpmで回転させた。データ収集のために160スキャンを280nm及び230nmで5分ごとに記録した。データ分析をC(S)分布を決定するためにプログラムSEDFITを用いて実施した。タンパク質の偏比容の決定を、それらのアミノ酸配列及び予測されるグリカン組成と組み合わせたSEDNTERPソフトウエアで実施した。SEDNTERPを、(このソフトウエアのデータベースでは表されない)Pluronic F68の寄与を無視することによって緩衝液の粘度及び密度を決定するためにも用いた。結果を、分子量に対してプロットした各分子種の濃度を示すグラフの形態で示す。すべての分子種の相対的存在量の決定を分布全体の曲線下総面積を試料の100%とみなし、分子種ごとの寄与により表される総面積の百分率を算出することによって実施した。
図10は、分析的超遠心分離法によって分析した精製gB-DeltaTM、gB-SLP12及びgB-SLP1-Del2のプロファイルを連続的に示す。gB-DeltaTM試料に対応するグラフは、複数のピークによって表される不均一な分布を示す。詳細には、前記試料中に認められる主な集団は、417kDa(35%)及び723kDa(30%)の分子種である(おそらくそれぞれ三量体及び四量体を表す)。より高分子量の多量体も前記試料中に存在する。反対に融合ループFL1及びFL2を突然変異させると、対応する精製gB-SLP12ポリペプチドのプロファイルは、主な集団が327kDa(63%)の分子種である(おそらく三量体を表す)より均一な集団を示す。より高分子量の多量体の存在はかろうじて認められた。類似のプロファイルが、主な集団が311kDa(67%)の分子種である(おそらく同様に三量体を表す)gB-SLP1-Del2試料において認められたが、より高分子量の多量体の存在はわずかである。
精製ポリペプチドgB-SLP12-Delta725及びgB-SLP12-Delta113中のさまざまな分子種の溶液中での均一性及びサイズ分布を決定するために分析的超遠心分離法を3.2節に記載のとおり実施した。ポリペプチドは、実施例2に記載のとおり組み換え的に発現させ、本実施例3の最初の段落に記載のとおり精製した。精製後、gB-SLP12-Delta725及びgB-SLP12-Delta113をそれぞれ0.1% プルロニック(Pluronic)を含む緩衝液又はPluronicを含まない緩衝液のいずれかに再懸濁した。
図11Aは、0.1% Pluronicの存在下又は非存在下での分析的超遠心分離法によって分析した精製gB-SLP12-Delta113ポリペプチドのプロファイルを連続的に示す。Pluronic非存在下で認められたプロフィルは、精製ポリペプチドの集団内で三量体を表す類似の72%の集団を有して、図10においてgB-SLP12及びgB-SLP12-Del2について認められたプロファイル(すなわち先行技術のgBポリペプチド(gB-DeltaTM)と比較して改善された生成物プロファイル)と同様であった。しかし、Pluronicの存在下では、三量体の百分率は単量体の百分率(25%)の増加及び230kDa付近の多量体の存在に伴って低下した。Pluronicの存在下でのgB-SLP12-Delta113ポリペプチドの単量体化の傾向は、界面活性剤への感受性を示している。
gB-SLP12-Delta113及びgB-SLP12-Delta725の両方が三量体に富む割合を有して改善された生成物プロファイルを示すが、得られた結果は(その三量体プロファイルがPluronicの存在又は非存在において維持されたことから)gB-SLP12-Delta725が溶液中での増大した構造安定性を有する追加的利点を表すことを示す。実際に界面活性剤処置は、このポリペプチドの沈降特性に観察可能な影響を有さなかった。
精製gB-DeltaTM及びgB-SLP12のタンパク質サイズを、280nmでのUV検出器及びTSK G5000PWXLカラム(東ソーバイオサイエンス)を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによっても決定した。試料を室温、流速0.5ml/分でロードした。溶出は同じ流速、室温でPBS+0.1% Pluronicで実施した。サイログロブリン(669kDa)、フェリチン(440kDa)、カタラーゼ(232kDa)、アルドラーゼ(158kDa)、アルブミン(68kDa)、コンアルブミン(75kDa)、オボアルブミン(43kDa)、炭酸脱水素酵素(29kDa)及びリボヌクレアーゼ(13.7kDa)を較正のために用いた。
