JP6126072B2 - 遺伝子発現を抑制する治療におけるリポソームによる効率的な送達のプロセスおよび組成物 - Google Patents

遺伝子発現を抑制する治療におけるリポソームによる効率的な送達のプロセスおよび組成物 Download PDF

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Description

本開示は、一般に、生物学的に活性な薬剤および薬物薬剤の送達のためのプロセス、組成物、および使用に関する。本開示のプロセスおよび組成物は、選択された細胞、組織、器官、または対象への治療用薬剤の送達に有用である。本発明の実施形態は、核酸薬剤を含む、医薬品および治療用薬剤の送達、ならびに薬物送達を達成するための物質を作製および使用するための方法を提供し得る。特に、本発明は、リポソームまたはラメラベシクルを含有するプロセスおよび組成物、ならびに他の形態の送達促進組成物および製剤、ならびにこれらの送達物質のための治療方法および使用に関する。
配列表
本願は、２００９年１０月１４日に作成された、９９，６２２バイトの大きさで、ＭＤ−０８−１６ＰＣＴ．ｔｘｔと名づけられたＡＳＣＩＩファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してこれにより提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
対象への治療用化合物の送達は、該化合物が、その標的細胞もしくは組織に達する限られた能力によって、または細胞内での該化合物の制限された侵入もしくは行き来（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）によって妨害されることがあり得る。治療用物質の送達は、一般に、細胞の膜によって制限されている。送達に対するこれらの障壁および制限は、結果を達成するために望ましい濃度よりもはるかに高濃度の化合物を使用する必要性を生じ得、これは、毒性効果および副作用のリスクをもたらす。
特定の治療用化合物を送達する際のさらなる制限は、輸送プロセスにおいて、分解から化合物を保護する必要性である。特に、血液循環を介した全身送達は、種々のタンパク質、酵素、および免疫学的な成分および因子に該化合物を曝し得る。
送達のための１つの戦略は、天然もしくは合成の脂質またはポリマー担体分子を用いて細胞内への化合物の輸送を改善することである。これらの物質は、細胞内への選択的侵入のために存在する機序を利用し得るが、依然として核酸およびタンパク質等の外因性分子は排除し得る。例えば、カチオン性脂質は、薬物薬剤と相互作用し、細胞膜との接触を提供し得る。また、特定の天然および合成親油性分子は、薬物薬剤用の担体としてリポソームまたは粒子に組織化され得る。ナノメートルまたはサブミクロンの大きさのリポソームは、エンドサイトーシス等の細胞内への選択的侵入のために存在する機序を利用することができる。リポソーム薬物担体は、薬物分子を分解から保護すると共に、細胞によるその取り込みを改善し得る。また、リポソーム薬物担体は、静電気的および他の相互作用によって特定の化合物をカプセル化またはそれに結合することができ、負に荷電した細胞膜と相互作用して膜を通過する輸送を開始し得る。
リポソームの欠点は、治療用リポソーム製剤の生物学的活性が、一般に、リポソームへの活性薬剤の取り込みの度合いに依存することである。一般に、取り込みの高い度合いが、高い治療活性を得るために望ましい。さらに、リポソームの取り込みは、製剤内で残存するさらなる担体分子を必要とし得る。
薬物薬剤送達用のリポソームの別の制限は、それらを使用することにより、送達製剤の質量を増加させることである。治療用製剤の生物学的活性およびその相対毒性は、製剤を調製するために使用される、たとえば親油性分子および担体等の追加の成分の性質および質量によって影響を受け得る。活性薬剤の送達用の従来の脂質系リポソーム製剤は、活性薬剤の質量に対する１０〜１５倍以上の脂質分子の質量の比を有し得る。一般に、活性薬剤に対する脂質または担体の低い比が、さらに効率的かつ望ましい。核酸薬剤用のかかるリポソーム製剤は、１リポソーム当たり数百以下の複製の核酸薬剤分子を含有し得る。
調節性ＲＮＡの理解、ならびにとりわけ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ＲＮＡｉ療法、ＲＮＡ系薬物、アンチセンス療法、および遺伝子療法の開発により、細胞内への活性核酸薬剤の導入に有効な手段の必要性が増大している。一般に、核酸は、細胞または血漿内で限定的な期間のみ安定である。しかしながら、核酸系薬剤は、組成物および製剤中で安定化され得、次いで、これを細胞内送達のために分散させ得る。
必要とされているものは、薬物および生物学的活性分子の全身および局所送達のためのプロセス、組成物、および使用である。とりわけ、生物学的活性分子および治療用分子の送達の効率を増大させる、リポソーム型を含む、送達構造物および担体を作製し、使用するためのプロセスに対する必要性がある。特に、リポソーム製剤、遺伝子発現抑制治療薬、および他の薬剤のために軽減した量の担体物質を用いて、効率的な送達を有すると共に、生物学的に活性を高くすることが望ましい。
概要
本開示は、最終的に、治療として用いる薬物薬剤の細胞内および生体内送達のための新規のプロセス、組成物、および製剤を提供し、これは、一般に、細胞保護作用および比較的低い毒性を維持する。本開示の方法および組成物は、選択された細胞、組織、および器官への薬物薬剤の送達に有用である。
幾つかの態様では、本開示は、細胞への活性核酸薬剤または分子を送達するためのプロセス、組成物、および方法を提供する。該活性薬剤は、薬剤作用、あるいは、ＲＮＡ干渉、またはアンチセンスもしくはリボザイム効果の応答を生じることによって、治療または薬理効果を提供し得る。本開示の活性薬剤は、ゲノム発現の制御、または遺伝子治療のために有用であり得る。
本発明の実施形態は、活性薬剤の水性緩衝溶液を含む第１の流れを提供し、有機溶媒中で１つ以上のリポソーム形成化合物の非水性溶液を含む第２の流れを提供し、該第１の流れを該第２の流れに衝突させ、それによって、約２０％〜約５０％ｖ／ｖの有機溶媒の濃度を有する衝突流を形成することによって、１つ以上の活性薬剤を含有するリポソーム組成物を含む、組成物を作製するための様々なプロセスを提供する。該衝突流は、約６〜約７．４のｐＨを有し得る。該衝突流は、約２０℃〜約３５℃の温度で、約０．５時間〜約８時間、収集リザーバ中で培養され、それによって、リポソームを含む培養物を形成することができる。
ある実施形態において、１つ以上の活性薬剤を含有する組成物を作製するためのプロセスは、有機溶媒の濃度を約２０％ｖ／ｖ未満にするのに十分な緩衝液を培養物に添加することによって培養物の反応を停止させることを含み得る。
幾つかの態様において、本発明のリポソーム形成化合物は、１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物であり得る。ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、リポソームを形成し得るアミノ酸基を含有する合成有機化合物である。ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、アミノ酸基のＮ末端あるいはＣ末端のいずれか、または両末端で、送達促進尾部または親油性尾部を含有することができる。
幾つかの変形において、１つ以上の活性薬剤を含有する組成物を作製するためのプロセスは、さらに、活性薬剤を含有する該第１の流れの体積流量が、リポソーム形成分子を含有する該第２の流れの体積流量の２倍以上であることを含み得る。ある変形において、該第１の流れの体積流量は、該第２の流れの体積流量の３倍以上、または該第２の流れの体積流量の５倍以上である。
本開示の活性薬剤は、ＵｓｉＲＮＡ、核酸含有薬剤、遺伝子発現抑制剤、遺伝子調節剤、アンチセンス薬剤、ペプチド核酸薬剤、リボザイム薬剤、ＲＮＡ薬剤、またはＤＮＡ薬剤であり得る。幾つかの実施形態において、該活性薬剤は、薬学的化合物、または小分子医薬品であり得る。
１つ以上の活性薬剤を含有するリポソーム組成物を作製するためのプロセスは、有機溶媒の濃度を調節するために、該収集リザーバに緩衝液を添加することをさらに含み得る。該衝突流のｐＨは、約３〜約６であるように調節され得る。培養ステップは、約３〜約６のｐＨで行われ得る。
ある態様において、該活性薬剤は、５０％を上回るレベルで、または７０％を上回るレベルで、リポソーム中にカプセル化され得る。
幾つかの態様において、本発明は、４５℃の温度で７日間、遺伝子発現抑制活性を保持するリポソーム組成物を提供し得る。ある態様において、該リポソーム組成物は、４５℃の温度で７日間、該活性薬剤のカプセル化を保持し得る。
本発明のプロセスは、接線流濾過および透析濾過によって該培養物を濾過することを含み得る。接線流濾過後、該リポソームは、直径約１６０ｎｍ未満の均一の大きさであり得、約４０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約１５０ｎｍの平均直径を有し得る。さらなる実施形態において、該培養物は、滅菌され得、該有機溶媒は、異なる薬学的に許容される緩衝液と交換され得る。
本開示の幾つかのプロセスにおいて、該培養物は、接線流濾過および透析濾過によって濾過され得る。ある実施形態において、該培養物は、滅菌され得る。
本発明のプロセスは、約１％〜約４０％ｖ／ｖの濃度で、該第１の流れに有機溶媒を添加することを含み得る。
該有機溶媒は、注射用の滅菌水中の約４０〜約９９％ｖ／ｖ、または約７０〜約９５％の濃度の（Ｃ１−６）アルカノールであり得る。
本開示のプロセスの培養時間は、約１時間〜約４時間の長さであり得る。
本発明は、さらに、本開示のプロセスの任意の変形によって作製される薬学的組成物を企図する。
一般に、本開示は、生体細胞への治療用核酸を送達するための方法を含む。
幾つかの実施形態において、本開示は、本発明のプロセスに従って組成物を調製し、該組成物で生体細胞を処置することによって、該細胞内で遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。
本明細書に開示される哺乳動物において、遺伝子の発現を阻害するための方法は、本発明のプロセスに従って組成物を調製すること、および該哺乳動物に該組成物を投与することを含む。
本発明の実施形態は、さらに、本発明のプロセスに従って組成物を調製し、ヒトに該組成物を投与することによって、ヒトにおいて、疾患を治療するための方法を提供し得、該疾患は、癌、膀胱癌、肝臓癌、肝疾患、高コレステロール血症、炎症性疾患、代謝性疾患、炎症、関節炎、リウマチ性関節炎、脳炎、骨折、心臓疾患、およびウイルス性疾患である。
本開示は、さらに、疾患を治療するための、および疾患を治療するための医薬の調製における、組成物の使用を企図する。
本発明は、細胞への生物学的薬剤を送達するための様々な組成物および製剤を提供する。さらに具体的には、ある態様において、本開示は、リポソーム製剤およびナノメートルスケールサイズの担体粒子を提供する。該担体粒子は、リポソームに取り込まれ得、送達において安定性の増加を示し得、遺伝の発現または活性を調節するための薬物薬剤を効率的に送達することができる。
本開示は、薬物および生物学的活性分子の全身および局所送達を向上するための、組成物、方法、および使用を提供する。とりわけ、本願は、送達効率の増加を伴い、細胞内で活性薬剤を送達することができる送達構造物および担体を作製および使用するための新規の組成物および方法を提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、１つ以上の担体粒子を含有するリポソームを含む組成物を提供し、各担体粒子は、活性核酸薬剤およびペプチドを含み、ペプチドの質量＋リポソームの質量／核酸薬剤の質量の比は、約１５未満、または約１２未満、または約１０未満、または約９未満、または約８未満、または約５未満である。
ある実施形態において、本発明は、生体内で、ＡｐｏＢの遺伝子発現を抑制するために、５０％以上、７０％以上、または９０％以上のノックダウン活性を有する、組成物を提供する。
幾つかの変形において、本開示の組成物は、アミノ酸脂質を含むリポソームを含有し得る。
ある態様において、本開示の組成物は、荷電した担体粒子、負に荷電した担体粒子、または正に荷電した担体粒子を含有し得る。
ある変形において、該活性核酸薬剤は、ＲＮＡｉ誘導薬剤またはアンチセンス薬剤である。各リポソームは、該活性薬剤分子の５００個以上の複製、または１０００個以上の複製、または５０００個以上の複製を含有し得る。
幾つかの変形において、担体粒子用に使用するペプチドは、切断可能なペプチドまたは架橋可能なペプチドである。幾つかの実施形態において、該ペプチドは、ＰＮ４１１０またはＰＮ１８３である。
