JP6133053B2 - Method and apparatus for quantifying amyloid aggregates - Google Patents
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Description
本発明は、アミロイドの凝集体の定量方法及びその定量装置に関する。 The present invention relates to a method for quantifying amyloid aggregates and a quantification apparatus therefor.
社会的問題となっているアルツハイマー型認知症の研究においては、根本的治療の観点から、ベータアミロイドタンパク質が早期診断及び治療のターゲットとして注目を浴びている。アルツハイマー型認知症において、ベータアミロイドタンパク質の脳内における蓄積が、最初にあらわれる病態だからである。蓄積したベータアミロイドタンパク質は、βシート構造に富む凝集体を形成し脳内の神経細胞に悪影響を与える。そのため、ベータアミロイドタンパク質の濃度及びベータアミロイドタンパク質の凝集についての情報を測定する方法が重要となる。 In the study of Alzheimer type dementia, which has become a social problem, beta amyloid protein has attracted attention as a target for early diagnosis and treatment from the viewpoint of fundamental treatment. This is because, in Alzheimer-type dementia, accumulation of beta amyloid protein in the brain appears first. Accumulated beta amyloid protein forms aggregates rich in β-sheet structure and adversely affects neurons in the brain. Therefore, a method of measuring information about the concentration of beta amyloid protein and the aggregation of beta amyloid protein is important.
ベータアミロイドタンパク質は、凝集状態によって水に対し不溶となるものもあり、その場合には高速液体クロマトグラフィー及び電気泳動といった手法の適用が困難となる。そこで、不溶化物含有の有無に関わらず、ベータアミロイドタンパク質の凝集を測定する方法として蛍光測定がよく用いられる。蛍光測定の従来法として、チオフラビンＴ等の蛍光色素（蛍光物質）と分光蛍光光度計とを利用した蛍光強度測定がある（特許文献１）。この測定法は、チオフラビンＴと、ベータアミロイドタンパク質の凝集によって形成されるβシート構造と、の相互作用によって生じる蛍光を利用した方法であり、凝集体の定量や凝集状態の測定を行うことができる。 Some beta amyloid proteins become insoluble in water depending on the aggregation state, and in that case, it is difficult to apply techniques such as high performance liquid chromatography and electrophoresis. Therefore, fluorescence measurement is often used as a method for measuring the aggregation of beta amyloid protein regardless of the presence or absence of insolubilized substances. As a conventional method of fluorescence measurement, there is fluorescence intensity measurement using a fluorescent dye (fluorescent substance) such as thioflavin T and a spectrofluorometer (Patent Document 1). This measurement method is a method using fluorescence generated by the interaction between thioflavin T and a β sheet structure formed by aggregation of beta amyloid protein, and it is possible to measure the aggregate and measure the aggregation state. .
しかしながら、上記蛍光強度測定では、測定の対象とすべきでないチオフラビンＴの自家蛍光及び不純物に由来する蛍光も積算してしまうため、凝集体の定量において正確な値を得ることができない。 However, in the fluorescence intensity measurement, since autofluorescence of thioflavin T that should not be measured and fluorescence derived from impurities are also integrated, an accurate value cannot be obtained in the quantification of aggregates.
このような背景から、ベータアミロイドタンパク質の凝集体（ベータアミロイド凝集体）等のアミロイド凝集体の量を精度良く測定する方法の開発が望まれている。 Against this background, development of a method for accurately measuring the amount of amyloid aggregates such as aggregates of beta amyloid protein (beta amyloid aggregates) is desired.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、精度良く測定することが可能なアミロイドの凝集体の定量方法及びその定量装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a method for quantifying amyloid aggregates and a quantification apparatus thereof that can be measured with high accuracy.
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、ある特定の蛍光物質とアミロイド凝集体とが結合した複合体に由来する蛍光寿命値が、アミロイドの凝集状態に依存せずに一定であることを見出し、本願発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that the fluorescence lifetime value derived from a complex in which a specific fluorescent substance and an amyloid aggregate are bound is constant without depending on the aggregation state of amyloid. The headline and the present invention have been completed.
すなわち、本発明は、アミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む試料に、上記蛍光物質を励起する光を照射する、励起光照射ステップと、
上記試料から発する蛍光を経時的に検出して、蛍光減衰曲線のデータを取得する、データ取得ステップと、
上記蛍光減衰曲線のデータと、上記蛍光物質と上記アミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値と、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて上記複合体に由来する第一の重み因子を算出する、重み因子算出ステップと、
上記第一の重み因子に基づいて前記アミロイドの凝集体の量を算出する、凝集体定量ステップと、
を含む、アミロイドの凝集体の定量方法を提供する。
That is, the present invention comprises an excitation light irradiation step of irradiating a sample containing an amyloid aggregate and a fluorescent material with light that excites the fluorescent material,
A data acquisition step of detecting fluorescence emitted from the sample over time to acquire fluorescence decay curve data;
The fluorescence decay curve data, a first fluorescence lifetime value derived from a complex in which the fluorescent substance and the amyloid aggregate are bound, and one or more fluorescence lifetimes derived from a fluorescence component other than the complex A weighting factor calculating step for calculating a first weighting factor derived from the complex based on the value;
Calculating an amount of the amyloid aggregates based on the first weighting factor, and an aggregate quantification step;
A method for quantifying amyloid aggregates, comprising:
本発明の定量方法によれば、上記蛍光物質と上記アミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値は、アミロイドの凝集体の状態に依存せずに一定であるので、アミロイドの凝集体を精度良く測定することが可能になる。 According to the quantification method of the present invention, the first fluorescence lifetime value derived from the complex in which the fluorescent substance and the amyloid aggregate are bound is constant without depending on the state of the amyloid aggregate. It becomes possible to accurately measure amyloid aggregates.
上記蛍光物質は、チオフラビンＳ、６−（２−フルオロエトキシ）−２−（４−メチルアミノスチリル）ベンゾオキサゾール及び８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、並びに、下記式（１）、（２）、（３）又は（４）で表される化合物から選ばれることが好ましい。これらの蛍光物質を用いることによって、アミロイドの凝集体をより精度良く測定することが可能になる。式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ３は炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示し、ＡはＯ又はＳを示し、５員環に含まれる窒素原子は炭素数１〜６のアルキル基と結合していてもよく、式（２）中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水酸基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を示し、Ｘは水素又はハロゲンを示し、式（３）中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に水素、水酸基、ハロゲン、又は、１若しくは２つの炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示し、式（４）中、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ独立に水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ１４は炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示す。
The fluorescent substance includes thioflavine S, 6- (2-fluoroethoxy) -2- (4-methylaminostyryl) benzoxazole, 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid, and the following formulas (1) and (2): , (3) or (4) is preferred. By using these fluorescent substances, it is possible to measure amyloid aggregates with higher accuracy. In formula (1), R 1 and R 2 each independently represent hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 3 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen or a hydroxyl group, and A represents O or S represents a nitrogen atom contained in the 5-membered ring and may be bonded to an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. In formula (2), R 4 and R 5 are each independently a hydroxyl group or a
本発明に係る定量方法は、上記データ取得ステップに続いて、上記第一の蛍光寿命値を、上記蛍光減衰曲線のデータと、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて算出する、蛍光寿命算出ステップを更に含んでもよい。上記ステップを更に含むことで、上記第一の蛍光寿命値が不明である蛍光物質を用いた場合でも、アミロイドの凝集体を定量することが可能になる。 In the quantification method according to the present invention, following the data acquisition step, the first fluorescence lifetime value is converted into one or a plurality of fluorescence lifetime values derived from the fluorescence decay curve data and a fluorescence component other than the complex. And a fluorescence lifetime calculating step for calculating based on the above. By further including the above step, it is possible to quantify amyloid aggregates even when a fluorescent material whose first fluorescence lifetime value is unknown is used.
更に本発明は、アミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む試料に、上記蛍光物質を励起する光を照射する光源部と、上記試料から発する蛍光を経時的に検出する検出部と、経時的に検出した上記蛍光から蛍光減衰曲線のデータを記録する記録部と、上記蛍光減衰曲線のデータと、上記蛍光物質と上記アミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値と、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて上記複合体に由来する第一の重み因子を算出し、上記第一の重み因子に基づいて上記アミロイドの凝集体の量を算出する演算部と、を備える、アミロイドの凝集体の定量装置を提供する。 Furthermore, the present invention provides a light source unit that irradiates a sample containing an amyloid aggregate and a fluorescent material with light that excites the fluorescent material, a detection unit that detects fluorescence emitted from the sample over time, A recording unit for recording fluorescence decay curve data from the detected fluorescence, the fluorescence decay curve data, and a first fluorescence lifetime value derived from a complex in which the fluorescent substance and the amyloid aggregate are bound together. Calculating a first weighting factor derived from the complex based on one or more fluorescence lifetime values derived from fluorescent components other than the complex, and based on the first weighting factor An amyloid aggregate quantification apparatus comprising: an arithmetic unit that calculates the amount of aggregates.
本発明によれば、精度良く測定することが可能なアミロイド凝集体の定量方法及びその定量装置を提供することが可能になる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it becomes possible to provide the quantification method of amyloid aggregate which can be measured with sufficient precision, and its quantification apparatus.
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following embodiments.
本実施形態に係るアミロイドの凝集体の定量方法は、励起光照射ステップと、データ取得ステップと、重み因子算出ステップと、凝集体定量ステップと、を含む。 The method for quantifying amyloid aggregates according to the present embodiment includes an excitation light irradiation step, a data acquisition step, a weight factor calculation step, and an aggregate quantification step.
励起光照射ステップでは、アミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む試料に、上記蛍光物質を励起する光を照射する。 In the excitation light irradiation step, the sample containing the amyloid aggregate and the fluorescent material is irradiated with light for exciting the fluorescent material.