図13に示すとおり、gB-SLP12はサイズ排除クロマトグラフィーによって測定された357kDaのサイズ(おそらく三量体形態を表す)を有する。先行技術の二つのポリペプチド、gB-DeltaTM及びgB-S50-DeltaTM(すなわちインタクトな融合ループを有するポリペプチド)は710kDaの類似するサイズ(より高い分子量の多量体を表す)を有する。これらの結果は、本発明のポリペプチド(gB-SLP12)が先行技術のポリペプチド(gB-DeltaTM)とは異なる生成物プロファイルを有するという分析的超遠心分離法で得られた上の結果を確認する。
gB-SLP12ポリペプチドのC末端クリッピング
4.1 発現及び精製
gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113及びgB-SLP12-Delta725ポリペプチドを実施例2に記載のとおり一過的に形質移入し、発現させた。gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113及びgB-SLP12-Delta725ポリペプチドを実施例3の最初の段落に記載のとおり精製した。形質移入後6日目に回収した後、gB-DeltaTM上清にBis-Tris及びEmpigen BBをそれぞれ最終濃度20mM及び0.4%に達するまで補充した。次いでそれを、20mM Bis-Tris-0.4% Empigen BBを含む緩衝液pH6.0で平衡化したQ-Seharose XLカラム(GE Healthcare)にロードした。結合したペプチドを20mM Bis-Tris-0.4% Empigen BBを含む緩衝液pH6.0を75%と20mM Bis-Tris-0.4% Empigen BB-1M NaClを含む緩衝液pH6.0を25%との混合液でカラムから溶出させた。次いで溶出液にリン酸ナトリムを最終濃度10mMに達するまで補充し、pH6.8に調整した。次いでそれを10mMリン酸ナトリウム-0.4% Empigen BB-0.25M NaClを含む緩衝液pH6.8で平衡化したヒドロキシアパタイトtype IIカラム(Bio-Rad)にロードした。ポリペプチドを含有する素通り画分を回収し、10mMリン酸ナトリウム-0.4% Empigen BB-0.25M NaClを含む緩衝液pH6.8で平衡化したCellufine Sulfateカラム(JNC Corporation)にロードした。ポリペプチドを含有する素通り画分を回収し、100kD Pellicon XL膜(Millipore)を用いる限外ろ過によって濃縮し、10mMリン酸ナトリウム-0.4% Empigen BBを含む緩衝液pH7.2で平衡化したSuperdex 200カラム(GE Healthcare)にロードした。溶出物を回収し、濃縮及び10mMリン酸カリウムpH7.2で透析ろ過(diafiltered)した。
上の精製ポリペプチドをN-グリコシダーゼF脱グリコシル化キット(Roche、No. 11836552001)を製造者の説明書に従って用いて脱グリコシル化した。精製した各脱グリコシル化ポリペプチドの等量をMOPS緩衝液を用いてCriterion XT 4-12% Bis Trisゲル(Biorad)にかけた。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、膜を抗gB抗体MAb 27-156(Spaete et al.,Virology 167,207-225(1988)(図14A、図14B、レーン3、図14C、レーンB及び図14D、レーンD)又は抗6X Hisタグ抗体(Abcam,No.ab9108)(図14B、レーン2、図14C、レーンA及び図14D、レーンC)のいずれかで探索した。
図14Aは、抗gB抗体が精製gB-DeltaTMポリペプチドの集団における二つの異なる形態を認識することを示し、ポリペプチドが精製された集団において異なるサイズの少なくとも二つの形態、それぞれ92kDa及び80kDaで存在することを示唆している。アミノ酸の分子量の平均値(110Da)に基づいて、830アミノ酸を含むgB-DeltaTMの分子量は91kDa付近であるはずである。したがって92kDaのバンドはおそらく全長gB-DeltaTMポリペプチドに対応し、一方80kDaのバンドはポリペプチドの短縮バージョンに対応し、集団内でいくらかのポリペプチドが切断され、80kDa付近のクリップされた生成物が産生されていることを示唆している。
図14に示すデータは、ポリペプチドgB-DeltaTM及びgB-SLP12のポリペプチドのC末端部分で生じるクリッピングが細胞質ドメインの少なくとも一部を除去すると生じないことを示している。