本開示は、リポソーム組成物を調製することと、該組成物で細胞を処置することと、を含む、活性核酸薬剤を該細胞に送達するための方法を提供する。
ある態様において、本開示は、リポソーム組成物を調製することと、該組成物で細胞を処置することと、を含む、該細胞内での遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。
幾つかの態様において、本開示は、リポソーム組成物を調製することと、哺乳動物に該組成物を投与することと、を含む、該哺乳動物において、遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、ヒトにおいて、疾患を治療するための方法を提供し、該疾患は、リウマチ性関節炎を含む炎症性疾患、高コレステロール血症を含む代謝性疾患、肝疾患、脳炎、骨折、心臓疾患、肝炎およびインフルエンザを含むウイルス性疾患、ならびに癌から選択され、これには、リポソーム組成物を調製することと、該ヒトに該組成物を投与することと、を含む。
ある実施形態において、本開示は、リウマチ性関節炎を含む炎症性疾患、高コレステロール血症を含む代謝性疾患、肝疾患、脳炎、骨折、心臓疾患、肝炎およびインフルエンザを含むウイルス性疾患、ならびに癌を含む疾患を治療するための医薬の調製における、リポソーム組成物の使用を提供する。
幾つかの変形において、本開示は、リウマチ性関節炎を含む炎症性疾患、高コレステロール血症を含む代謝性疾患、肝疾患、脳炎、骨折、心臓疾患、肝炎およびインフルエンザを含むウイルス性疾患、ならびに癌から選択される疾患を治療するためのリポソーム組成物の使用を提供する。
この概要は、本発明の詳細説明、ならびに図、添付の実施例および特許請求の範囲と共に、全体として本発明の開示を包含する。
特定のリポソーム形成化合物が、二重層ベシクル１０を形成する、本発明のリポソームの実施形態の略図である。本実施形態において、リポソームの外層は、リポソーム形成分子のうちの１つの頭部基に付着したポリエチレングリコール鎖２０によって保護される。また、該リポソームの外層は、細胞または組織を特異的に標的とするためのリガンド３０も示す。本実施形態において、該リポソームベシクルは、縮合ＲＮＡナノ粒子４０、二本鎖ＲＮＡ二重鎖ペプチド結合体５０、三本鎖ｍｄＲＮＡ６０、ダイサー酵素基質ＲＮＡ７０、長いオーバーハング付きｄｓＲＮＡ８０、および平滑末端付きｓｉＲＮＡ９０を含む活性干渉ＲＮＡ成分の搭載物を含有する。 本開示のリポソーム組成物を調製するための特定の実施形態のフローチャート。活性薬剤溶液、緩衝溶液、および１つ以上のリポソーム形成化合物の溶液を含む試薬溶液は、別個に調製され、リザーバ２００に提供される。該活性薬剤溶液およびリポソーム形成化合物の溶液は、衝突流２１０において接触される。該衝突流は、収集リザーバ２２０に収集される。該収集された物質は、培養プロセス２３０のためにリザーバに保持され、そのステップの後、物質は、反応停止２４０によって安定化される。反応停止した物質は、濾過プロセス２５０に供される。該濾過出力２６０は、仕上げプロセスへと続く。 本開示のリポソーム組成物を仕上げるための特定の実施形態のフローチャート。リポソーム組成物の調製からの濾過出力物質であり得る、リポソーム組成物は、滅菌される３００。滅菌した組成物を担持するための容器は、充填３１０、仕上げ３２０され、その後、滅菌組成物は、保管３４０のために冷凍される３３０。最終組成物を、使用のために出荷する３５０。 本開示のリポソーム組成物を調製するための特定の実施形態のプロセス図。活性薬剤溶液は、リザーバ４００中に維持される。ＤＩＬＡ２化合物または脂質等のリポソーム形成成分を含有する溶液は、別個のリザーバ４１０中に維持される。緩衝溶液は、別のリザーバ４２０中に維持される。それらの溶液は、独立して選択された流量で別個の蠕動ポンプ４３０を用いて送り出される。該溶液は、任意に、インラインフィルタを通過し得るか、またはリザーバに充填される前に濾過され得る。衝突プロセスにおいて、該活性薬剤溶液は、接触点４３４で、リポソーム形成成分を含有する溶液と接触させる。該衝突流は、任意に、１つ以上の混合管４３６を通過し得る。該衝突流は、培養プロセスのために収集リザーバ４４０に入る。反応停止プロセスの緩衝溶液は、任意に、別個のリザーバ４５０に維持され得る。該リポソーム組成物４６０は、濾過プロセスに入るために、収集リザーバ４４０を出る。 本開示のリポソーム組成物を調製するための特定の実施形態のプロセス図。安定化リポソーム組成物を、収集リザーバの出力４６０からリザーバ５００に提供する。透析濾過緩衝溶液は、別個のリザーバ５２０中に維持される。蠕動ポンプ５０２は、中空繊維膜５０４を含有する管を通ってリザーバ５００から安定化リポソーム組成物の循環を提供する。接線流濾過は、この循環を介して生じ、濾液５３０の除去によって安定化リポソーム組成物を濃縮する。リザーバ５２０からの緩衝液のさらなる取り替えは、固定または可変容量で透析濾過を可能にする。任意に、安定化リポソーム組成物の透析は、蠕動ポンプ５０６を用いてリザーバ５４０からの透析緩衝溶液を起動することによって行われ得る。特定の濃度で、安定化リポソーム組成物は、仕上げプロセスに出力される５５０。 図６は、ｄｓＲＮＡへのポリアルギニン結合領域の結合が、ポリアルギニン結合領域の長さと共に増加したことを示す。図６において、最強の結合（ＳＹＢＲ金の染色を変位させる最大能力）が、ＰＮ３４９９で観察され、これは、合計１０個のアルギニンを含有する二量体ペプチドであった。
本発明の実施形態は、核酸薬剤を含む、医薬品および治療用薬剤の送達、ならびに薬物送達を達成するための物質を作製および使用するための方法を提供し得る。
本発明は、さらに、種々の分子および構造物を細胞に送達するために有用である新規の薬物送達促進プロセスおよび組成物に関する。本発明は、最終的に、薬物送達、治療薬、ならびに対象における、遺伝子の発現または活性の調節に応答するものを含む疾患および状態の診断および治療のために行われる、様々なプロセス、化合物、組成物、製剤、ならびに使用を提供する。さらに具体的には、本発明は、リポソームまたはラメラビシクルを含有するプロセスおよび組成物、ならびに他の形態の送達促進組成物および製剤、ならびに治療方法およびこれらの送達物質の使用に関する。
本開示のプロセスおよび組成物は、さらに、核酸薬剤、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、ならびに小分子化合物および薬物等の、治療用、予防用、および診断用薬剤の送達のために使用され得る。
本開示の組成物および方法は、リポソームまたはラメラビシクル内でのカプセル化等の形態で、治療用薬剤の送達に有用である。これらの形態は、種々の直径のナノ粒子を含み得る。
調節性ＲＮＡの理解、ならびにとりわけ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉもしくはｉＲＮＡ）、ＲＮＡｉ療法、ＲＮＡ系薬物、アンチセンスもしくはリボザイム療法、およびＤＮＡ遺伝子療法の開発により、細胞内への活性核酸薬剤の導入に有効な手段の必要性が増大している。一般に、核酸は、細胞または血液に導入される場合、限定的な期間のみ安定である。しかしながら、核酸系薬剤は、組成物および製剤中で安定化され得、次いで、これを投与し、細胞内送達のために分散させ得る。
核酸薬剤には、遺伝子発現抑制剤、遺伝子調節剤、アンチセンス薬剤、ペプチド核酸薬剤、リボザイム薬剤、ＲＮＡ薬剤、およびＤＮＡ薬剤等の任意の核酸含有部分が含まれる。
幾つかの実施形態において、本開示の組成物および方法は、リポソーム中にカプセル化された治療用薬剤の送達に有用である。これらの実施形態において、該治療用薬剤は、搭載物と言及され得る。
例えば、図１は、種々の親油性分子が、二重層ベシクル１０を形成する、本発明のリポソームの実施形態の略図を示す。本実施形態において、該リポソームの外層は、親油性分子のうちの１つの頭部基に付着したポリエチレングリコール鎖２０によって保護される。また、該リポソームの外層は、細胞または組織の特異的標的化のためのリガンド３０を示す。本実施形態において、該リポソームベシクルは、本実施形態にプールされる、縮合ＲＮＡナノ粒子４０、二本鎖ＲＮＡ二重鎖ペプチド結合体５０、三本鎖ｍｄＲＮＡ６０、ダイサー基質ＲＮＡ７０、長いオーバーハング付きｄｓＲＮＡ８０、および平滑末端付きｓｉＲＮＡ９０を含む活性干渉ＲＮＡ成分の搭載物を含有する。治療用搭載物の他の形態は、マイクロＲＮＡ、ヘアピンＲＮＡ、ＤＮＡ、またはリボザイムの形態を含み得る。
一般に、いかなる活性薬剤も、本開示のプロセスおよび組成物において、搭載物として利用され得る。幾つかの実施形態において、該搭載物は、小有機分子の医薬品であり得る。ある実施形態において、該搭載物は、負に荷電した、または中性の治療用薬剤であり得る。
本開示の幾つかの態様において提供されるプロセスおよび組成物は、放出可能な形態または組成物中の治療用薬剤を送達し得る。放出可能な形態および組成物は、活性薬剤に結合および放出する分子、活性薬剤に結合しかつ該薬剤の放出を補助する部分を解放する分子、活性薬剤に結合し、かつその後に該薬剤の放出を補助するために生物学的区画内で形態が調節される分子、および放出メディエーター化合物と混合される活性薬剤に結合する分子を含有する組成物を含む。
ある態様において、本開示は、治療用薬剤の送達に好適なリポソーム組成物を作製するための方法および装置を提供する。ある実施形態において、本開示の活性薬剤は、ＵｓｉＲＮＡである。本開示の方法は、二本鎖または三本鎖ＲＮＡ構造物、ＲＮＡペプチド結合体、縮合ＲＮＡナノ粒子、ダイサー基質ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ヘアピンＲＮＡ，および他の活性ＲＮＡ形態等の核酸薬剤のリポソーム組成物を提供し得る。
本開示の活性薬剤は、活性ＲＮＡ薬剤のペプチド縮合体であり得る。例えば、ペプチドまたは他の生体分子を活性ＲＮＡ薬剤を縮合させることによって形成されるナノ粒子、高分子種とのＲＮＡの縮合体は、本発明のリポソーム組成物への搭載物として取り込むことができる。該ナノ粒子は、架橋であり得る。
さらなる実施形態において、本開示の活性薬剤は、ペプチド、タンパク質、プロテアーゼ、抗体、モノクローナル抗体、抗体系薬物、ワクチン薬剤、または小分子薬物であり得る。
活性薬剤を含有する組成物は、水性溶液であり得る。
本明細書で使用される、水性溶液という用語は、水溶液、滅菌水溶液、または溶媒の大部分が水である任意の溶液を指す。水性溶液は、例えば、幾つかの有機溶媒を含有し得る。
水性溶媒の例には、水、注射用の滅菌水、リンガー液、および等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。
リポソーム形成分子または親油性分子を含有する組成物は、非水性溶液であり得る。
本明細書で使用される、非水性溶液という用語は、溶媒の大部分が水ではない任意の溶液を指す。非水性溶液は、いくらかの水を含有し得る。
非水性溶媒の例には、水と混合できる有機溶媒、アルカノール、（Ｃ１−６）アルカノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｓｅｃブタノール、ｔ−ブタノール、アルカノール水、エタノール水、アセトニトリル、アセトン、ケトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤溶液、洗浄用溶液、およびこれらの組み合わせが含まれる。
リポソーム組成物のプロセス
本発明の実施形態は、活性薬剤を含有するリポソーム含有組成物を作製するための様々なプロセス、および薬物送達の方法を提供し得る。
幾つかの態様において、リポソーム組成物は、２つの組成物、例えば、１つ以上の活性薬剤を含有する組成物、および１つ以上のリポソーム形成分子を含有する別個の組成物を衝突させることによって作製することができる。
一般に、本開示のリポソーム構造物は、調製プロセスの全てのステップが完了するまで、完全に活性な形態において構成されない。ある一定の期間が、本発明のプロセスにおける各ステップに必要とされる。リポソーム組成物の形成率は、一般に、多くの変数、例えば、流量、温度、ｐＨ、各構成成分の濃度等の組み合わせの予測できない効果に依存し得る。幾つかの実施形態において、培養時間が、形成プロセスを管理するために使用される。
図２は、本開示のリポソーム組成物を調製するための特定の実施形態のフローチャートを示す。図２を参照すると、活性薬剤溶液、緩衝溶液、および１つ以上のリポソーム形成化合物の溶液を含む試薬溶液は、別個に調製され、溶液リザーバ２００に提供される。該試薬溶液は、任意に、別個に濾過され得るか、または無菌で調製され得る。活性薬剤溶液およびリポソーム形成化合物の溶液は、衝突プロセス２１０において接触される。該衝突流は、収集リザーバ２２０に収集される。該収集された物質は、培養プロセス２３０のためにリザーバに保持されて、それらのステップの後、反応停止によって安定化される２４０。反応停止した物質は、濾過プロセス２５０に供される。該濾過出力２６０は、仕上げプロセスへ取り出される。