本実施形態に係るアミロイドは、層状のβシート構造を含むアミロイド線維（アミロイド繊維）を形成し得るタンパク質を意味する。上記アミロイドとしては、例えば、ベータアミロイドタンパク質（アミロイドβタンパク質）、免疫グロブリン軽鎖タンパク質、アミロイドＡタンパク質、トランスサイレチンタンパク質、リソザイム、ＢｒｉＬタンパク質、シスタチンＣタンパク質、スクレイピータンパク質、β２ミクログロブリン、アポリポプロテインＡ１、ゲルソリン（ゲルゾリン）、ランゲルハンス島アミロイドタンパク質、フィブリノーゲン、プロラクチン、インシュリン、カルシトニン、心房性ナトリウムペプチド、α−シヌクレイン（シヌクリン）、プリオンタンパク質、ハンチンチンタンパク質、スーパーオキサイドジスムターゼ、α１−アンチキモトリプシ及びタウタンパク質が挙げられる。本実施形態に係る定量方法は、ベータアミロイドタンパク質に対して好ましく適用される。 The amyloid according to the present embodiment means a protein capable of forming amyloid fibrils (amyloid fibrils) including a layered β sheet structure. Examples of the amyloid include beta amyloid protein (amyloid β protein), immunoglobulin light chain protein, amyloid A protein, transthyretin protein, lysozyme, BriL protein, cystatin C protein, scrapie protein, β2 microglobulin, apolipoprotein A1. , Gelsolin (gelsolin), Langerhans islet amyloid protein, fibrinogen, prolactin, insulin, calcitonin, atrial sodium peptide, α-synuclein (synuclein), prion protein, huntingtin protein, superoxide dismutase, α1-antichymotrypsin and tau Examples include proteins. The quantification method according to this embodiment is preferably applied to beta amyloid protein.
本実施形態に係るアミロイドの凝集体（以下、アミロイド凝集体という場合がある）は、複数のアミロイド分子が凝集することによって生成される物質を意味する。アミロイド凝集体には、上記アミロイドのダイマー、トリマー、テトラマー、オリゴマー等が含まれる。 The aggregate of amyloid according to the present embodiment (hereinafter sometimes referred to as amyloid aggregate) means a substance generated by aggregation of a plurality of amyloid molecules. Amyloid aggregates include dimers, trimers, tetramers, oligomers, and the like of the above amyloid.
本実施形態に係る蛍光物質としては、蛍光物質とアミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する蛍光寿命値が、アミロイドの凝集状態に依存せずに一定となるような蛍光物質であれば特に制限されない。例えば、チオフラビンＳ、６−（２−フルオロエトキシ）−２−（４−メチルアミノスチリル）ベンゾオキサゾール（ＢＦ−１６８）及び８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、並びに、下記式（１）、（２）、（３）又は（４）で表される化合物が挙げられる。これらの蛍光物質を用いることによって、アミロイドの凝集体をより精度良く測定することが可能になる。 As the fluorescent substance according to the present embodiment, a fluorescent substance whose fluorescence lifetime value derived from the complex in which the fluorescent substance and the amyloid aggregate are combined is constant without depending on the amyloid aggregation state is used. There is no particular limitation. For example, thioflavine S, 6- (2-fluoroethoxy) -2- (4-methylaminostyryl) benzoxazole (BF-168) and 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS), and the following formula (1 ), (2), (3) or (4). By using these fluorescent substances, it is possible to measure amyloid aggregates with higher accuracy.
式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ３は炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示し、ＡはＯ又はＳを示す。さらに、５員環に含まれる窒素原子は炭素数１〜６のアルキル基と結合していてもよい。上記炭素数１〜６のアルキル基は、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましく、メチル基であることがより好ましい。上記ハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素及びヨウ素が挙げられる。 In formula (1), R 1 and R 2 each independently represent hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 3 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen or a hydroxyl group, and A represents O or S is shown. Furthermore, the nitrogen atom contained in the 5-membered ring may be bonded to an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. The alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and more preferably a methyl group. Examples of the halogen include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
式（１）で表される化合物としては、例えば、チオフラビンＴ、２−（４’−アミノフェニル）−６−メチルベンゾオキサゾール（ＭＢＰＡ）、２−（４’−メチルアミノフェニル）−６−メチルベンゾオキサゾール（（６−Ｍｅ−）ＢＴＡ−１）、２−（４’−ジメチルアミノフェニル）−６−ヨードベンゾチアゾール（ＴＺＤＭ）、２−（４’−メチルアミノフェニル）−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（ＰＩＢ）及び２−（４’−ジメチルアミノフェニル）−６−ヨードベンゾオキサゾール（ＩＢＯＸ）が挙げられる。 Examples of the compound represented by the formula (1) include thioflavine T, 2- (4′-aminophenyl) -6-methylbenzoxazole (MBPA), 2- (4′-methylaminophenyl) -6-methyl. Benzoxazole ((6-Me-) BTA-1), 2- (4'-dimethylaminophenyl) -6-iodobenzothiazole (TZDM), 2- (4'-methylaminophenyl) -6-hydroxybenzothiazole (PIB) and 2- (4′-dimethylaminophenyl) -6-iodobenzoxazole (IBOX).
式（２）中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水酸基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を示し、Ｘは水素又はハロゲンを示す。上記炭素数１〜６のアルコキシ基は、炭素数１〜３のアルコキシ基であることが好ましく、メトキシ基であることがより好ましい。上記ハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素及びヨウ素が挙げられる。 In Formula (2), R 4 and R 5 each independently represent a hydroxyl group or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, and X represents hydrogen or halogen. The alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms is preferably an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, and more preferably a methoxy group. Examples of the halogen include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
式（２）で表される化合物としては、例えば、１−フルオロ−２，５−ビス（３−カルボキシ−４−ヒドロキシスチリル）ベンゼン（ＦＳＢ）、１，４−ビス（３−カルボキシ−４−ヒドロキシスチリル）ベンゼン（Ｘ−３４）、１−ブロモ−２，５−ビス（３−カルボキシ−４−ヒドロキシスチリル）ベンゼン（ＢＳＢ）、１−ヨード−２，５−ビス（３−カルボキシ−４−ヒドロキシスチリル）ベンゼン（ＩＳＢ）及び１−ヨード−２，５−ビス（３−カルボキシ−４−メトキシスチリル）ベンゼン（ＩＭＳＢ）が挙げられる。 Examples of the compound represented by the formula (2) include 1-fluoro-2,5-bis (3-carboxy-4-hydroxystyryl) benzene (FSB), 1,4-bis (3-carboxy-4-). Hydroxystyryl) benzene (X-34), 1-bromo-2,5-bis (3-carboxy-4-hydroxystyryl) benzene (BSB), 1-iodo-2,5-bis (3-carboxy-4-) Hydroxystyryl) benzene (ISB) and 1-iodo-2,5-bis (3-carboxy-4-methoxystyryl) benzene (IMSB).
式（３）中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に水素、水酸基、ハロゲン、又は、１若しくは２つの炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。上記炭素数１〜６のアルキル基は、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましく、メチル基であることがより好ましい。上記ハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素及びヨウ素が挙げられる。 In formula (3), R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are each independently substituted with hydrogen, a hydroxyl group, a halogen, or one or two alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms. An amino group which may be present. The alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and more preferably a methyl group. Examples of the halogen include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
式（３）で表される化合物としては、例えば、レスベラトロール、ピセアタンノール、（Ｅ）−３’−ヨード−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスチルベン（ｍ−Ｉ−スチルベン）、４−ジメチルアミノスチルベン及び４−Ｎ−メチルアミノ−４’−ヒドロキシスチルベン（ＳＢ−１３）が挙げられる。 Examples of the compound represented by the formula (3) include resveratrol, piceatannol, (E) -3′-iodo-4-N, N-dimethylaminostilbene (mI-stilbene), 4- Examples include dimethylaminostilbene and 4-N-methylamino-4′-hydroxystilbene (SB-13).
式（４）中、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ独立に水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ１４は炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示す。上記炭素数１〜６のアルキル基は、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましく、メチル基であることがより好ましい。上記ハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素及びヨウ素が挙げられる。 In formula (4), R 12 and R 13 each independently represent hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and R 14 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen or a hydroxyl group. The alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and more preferably a methyl group. Examples of the halogen include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
式（４）で表される化合物としては、例えば、５−ブロモ−２−（４−ジメチルアミノフェニル）ベンゾフラン（ＢＦ−１）が挙げられる。 Examples of the compound represented by the formula (4) include 5-bromo-2- (4-dimethylaminophenyl) benzofuran (BF-1).
本実施形態に係るアミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む試料としては、これらの成分が含まれていればどのような試料でも制限されないが、好ましくは液体の試料である。上記試料は、例えばアミロイドの凝集体を含む生体試料と蛍光物質とを混合することによって調製することができる。上記生体試料としては、脳脊髄液等が挙げられる。 The sample containing the amyloid aggregate and the fluorescent substance according to the present embodiment is not limited to any sample as long as these components are included, but is preferably a liquid sample. The sample can be prepared, for example, by mixing a biological sample containing an amyloid aggregate and a fluorescent substance. Examples of the biological sample include cerebrospinal fluid.
本実施形態に係る蛍光物質を励起する光としては、用いられる蛍光物質を励起することができれば特に制限されないが、例えば２８０〜８００ｎｍの範囲から選ばれる波長の光が挙げられる。 The light that excites the fluorescent substance according to the present embodiment is not particularly limited as long as the fluorescent substance to be used can be excited, and examples thereof include light having a wavelength selected from a range of 280 to 800 nm.