ポリペプチドgB-SLP12-Delta725のN末端不均一性
図12Aに示すとおり、CMV gB-SLP12-Delta725ポリペプチドは、細胞中で組換え発現されると、N末端で不均一である成熟ポリペプチドの集団を生じる。実際にシグナルペプチダーゼは、示すとおり異なるアミノ酸位置でシグナル配列を切断する。この現象はシグナルペプチダーゼの「ゆらぎ(woobling)」とも称される。
実施例1に記載のとおりHisタグを含有するgB-SLP12-Delta725、gB-SLP12-Delta725-LVL759、gB-SLP12-Delta725-LVL776及びgB-SLP12-Delta725-CD33ポリペプチドを実施例2に記載のとおり組換え発現させた。形質移入後6日目に培養上清を回収した。EDTA-free protease inhibitor cocktail(Roche、No.11873580001)を上清に添加し、NaCl濃度を500mMに、最終pHを8.3に調整した。IMAC sepharose 6 FF(GE Healthcare)を直径5cmのガラスカラム(Waters)に詰めた。カラムを5カラム容積の結合緩衝液(10mM Tris、500mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.3)で平衡化した。上清を平衡化したカラムに流速10ml/分でロードした。未結合物質を2カラム容積の上の結合緩衝液で洗浄した。50mlの画分で回収した。カラムを追加的に2カラム容積の上の結合緩衝液でさらに洗浄した。10mlの画分で回収した。カラムに結合したタンパク質を6カラム容積の溶出緩衝液(Tris、500mM NaCl、350mMイミダゾール、pH8.30)で溶出した。10mlの画分で回収した。画分をSDS-PAGEゲルにロードし、陽性画分をプールし、Centricon Ultrafiltration device(Millipore)で濃縮した。濃縮したタンパク質をRCDC modified Lowry colorimetric assay(Biorad)で定量した。5から10μgの精製タンパク質をN-グリコシダーゼF脱グリコシル化キット(Roche,No.11836552001)を製造者の説明書に従って用いて脱グリコシル化した。脱グリコシル化タンパク質をRCDC precipitation reactant (BioRad)によって沈殿させ、SDS-PAGE還元ローディング緩衝液に再懸濁し、SDS-PAGEにロードした。脱グリコシル化タンパク質に対応する位置に移動したタンパク質バンドをトリプシン消化及びMS/MSペプチドマッピング分析のために切った。
精製タンパク質を含有するゲル片をアセトニトリル(ACN)で脱水した。タンパク質を還元緩衝液(10mM DTT、100mM重炭酸アンモニウム)を添加することによって30分間、40℃で還元し、アルキル化緩衝液(55mMヨードアセトアミド、100mM重炭酸アンモニウム)を添加することによって20分間、40℃でアルキル化した。次いでゲル片を、(すべての試薬を除去する前に)ACNを添加することによってさらに5分間、40℃で脱水及び洗浄した。次いでゲル片を5分間、40℃乾燥し、次いでトリプシン溶液(6ng/μlのトリプシン配列決定グレード(Promegaから)、25mM重炭酸アンモニウム)で4℃、40分間再水和させた。タンパク質消化を、58℃、1時間実施し、1%ギ酸及び2% ACNの混合液15μlで停止させた。上清を96ウエルプレートに移し、トリプシン消化ペプチドの抽出を室温で抽出緩衝液(1%ギ酸及び50% ACN)を用いる2回の30分間抽出ステップで実施した。すべての抽出ペプチドを96ウエルプレートにプールし、次いで真空遠心分離で完全に乾燥させた。プレートをシールし、LC-MS/MS分析へのさらなるプロセスまで-20℃で保存した。
LC-MS/MS分析の前に、抽出ペプチドを0.2%ギ酸12μl中で15分間撹拌して再溶解し、次いで2000rpm、1分間遠心分離した。LCカラムは、高圧充填セルで充填したC18逆相カラムである。長さ100mmの75lm i.d.フューズドシリカキャピラリーにC18 Jupiter 5 lm300Åreverse-phase material (Phenomenex)を充填した。このカラムをnano LC-2Dシステム(Eksigent)に設置し、LTQ Orbitrap (ThermoFisher Scientific)に繋いだ。クロマトグラフィーに用いた緩衝液は、0.2%ギ酸(緩衝液A)及び100%ACN/0.2%ギ酸(緩衝液B)であった。最初の12分間、試料5μlを流速650nl/分でカラムにロードし、続いて緩衝液Bを20分間で2-80%にし、次いで10分間で緩衝液Bを2%に戻す勾配をかけた。LC-MS/MSデータ取得をOrbitrapで取得されたスキャンイベント1についての完全スキャンMSからなす4スキャンイベントサイクルを用いて遂行した。