本発明は、衝突プロセスを含むリポソーム組成物を作製するプロセスの実施形態を含む。衝突プロセスは、活性薬剤を含有する組成物をリポソーム形成分子を含有する組成物に衝突させることによって衝突流を生み出すための１つ以上のステップを有し得る。
幾つかの態様において、活性薬剤のリポソーム組成物を作製するための本開示のプロセスは、培養プロセスの１つ以上のステップを有し得る。培養プロセスは、リザーバ中に衝突流を収集し、一定の培養時間、保持することを含むことができる。
本発明の実施形態は、さらに、培養した組成物が反応停止処理される、リポソーム組成物を作製するためのプロセスを含み得る。反応停止処理は、溶媒、緩衝液もしくは希釈液を、培養した組成物の流れもしくは混合物に添加することによって行われ得る。反応停止処理は、有機溶媒または分散剤等の特定の成分の濃度を規定レベルを下回るように希釈することであり得る。一般に、培養組成物の反応停止は、さらなるプロセスまたは仕上げステップに関して安定した組成物を形成し得る。反応停止処理のステップは、リポソーム構造を含有し得る培養組成物を安定させるように機能する。
収集リザーバ中の衝突流の培養は、プロセスの他のステップと共に、活性薬剤が、リポソームによって高度にカプセル化される、リポソーム製剤を提供することができる。例えば、ある実施形態において、リポソーム組成物の形成および本開示の構造は、衝突、混合、希釈、収集、培養、ｐＨの調節、反応停止、および濾過のステップのうちのいずれをも必要とし得る。
本開示のリポソーム組成物を作製するためのプロセスは、さらに、１つ以上の濾過ステップを含み得る。濾過ステップは、種々のプロセスパラメータを変更する、例えば、成分の濃度を制御もしくは変える、または粒径もしくは分散度、および他の物理的溶液パラメータを変えるために使用され得る。
図３は、本開示のリポソーム組成物を仕上げるための特定の実施形態のフローチャートを示す。図３を参照すると、リポソーム組成物の調製からの濾過出力物質であり得る、リポソーム組成物は、滅菌される３００。滅菌した組成物を担持するためのリザーバは、充填３１０、仕上げ３２０され、その後、滅菌組成物は、保管３４０のために冷凍される３３０。最終組成物は、使用のために出荷される３５０。
容器への物質の滅菌、充填、および仕上げ、ならびに最終製剤の保管を含む本開示のプロセスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ ｅｄ．１９９０）に記載されるもの等の当該技術分野において既知のステップおよび方法を使用し得る。
カプセル化、サイジング、およびリポソームの一般調製を評価するための幾つかの方法は、例えば、国際公開ＷＯ第２００１００５３７４号、米国特許公開第２００４０１４２０２５号および第２００７０２５２２９５号、ならびに米国特許第６，８４３，９４２号に与えられる。
衝突および混合
ある態様において、本発明は、活性薬剤のリポソーム組成物を作製するための様々な方法およびプロセス条件を提供する。
図４は、本開示のリポソーム組成物を調製するための特定の実施形態の略図を示す。図４を参照すると、活性薬剤溶液は、リザーバ４００中に維持される。ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物または脂質等のリポソーム形成成分を含有する溶液は、別個のリザーバ４１０中に維持される。緩衝溶液は、別のリザーバ４２０中に維持される。これらの溶液は、独立して選択された流量で別個の蠕動ポンプ４３０を用いて、移送管４０２を通して送り出される。該溶液は、任意に、インラインフィルタを通過し得るか、または対応するリザーバに充填される前に濾過され得る。衝突プロセスにおいて、該活性薬剤溶液は、接触点４３４で、リポソーム形成成分を含有する溶液と接触させることができる。該接触点は、いかなる形状、角度、配向、または大きさであり得る。該衝突流は、１つ以上の乱流混合管４３６を通過し得る。該衝突流は、収集リザーバ４４０に入る。緩衝溶液は、リザーバ４２０から収集リザーバ４４０にポンプで送り出され得る。収集リザーバ４４０中で収集された混合物は、培養プロセスにおいて、一期間保持され得る。反応停止プロセスの緩衝溶液は、任意に、別個のリザーバ４５０中に維持され得る。該反応停止したリポソーム組成物４６０は、収集リザーバ４４０を出て濾過プロセスに入る。
ある実施形態において、リザーバ４５０中の該緩衝溶液は、任意に、衝突流を希釈するために使用され得、収集容器前、または任意の混合管前に衝突流で接触させ得る。
上で論じたように、リポソーム組成物を形成するために、本開示の特定のプロセスは、移送管中、および任意に、乱流混合管中の混合、容器もしくはリザーバ中への収集、培養プロセス、および反応停止処理を行う、衝突流を提供する。反応停止した物質は、濾過および仕上げのために出力される。
衝突流は、一般に、リポソーム形成分子を含有する組成物と活性薬剤の組成物とを接触させることによって生じる。該衝突流は、組成物を接触させて、単一の流れを形成するためのみの機能を果たし得る。該衝突流は、一般に、組成物の完全な相互分散（ｉｎｔｅｒｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）または相互混合を提供し得ない。任意のステップにおいて、衝突流は、乱流混合条件に供され得る。
該衝突流のｐＨは、約３〜約９の範囲で制御され得る。幾つかの実施形態において、該衝突流のｐＨは、約５〜約８、または約６〜約７、または約７．４である。ある変形において、該衝突流のｐＨは、約３〜約６である。該衝突流のｐＨは、移送管を通して、または混合管中で、または収集リザーバ中で衝突流を移送する間、調節され得る。ある実施形態において、該衝突流の初期ｐＨは、約５〜約８、または約６〜約７．４であり、該ｐＨは、初期衝突後、約３〜約６の範囲で調節される。ある実施形態において、該衝突流のｐＨは、常に、約７．４である。
衝突流を形成するために使用される組成物は、衝突前に、濾過され得る。本開示の１つ以上の活性薬剤を含有する組成物は、約２００ナノメートル（ｎｍ）以上、または約３００ｎｍ以上、または約５００ｎｍ以上の大きさの望ましくない粒子もしくは位相を除去するために、例えば、フロー濾過技術によって濾過され得る。種々のリポソーム形成分子を含有する組成物は、約２００ｎｍ以上、または約３００ｎｍ以上、または約５００ｎｍ以上の大きさの望ましくない粒子もしくは相を除去するために、例えば、フロー濾過技術によって濾過され得る。
該衝突流の温度は、約１５℃〜約３７℃の範囲で制御され得る。
本発明の態様は、さらに、該衝突流の組成物が、衝突される組成物の流量を用いて制御され得ることを提供する。一般に、各組成物は、選択された直径の管を通して流れ、したがって、衝突流中で混合される流れの相対体積流量は、衝突流中の種々の成分の濃度の説明を提供する。
例えば、同一直径の管を通って流れる２つの別個の流れを衝突させることによって衝突流が形成される場合、別個の流れの流量が、元の流れの成分の濃度と比較した、衝突流中の成分の濃度を決定し得る。故に、流量は、特定の特徴を有するリポソーム組成物を作製するために、衝突流中で所望の組成物を提供するために使用することができる。
ある実施形態において、該流れの流量は、リポソーム形成分子と比較した活性薬剤の濃度、ならびに、溶媒もしくは塩の濃度ならびに混合およびせん断力を含む他のパラメータを制御するために使用することができる。本発明の実施形態には、リポソーム製剤を作製するためのプロセスが含まれ、そこでは活性薬剤のカプセル化およびリポソーム粒径は、プロセス装置の流量を適応させることによって、有利に強化される。
ある態様において、本発明のプロセスは、親油性分子を含有する組成物の流れに活性薬剤の組成物の流れを衝突させるために、同一直径の管を採用し得る。ある変形において、該組成物の流量は、同じか、または同じでないことがあり得る。特定の実施形態において、活性薬剤を含有する組成物の流量は、親油性分子を含有する組成物の流量に同じでない場合がある。例えば、ある実施形態において、活性薬剤を含有する組成物の流量は、親油性分子を含有する組成物の流量の２倍であり得る。他の変形例において、活性薬剤を含有する組成物の流量は、親油性分子を含有する組成物の流量の２倍以上であり得るか、または幾つかの実施形態において、親油性分子を含有する組成物の流量の３倍以上、または親油性分子を含有する組成物の流量の５倍以上であり得る。
一般に、装置の管は、いかなる直径であってもよい。ある実施形態において、本発明のプロセスは、活性薬剤の組成物の流れを、リポソーム形成分子を含有する組成物の流れに衝突させるために、異なる直径の管を採用し得る。ある変形において、該管の直径は、同じか、あるいは同じではない場合がある。例えば、ある実施形態において、活性薬剤の溶液を含有する管の直径は、親油性分子の溶液を含有する管の直径の３／４であり得る。他の変形例において、活性薬剤の溶液を含有する管の直径は、親油性分子の溶液を含有する管の直径の半分であり得る。他の変形例において、活性薬剤の溶液を含有する管の直径は、親油性分子の溶液を含有する管の直径よりも大きいものであり得る。
幾つかの実施形態において、該衝突流は、さらに、流入混合のためのある手段を用いて混合され得る。流入混合のための手段は、流れの方法を変化させるように配置された１つ以上のチャネル、毛細管、または経路を有する混合器を含み、該チャネル、毛細管、または経路は、乱流混合を提供するために、１回以上分岐および再接続され得る。流入混合のための手段は、任意に、機械的撹拌機、シェーカー、またはかき混ぜ棒、ブレード、パドル、もしくはプレート、もしくは羽根を含み得る。
乱流混合に対するレイノルズ数は、２０００を上回る、または２４００を上回り得る。
乱流混合器中の混合流の滞留時間は、衝突流の流量を調節することによって制御することができる。幾つかの変形において、乱流混合器中の衝突流の流量および滞留時間は、リポソーム粒子のサイジングを制御するために使用することができる。
貫流混合の乱流混合管手段の一例は、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ社のインライン静的ミキサーＫ−０４６６９−５２、３１６ステンレス製管ミキサー、３／１６”管ＯＤ、２１要素である。
本開示の各プロセスに使用される装置の容器、管、および他の流れの構成要素は、使用される反応物および溶媒に不活性、かつ温度およびｐＨ等の反応条件に好適な、任意の物質から作製され得る。物質の例には、ポリマー、金属、ステンレス製、ガラス、およびセラミックが含まれる。また、該容器、管、および他の流れの構成要素は、不活性物質で被覆され得る。
該容器、管、および他の流れの構成要素は、一般に、各ステップにおいて、溶液および混合物の流量の制御を可能にする１つ以上の制御可能なポンプと流体連通される。該装置は、流量を制御するために、種々の弁、例えば、逆止め弁を含み得る。該容器、管、および他の流れの構成要素は、口金またはＯリングを含み得る、種々の締め具で連結され得る。該装置は、流れの経路において、種々の点で、温度センサーを含み得る。
本開示の方法および装置は、バッチまたは連続プロセスで使用され得る。
収集リザーバ、培養プロセス、および反応停止プロセス
図４を参照すると、幾つかの実施形態において、該衝突流は、収集リザーバ４４０に入る。収集リザーバ４４０において、収集された衝突流は、培養プロセスに供される。
培養プロセスは、収集物質を混合する１つ以上のステップ、希釈緩衝液を用いて希釈する１つ以上のステップ、収集リザーバ中でｐＨを調節する１つ以上のステップ、および特定の温度で培養時間、収集物質を保持する１つ以上のステップを含み得る。
該収集物質は、例えば、機械的撹拌機、ロッカー、またはかき混ぜ棒、ブレード、パドル、もしくはプレート、もしくは羽根を用いて、収集リザーバ中で混合され得る。
幾つかの変形において、衝突流は、リポソーム形成化合物を含有する組成物と活性薬剤の組成物とを接触させ、緩衝液、溶媒、もしくは希釈剤を衝突流に添加することによって形成され得る。緩衝液、溶媒、もしくは希釈剤の添加は、衝突流の混合または収集前に生じ得るか、または培養プロセスの一部として収集リザーバ中で行われ得る。緩衝液、溶媒、もしくは希釈剤の添加は、活性薬剤、リポソーム形成分子、および収集リザーバ中の別の溶媒等の他の成分の濃度を低下させる。
幾つかの実施形態において、移送管中で、あるいは混合管中で、あるいは収集リザーバ中のいずれかにかかわらず、衝突流への緩衝液、溶媒、もしくは希釈剤の添加は、約５０％（ｖ／ｖ）以下、または約４０％（ｖ／ｖ）以下、または約３５％（ｖ／ｖ）以下、または約３３％（ｖ／ｖ）以下、または約３０％（ｖ／ｖ）以下、または約２５％（ｖ／ｖ）以下、または約２２％（ｖ／ｖ）以下、または約２０％（ｖ／ｖ）以下まで、有機溶媒の濃度を希釈し得る。