データ取得ステップでは、上記試料から発する蛍光を経時的に検出して、蛍光減衰曲線のデータを取得する。 In the data acquisition step, fluorescence emitted from the sample is detected over time to acquire fluorescence decay curve data.
上記試料から発する蛍光を経時的に検出して、蛍光減衰曲線のデータを取得する方法としては、公知の方法であれば特に制限されない。例えば、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社製、商品名Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ）を用いた方法が挙げられる。 The method for detecting fluorescence emitted from the sample over time and acquiring the fluorescence decay curve data is not particularly limited as long as it is a known method. For example, the method using the fluorescence lifetime measuring apparatus (the Hamamatsu Photonics company make, brand name Quantaurus-Tau) is mentioned.
重み因子算出ステップでは、上記蛍光減衰曲線のデータと、上記蛍光物質と上記アミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値と、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて上記複合体に由来する第一の重み因子を算出する。 In the weighting factor calculation step, the fluorescence decay curve data, the first fluorescence lifetime value derived from the complex in which the fluorescent substance and the amyloid aggregate are combined, and the fluorescence component other than the complex are derived. A first weighting factor derived from the complex is calculated based on one or more fluorescence lifetime values.
上記第一の蛍光寿命値は、上記蛍光物質と上記アミロイドの凝集体とによって定まる固有の値であり、上記アミロイドの凝集状態に依存しない値である。そのため、本実施形態に係る定量方法では、アミロイドの凝集体を精度良く測定することが可能である。 The first fluorescence lifetime value is a unique value determined by the fluorescent substance and the amyloid aggregate, and is a value that does not depend on the aggregation state of the amyloid. Therefore, the quantification method according to the present embodiment can accurately measure amyloid aggregates.
上記複合体以外の蛍光成分としては、用いられる上記試料にもよるが、例えば、上記蛍光物質の自家蛍光による蛍光成分、蛍光寿命を測定する装置の特性に由来する見かけの蛍光成分、及び上記試料に含まれる不純物に由来する蛍光成分が挙げられる。 Depending on the sample used as the fluorescent component other than the complex, for example, the fluorescent component due to autofluorescence of the fluorescent material, the apparent fluorescent component derived from the characteristics of the apparatus for measuring the fluorescence lifetime, and the sample Fluorescent components derived from impurities contained in.
上記複合体に由来する第一の重み因子は、例えば、非特許文献２に記載の方法に従い以下の手順で算出することができる。
The first weight factor derived from the complex can be calculated by the following procedure according to the method described in
まず、下記数式（Ｉ）で表される関数Ｇ（ｔ）を、下記数式（ＩＩ）にしたがってコンボリューション積分し、関数Ｉ（ｔ）を得る。数式（ＩＩ）において、Ｅ（ｔ）は蛍光寿命測定装置の装置応答関数、Ｃはバックグラウンドである。次に、上記Ｉ（ｔ）と、測定された蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）とを比較し、両関数が最も良く一致するように、下記数式（ＩＩＩ）におけるχ２を最小にする変数（τ１〜τｎ、Ａ１〜Ａｎ）の組み合わせを探索する。上記探索を行うことによって、数式（Ｉ）におけるτ１〜τｎ、Ａ１〜Ａｎの最良の組み合わせが得られる。数式（ＩＩＩ）において、ｎ１は解析の開始時間、ｎ２は解析の終了時間を示す。 First, the function G (t) represented by the following formula (I) is convolution-integrated according to the following formula (II) to obtain the function I (t). In Equation (II), E (t) is the device response function of the fluorescence lifetime measuring device, and C is the background. Next, the above-mentioned I (t) is compared with the measured fluorescence decay curve F (t), and a variable (τ that minimizes χ 2 in the following formula (III) is set so that both functions agree best. 1 to τ n , A 1 to A n ) are searched for. By performing the search, τ 1 ~τ n in formula (I), the best combination of A 1 to A n are obtained. In Formula (III), n 1 represents the analysis start time, and n 2 represents the analysis end time.
この解析の結果によって得られたτ１〜τｎが各蛍光又は発光成分の寿命値であり、Ａ１〜Ａｎが各蛍光又は発光成分の重み因子、すなわち蛍光又は発光成分の量を示す。 Τ 1 ~τ n obtained by the results of this analysis is the lifetime value of each fluorescent or luminescent component, A 1 to A n are the weighting factors of each fluorescent or luminescent components, ie the amount of fluorescent or luminescent component.
ここで、ｎの値は、蛍光減衰曲線の解析に必要な指数関数の数を示す成分数であり、各成分は違う物理的機構及び／又は蛍光成分若しくは発光成分を起源とする。本実施形態において、これらの成分は、上記複合体に由来する蛍光成分、上記蛍光物質の自家蛍光による蛍光成分、蛍光寿命を測定する装置の特性に由来する見かけの蛍光成分、上記試料に含まれる不純物に由来する蛍光成分等を起源としている。 Here, the value of n is the number of components indicating the number of exponential functions necessary for analyzing the fluorescence decay curve, and each component originates from a different physical mechanism and / or fluorescent component or luminescent component. In this embodiment, these components are included in the sample, the fluorescent component derived from the complex, the fluorescent component due to autofluorescence of the fluorescent material, the apparent fluorescent component derived from the characteristics of the apparatus for measuring the fluorescence lifetime, and the sample. It originates from fluorescent components derived from impurities.
上記第一の蛍光寿命値、及び上記蛍光物質の自家蛍光の蛍光寿命値が既知である場合、これらの蛍光寿命値を定数として数式（Ｉ）に適用する。蛍光寿命を測定する装置が理想的な場合、蛍光減衰曲線は上述の２成分で解析できるはずであるが、他にも上記装置の特性に由来する見かけの蛍光成分、上記試料に含まれる不純物に由来する蛍光成分等が考えられるため、実際にはこれらの成分を含めた３成分以上の成分数で解析を行う。上記第一の蛍光寿命値がτｎで表されるとき、Ａｎが上記複合体に由来する第一の重み因子として求めることができる。 When the first fluorescence lifetime value and the fluorescence lifetime value of the autofluorescence of the fluorescent substance are known, these fluorescence lifetime values are applied to the formula (I) as constants. When the apparatus for measuring the fluorescence lifetime is ideal, the fluorescence decay curve should be able to be analyzed with the above two components, but in addition to the apparent fluorescence component derived from the characteristics of the apparatus, impurities contained in the sample Since fluorescent components derived from the above are conceivable, the analysis is actually performed with three or more components including these components. When the first fluorescence lifetime value is represented by τ n, A n can be obtained as the first weighting factor from the complex.
なお、上記第一の蛍光寿命値が未知であるとき、上記データ取得ステップに続いて、上記第一の蛍光寿命値を、上記蛍光減衰曲線のデータと、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて算出する、蛍光寿命算出ステップを更に含んでもよい。具体的には、上記蛍光減衰曲線のデータと、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、を上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に適用し、数式（ＩＩＩ）におけるχ２を最小にする変数（τｎ、Ａ１〜Ａｎ）の組み合わせを探索することによって、上記第一の蛍光寿命値（τｎ）を算出する。 When the first fluorescence lifetime value is unknown, following the data acquisition step, the first fluorescence lifetime value is derived from the fluorescence decay curve data and fluorescence components other than the complex. A fluorescence lifetime calculation step of calculating based on one or a plurality of fluorescence lifetime values may be further included. Specifically, the data of the fluorescence decay curve and one or more fluorescence lifetime values derived from fluorescent components other than the complex are applied to the above formulas (I) to (III), and the formula (III) The first fluorescence lifetime value (τ n ) is calculated by searching for a combination of variables (τ n , A 1 to A n ) that minimizes χ 2 in.
凝集体定量ステップでは、上記第一の重み因子に基づいて上記アミロイドの凝集体の量を算出する。上述したように上記第一の重み因子は、上記複合体に由来する蛍光成分の量、すなわち上記アミロイドの凝集体の量に対応する値である。そのため、上記第一の重み因子を直接上記アミロイドの凝集体の量の指標として用いてもよい。また、上記第一の重み因子を上記アミロイドの凝集体の量を反映する別のパラメータとしてもよい。例えば、基準となる第一の重み因子に対する相対比率として表して、上記アミロイドの凝集体の量を相対的に評価してもよい。 In the aggregate quantification step, the amount of the amyloid aggregate is calculated based on the first weighting factor. As described above, the first weighting factor is a value corresponding to the amount of the fluorescent component derived from the complex, that is, the amount of the amyloid aggregate. Therefore, the first weighting factor may be used directly as an index of the amount of the amyloid aggregate. The first weighting factor may be another parameter that reflects the amount of the amyloid aggregate. For example, it may be expressed as a relative ratio with respect to the first weighting factor serving as a reference, and the amount of the amyloid aggregates may be relatively evaluated.
次に本実施形態に係るアミロイドの凝集体の定量装置について説明する。本実施形態に係る装置は、アミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む試料に、上記蛍光物質を励起する光を照射する光源部と、上記試料から発する蛍光を経時的に検出する検出部と、経時的に検出した上記蛍光から蛍光減衰曲線のデータを記録する記録部と、上記蛍光減衰曲線のデータと、上記蛍光物質と上記アミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値と、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて上記複合体に由来する第一の重み因子を算出し、上記第一の重み因子に基づいて上記アミロイドの凝集体の量を算出する演算部と、を備える。以下、詳細に説明する。 Next, an apparatus for quantifying amyloid aggregates according to this embodiment will be described. An apparatus according to the present embodiment includes a light source unit that irradiates a sample containing an amyloid aggregate and a fluorescent material with light that excites the fluorescent material, a detection unit that detects fluorescence emitted from the sample over time, A recording unit for recording data of fluorescence decay curves from the fluorescence detected over time, first fluorescence derived from a complex in which the fluorescence decay curve data and the aggregate of the fluorescent substance and the amyloid are combined. A first weighting factor derived from the complex is calculated based on the lifetime value and one or more fluorescence lifetime values derived from a fluorescent component other than the complex, and based on the first weighting factor A calculation unit that calculates the amount of the amyloid aggregate. Details will be described below.