-図12は、検査したさまざまなポリペプチドのシグナル配列の切断部位に生じたシグナルペプチダーゼの「ゆらぎ」の定量的評価の結果を示す。シグナルペプチダーゼのゆらぎは、表示のポリペプチドの各集団内でそれらのN末端が異なるアミノ酸から始まるさまざまな成熟ポリペプチド形態の生成をもたらす。
これらの結果は、シグナルペプチダーゼが一貫して一つの主な切断部位だけを認識することから、gB-SLP12-Delta725-LVL759、gB-SLP12-Delta725-LVL776及びgB-SLP12-Delta725-CD33ポリペプチドではもはやゆらぎは生じなかったことを示している。これは、gBポリペプチドのシグナル配列及びリーダー配列になされた改変が、顕著な肯定的影響を成熟ポリペプチド集団の不均一性に有し、前記ポリペプチド集団を、99%を超える程度に均一にしたことを示唆している。
本発明の例示的CMV gBポリペプチドを含有する免疫原性組成物の免疫原性
C末端Hisタグを含み、節で記載されたとおり発現及び精製された次のポリペプチドgB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113、gB-SLP12-Delta725、LVL759、LVL776及びCD33を含有する免疫原性組成物の免疫原性を次のとおり検査した。
C57BL/6マウス10匹の群を21日間隔での2回投与で上記の例示的免疫原性組成物(表1に示す)でワクチン接種した。免疫処置は、筋肉内に行った(合計容積50μ中でリポソーム製剤中に各gBポリペプチド1.5μgを、2.5μgの3D-MPL及び2.5μgのQS21を含むアジュバント系ASAでアジュバント化した)。
C57BL/6マウス10匹の群を初期読み取りで2倍の差異を有する90%の検出力を得るように設計した。統計的分析を免疫処置2の14日後のデータにUNISTATを用いて実施した。分散の分析のために適用したプロトコールは次のとおり簡潔に記載され得る:データの対数変換;正規性を検証するための各集団(群)でのシャピロ・ウイルク検定;異なる集団(群)間の分散の均一性を検証するためのコクラン検定;選択されたデータについての分散分析(ANOVA 1又は2);多重比較のためのチューキー-HSD検定。
アッセイの前に、MRC5細胞を96ウエルプレートに播種し、3日間、37℃でインキュベートした。熱不活性化血清の系列希釈物を一定量のヒトCMV AD169ウイルスと1時間、37℃でインキュベートした。インキュベーション後、血清とウイルスとの混合物を、MRC5細胞を含む96ウエルプレートに添加した。プレートを2000rpmで1時間、37℃で遠心分離した。一晩37℃でインキュベーションした後、プレートを80%アセトン溶液で固定した(20-30分間、4℃)。アセトン溶液を除去し、CMV陽性ウエルを特異的モノクローナルビオチンコンジュゲート抗初期I(IE-I)抗体を用いて1時間、37℃で検出した。プレートをPBSで3回洗浄した。洗浄後、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを追加的に30分間、37℃で添加した。プレートを3回洗浄し、True-Blue溶液と10分間インキュベートした。特異的な有色シグナルを顕微鏡下の目視検査によって記録した。中和力価を、血清を含まないウイルス投与対照と比較して、CMV陽性ウエルの数を50%低下させる血清の最も高い希釈度の逆数として表した。
中和抗体応答を最初の免疫処置の21日後及び2回目の免疫処置の14日後に収集した血清試料について測定した。試料をヒトCMV AD169に対するそれらの中和活性に関して検査した。結果を図15Aに示す。検査したすべてのポリペプチドは、免疫処置2の14日後に有意な応答を誘導した(灰色バーを参照されたい)。gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113、gB SLP12-Delta725及びLVL759は、gB-DeltaTMと有意には*異ならない力価を誘導した。CD33(p-値:0.0006)及びLVL776(p-値:0.0116)は、gB-DeltaTMより有意に低い力価を誘導した。