収集リザーバ中の収集された混合物または組成物のｐＨは、約３〜約９の範囲で制御され得る。幾つかの実施形態において、収集された衝突流のｐＨは、約５〜約８、または約６〜約７．４になるように調節される。ある実施形態において、収集された混合物のｐＨは、約５〜約８であり、該ｐＨは、初期衝突後、約３〜約６の範囲まで調節される。幾つかの変形において、収集された衝突流のｐＨは、約７．４で維持される。本開示のリポソーム組成物はまた、ｐＨが各ステップにおいて、７．４であるプロセスにおいて形成され得る。
幾つかの態様において、収集リザーバ中で収集された混合物または組成物は、培養保持期間に供される。収集リザーバ中の培養物の保持期間の長さは、数分間〜数時間、または約１５分間〜約８時間、または約０．５時間〜約８時間、または約０．５時間〜約４時間、または約１時間〜約４時間、または約１時間〜約２時間の範囲に及び得る。
プロセスの幾つかの変形において、緩衝液、溶媒、もしくは希釈剤を用いた衝突流の希釈後、乱流混合が生じ、培養物の保持期間は、０．５時間〜約８時間、または約１時間〜約４時間、または約１時間〜約２時間の範囲に及び得る。
ある変形において、乱流混合は、緩衝液、溶媒、もしくは希釈剤を用いた衝突流の希釈前に生じ、培養物の保持期間は、数分間〜数時間、または約１５分間〜約８時間、または約０．５時間〜約８時間、または約０．５時間〜約４時間、または約１時間〜約４時間、または約１時間〜約２時間の範囲に及び得る。
培養プロセスの培養時間の長さは、一般に、衝突流の流量、ならびに温度およびｐＨ等の他のプロセスパラメータに依存し得る。
保持期間中、収集リザーバ中の収集された組成物の温度は、約１５℃〜約３７℃、または約２２℃〜約３５℃の範囲で制御され得る。
幾つかの態様において、培養プロセスは、緩衝液、溶媒、もしくは希釈剤の急速添加を用いて培養物を反応停止させることによって終了され得る。反応停止ステップは、約２０％（ｖ／ｖ）以下、または約１５％（ｖ／ｖ）以下、または約１０％（ｖ／ｖ）以下、または約５％（ｖ／ｖ）以下まで、有機溶媒の濃度を低下させ得る。
幾つかの実施形態において、反応停止プロセスは、さらに、活性薬剤をカプセル化するリポソームを含有する安定化リポソーム組成物を提供し得る。
濾過および仕上げ
上で論じられたように、幾つかの実施形態において、衝突流は、混合、収集、培養プロセス、および反応停止プロセスを経る。反応停止した物質は、濾過および仕上げのために出力される、安定化リポソーム組成物であり得る。
図５は、濾過および仕上げにより本開示のリポソーム組成物を調製するための特定の実施形態の略図を示す。図５を参照すると、反応停止したリポソーム組成物４６０等の安定化リポソーム組成物は、リザーバ５００に入れられる。透析濾過緩衝溶液は、別個のリザーバ５２０中に維持される。蠕動ポンプ５０２は、中空繊維膜５０４を含有する管を通ってリザーバ５００から安定化リポソーム組成物の循環を提供する。接線流濾過は、この循環を介して生じて、安定化したリポソーム組成物を濃縮し、濾液５３０は、中空繊維膜５０４を含有する管から除去される。リザーバ５２０からの緩衝液の取り替えの追加により、固定または可変容量で透析濾過を可能にする。安定化リポソーム組成物はまた、製剤中の活性薬剤の最終濃度を得るために緩衝液を添加することにより希釈され得る。任意に、安定化リポソーム組成物の透析は、リザーバ５４０からの透析緩衝溶液を起動するために蠕動ポンプ５０６を用いて行われ得る。特定の濃度の安定化されたリポソーム組成物が、仕上げ過程に出力される５５０。
一般に、濾液５３０は、有機溶媒およびカプセル化されていない活性薬剤を含み得る。故に、濾液の除去は、安定化リポソーム組成物中の有機溶媒の濃度を低下させ、カプセル化されていない活性薬剤を除去し得る。
一般に、反応停止した培養物は、薬学的組成物を調製するために望ましい範囲を下回る活性薬剤の濃度を有し得る。幾つかの実施形態において、反応停止した培養物は、薬学的組成物を調製するには高すぎる非水性溶媒の濃度を有し得る。これらの濃度は、上で論じたように、接線流濾過および透析濾過によって調節され得る。
幾つかの実施形態において、反応停止した培養物は、接線流濾過装置、またはカートリッジもしくはカセット接線流濾過装置に循環される。緩衝液または溶媒を添加しないで循環させる場合、接線流濾過は、緩衝液および溶媒の体積の減少した状態で、リポソーム組成物を保持し、それによって、その濃度を増加させる。
同様の装置は、非水性溶媒を除去し、それを透析濾過緩衝液と取り替えるために、透析濾過モードにおいて使用され得る。透析濾過モードにおいて、循環する残余物の体積は、本来、透析濾過緩衝液を添加することによって一定に保たれる。故に、有機溶媒の濃度は、それが浸透物に入り、除去される場合、減少する。
活性薬剤の濃度は、透析濾過ステップの残余物に緩衝液を添加することによって調節され、所望の最終濃度を達成し得る。濃度調節された残余物は、その後、直接フロー濾過を使用して、残余産物溶液を滅菌するために使用される、滅菌ユニットに提供され得る。滅菌された産物は、滅菌バイアル充填プロセスに使用され得、産物のバイアルは低温で保管される。瞬間冷凍、凍結乾燥、および低温凍結乾燥、ならびに他の手段を、産物を調製し、保管するために使用することができる。
ある実施形態において、所望の活性薬剤濃度に達するために、反応停止した培養物は、最初に、接線流濾過し、続いて、有機溶媒を除去するために透析濾過し、次いで、さらに接線流濾過し、最後に、緩衝液、溶媒、もしくは希釈剤を用いて希釈することによって濃縮され得る。
濾過のための方法および物質の例は、Ｍａｒｋ Ｃ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎｏｙｅｓ １９９０），ｐｐ１８６−８７に与えられる。濾過の幾つかの態様は、Ｍｕｎｉｒ Ｃｈｅｒｙａｎ，Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９８）において与えられる。
活性薬剤のカプセル化
リポソーム粒子による活性薬剤のカプセル化の度合いは、一般に、多くのプロセスパラメータによって影響を受ける。
幾つかの実施形態において、培養プロセス後のリポソーム粒子による活性薬剤のカプセル化の度合いは、５０％以上、または６０％以上、または７０％以上、または８０％以上、または９０％以上、または９５％以上、または９６％以上、または９７％以上、または９８％以上、または９９％以上、または本質的に１００％である。
活性薬剤の、本開示のリポソーム組成物は、一般に、均一な大きさのリポソーム粒子を含有する。リポソーム粒径は、直径約３００ｎｍ以下、または約２５０ｎｍ以下、または約２００ｎｍ以下、または約１８０ｎｍ以下、または約１６０ｎｍ以下、または約１５０ｎｍ以下、または約１４０ｎｍ以下、または約１３０ｎｍ以下、または約１２０ｎｍ以下、または約１１０ｎｍ以下、または約１００ｎｍ以下、または約９０ｎｍ以下、または約８０ｎｍ以下、または約７０ｎｍ以下であり得る。
リポソーム粒径は、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約６０ｎｍ〜約４００ｎｍ、または約７０ｎｍ〜約３００ｎｍ、または約７０ｎｍ〜約２００ｎｍ、または約７０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約１６０ｎｍの範囲に及び得る。
幾つかの変形において、安定化リポソーム組成物は、約１０％未満のリポソーム粒子の外側であり、カプセル化されていない活性薬剤、または約８％未満のカプセル化されていない活性薬剤、または約５％未満のカプセル化されていない活性薬剤、または約４％未満のカプセル化されていない活性薬剤、または約３％未満のカプセル化されていない活性薬剤、または約２％未満のカプセル化されていない活性薬剤、または約１％未満のカプセル化されていない活性薬剤を含有し得る。
安定化リポソーム組成物中の活性薬剤のカプセル化レベルは、約７０％〜約９９％、または約８０％〜約９９％、または約９０％〜約９９％、または約９５％〜約９９％の範囲に及び得る。安定化リポソーム組成物中の活性薬剤のカプセル化レベルは、本質的に１００％であり得る。
遺伝子の発現を停止する治療における効率的な送達
本開示は、一般に、新規の化合物および組成物、ならびに生物学的に活性な薬剤および薬物薬剤の送達のための方法およびその使用に関する。本開示の化合物および組成物は、選択された細胞、組織、器官、または対象への治療用薬剤の送達に有用である。さらに具体的には、本開示は、生物学的に活性な薬剤および薬物薬剤の送達をもたらすための、核酸薬剤を含む治療用薬剤の送達、ならびにペプチドを含有する物質を作成および使用するための方法に関する。
本開示は、薬物および生物学的活性分子の効率的な全身および局所送達のための、様々な化合物、組成物、方法および使用を提供する。効率的な送達は、ペプチドを含む種々の担体分子を用いて、リポソームへの活性薬剤の高度の充填によって提供され得る。本開示の化合物および組成物は、活性薬剤の高効率の送達を達成することができる。
送達の効率性の１つの尺度は、送達効率比である。本明細書で使用される、送達効率比は、担体分子の全質量／活性薬剤の質量の比である。送達効率比が低いほど、活性薬剤と比較して担体物質の質量が少なく、不要な毒性および副作用の可能性が低い。本明細書で使用される場合、低送達効率比が、さらに有利かつ望ましい。
本発明は、一般に、核酸の送達のための担体および製剤の分野に関する。核酸のための担体は、架橋可能かつ切断可能なペプチド構造を含む、ペプチド成分で形成される化合物および組成物を含む。さらに具体的には、本発明は、核酸と結合して複合体または縮合組成物を形成する、架橋可能なペプチド構造および切断可能なペプチド構造を提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、ペプチドおよび核酸から形成される複合体を提供する。これらの複合体は、ペプチドおよび核酸の複合体を有するコア構造を含み、コア構造は、ペプチドおよび核酸の種々の層を有する。核酸を用いて本発明の複合体の形成に好適なペプチドは、任意のカチオン性ペプチドを含む。
幾つかの態様において、ペプチドおよび核酸の複合体、縮合体、またはナノ粒子は、リポソーム製剤に充填され得る。本開示のリポソーム製剤は、生物学的に活性な薬剤および薬物薬剤、特に、核酸薬剤のための安定な送達を提供することができる。
幾つかの態様において、本開示の組成物および製剤は、毒性の低下を伴う生物学的活性を提供することができる。
また、遺伝子の発現または活性を修飾させる時に、担体、ペプチド、核酸構築体、またはペプチド複合体、ならびに本開示の製剤を使用する方法も、細胞標的成分および他の薬学的製剤成分と組み合わせて、任意に提供される。
本発明は、生物学的に活性な薬剤を細胞に送達するための様々な担体組成物を提供する。さらに具体的には、本開示は、小分子に縮合された核酸薬剤を有するナノメートルの規模の様々な担体構造を提供する。担体粒子は、送達において安定性を増加させ得、活性薬剤を効率的に送達し得る。リポソームに充填された担体粒子の製剤は、安定性および送達効率性の増加を提供することができる。
本開示の新規の化合物および組成物は、有利な範囲の送達効率比を達成することができる。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、ＲＮＡｉ誘導薬剤に対して、１５未満、または１０未満の送達効率比を提供する。
本開示の組成物および方法は、核酸、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、ならびに小分子化合物および薬物等の、治療用、予防用、および診断用薬剤の送達のために有用であり得る。これらの組成物は、種々の直径のナノ粒子を含み得る。
本開示は、最終的に、治療として用いる活性薬剤の細胞内および生体内送達のための新規の化合物、組成物、および製剤を提供し、これは、一般に、細胞保護作用および比較的低い毒性を維持する。本開示の化合物および組成物は、病状または表現型を修飾するために、選択された細胞、組織、器官、または区画への活性薬剤の送達に有用である。
幾つかの態様において、本開示は、ＲＮＡ干渉、アンチセンス効果、またはゲノム発現の制御もしくは調節の応答を生じるために、ＲＮＡ構造物を細胞に送達するための化合物、組成物、方法を提供する。
幾つかの変形において、本開示は、ＤＮＡ構造物またはＤＮＡ含有物質を細胞に送達するための化合物、組成物、および方法を提供する。
本明細書で使用される、「ペプチド核酸複合体」という用語は、核酸に結合された、または複合体化されたペプチドを指す。
ＲＮＡｉ誘導およびアンチセンス薬剤の効率的な送達