図１は、アミロイドの凝集体の定量装置の一実施形態を示す模式図である。アミロイドの凝集体の定量装置１００は、アミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む試料３に、蛍光物質を励起する光を照射する光源部６と、試料３から発する蛍光を経時的に検出する検出部１と、経時的に検出した蛍光から蛍光減衰曲線のデータを記録する記録部１５と、蛍光減衰曲線のデータと、蛍光物質とアミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値と、複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて複合体に由来する第一の重み因子を算出し、第一の重み因子に基づいてアミロイドの凝集体の量を算出する演算部１６と、を備えている。
FIG. 1 is a schematic diagram showing an embodiment of an apparatus for quantifying amyloid aggregates. The amyloid
光源部６は、複数の波長が照射可能な単一又は複数の光源から構成されている。光源部６は、公知の光源を適宜使用することができるが、例えば、ＬＥＤ、半導体レーザーが挙げられる。
The
光源部６は、試料３に蛍光物質を励起する光を照射するものであって、励起する光の波長は、２８０ｎｍ〜８００ｎｍである。ここで、光源部６は、単色光源であっても、複数の光源を組み合せた光源であってもよい。光源部６の発光は、所定時間連続してもよいし、任意のパターンでパルス点灯させてもよい。同一又は異なる波長特性を有する複数の光源を順番に発光させたり、複数の光源を同時に発光させたりしてもよい。試料の交換時に検出部１を外部光から保護するため、ハッチ１４と同期して開閉するシャッター２を組み合わせても良い。
The
検出部１は、蛍光物質を励起する光（励起光）が照射されたことによって試料３から生じる蛍光を検出するものであり、蛍光を検知する光センサーと、光センサーに入射する光を制限するためのフィルター、光センサーが検知して出力する信号に基づいて蛍光量を算出する蛍光算出部を有している。
The
検出部１には、光電子増倍管を用いたフォトンカウンター、アバランシェフォトダイオードを用いた微弱光計測装置等を用いることができる。
As the
記録部１５は、上記蛍光減衰曲線のデータの他にも、蛍光物質の自家蛍光の蛍光寿命値及び蛍光寿命測定装置の特性に由来する見かけの蛍光成分の蛍光寿命値等の解析に必要な情報も記録する。記録部１５は、後述するように解析装置１１に備えられてもよい。
In addition to the data of the fluorescence decay curve, the
演算部１６は、後述するように解析装置１１に備えられてもよい。
The
更に上記装置１００は、検出部１に入射する光を制御するシャッター２と、試料３から発せられる蛍光を検出部１に導く集光部４と、検出部１によって得られたデータを後述する解析装置１１に電気的に送信する通信部１０と、装置１００内の温度を調節するための温度調節部１９が設けられている。
Further, the
検出部１、シャッター２、試料３、集光部４及び光源部６は、外部からの光が遮断可能な遮光部１３に格納されている。遮光部１３は例えば暗箱である。
The
試料３は、ハッチ１４を開閉して交換を行うことができる。
The
検出部１、シャッター２、光源部６、通信部１０及び温度調節部１９は、解析装置１１と電気的に接続されており、解析装置１１内にある制御部１２によってその機能が制御されている。
The
解析装置１１には、記録部１５、演算部１６、解析結果の表示を行う表示部１７、制御に必要な情報を入力するため入力部１８を備えている。
The
制御部１２は装置１００の作動状況を所定の手順に従って制御可能な制御装置であり、コンピュータ、タイマー、リレー等を組み合わせたもの等が使用できる。
The
解析装置１１と制御部１２は双方の機能を備えた１つのコンピュータを使用しても良いし、制御部１２、記録部１５、演算部１６、表示部１７、入力部１８に相当する機能を備えたコンピュータ等を用いてもよい。
The
以下、本発明について、実施例を挙げて更に詳細に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
実施例１
（ａ）ベータアミロイド凝集体の調製
ベータアミロイドタンパク質（商品名：ヒト １−４２、ペプチド研究所製）をジメチルスルホキシドで５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、さらに１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩酸を用いて、ベータアミロイドタンパク質の濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。得られたベータアミロイドタンパク質の調製液は、インキュベータを用いて３７℃でインキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、ベータアミロイド凝集体を含む試料（以下、ベータアミロイド凝集体サンプルという場合がある）を調製した。ベータアミロイド凝集体の量を調整するため、インキュベートの時間が０分、２０分、４０分、６０分、８０分又は１００分である上記試料をそれぞれ準備した。すなわちインキュベートの時間が０分である試料には凝集体が存在せず、インキュベートの時間が増えるに従って凝集体の量が増加し、インキュベートの時間が１００分である試料が最も凝集体の量が多い試料となる。
Example 1
(A) Preparation of beta amyloid aggregate Beta amyloid protein (trade name: human 1-42, manufactured by Peptide Institute) was dissolved with dimethyl sulfoxide to 5 mmol / L, and further using 10 mmol / L hydrochloric acid, It diluted so that the density | concentration of beta amyloid protein might be set to 100 micromol / L. The resulting beta amyloid protein preparation was incubated at 37 ° C. using an incubator. By performing the above incubation, a sample containing a beta amyloid aggregate (hereinafter sometimes referred to as a beta amyloid aggregate sample) was prepared. In order to adjust the amount of beta amyloid aggregates, the above samples having incubation times of 0 minutes, 20 minutes, 40 minutes, 60 minutes, 80 minutes, or 100 minutes were prepared. That is, there is no aggregate in the sample with the incubation time of 0 minutes, the amount of aggregate increases as the incubation time increases, and the sample with the incubation time of 100 minutes has the highest amount of aggregate. It becomes a sample.
（ｂ）ベータアミロイド凝集体の染色
ベータアミロイド凝集体サンプル１０μＬに、５μｍｏｌ／ＬのチオフラビンＴ溶液（溶媒：５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ９．０）９９０μＬを混合して染色試料とした。
(B) Staining of beta amyloid aggregates 10 μL of beta amyloid aggregate samples were mixed with 990 μL of a 5 μmol / L thioflavin T solution (solvent: 50 mmol / L glycine-sodium hydroxide solution, pH 9.0) to obtain a stained sample. .
（ｃ）染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光減衰曲線の測定
（ａ）及び（ｂ）の操作で得られた、インキュベートの時間（以下、凝集時間という場合がある）が０分〜１００分であるベータアミロイド凝集体サンプルから調製された染色試料を、それぞれ１ｃｍ角の石英セルに１０００μＬ分注した。その後、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社製、商品名Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ）を用いて、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで、蛍光減衰曲線の測定を行った。測定された蛍光減衰曲線を図２に示す。図２において、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ、凝集時間が０分、２０分、４０分、６０分、８０分及び１００分であるベータアミロイド凝集体サンプルを用いたときの蛍光減衰曲線を示す。
(C) Measurement of fluorescence decay curve of stained beta amyloid aggregates The incubation time (hereinafter sometimes referred to as aggregation time) obtained by the operations of (a) and (b) is 0 to 100 minutes. A stained sample prepared from a certain beta amyloid aggregate sample was dispensed in an amount of 1000 μL into a 1 cm square quartz cell. Thereafter, a fluorescence decay curve was measured at an excitation wavelength of 405 nm and an observation wavelength of 500 nm using a fluorescence lifetime measuring apparatus (trade name Quantaurus-Tau, manufactured by Hamamatsu Photonics). The measured fluorescence decay curve is shown in FIG. In FIG. 2, a, b, c, d, e, and f are obtained when a beta amyloid aggregate sample having an aggregation time of 0 minutes, 20 minutes, 40 minutes, 60 minutes, 80 minutes, and 100 minutes is used, respectively. The fluorescence decay curve of is shown.
（ｄ）蛍光減衰曲線の解析によるベータアミロイド凝集体の定量
得られたそれぞれの減衰曲線Ｆ（ｔ）は、非特許文献２に従い以下の手順で、固有の蛍光寿命値と重み因子とを持つ複数の蛍光成分に分離した。
(D) Quantification of Beta Amyloid Aggregate by Analysis of Fluorescence Decay Curve Each obtained decay curve F (t) has a plurality of intrinsic fluorescence lifetime values and weighting factors according to the following procedure according to
まず、数式（Ｉ）で表される関数Ｇ（ｔ）を、数式（ＩＩ）にしたがってコンボリューション積分し、関数Ｉ（ｔ）を得た。数式（ＩＩ）において、Ｅ（ｔ）は蛍光寿命測定装置の装置応答関数、Ｃはバックグラウンドである。次に、上記Ｉ（ｔ）と、測定された蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）とを比較し、両関数が最も良く一致するように、数式（ＩＩＩ）におけるχ２を最小にする変数の組み合わせを探索した。上記探索を行うことによって、数式（Ｉ）におけるτ１〜τｎ、Ａ１〜Ａｎの最良の組み合わせを得た。数式（ＩＩＩ）において、ｎ１は解析の開始時間、ｎ２は解析の終了時間を示す。 First, the function G (t) represented by the formula (I) was convolution-integrated according to the formula (II) to obtain a function I (t). In Equation (II), E (t) is the device response function of the fluorescence lifetime measuring device, and C is the background. Next, I (t) is compared with the measured fluorescence decay curve F (t), and a combination of variables that minimizes χ 2 in Formula (III) is determined so that both functions are best matched. Explored. By performing the search to obtain formula (I) in τ 1 ~τ n, the best combination of A 1 to A n. In Formula (III), n 1 represents the analysis start time, and n 2 represents the analysis end time.