抗gB抗体の定量をコーティング抗原としてgB**と称するgBポリペプチド(EP0759995に記載)を用いてELISAによって実施した。抗原をPBS中に最終濃度4μg/mlに希釈し(100μl/ウエル)、96ウエルプレートで一晩、4℃でインキュベートした。次いでプレートを1%ウシ血清アルブミンを含有するPBS 200μlで1時間、37℃で飽和させた。血清の2倍希釈系列をウエルに添加し(100μl/ウエル)、1時間30分、37℃でインキュベートした。プレートをPBS/0.1% Tween 20で4回洗浄した。100μlのビオチン-コンジュゲート抗マウスIgを各ウエルに添加し、1時間、37℃でインキュベートした。PBS/0.1% Tween 20での4回洗浄後、100μlのストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを添加し、追加的に30分間、37℃でインキュベーション。プレートをPBS/0.1% Tween 20で4回及び水で1回洗浄した。次いでプレートを0.1クエン酸緩衝液pH5.8中の75%テトラメチルベンジジンの100μlと10分間、22℃でインキュベートした。この反応を100μlの0.4N H2SO4で停止し、比色定量を分光光度計450/620nmで読み取った。濃度が既知である精製gB-DeltaTMの以前のロットをこの実験における標準として用いた。ソフトウエアSoftMax Proを用いて、ELISA力価を決定し、ELISA Unit/mlで表した。
ELISA力価を最初の免疫処置の21日後及び2回目の免疫処置の14日後に回収した血清試料について測定した。結果を図15Bに示す。検査したすべてのポリペプチドは、免疫処置2の14日後に有意な応答を誘導した(灰色バーを参照されたい)。gB-SLP12-Delta113及びgB SLP12-Delta725は、gB-DeltaTMによって誘導された力価と有意には*異ならない力価を誘導した。gB-SLP12、CD33、LVL759及びLVL776は有意には*異ならない力価を誘導した。gB-DeltaTMは、gB-SLP12(p-値:0.0002)、CD33(p-値:0.0226)、LVL759(p-値:0.0002)及びLVL776(p-値:0.0001)より有意に高い力価を誘導した。
Claims (33)
- 配列番号1に記載の配列の位置155〜157に又は他のサイトメガロウイルス(CMV) gBポリペプチドにおける対応する位置にあるアミノ酸Y.I.Yによって定義される融合ループ1(FL1)ドメイン及び配列番号1に記載の配列の位置240〜242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるアミノ酸W.L.Yによって定義される融合ループ2(FL2)ドメインを含むgBタンパク質細胞外ドメインを含むCMV gBポリペプチドであって、少なくとも前記融合ループFL1ドメインにおける位置155〜157にあるアミノ酸Y.I.Yがアミノ酸G.H.Rでそれぞれ置換されており、且つ膜貫通ドメイン(TM)が非機能性である、前記CMV gBポリペプチド。
- 前記細胞外ドメインのアミノ酸の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%を含むか又は前記細胞外ドメイン全体を含む、請求項1に記載のCMV gBポリペプチド。
- 前記TMドメインの少なくとも一部分の欠失を含む、請求項1又は2に記載のCMV gBポリペプチド。
- 前記TMドメインのアミノ酸の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%が欠失されている、請求項3に記載のCMV gBポリペプチド。
- 配列番号1に記載の配列の位置725〜775の又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置のアミノ酸の欠失を含む、請求項3又は4に記載のCMV gBポリペプチド。
- 配列番号1に記載の配列の位置701〜775の又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置のアミノ酸の欠失を含む、請求項3又は4に記載のCMV gBポリペプチド。
- 細胞質ドメインの少なくとも一部分の欠失を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のCMV gBポリペプチド。
- 前記細胞質ドメインの少なくとも一つの疎水性アミノ酸領域の欠失を含む、請求項7に記載のCMV gBポリペプチド。