幾つかの態様において、本発明の組成物および方法は、高濃度または密度の活性薬剤分子を有する担体粒子を提供することによって、活性薬剤の効率的な送達を提供する。該担体粒子は、リポソームに充填され、薬学的製剤中に高濃度または密度の活性薬剤分子を提供することができる。
ある態様において、本発明の組成物および方法は、ある範囲の送達効率比を有するＲＮＡｉ誘導薬剤またはアンチセンス薬剤の製剤を提供する。本開示のＲＮＡｉ誘導薬剤またはアンチセンス薬剤用の製剤は、１５未満、または１２未満、または１０未満、または９未満、または８未満、または５未満の送達効率比を有利に有し得る。
ある実施形態において、効率的な送達は、カチオン性ペプチドで縮合された核酸薬剤からなる担体粒子を用いて達成することができる。例えば、ＲＮＡｉ誘導薬剤またはアンチセンス薬剤等の核酸薬剤と組み合わせたカチオン性ペプチドの荷電に基づいて、担体粒子は、最大６つ以上のペプチド結合領域が、活性ＲＮＡ薬剤に結合し得る構造を含むことができる。
幾つかの変形において、ＲＮＡｉ誘導薬剤またはアンチセンス薬剤等の核酸薬剤からなり、かつリポソームに充填される担体粒子を含有する製剤において、リポソームは、１粒子当たりＲＮＡｉ誘導薬剤またはアンチセンス薬剤分子の５００を超える、または１，０００を超える、または５，０００を超える、または６，０００を超える、または７，０００を超える、または８，０００を超える、または９，０００を超える、または１０，０００を超える、もしくはそれ以上の複製を有し得る。
例えば、幾つかの態様において、２のＮ：Ｐ、１ｇ／ｃｃの密度、１．２６×１０６ｎｍ３の粒子体積を有する球状粒子については、３７８１．２の分子量（正味７カチオン性荷電）を有するペプチドおよび１３，５００の分子量（正味４０アニオン性荷電）を有する二重鎖ＲＮＡからなり、粒子の質量は、１．２６×１０−９マイクログラムであり、該粒子は、二重鎖ＲＮＡ当たり１１．４ペプチドを有する。この例について、該送達効率比は、ペプチドの質量／ＲＮＡの質量の比であり、それは３．２である。ＲＮＡによって表される粒子の質量の割合は、０．２４であり、粒子中の二重鎖ＲＮＡ分子数は、１３，３６９であり、１粒子当たりペプチド分子数は、１．５３×１０５である。言い換えれば、これらの担体粒子を含有し、追加の担体分子がない製剤は、粒子に基づいて、３．２の送達効率比、および２４％のＲＮＡｉ−薬剤の質量分率ローディング値を有し得る。
リポソーム製剤
幾つかの態様において、本発明の担体粒子は、リポソーム製剤中に充填またはカプセル化され得る。例えば、幾つかの実施形態において、担体粒子は、米国特許出願第１２／１１４，２８４号に開示されるもの等のリポソーム製剤中にカプセル化されるように送達され得る。
ある実施形態において、リポソーム製剤中にカプセル化されるように送達される本発明の担体粒子の薬学的製剤は、本発明のペプチド担体粒子組成物を有さないＲＮＡのリポソーム製剤と比較して、二重鎖ＲＮＡのペイロードを２０倍増加させ得る。
例えば、幾つかの実施形態において、リポソーム製剤中にカプセル化されるように送達される本発明の担体粒子の薬学的製剤は、本発明のペプチド担体粒子組成物を有さないＲＮＡのリポソーム製剤と比較して、担体質量を４５％減少させ得る。
幾つかの実施形態において、ＲＮＡ薬剤用の担体粒子の薬学的製剤は、核酸を送達する時、ペプチドを使用するペプチド含有送達システムを含む。このシステムは、リポソーム製剤に取り込まれ得るＲＮＡ薬剤のペイロードを増加させ得る。ペプチド含有のナノ粒子を用いて、送達の効率、および送達システムの組織分布パターンを、強化し得る。幾つかの実施形態において、該送達システムは、リポソーム粒子当たり最大２０倍のＲＮＡペイロードの増加を示し得る、一方、担体賦形剤の全量の約４５％減少させる。幾つかの変形において、該システムは、ペプチドを有さないリポソーム製剤と比較して、例えば、ＡｐｏＢの生体内のノックダウンによって測定されるように、ＲＮＡ薬剤の用量の３０％減少を達成し得、一方、マウス肝臓において、８５％ノックダウン、およびマウス空腸において、ノックダウンを維持する。故に、本発明の担体粒子の薬学的製剤は、ｓｉＲＮＡ、ｍｄＲＮＡ、またはアンチセンス薬剤等のＲＮＡ薬剤の送達効率を大幅に改善し得る。
担体ナノ粒子
幾つかの実施形態において、本発明の担体粒子は、２００８年１０月１６日に出願の米国特許出願第６１／１０６，０６２号に記載されるように、調製され得る。
本開示の担体粒子は、一般に、均一粒径からなる。担体粒径は、直径約３００ｎｍ以下、または約２５０ｎｍ以下、または約２００ｎｍ以下、または約１８０ｎｍ以下、または約１６０ｎｍ以下、または約１５０ｎｍ以下、または約１４０ｎｍ以下、または約１３０ｎｍ以下、または約１２０ｎｍ以下、または約１１０ｎｍそれ以下、または約１００ｎｍ以下、または約９０ｎｍ以下、または約８０ｎｍ以下、または約７０ｎｍ以下であり得る。
本開示の活性薬剤担体粒子は、様々な粒径、例えば、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約６０ｎｍ〜約４００ｎｍ、または約７０ｎｍ〜約３００ｎｍ、または約７０ｎｍ〜約２００ｎｍ、または約７０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約１６０ｎｍを有し得る。
幾つかの実施形態において、本開示の活性薬剤担体粒子は、負荷電であり得る。例えば、ＲＮＡｉ薬剤およびカチオン性ペプチドからなる担体粒子は、粒子が負荷電を保持するように縮合され得る。
幾つかの実施形態において、本開示の活性薬剤担体粒子は、正荷電であり得る。例えば、ＲＮＡｉ薬剤およびカチオン性ペプチドからなる担体粒子は、粒子が正荷電を必要とするように縮合され得る。
担体およびペプチド結合領域
幾つかの態様において、本開示の担体化合物および組成物は、核酸に結合して、ナノメートルの大きさの粒子を形成することによって、生物学的活性核酸成分で縮合するペプチド成分で形成され得る。
幾つかの実施形態において、本開示の担体組成物に好適なペプチドは、２００８年１１月１９日出願の米国特許出願第６１／１１６，２５８号に記載されている。
１つ以上の結合領域を有する１個のペプチドが核酸に結合する場合、担体が、形成され得る。
ある変形において、ペプチドの１つ以上のカチオン性結合領域は、同一または異なる核酸分子に結合し得る。
本開示の架橋可能かつ切断可能なペプチド構造物は、１つ以上の結合領域において、ペプチド鎖に沿って分布される複数のカチオン性残基を有利に有し得る。カチオン性残基の数および分布の変形は、活性薬剤へのペプチドの結合の強度で異なって使用することができる。
本発明のペプチドには、核酸および１つ以上のリンカー基に結合するのに十分な正荷電を有する結合領域を有するカチオン性ペプチドが含まれる。本発明のペプチドの結合領域は、核酸に結合するのに十分な正荷電を有し得る。リンカー基は、互いに連結されて、２個以上のペプチドを単一分子に架橋することができる。
活性核酸薬剤と縮合して、本開示の担体粒子を形成することが可能なペプチドは、核酸に結合するのに十分な正荷電、および結合された核酸を含む自己架橋された構築物を形成するのに十分なリンカー基を有し得る。
本開示は、核酸に結合するのに十分な正に荷電した残基を有し、架橋されたペプチドを形成することが可能なペプチドを提供する。
幾つかの実施形態において、生物学的に活性な薬剤は、カチオン性ペプチドで結合することができる核酸薬剤である。核酸薬剤は、１個、２個、３個、４個、５個、または６個もしくはそれ以上のペプチドに結合して、複合体を形成することができる。縮合粒子は、核酸−ペプチド複合体を凝集し、結合することによって形成され得る。
幾つかの実施形態において、核酸薬剤は、ペプチドが１つ以上の核酸薬剤に付着するように１つ以上のペプチドの部分に結合し得る。
担体構造物または構築物は、ペプチドが結合する生物学的に活性な薬剤と本発明の架橋可能なまたは切断可能なペプチドを混合することによって形成され得る。薬剤へのペプチドの結合は、ペプチドの架橋が生じると同時に、またはペプチドが架橋される前もしくは後に行われ得る。
幾つかの態様において、担体は、ペプチドおよび核酸の縮合物であり得る架橋されたペプチド構築物である。縮合物は、核酸等の生物学的に活性な薬剤を組み込むことができるナノメートルの大きさの担体粒子を形成し得る。
架橋可能なペプチド
幾つかの実施形態において、本発明の架橋可能なペプチドは、架橋可能な末端残基または基を含有し得る。
例えば、架橋可能なペプチドは、ペプチドの二量体をもたらすペプチド間ジスルフィド結合を形成することによって架橋され得る単一末端システイン残基を有し得る。
幾つかの変形において、ペプチドは、架橋して、生物学的に活性な薬剤結合する、および生物学的に活性な薬剤のための担体となり得る、多量体ペプチド構築物を形成することができる１つ以上のスルフヒドリル基を含み得る。
幾つかの実施形態において、架橋可能な基は、低ｐＨで切断され得るか、またはタンパク質もしくは酵素の作用によって切断され得る切断可能な架橋を形成し得る。切断可能な架橋の例には、化学的に切断可能な酸に不安定な架橋および酵素切断可能な架橋が含まれる。
架橋可能な基の例には、最大１０００個の原子を有する有機基、二官能性リンカー、二官能性架橋剤、およびへテロ二官能性リンカーが含まれる。架橋可能な基は、ペプチド残基の置換基であり得るか、またはペプチドの末端で付着され得る。
ある実施形態において、架橋可能なペプチド構造物には、各末端で架橋可能な基を有するペプチドが含まれる。幾つかの変形において、架橋可能なペプチド構造物には、各末端で架橋可能な基を有するペプチドの二量体、三量体、多量体が含まれる。
切断可能なペプチド
幾つかの態様において、本開示は、ペプチド配列の部分間に位置する、内部で切断可能なリンカー基を含有する切断可能なペプチドを提供する。
幾つかの実施形態において、切断可能なペプチドは、切断可能な基によって一緒に連結される２つのカチオン性結合領域を有し得る。切断可能な基は、ペプチドの種々の結合領域を互いから引き離すように切断され得る。
カチオン性結合領域は、核酸等の生物学的に活性な薬剤に結合し得る。
幾つかの変形において、結合領域を引き離すためのペプチドのリンカー基の切断は、切断されないペプチドと比較して、生物学的に活性な薬剤からペプチドのさらなる急速解離を可能にし得る。
細胞内に切断可能なリンカーは、化学的還元によって、または細胞内環境において種々のタンパク質もしくは酵素の作用によって切断され得る。
縮合粒子および放出可能な形態
本開示の化合物および組成物には、１つ以上のペプチド成分および１つ以上の活性薬剤からなる縮合粒子または担体が含まれる。
一般に、ペプチドおよび活性薬剤で形成される縮合粒子は、アニオン性、中性、またはカチオン性であり得る。生体内での担体粒子の送達については、中性またはカチオン性形態が好ましい。縮合粒子は、コア粒子とも称され得る。
幾つかの実施形態において、縮合粒子は、架橋可能なペプチドの第１の部分および活性薬剤で形成され得る。同一または異なる架橋可能なペプチドの１つ以上のさらなる層が、粒子に添加され得る。
幾つかの変形において、縮合粒子は、切断可能なペプチドの第１の部分および活性薬剤で形成され得る。同一または異なる切断可能なペプチドの１つ以上のさらなる層が、粒子に添加され得る。
ある実施形態において、縮合粒子は、切断可能なペプチドの第１の部分および活性薬剤で形成され得る。架橋可能なペプチドの１つ以上のさらなる層が、粒子に添加され得る。
幾つかの変形において、縮合粒子は、架橋可能なペプチドの第１の部分および活性薬剤で形成され得る。切断可能なペプチドの１つ以上のさらなる層が、粒子に添加され得る。
幾つかの実施形態において、アニオン性の縮合粒子は、架橋可能なまたは切断可能なペプチドの第１の部分および活性核酸薬剤で形成され得る。カチオン性架橋可能なまたは切断可能なペプチドのさらなる層が、アニオン性粒子に添加され、中性またはカチオン性担体粒子を形成し得る。
ある変形において、アニオン性の縮合粒子は、架橋可能なまたは切断可能なペプチドの第１の部分および活性核酸薬剤で形成され得る。カチオン性架橋可能なまたは切断可能なペプチドのさらなる層が、アニオン性粒子に添加され、中性またはカチオン性担体粒子を形成し得る。アニオン性エンドソーム溶解性化合物の更なる層を、中性またはカチオン性担体粒子に添加し、層状の中性またはカチオン性担体粒子を形成し得る。
幾つかの態様において、該活性薬剤は、１つ以上の薬物化合物、１つ以上のアンチセンス薬剤、１つ以上のＲＮＡｉ誘導薬剤、または１つ以上のＤＮＡ含有薬剤であり得る。
幾つかの実施形態において、本開示の組成物または製剤は、縮合粒子または層状担体粒子をカチオン性リポソームに取り込むことによって調製され得る。
幾つかの実施形態において、本開示の組成物および方法は、放出可能な形態または組成物中の治療用薬剤を提供し得る。放出可能な形態および組成物は、活性薬剤に結合および放出する分子、活性薬剤に結合し、かつ該薬剤の放出を補助する部分を解放する分子、活性薬剤に結合し、かつその後に該薬剤の放出を補助するために生物学的区画内の形態において調節される分子、および放出メディエーター化合物と混合される活性薬剤に結合する分子を含有する組成物を含む。