この解析の結果によって得られたτ１〜τｎが各蛍光成分の寿命、Ａ１〜Ａｎが各蛍光成分の重み因子、すなわち蛍光成分の量である。 Τ 1 to τ n obtained as a result of this analysis are lifetimes of the respective fluorescent components, and A 1 to An are weighting factors of the respective fluorescent components, that is, the amounts of the fluorescent components.
ｎの値は、すなわち減衰曲線の解析に必要な指数関数の数を示す成分数と呼ばれる数値である。各成分は違う物理的機構及び／又は蛍光種を起源とする。本実施例において、これらの成分は、蛍光寿命測定装置の特性、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光、チオフラビンＴの自家蛍光、及びそれ以外の蛍光成分を起源としており、成分数ｎは試料の状態によって適意に決定する必要がある。 The value of n is a numerical value called the number of components indicating the number of exponential functions necessary for analyzing the attenuation curve. Each component originates from a different physical mechanism and / or fluorescent species. In this example, these components originate from the characteristics of the fluorescence lifetime measuring apparatus, the fluorescence of beta amyloid aggregates stained with thioflavin T, the autofluorescence of thioflavin T, and other fluorescent components, and the number of components n Needs to be determined appropriately depending on the condition of the sample.
チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体、及びチオフラビンＴの自家蛍光の蛍光寿命値が既知である場合、これらの蛍光寿命値を定数として数式（Ｉ）に適用する。計測装置が理想的な場合、蛍光減衰曲線は上記２成分で解析できるはずであるが、計測装置の特性に由来する見かけの成分、及びチオフラビンＴ以外の蛍光成分があるため、実際にはこれらの成分を含めた３成分以上の成分数で解析を行った。 In the case where the fluorescence lifetime values of the beta amyloid aggregates stained with thioflavin T and the autofluorescence of thioflavin T are known, these fluorescence lifetime values are applied as constants to the formula (I). When the measuring device is ideal, the fluorescence decay curve should be able to be analyzed with the above two components, but since there are apparent components derived from the characteristics of the measuring device and fluorescent components other than thioflavin T, these are actually The analysis was performed with three or more components including the components.
チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値τ４を１．８ｎｓ、チオフラビンＴの自家蛍光の蛍光寿命値τ３を６．６ｎｓとしたときの、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の重み因子Ａ４（第一の重み因子）の変化を図３に示す。 Beta amyloid aggregates stained with thioflavin T when the fluorescence lifetime value τ 4 of the beta amyloid aggregate stained with thioflavin T is 1.8 ns and the fluorescence lifetime value τ 3 of autofluorescence of thioflavin T is 6.6 ns A change in the weighting factor A 4 (first weighting factor) of the aggregate is shown in FIG.
重み因子Ａ４は、すなわちチオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の量を示すものである。図３は、凝集の進行に従って重み因子Ａ４が増えていることを示しており、本手法によってベータアミロイド凝集体の量を定量できることを示すものである。 Weighting factor A 4, that shows the amount of beta amyloid aggregates stained by thioflavin T. Figure 3 shows that the weighting factors A 4 is increasing with progress of aggregation, the present method is intended to show that you can quantify the amount of beta amyloid aggregates.
凝集時間が０分であるときにおける重み因子Ａ４を１とした場合の、重み因子Ａ４の凝集時間に対する変化を図４に示す。同じ試料において、凝集時間が０分であるときの全蛍光量を１とした場合の相対比率も同時に示した。本手法の結果に関して、ベータアミロイド凝集体の増加による計測値（重み因子Ａ４）の増加は、蛍光強度の増加と一致した傾向を示した。すなわち、本手法による計測値が蛍光量を評価する方法と本質的に同じ情報を与えることが示された。さらに図４によれば、計測値の増分は、本手法の方が従来の方法よりも大きく、ベータアミロイド凝集体をより高感度に検出できることを示している。なお上述の減衰曲線の解析方法については、非特許文献２による一般的な解析方法を適用したものであり、本実施例によって、より高度な解析方法の適用を妨げるのではない。
When coagulation time has a weight factor A 4 and 1 in the time is 0 minutes, the change on the aggregation time of the weighting factors A 4 shown in FIG. In the same sample, the relative ratio when the total fluorescence amount is 1 when the aggregation time is 0 minutes is also shown. Regarding the result of this method, the increase in the measured value (weighting factor A 4 ) due to the increase in the beta amyloid aggregates showed a tendency consistent with the increase in the fluorescence intensity. That is, it was shown that the measured value by this method gives essentially the same information as the method for evaluating the fluorescence amount. Furthermore, according to FIG. 4, the increment of the measured value is larger in the present method than in the conventional method, indicating that the beta amyloid aggregate can be detected with higher sensitivity. Note that the analysis method of the above-described attenuation curve applies a general analysis method according to
実施例２
本実施例は、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値が未知であった場合のベータアミロイド凝集体の定量手法について記載するものである。なお本実施例は、蛍光寿命値が未知である場合の解析方法の一例であり、より高度な解析方法の適用を妨げるものではない
Example 2
This example describes a method for quantifying beta amyloid aggregates when the fluorescence lifetime value of the beta amyloid aggregates stained with thioflavin T is unknown. In addition, a present Example is an example of the analysis method in case a fluorescence lifetime value is unknown, and does not prevent application of a more advanced analysis method.
ベータアミロイド凝集体の調製、ベータアミロイド凝集体の染色、及び染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光減衰曲線の測定は、実施例１に準じて行った。 Preparation of the beta amyloid aggregate, staining of the beta amyloid aggregate, and measurement of the fluorescence decay curve of the stained beta amyloid aggregate were performed according to Example 1.
本実施例においては、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値が未知であることから、解析における成分数ｎ、及びチオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体からの蛍光の寿命を以下に示す手順を用いて決定した。 In this example, since the fluorescence lifetime value of the beta amyloid aggregate stained with thioflavin T is unknown, the number n of components in the analysis and the lifetime of fluorescence from the beta amyloid aggregate stained with thioflavin T are calculated. It was determined using the procedure shown below.
蛍光物質によって染色された凝集体の蛍光寿命値が未知である場合の解析の手順（１）
手順１：凝集時間が０分である染色試料の蛍光減衰曲線について必要かつ十分な成分数ｎで解析する。
手順２：解析の結果得られた蛍光寿命値τ１〜τｎを定数とする。
手順３：凝集時間が０分を超えている染色試料の蛍光減衰曲線について、成分数ｎ＋１で解析する。
手順４：解析の結果、得られた蛍光寿命値τｎ＋１、及び重み因子Ａｎ＋１を蛍光物質によって染色された凝集体の蛍光寿命値と量とする。
Analysis procedure when the fluorescence lifetime value of the aggregate stained with the fluorescent substance is unknown (1)
Procedure 1: Analyze the fluorescence decay curve of a stained sample with an aggregation time of 0 minutes with the necessary and sufficient number of components n.
Procedure 2: Fluorescence lifetime values τ 1 to τ n obtained as a result of analysis are set as constants.
Procedure 3: Analyze the fluorescence decay curve of the stained sample with an aggregation time exceeding 0 minutes with the number of components n + 1.
Procedure 4: As a result of the analysis, the fluorescence lifetime value τ n + 1 and the weighting factor A n + 1 obtained are used as the fluorescence lifetime value and amount of the aggregate stained with the fluorescent substance.
以下、手順（１）に従い、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値の決定と定量方法とを具体的に説明する。 Hereinafter, according to the procedure (1), the determination and quantification method of the fluorescence lifetime value of the beta amyloid aggregate stained with thioflavin T will be specifically described.
まず、ベータアミロイドタンパク質のモノマー（以下、ベータアミロイドモノマーという場合がある）である凝集時間が０分である試料の蛍光減衰曲線について、上述した数式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を用いて解析を行った。解析を行うにあたり成分数ｎは任意であるが、Ｉ（ｔ）とＦ（ｔ）とが最も良く一致するのに必要な最低限の数とした。 First, a fluorescence decay curve of a sample whose aggregation time is 0 minute, which is a monomer of beta amyloid protein (hereinafter sometimes referred to as beta amyloid monomer), is analyzed using the above-described mathematical formulas (I) to (III). It was. In performing the analysis, the number of components n is arbitrary, but it is set to the minimum number necessary for best matching between I (t) and F (t).
このベータアミロイドモノマー試料においては、ベータアミロイド凝集体に由来する蛍光成分は存在しないはずなので、ここで決定されたｎ個の成分は、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光以外からの蛍光成分、すなわち上述した蛍光寿命測定装置の特性由来する見かけの蛍光成分、チオフラビンＴの自家蛍光に由来する蛍光成分、及び不純物等、それ以外のものに由来する蛍光成分の３成分である。 In this beta amyloid monomer sample, there should be no fluorescent component derived from the beta amyloid aggregate, so the n components determined here are fluorescence from other than the fluorescence of the beta amyloid aggregate stained with thioflavin T. There are three components, namely, an apparent fluorescent component derived from the characteristics of the fluorescence lifetime measuring apparatus described above, a fluorescent component derived from auto-fluorescence of thioflavin T, and a fluorescent component derived from others such as impurities.