- 配列番号1に記載の配列のアミノ酸825〜877の又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置のアミノ酸の欠失を含む、請求項8に記載のCMV gBポリペプチド。
- 前記細胞質ドメインのアミノ酸の少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の欠失又は前記細胞質ドメイン全体の欠失を含む、請求項7に記載のCMV gBポリペプチド。
- 配列番号1に記載の配列の融合ループFL2ドメインにおける位置240〜242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるアミノ酸W.L.Yが、アミノ酸A.F.Hでそれぞれ置換されている、請求項1〜10のいずれか1項に記載のCMV gBポリペプチド。
- リーダー配列の少なくとも一部分の欠失を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載のCMV gBポリペプチド。
- リーダー配列のアミノ酸の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又はリーダー配列全体の欠失を含む、請求項12に記載のCMV gBポリペプチド。
- 配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号19、配列番号20及び配列番号21に記載の配列から成る群から選択される配列を有するCMV gBポリペプチド。
- 適切な薬学的担体と混合した請求項1〜14のいずれか1項に記載のCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物。
- pUL131、gL、gH、pUL128、pUL130又はこれらのいずれかの組合せから成る群から選択される少なくとも1個以上のCMV抗原をさらに含む、請求項15に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項15又は16に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントがリポソーム製剤中の3D-MPL及びQS21を含む、請求項17に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントが水中油型乳剤を含む、請求項17に記載の免疫原性組成物。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のCMV gBポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15及び配列番号17に記載の配列から成る群から選択される配列を有するポリヌクレオチド。
- 請求項20又は21に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項22に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
- CMV感染の予防及び/又は治療における使用のための、請求項1〜14のいずれか1項に記載のCMV gBポリペプチド又は請求項15〜19のいずれか1項に記載の組成物。
- CMV感染を予防及び/又は治療するための医薬の調製における請求項1〜14のいずれか1項に記載のCMV gBポリペプチド又は請求項15〜19のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 新生児における先天性CMV感染を予防するための、請求項24に記載のCMV gBポリペプチド又は組成物。
- 新生児における先天性CMV感染を予防するための、請求項25に記載の使用。
- 対象がCMV血清陰性対象である、請求項24又は26に記載のCMV gBポリペプチド又は組成物。
- 対象がCMV血清陰性対象である、請求項25又は27に記載の使用。
- 前記CMV血清陰性対象が出産年齢の女性である、請求項28に記載のCMV gBポリペプチド又は組成物。
- 前記CMV血清陰性対象が出産年齢の女性である、請求項29に記載の使用。
- 前記CMV血清陰性対象が青年期の女子である、請求項28に記載のCMV gBポリペプチド又は組成物。
- 前記CMV血清陰性対象が青年期の女子である、請求項29に記載の使用。
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