本明細書で使用される、放出可能な形態には、本開示の架橋可能なまたは切断可能なペプチドを含有するもの、またはエンドソーム溶解化合物もしくは物質を含有する形態が含まれる。
縮合または担体粒子は、切断可能なペプチド構造物またはマトリックスを含有し得る。ペプチド構造物の切断は、ペプチド架橋を切断することができる化合物を含有する生物環境または区画に、担体の侵入等の特定の事象によって引き起こされ得る。ペプチドリンカー基の切断は、細胞質ゾル中または種々の細胞内または細胞外の区画中の細胞内に発生し得る。
ジスルフィドペプチドリンカー基の切断は、化学的に、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはメルカプトエタノールによるジスルフィドの還元によって行われ得る。
ある実施形態において、ジスルフィド還元酵素が、ペプチドジスルフィド結合を切断するために使用され得る。
細胞内に入ると、ジスルフィド架橋は還元され得、それによって効率的な送達のために活性薬剤を放出する。エンドソームの環境は、還元環境であり、ジスルフィド還元、および活性薬剤の放出を媒介すると考えられる。
細胞内での放出は、ペプチド架橋の破壊または切断によって、ならびにペプチドからの生物学的に活性な薬剤の解離によって発生し得る。
本発明のペプチドおよびペプチド構築物は、１つ以上の正に荷電したアミノ酸残基を有する１つ、２つ、またはそれ以上の結合領域を有利に含有し得る。該結合領域は、１つの正に荷電した結合領域は、切断可能な架橋によって、次の結合領域に切断可能に結合される鎖に付着され得る。
カチオン性領域は、核酸薬剤等の活性薬剤の結合領域としての役割を果たし得、幾つかのカチオン性領域は、ペプチドを活性薬剤に協調的に付着させるために同一の活性薬剤に結合し得る。
ある実施形態において、本開示の放出可能な形態には、ペプチドおよび核酸の縮合粒子が含まれ、ペプチド成分には、核酸の放出をもたらすように切断され得る架橋が含まれる。ペプチドのリンカー基の切断は、細胞外ドメインから細胞内ドメインに輸送において、またはエンドサイトーシス中、もしくは細胞によるエンドソームの取り込みおよび送達に発生するようなペプチドの環境の変化によって引き起こされ得る。
ペプチドにおける切断可能なリンカーの例には、エンドサイトーシス中、もしくはリソソームとの細胞内相互作用を通して切断され得るヒドラゾン等の酸切断可能な基が含まれる。
幾つかの実施形態において、活性薬剤の放出は、酸不安定性リンカーによって提供され得る。
酸不安定性リンカーの例には、オルトエステル基、ヒドラゾン、ｃｉｓ−アセトニル、アセタール、ケタール、シリルエーテル、シラザン、イミン、シトラコン酸無水物（ｃｉｔｒｉｃｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、マレイン酸無水物、クラウンエーテル、アザクラウンエーテル、チアクラウンエーテル、ジチオベンジル基、ｃｉｓ−アコニット酸、ｃｉｓ−カルボン酸アルカトリエン、メタクリル酸、およびこれらの混合物を含むリンカーが含まれる。
酸不安定性基およびリンカーの例は、米国特許第７，０９８，０３２号、第６，８９７，１９６号、第６，４２６，０８６号、第７，１３８，３８２号、第５，５６３，２５０号、および第５，５０５，９３１号に与えられる。
ペプチドにおける切断可能なリンカーの例には、細胞内カテプシンによって切断され得るＶａｌ−Ｃｉｔ等のカテプシン切断可能なリンカーが含まれる。カテプシンＢ、Ｄ、およびＬにおける基質配列の例を、それぞれ、表１、２、および３に示す。切断可能なリンカーには、カテプシンＢ、Ｄ、およびＬ基質（Ｐ２−Ｐ２′）のジ−、トリ−、テトラペプチドサブユニットが含まれる。
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 幾つかの変形において、本開示の放出可能な形態には、ペプチドおよび核酸の縮合粒子ならびにエンドソーム溶解性化合物が含まれる。これらの変形において、エンドソーム溶解性化合物は、エンドソームから細胞にコア粒子および活性薬剤の放出を補助し得る、一方、ペプチド成分には、細胞内のコア縮合粒子から核酸の放出および解離をもたらすように切断され得る架橋が含まれ得る。
エンドソーム溶解性化合物の例には、クロロキン、４−アミノキノリン、アミノキノリン、アモジアキン、細胞透過性ペプチド、トランスポータン、ペネトラチン、インフルエンザウイルスからのヘマグルチニンの融合ペプチド（例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．８，７１５−７２０，２００１を参照のこと）、およびインフルエンザに基づくペプチドｄｉＩＮＦ７が含まれる。
ある実施形態において、担体粒子または構築物は、細胞または細胞内送達における標的化剤と共に製剤化され得る。幾つかの変形において、担体粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の合成ポリマーと組み合わせて、非特異的効果または血液成分との相互作用を軽減し得る。好適な合成ポリマーには、ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）、またはＰＥＧ−ポリウレタンもしくはＰＥＧ−ポリプロピレン等のＰＥＧコポリマーが含まれる。例えば、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９２）を参照のこと。
使用方法
本開示は、核酸薬剤を含有する担体粒子を含有する組成物を調製することと、組成物を用いて細胞を処置することと、を含む、治療用核酸を細胞に送達するための方法を含む。
本開示は、核酸薬剤を含有する担体粒子を含有する組成物を調製することと、組成物を用いて細胞を処置することと、を含む、細胞内の遺伝子の発現を阻害するための方法を含む。
本開示は、核酸薬剤を含有する担体粒子を含有する組成物を調製することと、哺乳動物に組成物を投与することと、を含む、哺乳動物において、遺伝子の発現を阻害するための方法を含む。
本開示は、ヒトにおいて、疾患を治療するための方法を含み、該疾患は、リウマチ性関節炎を含む炎症性疾患、高コレステロール血症を含む代謝性疾患、肝疾患、脳炎、骨折、心臓疾患、肝炎およびインフルエンザを含むウイルス性疾患、ならびに癌から選択され、これには、リポソーム組成物を調製することと、該ヒトに該組成物を投与することと、を含む。
活性薬剤
幾つかの態様において、本開示は、治療用薬剤の送達に好適な組成物を作製するための方法を提供する。本開示の方法は、縮合ＲＮＡナノ粒子、二本鎖または三本鎖ＲＮＡ構造物、ＲＮＡペプチド結合体、ダイサー基質ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ヘアピンＲＮＡ、他の活性および調節性ＲＮＡ形態等の核酸薬剤の組成物、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡを含むアンチセンス治療用形態、ならびにＤＮＡおよびＤＮＡ含有形態を提供し得る。
本開示の活性薬剤は、一本鎖または二本鎖核酸であり得る。本開示の活性薬剤は、抗原もしくは免疫原性タンパク質またはポリペプチドであり得る。
本開示の活性薬剤は、活性薬剤のペプチド縮合体であり得る。例えば、活性薬剤は、ペプチドもしくは他の生体分子と活性薬剤を縮合することによって形成されるナノ粒子、またはペプチド、生体分子、もしくは高分子を有する活性薬剤の縮合体もしくは複合体からなり得る。ナノ粒子または縮合体は、架橋され得る。ナノ粒子または縮合体は、リポソーム組成物への搭載物として取り込むことができる。
本開示の活性薬剤は、アンチセンスもしくはセンス、ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチド、または修飾ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドであり得、これは、標的核酸配列に結合して、種々の相互作用によって標的配列の転写もしくは翻訳を遮断する。アンチセンスまたはセンス薬剤は、ヌクレオチド二重と共に三重らせんを形成し得るか、またはリボザイムであり得るか、またはプロモーター配列もしくはエンハンサー配列を含む転写もしくは翻訳調節塩基配列をコードし得る。アンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質の発現を遮断するために使用され得、修飾核酸塩基もしくは糖基、もしくは他の基を有し得るか、または強化された安定性もしくは活性における、生体分子、ペプチド、もしくはタンパク質との結合体であり得る。アンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の組成物および方法によって、その標的核酸を含有する細胞に送達され得る。アンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される、オリゴヌクレオチド−担体の複合体、もしくはリポソーム製剤を用いて、その標的核酸を含有する細胞に送達され得る。
架橋可能なおよび切断可能なペプチド
本発明の架橋可能なペプチドは、式Ｉに示される構造を有するものを含む。
Ａ−Ｂ 式Ｉ
ここで、Ａは、カチオン性結合領域を含有し得る、２〜約１６個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、Ｂは、架橋可能な基であり、ここで、Ａは、ｐＨ７で、１個以上の正に荷電した残基を含有する。
Ｂの例は、システインを含む。
Ｂの他の例には、最大１０００個の原子を有する有機基、二官能性リンカー、二官能性架橋剤、およびへテロ二官能性リンカー、カルバメート、およびエステルが含まれる。
Ａの例は、カチオン性ペプチドを含む。
Ａの例には、式ＩＩに示される構造を有するカチオン性ペプチドが含まれる。
（Ｘａａ１）ｍ−（Ｘａａ２）ｎ−（Ｘａａ３）ｏ−（Ｘａａ４）ｐ 式ＩＩ
Ｘａａは、アミノ酸残基であり、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、およびＸａａ４のそれぞれは独立して、同一または異なるアミノ酸残基が選択され、ｍ、ｎ、ｏ、およびｐのそれぞれは、０から４であり、ｍ、ｎ、ｏ、およびｐの合計が、２以上である事を条件とし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、およびＸａａ４のうちの１つ以上は、ｐＨ７で、正に荷電した残基である。
カチオン性ペプチドは、例えば、Ａの残基が塩基性側鎖を有する場合、調製され得る。塩基性側鎖を有するアミノ酸の例には、アルギニン（Ａｒｇ）、ホモアルギニン（ホモＡｒｇ）（側鎖−（ＣＨ２）４ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２）、ノルアルギニン（ノルＡｒｇ）（側鎖−（ＣＨ２）２ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２）、ノル−ノルアルギニン（ノルノルＡｒｇ）（側鎖−（ＣＨ２）ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２）、オルニチン、リジン、ホモリジン、ヒスチジン、１−メチルヒスチジン、ピリジルアラニン（Ｐａｌ）、アスパラギン、Ｎ−エチルアスパラギン、グルタミン、および４−アミノフェニルアラニン、ならびにこれらの側鎖修飾誘導体が含まれる。
本明細書で使用される、「ホモ」という用語は、アミノ酸に言及する場合、さらなる炭素がその側鎖に付加されていることを意味し、「ノル」という用語は、アミノ酸に言及する場合、炭素が、その側鎖から差し引かれていることを意味する。故に、ホモリジンとは、側鎖−（ＣＨ２）５ＮＨ２を指す。
カチオン性ペプチドはまた、残基の側鎖が、イオン性基または置換基を含む場合、調製することもできる。
幾つかの実施形態において、該カチオン性残基は、ＮＧ−メチルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジメチルアルギニン、ＮＧ−メチル−ホモアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジメチル−ホモアルギニン、ＮＧ−メチル−ノルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジメチル−ノルアルギニン、またはＮＧ−メチル−ノル−ノルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジメチル−ノル−ノルアルギニンである。