次に、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体が存在すると思われる、凝集時間が２０分以上である試料から得られた蛍光減衰曲線について、ベータアミロイド凝集体に由来する蛍光成分として新たに成分を追加、すなわち４成分で解析を行った。この解析において、ベータアミロイド凝集体以外の蛍光成分は、ベータアミロイドモノマー試料で得られた３個の蛍光寿命値（τ１〜τ３）として全て既知であるため、これら既知の蛍光寿命値を定数として解析した。この解析の結果、得られた蛍光寿命値τ４が、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値であり、その重み因子Ａ４がベータアミロイド凝集体の量となる。 Next, regarding a fluorescence decay curve obtained from a sample having an aggregation time of 20 minutes or longer, which is considered to have a beta amyloid aggregate stained with thioflavin T, a new component as a fluorescent component derived from the beta amyloid aggregate Was added, that is, analysis was performed with four components. In this analysis, since the fluorescence components other than the beta amyloid aggregate are all known as the three fluorescence lifetime values (τ 1 to τ 3 ) obtained from the beta amyloid monomer sample, these known fluorescence lifetime values are used as constants. As analyzed. As a result of this analysis, the obtained fluorescence lifetime value τ 4 is the fluorescence lifetime value of the beta amyloid aggregate stained with thioflavin T, and the weighting factor A 4 is the amount of the beta amyloid aggregate.
上記解析手法において、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体で得られた蛍光減衰曲線のそれぞれについて、上記解析を個別に行ってもよい。別の解析手法として以下の手順（２）で行ってもよい。 In the above analysis method, the above analysis may be performed individually for each of the fluorescence decay curves obtained with the beta amyloid aggregates stained with thioflavin T. As another analysis method, the following procedure (2) may be used.
蛍光物質によって染色された凝集体の蛍光寿命値が未知である場合の解析の手順（２）
手順１：凝集時間が０分である染色試料の蛍光減衰曲線について必要かつ十分な成分数ｎで解析する。
手順２：解析の結果得られた蛍光寿命値τ１〜τｎを定数とする。
手順３：十分に凝集が進行した染色試料の蛍光減衰曲線について、成分数ｎ＋１で解析する。
手順４：解析の結果、得られた寿命値τｎ＋１を凝集体の蛍光寿命値として、同様に定数とする。
手順５：十分に凝集が進行した染色試料以外の染色試料について、τ１〜τｎ＋１を定数として解析する。
手順６：解析の結果、得られた重み因子Ａｎ＋１を蛍光物質によって染色された凝集体の量とする。
Analysis procedure when the fluorescence lifetime value of the aggregate stained with the fluorescent substance is unknown (2)
Procedure 1: Analyze the fluorescence decay curve of a stained sample with an aggregation time of 0 minutes with the necessary and sufficient number of components n.
Procedure 2: Fluorescence lifetime values τ 1 to τ n obtained as a result of analysis are set as constants.
Procedure 3: Analyze the fluorescence decay curve of the stained sample in which aggregation has progressed sufficiently with the number of components n + 1.
Procedure 4: As a result of analysis, the lifetime value τ n + 1 obtained is set as a constant in the same manner as the fluorescence lifetime value of the aggregate.
Procedure 5: Analyze τ 1 to τ n + 1 as constants for stained samples other than the stained sample in which aggregation has sufficiently progressed.
Procedure 6: The weighting factor An + 1 obtained as a result of the analysis is the amount of aggregates stained with the fluorescent substance.
まず、上記手順（２）に従い、ベータアミロイド凝集体が最も多いと思われる、凝集時間が１００分である試料について最初に解析を行い、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体からの蛍光寿命値τｎ＋１を求める。凝集時間が異なる他の試料を用いた減衰曲線については、この値（τｎ＋１）をチオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の既知の蛍光寿命として解析すれば、正確かつ迅速に解析を行うことができる。以下、具体的に説明する。 First, according to the above procedure (2), a sample having an aggregation time of 100 minutes, which is considered to have the most beta amyloid aggregates, was first analyzed, and the fluorescence lifetime value from the beta amyloid aggregates stained with thioflavin T τ n + 1 is obtained. For decay curves using other samples with different aggregation times, this value (τ n + 1 ) can be analyzed accurately and quickly if analyzed as the known fluorescence lifetime of beta amyloid aggregates stained with thioflavin T. Can do. This will be specifically described below.
本実施例において、まずベータアミロイドモノマーに相当する凝集時間が０分である試料は、ｎ＝３、すなわち３成分で解析された。 In this example, a sample having an aggregation time corresponding to beta amyloid monomer of 0 minutes was analyzed with n = 3, that is, three components.
次にτ１〜τ３の値を固定して、凝集時間が１００分である試料の蛍光減衰曲線を、４成分、すなわちτ４及びＡ１〜Ａ４を変数として解析し、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値τ４とこの試料における凝集体の量Ａ４とを求めた。 Next, the value of τ 1 to τ 3 is fixed, and the fluorescence decay curve of the sample with an aggregation time of 100 minutes is analyzed using four components, that is, τ 4 and A 1 to A 4 as variables, and stained with thioflavin T. The fluorescence lifetime value τ 4 of the resulting beta amyloid aggregate and the amount of aggregate A 4 in this sample were determined.
最後に凝集時間が異なる他の凝集体試料について、τ１〜τ４を定数としＡ１〜Ａ４のみを変数として解析することによって、それぞれの凝集体の量を示すＡ４を決定した。 For the last aggregation time different from the aggregate samples, by analyzing the τ 1 ~τ 4 only A 1 to A 4 is a constant as a variable to determine the A 4 indicating the amount of each of the aggregates.
本実施例の方法によって決定された、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値τ４は１．６ｎｓとなった。凝集体の量を示す重み因子Ａ４の凝集時間に対する経時変化は、図３と同じであり、本手法によってもベータアミロイド凝集体の定量が可能であることが示された。 The fluorescence lifetime value τ 4 of the beta amyloid aggregate stained with thioflavin T determined by the method of this example was 1.6 ns. Aging for agglomeration time weight factor A 4 indicating the amount of aggregates is the same as FIG. 3, it is also by this method are possible quantification of beta-amyloid aggregates was demonstrated.
本実施例によれば、チオフラビンＴ等の蛍光物質によって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値が未知であっても、ベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値を決定することができると共に、ベータアミロイド凝集体の定量が可能である。 According to this example, even if the fluorescence lifetime value of the beta amyloid aggregate stained with a fluorescent substance such as thioflavin T is unknown, the fluorescence lifetime value of the beta amyloid aggregate can be determined and the beta amyloid can be determined. Quantification of aggregates is possible.
実施例３
本実施例は蛍光物質として、チオフラビンＴの類縁化合物であるチオフラビンＳを適用した例である。ベータアミロイド凝集体は、実施例１に記載の方法で調製した。
Example 3
In this example, thioflavin S, which is a similar compound of thioflavin T, is applied as a fluorescent substance. Beta amyloid aggregates were prepared by the method described in Example 1.
このベータアミロイド凝集体サンプル１０μＬに、５μｍｏｌ／ＬのチオフラビンＳ溶液（溶媒：５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ９．０）９９０μＬを混合して染色試料とした。上記染色試料は、実施例１に記載の方法によって蛍光寿命値の計測を行った。得られた蛍光減衰曲線を図５に示す。図５において、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ、凝集時間が０分、２０分、４０分、６０分、８０分及び１００分であるベータアミロイド凝集体サンプルを用いたときの蛍光減衰曲線を示す。 A 10 μL sample of this beta amyloid aggregate was mixed with 990 μL of a 5 μmol / L thioflavin S solution (solvent: 50 mmol / L glycine-sodium hydroxide solution, pH 9.0) to obtain a stained sample. The dyeing samples were measured for fluorescence lifetime values by the method described in Example 1. The obtained fluorescence decay curve is shown in FIG. In FIG. 5, a, b, c, d, e, and f are obtained when a beta amyloid aggregate sample having an aggregation time of 0 minutes, 20 minutes, 40 minutes, 60 minutes, 80 minutes, and 100 minutes is used, respectively. The fluorescence decay curve of is shown.
この減衰曲線を用いて、実施例２に記載の方法で解析を行った結果、チオフラビンＳによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値は４．５ｎｓとなった。凝集時間が０分である凝集体の重み因子を１とした場合の、凝集体の重み因子の凝集時間に対する変化を図６に示す。同じ試料における全蛍光量について、凝集時間が０分であるときを１とした場合の相対比率も同時に示した。本手法の結果に関して、凝集体の増加による計測値の増加は、蛍光強度の増加と一致した傾向を示した。本手法による計測値が蛍光量を評価する方法と本質的に同じ情報を与えることが示された。さらに図６によれば、値の増分は本手法の方が従来の方法に比べてより大きく、凝集体をより高感度に検出できることが示された。 As a result of analysis using the decay curve by the method described in Example 2, the fluorescence lifetime value of the beta amyloid aggregate stained with thioflavin S was 4.5 ns. FIG. 6 shows the change of the weighting factor of the aggregate with respect to the aggregation time when the weighting factor of the aggregate having an aggregation time of 0 minutes is 1. For the total amount of fluorescence in the same sample, the relative ratio when the aggregation time is 0 minutes is also shown at the same time. Regarding the results of this method, the increase in measured values due to the increase in aggregates showed a tendency consistent with the increase in fluorescence intensity. It was shown that the measured value by this method gives essentially the same information as the method of evaluating the amount of fluorescence. Furthermore, according to FIG. 6, the increment of the value was larger in this method than in the conventional method, and it was shown that aggregates can be detected with higher sensitivity.
本実施例によれば、チオフラビンＳのような自家蛍光が比較的強い蛍光物質であっても、凝集体の定量が可能となる。また本手法が、チオフラビン系色素一般に適用できることも本実施例によって示された。 According to the present Example, even if it is a fluorescent substance with comparatively strong autofluorescence like thioflavine S, the aggregate can be quantified. The present example also showed that this method can be applied to thioflavine dyes in general.
実施例４
本実施例は蛍光物質として、アミロイドを認識するための蛍光試薬として用いられる、１−フルオロ−２，５−ビス（３−カルボキシ−４−ヒドロキシスチリル）ベンゼン（ＦＳＢ）を適用した例である。ＦＳＢは、アミロイド染色色素として古くから用いられているコンゴーレッドの類縁化合物であり、コンゴーレッドより強い蛍光強度を持つアミロイド認識蛍光試薬として知られている。ベータアミロイド凝集体は、実施例１に記載の方法で調製した。
Example 4
In this example, 1-fluoro-2,5-bis (3-carboxy-4-hydroxystyryl) benzene (FSB), which is used as a fluorescent reagent for recognizing amyloid, is applied as a fluorescent substance. FSB is a related compound of Congo Red that has been used for a long time as an amyloid staining dye, and is known as an amyloid-recognizing fluorescent reagent having a fluorescence intensity stronger than that of Congo Red. Beta amyloid aggregates were prepared by the method described in Example 1.
このベータアミロイド凝集体サンプル１０μＬに、１％（ｗ／ｖ）ＦＳＢ溶液（溶媒：ＤＭＳＯ）の４０００倍希釈液（希釈液：５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ９．０）９９０μＬを混合して染色試料とした。上記染色試料は、実施例１に記載の方法によって蛍光寿命の計測を行った。得られた蛍光減衰曲線を図７に示す。図７において、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ、凝集時間が０分、２０分、４０分、６０分、８０分及び１００分であるベータアミロイド凝集体サンプルを用いたときの蛍光減衰曲線を示す。 To 10 μL of this beta amyloid aggregate sample, 990 μL of a 1% (w / v) FSB solution (solvent: DMSO) 4000-fold diluted solution (diluted solution: 50 mmol / L glycine-sodium hydroxide solution, pH 9.0) was mixed. A dyed sample was obtained. The above dyed sample was measured for fluorescence lifetime by the method described in Example 1. The obtained fluorescence decay curve is shown in FIG. In FIG. 7, a, b, c, d, e, and f are obtained when a beta amyloid aggregate sample having an aggregation time of 0 minutes, 20 minutes, 40 minutes, 60 minutes, 80 minutes, and 100 minutes is used, respectively. The fluorescence decay curve of is shown.
この減衰曲線を用いて、実施例２に記載の方法で解析を行った結果、ＦＳＢによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値は２．３３ｎｓとなった。凝集時間が０分である凝集体の重み因子を１とした場合の、凝集体の重み因子の凝集時間に対する変化を図８に示す。同じ試料における全蛍光量について、凝集時間が０分であるときを１とした場合の相対比率も同時に示した。本手法の結果に関して、凝集体の増加による計測値の増加は、蛍光強度の増加と一致した傾向を示した。本手法による計測値が蛍光量を評価する方法と本質的に同じ情報を与えることが示された。さらに図８によれば、値の増分は本手法の方が従来の方法に比べてより大きく、凝集体をより高感度に検出できることが示された。 As a result of analysis using the decay curve by the method described in Example 2, the fluorescence lifetime value of the beta amyloid aggregate stained with FSB was 2.33 ns. FIG. 8 shows the change of the weighting factor of the aggregate with respect to the aggregation time when the weighting factor of the aggregate whose aggregation time is 0 minute is 1. For the total amount of fluorescence in the same sample, the relative ratio when the aggregation time is 0 minutes is also shown at the same time. Regarding the results of this method, the increase in measured values due to the increase in aggregates showed a tendency consistent with the increase in fluorescence intensity. It was shown that the measured value by this method gives essentially the same information as the method of evaluating the amount of fluorescence. Furthermore, according to FIG. 8, the increment of the value was larger in this method than in the conventional method, and it was shown that aggregates can be detected with higher sensitivity.
本実施例によれば、ＦＳＢのようなチオフラビンＴとは別の骨格を持つアミロイド認識蛍光試薬であっても、凝集体の定量が可能となる。さらに本手法が、一般的なアミロイド認識蛍光試薬に適用できることも本実施例より示された。 According to this example, even if it is an amyloid-recognizing fluorescent reagent having a skeleton different from that of thioflavin T such as FSB, it is possible to quantify the aggregate. Furthermore, it was shown from this example that this method can be applied to a general amyloid-recognizing fluorescent reagent.
実施例５
本実施例は蛍光物質として、粘性蛍光プローブとして有名な８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を適用した例である。ＡＮＳはアミロイド染色にはあまり用いられないが、溶媒の粘性等によって分子の運動が抑制されると蛍光強度が増強するという、チオフラビンＴと同じ発蛍光機構を持つ化合物である。ベータアミロイド凝集体は、実施例１に記載の方法で調製した。
Example 5
In this example, 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS), which is famous as a viscous fluorescent probe, is applied as a fluorescent substance. ANS is a compound having the same fluorescence mechanism as that of thioflavin T, which is not often used for amyloid staining, but increases the fluorescence intensity when the movement of the molecule is suppressed by the viscosity of the solvent. Beta amyloid aggregates were prepared by the method described in Example 1.
このベータアミロイド凝集体サンプル１０μＬに、５μｍｏｌ／ＬのＡＮＳ溶液（溶媒：５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ９．０）９９０μＬを混合して染色試料とした。上記染色試料は、実施例１に記載の方法で蛍光寿命計測を行った。ただし、本実施例においては観測波長を４３５ｎｍに設定して測定を行った。得られた蛍光減衰曲線を図９に示す。図９において、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ、凝集時間が０分、２０分、４０分、６０分、８０分及び１００分であるベータアミロイド凝集体サンプルを用いたときの蛍光減衰曲線を示す。 A 10 μL sample of this beta amyloid aggregate was mixed with 990 μL of a 5 μmol / L ANS solution (solvent: 50 mmol / L glycine-sodium hydroxide solution, pH 9.0) to obtain a stained sample. The stained sample was subjected to fluorescence lifetime measurement by the method described in Example 1. However, in this example, the measurement was performed with the observation wavelength set to 435 nm. The obtained fluorescence decay curve is shown in FIG. In FIG. 9, a, b, c, d, e, and f are obtained when a beta amyloid aggregate sample having an aggregation time of 0 minutes, 20 minutes, 40 minutes, 60 minutes, 80 minutes, and 100 minutes is used, respectively. The fluorescence decay curve of is shown.
この減衰曲線を用いて、実施例２に記載の方法で解析を行った結果、ＡＮＳによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値は０．８８ｎｓとなった。凝集時間が０分である凝集体の重み因子を１とした場合の、凝集体の重み因子の凝集時間に対する変化を図１０に示す。同じ試料における全蛍光量について、凝集時間が０分であるときを１とした場合の相対比率も同時に示した。本手法の結果に関して、凝集体の増加による計測値の増加は、蛍光強度の増加と一致した傾向を示した。本手法による計測値が蛍光量を評価する方法と本質的に同じ情報を与えることが示された。 As a result of analysis using the decay curve by the method described in Example 2, the fluorescence lifetime value of the beta amyloid aggregate stained with ANS was 0.88 ns. FIG. 10 shows the change of the aggregate weight factor with respect to the aggregation time when the aggregate weight factor with an aggregation time of 0 minutes is set to 1. For the total amount of fluorescence in the same sample, the relative ratio when the aggregation time is 0 minutes is also shown at the same time. Regarding the results of this method, the increase in measured values due to the increase in aggregates showed a tendency consistent with the increase in fluorescence intensity. It was shown that the measured value by this method gives essentially the same information as the method of evaluating the amount of fluorescence.
ＡＮＳは粘性によって蛍光スペクトルが大きくシフトすることが知られており、シフト前とシフト後の蛍光強度比を求めることで、蛍光量より鋭敏に蛍光変化を計測することができる。この蛍光比による凝集体の計測の結果も図１０中に点線で示した。図１０によれば、値の増分は、従来から用いられている蛍光量又は蛍光比による計測よりも本手法の方がより大きく、凝集体をより高感度に検出できることが示された。 It is known that the fluorescence spectrum of ANS greatly shifts due to viscosity. By obtaining the fluorescence intensity ratio before and after the shift, the fluorescence change can be measured more sensitively than the fluorescence amount. The result of measurement of aggregates by this fluorescence ratio is also indicated by a dotted line in FIG. According to FIG. 10, the increment of the value is larger in the present method than in the conventional measurement based on the fluorescence amount or the fluorescence ratio, and it is shown that the aggregate can be detected with higher sensitivity.
なおＡＮＳにおいては、他の蛍光色素と異なり、凝集時間が４０分以上である試料中の凝集体の量が単調に増加していない。これはＡＮＳとベータアミロイド凝集体とが他の蛍光物質とは異なる結合様式を持っているために起こる現象であり、本手法に由来するものではない。本実施例によれば、ＡＮＳのようなチオフラビンＴと同じ発蛍光機構を持つ化合物であっても、凝集体の定量が可能となる。 In ANS, unlike other fluorescent dyes, the amount of aggregates in a sample having an aggregation time of 40 minutes or longer does not increase monotonously. This is a phenomenon that occurs because ANS and beta amyloid aggregates have different binding modes from other fluorescent substances, and is not derived from this method. According to the present Example, even if it is a compound which has the same fluorescence mechanism as thioflavine T like ANS, an aggregate can be quantified.
実施例６
本実施例は蛍光物質として、チオフラビンＴの骨格を参考に設計されたＰＥＴ用ベータアミロイド標識試薬である６−（２−フルオロエトキシ）−２−（４−メチルアミノスチリル）ベンゾオキサゾール（ＢＦ−１６８）を適用した例である。ベータアミロイド凝集体は、実施例１に記載の方法で調製した。
Example 6
In this example, 6- (2-fluoroethoxy) -2- (4-methylaminostyryl) benzoxazole (BF-168) is a beta amyloid labeling reagent for PET designed with reference to the skeleton of thioflavin T as a fluorescent substance. ) Is applied. Beta amyloid aggregates were prepared by the method described in Example 1.