幾つかの実施形態において、該カチオン性残基は、ＮＧ−エチルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジエチルアルギニン、ＮＧ−エチル−ホモアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジエチル−ホモアルギニン、ＮＧ−エチル−ノルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジエチル−ノルアルギニン、またはＮＧ−エチル−ノル−ノルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジエチル−ノル−ノルアルギニンである。
ある実施形態において、該カチオン性残基は、ＮＧ−アルキルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジアルキルアルギニン、ＮＧ−アルキル−ホモアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジアルキル−ホモアルギニン、ＮＧ−アルキル−ノルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジアルキル−ノルアルギニン、またはＮＧ−アルキル−ノル−ノルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジアルキル−ノル−ノルアルギニンである。
幾つかの実施形態において、該カチオン性残基は、グアニジンもしくはアミジンを含有する側鎖を有するアミノ酸である。例えば、該Ｘａａ残基の側鎖は、グアニド、アミジノ、ジヒドロイミダゾール、４−グアニド−フェニル、４−アミジノ−フェニル、Ｎ−アミジノ−ピペリジン、Ｎ−アミジノ−ピペラジン、４，５−ジヒドロイミダゾール、２−（Ｎ−アミジノ）−ピロリジニル、もしくは４−［（２−アミノピリミジニル）］エチルのような基を含み得る。
カチオン性残基の例は、以下の構造物およびそれらの塩形態を含む側鎖を有し得る。
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 本発明の切断可能なペプチドは、式Ｉに示される構造物の二量体であるもの、例えば、二量体Ａ−Ｂ−Ｂ−Ａを含み、ここでリンカー基Ｂは、互いに連結可能であり、連結−Ｂ−Ｂ−は切断され得る。
例えば、二量体Ａ−Ｂ−Ｂ−Ａは、Ａ−Ｂ−（Ｓ−Ｓ）−Ｂ−Ａであり得、ここで（Ｓ−Ｓ）は、ジスルフィド連結である。
連結−Ｂ−Ｂ−の他の例には、最大１０００個の原子を有する有機基、二官能性リンカーで形成された連結、二官能架橋剤で形成された連結、へテロ二官能性リンカーで形成された連結、ヒドラゾンリンカー、カルバメート連結、およびエステル連結が含まれる。
本発明の架橋可能なペプチドは、式ＩＩに示される構造を有するものを含み、
Ｂ−Ａ−Ｂ 式ＩＩ
ここで、Ａは、約２〜約１６個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、Ｂは、上記で定義される、架橋可能な基であり、ここでＡは、ｐＨ７で、１個以上の正に荷電した残基を含有する。
Ｂの例は、システインを含む。
Ａの例は、カチオン性ペプチドを含む。
本発明の切断可能なペプチドは、式ＩＩに示される構造の二量体、三量体、または多量体であるもの、例えば、二量体Ｂ−Ａ−Ｂ−Ｂ−Ａ−Ｂおよび多量体−（Ｂ−Ａ−Ｂ）ｎ−を含み、ここで、リンカー基Ｂは、互いに連結可能であり、連結−Ｂ−Ｂ−は切断され得る。一部のこれらの切断可能なペプチドは、各末端で架橋可能な基を保持するため、架橋可能なままである。
本開示のペプチドの調製に好適なカチオン性結合領域の例を表４に示す。本開示の架橋可能なペプチドは、表４に示されるペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかで付着したシステインを伴い、表４に示される結合領域を有し得る。本開示の架橋可能なペプチドは、二量体を形成し得る。
Figure 0006126072
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 本開示の切断可能なペプチドの例を表５に示す。
Figure 0006126072
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 本明細書で使用される、アミノ酸名および名称とは、対応するアミノ酸の任意の立体異性体を指す。
表５において、ペプチド配列の内部にある基は、切断部位を提供し得る。例えば、内部切断部位は、ジスルフィド結合またはＶａｌ−Ｃｉｔ連結であり得る。
切断可能な連結の例には、米国特許公開第２００８０１６６３６３号に記載の、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、およびＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号３７６）が含まれる。
投与経路
本開示の活性薬剤の組成物は、薬学的組成物において使用され得る。対象への本開示のリポソーム製剤の投与は、非経口、経口、吸入による、局所、粘膜、直腸、または口腔であり得る。非経口用は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内（ｉｎｔｅｒｓｔｅｒｎａｌ）、くも膜下内、病巣内、および頭蓋内注射もしくは注入技術を含む。
有効な量
特定の疾患を処置するための本開示の有効な量の活性薬剤組成物は、一般に、疾患の症状を改善するか、または軽減するのに十分な量である。本開示の有効な量の活性薬剤組成物は、薬剤に起因するいずれかの生物学的効果を生じるのに十分な量であり得る。該組成物は、単回投与として投与され得るか、または反復投与によって投与され得る。
ＤＩＬＡ２アミノ酸リポソーム形成化合物
本開示のリポソーム組成物は、米国第２００８−０３１７８３９ Ａ１号に開示されている、１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を含み得る。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、特定の条件下で、リポソーム構成を形成し得る合成有機化合物である。ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、アミノ酸のＮ末端あるいはＣ末端のいずれか、または両末端で、送達促進尾部または親油性尾部を置換することによって形成され得る。幾つかの実施形態において、該アミノ酸コアは、１つ以上のアミノ酸を含み得るか、または２〜２０個のアミノ酸残基のペプチドであり得る。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、カチオン性もしくは非カチオン性であり得、ここで、非カチオン性には、中性およびアニオン性が含まれる。本明細書で使用される、種の物理的状態もしくはイオン性とは、別途特定されない限り、約ｐＨ７を有する環境を指す。
幾つかの態様において、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、放出可能な形態において、治療用薬剤の送達を提供し得る。放出可能な形態および組成物は、治療効果を提供するために、細胞による薬剤の十分な取り込みを提供するように設計される。
放出可能な形態は、活性薬剤に結合およびそれを放出するＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を含む。幾つかの実施形態において、活性薬剤の放出は、酸不安定性リンカーによって提供され得る。
酸不安定性リンカーの例には、オルトエステル基、ヒドラゾン、ｃｉｓ−アセトニル、アセタール、ケタール、シリルエーテル、シラザン、イミン、シトラコン酸無水物（ｃｉｔｒｉｃｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、マレイン酸無水物、クラウンエーテル、アザクラウンエーテル、チアクラウンエーテル、ジチオベンジル基、ｃｉｓ−アコニット酸、ｃｉｓ−カルボン酸アルカトリエン、メタクリル酸、およびこれらの混合物を含むリンカーが含まれる。
酸不安定性基およびリンカーの例は、米国特許第７，０９８，０３２号、第６，８９７，１９６号、第６，４２６，０８６号、第７，１３８，３８２号、第５，５６３，２５０号、および第５，５０５，９３１号に与えられる。
本開示の化合物および組成物の放出可能な形態は、活性薬剤に結合し、かつ該薬剤の放出を補助する部分を解放する分子を含む。幾つかの実施形態において、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、細胞への薬剤の送達を補助するエタノール等の小分子を放出する基を含み得る。ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、活性薬剤に結合し得、細胞との接触後、または生理学的ｐＨより低い局所的ｐＨを有する生物学的区画内に輸送された後、その酸性環境において加水分解されて、エタノールを放出して、該薬剤の送達を補助し得る。幾つかの実施形態において、該薬剤の送達を補助するエタノール等の小分子は、親油性成分に結合され得る。
幾つかの実施形態において、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、細胞への薬剤の送達を補助するエタノール等の小分子を放出する化合物と混合され得る。
本開示の化合物および組成物の放出可能な形態には、活性薬剤に結合して、細胞との接触後、または生理学的ｐＨより低い局所的ｐＨを有する生物学的区画内に送達された後、その酸性環境においてカチオン性形態へと変化されて、該薬剤の放出を補助し得る、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物が含まれる。
幾つかの実施形態において、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、活性薬剤に結合し得、酸性環境においてカチオン性形態へと変化されて、活性薬剤の放出を補助し得る化合物と混合され得る。
加水分解可能かつ変化可能な基の例は、米国特許第６，８４９，２７２号、第６，２００，５９９号、ならびにＺ．Ｈ．Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｆ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，“Ｂｉｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ： Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（ｅｄ．），Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ２００６）に与えられる。
幾つかの実施形態において、本開示の化合物および組成物の放出可能な形態には、活性薬剤に結合し得、酸性環境において中性形態へと変化されて、活性薬剤の放出を補助し得る脂質もしくは化合物と混合され得るＤＩＬＡ２アミノ酸化合物が含まれる。該酸性環境は、細胞と接触した後に、または生理学的ｐＨより低い局所的ｐＨを有する生物学的区画内に輸送された後に、侵入され得る。
アニオン性形態から中性形態へと変化可能な化合物の例には、米国特許第６，８９７，１９６号、第６，４２６，０８６号、および第７，１０８，８６３号に記載されるようなコレステリルヘミサクシネート（ＣＨＥＭＳ）が含まれる。幾つかの例において、ＣＨＥＭＳは、Ｃｕｌｌｉｓ，１４６３ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １０７−１４（２０００）に記載されるようなｐＨ感受性ポリモフィズム（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を示す。
幾つかの実施形態において、本開示の化合物および組成物の放出可能な形態は、活性薬剤に結合し得、ｐＨ感受性ポリマー物質と混合され得るＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を含む。
ｐＨ感受性ポリマー物質の例は、米国特許第６，８３５，３９３号に与えられる。
幾つかの実施形態において、該活性薬剤の放出は、酵素切断可能なペプチドによって提供され得る。
幾つかの態様において、本開示は、式Ｉに示されるような、様々なＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を提供する。
Ｒ３−（Ｃ＝Ｏ）−Ｘａａ−Ｚ−Ｒ４ 式Ｉ
式中、
Ｘａａは、一般式−ＮＲＮ−ＣＲ１Ｒ２−（Ｃ＝Ｏ）−を有する任意のＤ−またはＬ−アミノ酸残基、または２〜２０アミノ酸残基のペプチドであり、式中、