このベータアミロイド凝集体サンプル１０μＬに、５μｍｏｌ／ＬのＢＦ−１６８溶液（溶媒：０．０５［ｖｏｌ］％のＤＭＳＯを含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ９．０）９９０μＬを混合して染色試料とした。 To 10 μL of this beta amyloid aggregate sample, 990 μL of 5 μmol / L BF-168 solution (solvent: 50 mmol / L glycine-sodium hydroxide solution, pH 9.0 containing 0.05 [vol]% DMSO) was mixed. A dyed sample was obtained.
染色試料は、実施例１に記載の方法で蛍光寿命計測を行った。ただし、本実施例においては観測波長を４８０ｎｍに設定して測定を行った。得られた蛍光減衰曲線を用いて、実施例２に記載の方法で解析を行った結果、ＢＦ−１６８によって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値は４．５ｎｓとなった。凝集時間が０分である凝集体の重み因子を１とした場合の、凝集体の重み因子の凝集時間に対する変化を図１１に示す。同じ試料における全蛍光量について、凝集時間が０分であるときを１とした場合の相対比率も同時に示した。本手法の結果に関して、凝集体の増加による計測値の増加は、蛍光強度の増加と一致した傾向を示した。本手法による計測値が蛍光量を評価する方法と本質的に同じ情報を与えることが示された。さらに図１１によれば、値の増分は本手法の方が従来の方法に比べてより大きく、凝集体をより高感度に検出できることを示している。 The stained sample was subjected to fluorescence lifetime measurement by the method described in Example 1. However, in this example, the measurement was performed with the observation wavelength set to 480 nm. As a result of analyzing by the method as described in Example 2 using the obtained fluorescence decay curve, the fluorescence lifetime value of the beta amyloid aggregate dye | stained by BF-168 became 4.5 ns. FIG. 11 shows the change of the aggregate weighting factor with respect to the aggregation time when the aggregation weighting factor having an aggregation time of 0 minutes is set to 1. For the total amount of fluorescence in the same sample, the relative ratio when the aggregation time is 0 minutes is also shown at the same time. Regarding the results of this method, the increase in measured values due to the increase in aggregates showed a tendency consistent with the increase in fluorescence intensity. It was shown that the measured value by this method gives essentially the same information as the method of evaluating the amount of fluorescence. Furthermore, according to FIG. 11, the increment of the value is larger in this method than in the conventional method, indicating that aggregates can be detected with higher sensitivity.
本実施例によれば、ＢＦ−１６８のような、ＰＥＴ計測用として設計された標識試薬であっても、凝集体の定量が可能となる。本手法が、ＰＥＴ用ベータアミロイド標識試薬一般に適用できることも本実施例よって示された。 According to the present Example, even if it is a labeling reagent designed for PET measurement, such as BF-168, the aggregate can be quantified. This example also shows that this technique can be applied to general beta amyloid labeling reagents for PET.
実施例７
本実施例は蛍光物質として、スチルベン系の骨格を持つベータアミロイド標識試薬であるレスベラトロールを適用した例である。ベータアミロイド凝集体は、実施例１に記載の方法で調製した。
Example 7
In this example, resveratrol, which is a beta amyloid labeling reagent having a stilbene-based skeleton, is applied as a fluorescent substance. Beta amyloid aggregates were prepared by the method described in Example 1.
このベータアミロイド凝集体サンプル１０μＬに、５μｍｏｌ／Ｌのレスベラトロール溶液（溶媒：５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ９．０）９９０μＬを混合して染色試料とした。上記染色試料は、実施例１に記載の方法で蛍光寿命の計測を行った。得られた減衰曲線を用いて、実施例２に記載の方法で解析を行った結果、レスベラトロールによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値は４．５ｎｓとなった。凝集時間が０分である凝集体の重み因子を１とした場合の、凝集体の重み因子の凝集時間に対する変化を図１２に示す。同じ試料における全蛍光量について、凝集時間が０分であるときを１とした場合の相対比率も同時に示した。本手法の結果に関して、凝集体の増加による計測値の増加は、蛍光強度の増加と一致した傾向を示した。本手法による計測値が蛍光量を評価する方法と本質的に同じ情報を与えることが示された。さらに図１２によれば、値の増分は本手法の方がより大きく、凝集体をより高感度に検出できることを示している。 A 10 μL sample of this beta amyloid aggregate was mixed with 990 μL of a 5 μmol / L resveratrol solution (solvent: 50 mmol / L glycine-sodium hydroxide solution, pH 9.0) to obtain a stained sample. The stained sample was measured for fluorescence lifetime by the method described in Example 1. As a result of analysis using the obtained attenuation curve by the method described in Example 2, the fluorescence lifetime value of the beta amyloid aggregate stained with resveratrol was 4.5 ns. FIG. 12 shows the change of the weight factor of the aggregate with respect to the aggregation time when the weight factor of the aggregate whose aggregation time is 0 minute is 1. For the total amount of fluorescence in the same sample, the relative ratio when the aggregation time is 0 minutes is also shown at the same time. Regarding the results of this method, the increase in measured values due to the increase in aggregates showed a tendency consistent with the increase in fluorescence intensity. It was shown that the measured value by this method gives essentially the same information as the method of evaluating the amount of fluorescence. Furthermore, according to FIG. 12, the increment of the value is larger in this method, indicating that aggregates can be detected with higher sensitivity.
本実施例によれば、レスベラトロールのような、スチルベン系の骨格を持つベータアミロイド標識試薬であっても、凝集体の定量が可能となる。さらに本手法が、スチルベン系ベータアミロイド標識試薬一般に適用できることも本実施例によって示された。 According to the present Example, even if it is a beta amyloid labeling reagent with a stilbene-type frame | skeleton like resveratrol, the fixed_quantity | quantitative_assay of an aggregate is attained. Furthermore, the present example also showed that this technique can be applied to stilbene-based beta amyloid labeling reagents in general.
１…検出部、６…光源部、１５…記録部、１６…演算部、１００…アミロイドの凝集体の定量装置。
DESCRIPTION OF
Claims (2)
前記第一の試料から発する蛍光を経時的に検出して、第一の蛍光減衰曲線のデータを取得する、データ取得ステップと、
前記蛍光物質と前記アミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値を、前記第一の蛍光減衰曲線のデータと、前記複合体以外の蛍光成分に由来する複数の蛍光寿命値と、に基づいて算出する、蛍光寿命算出ステップであって、前記複合体以外の蛍光成分に由来する複数の蛍光寿命値は、凝集していない前記アミロイドと前記蛍光物質とを含む第二の試料に前記光を照射することによって前記第二の試料から発する蛍光を経時的に検出して取得された第二の蛍光減衰曲線のデータに基づいて算出されている、ステップと、
前記第一の蛍光減衰曲線のデータと、前記第一の蛍光寿命値と、前記複合体以外の蛍光成分に由来する複数の蛍光寿命値と、に基づいて前記複合体に由来する第一の重み因子を算出する、重み因子算出ステップと、
前記第一の重み因子に基づいて前記アミロイドの凝集体の量を算出する、凝集体定量ステップと、
を含む、アミロイドの凝集体の定量方法。 Irradiating the first sample containing the amyloid aggregate and the fluorescent material with light for exciting the fluorescent material;
A data acquisition step of detecting fluorescence emitted from the first sample over time and acquiring data of a first fluorescence decay curve;
The first fluorescence lifetime value derived from the complex in which the fluorescent substance and the amyloid aggregate are bound to each other, the first fluorescence decay curve data, and a plurality of fluorescences derived from the fluorescence components other than the complex A fluorescence lifetime calculation step for calculating a lifetime based on the lifetime value, wherein a plurality of fluorescence lifetime values derived from a fluorescence component other than the complex include the amyloid that is not aggregated and the fluorescent material. Calculated based on the data of the second fluorescence decay curve obtained by detecting the fluorescence emitted from the second sample over time by irradiating the sample with the light, and
A first weight derived from the complex based on the data of the first fluorescence decay curve, the first fluorescence lifetime value, and a plurality of fluorescence lifetime values derived from a fluorescence component other than the complex A weight factor calculating step for calculating a factor;
Calculating the amount of aggregates of the amyloid based on the first weighting factor;
A method for quantifying amyloid aggregates, comprising:
（式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ３は炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示し、ＡはＯ又はＳを示し、５員環に含まれる窒素原子は炭素数１〜６のアルキル基と結合していてもよく、式（２）中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水酸基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を示し、Ｘは水素又はハロゲンを示し、式（３）中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に水素、水酸基、ハロゲン、又は、１若しくは２つの炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示し、式（４）中、Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ独立に水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ１４は炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示す。）
The fluorescent substance includes thioflavine S, 6- (2-fluoroethoxy) -2- (4-methylaminostyryl) benzoxazole, 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid, and the following formulas (1) and (2): The quantification method according to claim 1, wherein the method is selected from compounds represented by (3) or (4).
(In Formula (1), R 1 and R 2 each independently represent hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 3 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, halogen or hydroxyl group, and A represents O Or a nitrogen atom contained in the 5-membered ring may be bonded to an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and in formula (2), R 4 and R 5 are each independently a hydroxyl group or a carbon number of 1; -6 represents an alkoxy group, X represents hydrogen or halogen, and in formula (3), R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are each independently hydrogen, hydroxyl group, halogen, or 1 represents an amino group which may be substituted with one or two alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, and in formula (4), R 12 and R 13 are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; are shown, R 14 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, halogen or hydroxyl Are shown.)
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