Ｒ１は、非水素、アミノ酸の、置換もしくは非置換の側鎖であり、
Ｒ２は、水素、または炭素、酸素、窒素、硫黄、および水素原子からなり、かつ１〜２０個の炭素原子を有する有機基、またはＣ（１−５）アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、Ｃ（３−５）アルケニル、Ｃ（３−５）アルキニル、Ｃ（１−５）アルカノイル、Ｃ（１−５）アルカノイルオキシ、Ｃ（１−５）アルコキシ、Ｃ（１−５）アルコキシ−Ｃ（１−５）アルキル、Ｃ（１−５）アルコキシ−Ｃ（１−５）アルコキシ、Ｃ（１−５）アルキル−アミノ−Ｃ（１−５）アルキル−、Ｃ（１−５）ジアルキル−アミノ−Ｃ（１−５）アルキル−、ニトロ−Ｃ（１−５）アルキル、シアノ−Ｃ（１−５）アルキル、アリール−Ｃ（１−５）アルキル、４−ビフェニル−Ｃ（１−５）アルキル、カルボキシル、もしくはヒドロキシルであり、
ＲＮは、水素、または炭素、酸素、窒素、硫黄、および水素原子からなり、かつ１〜２０個の炭素原子を有する有機基、またはＣ（１−５）アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、Ｃ（３−５）アルケニル、Ｃ（３−５）アルキニル、Ｃ（１−５）アルカノイル、Ｃ（１−５）アルカノイルオキシ、Ｃ（１−５）アルコキシ、Ｃ（１−５）アルコキシ−Ｃ（１−５）アルキル、Ｃ（１−５）アルコキシ−Ｃ（１−５）アルコキシ、Ｃ（１−５）アルキル−アミノ−Ｃ（１−５）アルキル−、Ｃ（１−５）ジアルキル−アミノ−Ｃ（１−５）アルキル−、ニトロ−Ｃ（１−５）アルキル、シアノ−Ｃ（１−５）アルキル、アリール−Ｃ（１−５）アルキル、４−ビフェニル−Ｃ（１−５）アルキル、カルボキシル、もしくはヒドロキシルであり、
Ｒ３は、天然に存在するか、もしくは合成のリン脂質、糖脂質、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド、もしくはガングリオシドに由来する親油性尾部；または置換もしくは非置換の、Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル−Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（３−２２）アルケニル、Ｃ（３−２２）アルキニル、Ｃ（３−２２）アルコキシ、もしくはＣ（６−１２）アルコキシ−Ｃ（３−２２）アルキル；または任意の他の天然に存在するか、もしくは合成の脂質の親油性尾部、または本明細書において以下に記載の脂質のうちのいずれか１つの親油性尾部であり、ステロイドを含み得；
Ｒ４は、天然に存在するか、もしくは合成のリン脂質、糖脂質、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド、もしくはガングリオシドに由来する親油性尾部；または置換もしくは非置換の、Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル−Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（３−２２）アルケニル、Ｃ（３−２２）アルキニル、Ｃ（３−２２）アルコキシ、もしくはＣ（６−１２）アルコキシ−Ｃ（３−２２）アルキル；または任意の他の天然に存在するか、もしくは合成の脂質の親油性尾部、または本明細書において以下に記載の脂質のうちのいずれか１つの親油性尾部であり、ステロイドを含み得；
Ｚは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２Ｓ（Ｏ）−、または水素、炭素、酸素、窒素、および硫黄原子から選択される１〜４０個の原子からなる有機リンカー、
ならびにその塩である。
幾つかの実施形態において、Ｒ３は独立して、置換もしくは非置換の、Ｃ（６−２２）アルキルもしくはＣ（６−２２）アルケニルであり；Ｒ４は独立して、置換もしくは非置換の、Ｃ（６−２２）アルキルもしくはＣ（６−２２）アルケニルである。
残基Ｘａａは、Ｄ−立体中心もしくはＬ−立体中心であり得る。
幾つかの実施形態において、Ｒ１は、非水素、アミノ酸の、置換もしくは非置換の側鎖であり、ここで、側鎖の置換基は、水素、炭素、酸素、窒素、および硫黄原子から選択される１〜４０個の原子からなる有機基である。
幾つかの実施形態において、Ｚは、アルキルもしくは有機リンカー合成ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ））、もしくはＰＥＧコポリマー（例えば、ＰＥＧ−ポリウレタンもしくはＰＥＧ−ポリプロピレン）である。例えば、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９２）を参照のこと。
幾つかの実施形態において、本発明は、上記式に示されるような、様々なＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を提供し、
Ｘａａは、一般式−ＮＲＮ−ＣＲ１Ｒ２−（Ｃ＝Ｏ）−を有する任意のＤ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸であり、式中、
Ｒ１は、非水素、アミノ酸の、置換もしくは非置換の塩基性側鎖であり、
Ｒ２は、水素、もしくはＣ（１−５）アルキルであり、
ＲＮは、水素、もしくはＣ（１−５）アルキルであり、
Ｒ３は、天然に存在するか、もしくは合成のリン脂質、糖脂質、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド、もしくはガングリオシドに由来する親油性尾部；または置換もしくは非置換の、Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル−Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（３−２２）アルケニル、Ｃ（３−２２）アルキニル、Ｃ（３−２２）アルコキシ、もしくはＣ（６−１２）アルコキシ−Ｃ（３−２２）アルキル；または任意の他の天然に存在するか、もしくは合成の脂質の親油性尾部、または本明細書において以下に記載の脂質のうちのいずれか１つの親油性尾部であり、ステロイドを含み得；
Ｒ４は、天然に存在するか、もしくは合成のリン脂質、糖脂質、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド、もしくはガングリオシドに由来する親油性尾部；または置換もしくは非置換の、Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル−Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（３−２２）アルケニル、Ｃ（３−２２）アルキニル、Ｃ（３−２２）アルコキシ、もしくはＣ（６−１２）アルコキシ−Ｃ（３−２２）アルキル；または任意の他の天然に存在するか、もしくは合成の脂質の親油性尾部、または本明細書において以下に記載の脂質のうちのいずれか１つの親油性尾部であり、ステロイドを含み得；
Ｚは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２Ｓ（Ｏ）−、または水素、炭素、酸素、窒素、および硫黄原子から選択される１〜４０個の原子からなる有機リンカーである。
幾つかの実施形態において、本発明は、上記式Ｉに示されるような、様々なＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を提供し、
Ｘａａは、一般式−ＮＲＮ−ＣＲ１Ｒ２−（Ｃ＝Ｏ）−を有する任意のＤ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸であり、式中、
Ｒ１は、非水素、アミノ酸の、置換もしくは非置換の塩基性側鎖であり、
Ｒ２は、水素、もしくはＣ（１−５）アルキルであり、
ＲＮは、水素、もしくはＣ（１−５）アルキルであり、
Ｒ３は、置換もしくは非置換の、Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル−Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（３−２２）アルケニル、Ｃ（３−２２）アルキニル、Ｃ（３−２２）アルコキシ、もしくはＣ（６−１２）アルコキシ−Ｃ（３−２２）アルキルであり、
Ｒ４は、置換もしくは非置換の、Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル−Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（３−２２）アルケニル、Ｃ（３−２２）アルキニル、Ｃ（３−２２）アルコキシ、もしくはＣ（６−１２）アルコキシ−Ｃ（３−２２）アルキルであり、
Ｚは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２Ｓ（Ｏ）−、または水素、炭素、酸素、窒素、および硫黄原子から選択される１〜４０個の原子からなる有機リンカーである。
幾つかの実施形態において、本発明は、上記式に示されるような、様々なＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を提供し、
Ｘａａは、一般式−ＮＲＮ−ＣＲ１Ｒ２−（Ｃ＝Ｏ）−を有する任意のＤ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸であり、式中、
Ｒ１は、非水素、アミノ酸の、置換もしくは非置換の塩基性側鎖であり、
Ｒ２は、水素、もしくはＣ（１−５）アルキルであり、
ＲＮは、水素、もしくはＣ（１−５）アルキルであり、
Ｒ３は、置換もしくは非置換の、Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル−Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（３−２２）アルケニル、Ｃ（３−２２）アルキニル、Ｃ（３−２２）アルコキシ、もしくはＣ（６−１２）アルコキシ−Ｃ（３−２２）アルキルであり、
Ｒ４は、置換もしくは非置換の、Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル−Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（３−２２）アルケニル、Ｃ（３−２２）アルキニル、Ｃ（３−２２）アルコキシ、もしくはＣ（６−１２）アルコキシ−Ｃ（３−２２）アルキルであり、
ＺはＮＨである。
幾つかの実施形態において、本発明は、上記式に示されるような、様々なＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を提供し、
Ｘａａは、一般式−ＮＲＮ−ＣＲ１Ｒ２−（Ｃ＝Ｏ）−を有する任意のＤ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸であり、式中、
Ｒ１は、非水素、アミノ酸の、置換もしくは非置換の塩基性側鎖であり、
Ｒ２は、水素、もしくはＣ（１−５）アルキルであり、
ＲＮは、水素、もしくはＣ（１−５）アルキルであり、
Ｒ３は、置換もしくは非置換の、Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル−Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（３−２２）アルケニル、Ｃ（３−２２）アルキニル、Ｃ（３−２２）アルコキシ、もしくはＣ（６−１２）アルコキシ−Ｃ（３−２２）アルキルであり、
Ｒ４は、置換もしくは非置換の、Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル、Ｃ（６−１２）シクロアルキル−Ｃ（３−２２）アルキル、Ｃ（３−２２）アルケニル、Ｃ（３−２２）アルキニル、Ｃ（３−２２）アルコキシ、もしくはＣ（６−１２）アルコキシ−Ｃ（３−２２）アルキルであり、
ＺはＯである。
例えば、Ｘａａが塩基性側鎖を有するカチオン性ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物が、調製され得る。塩基性側鎖を有するアミノ酸の例には、アルギニン（Ａｒｇ）、ホモアルギニン（ホモＡｒｇ）（側鎖−（ＣＨ２）４ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２）、ノルアルギニン（ノルＡｒｇ）（側鎖−（ＣＨ２）２ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２）、ノル−ノルアルギニン（ノルノルＡｒｇ）（側鎖−（ＣＨ２）ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２）、オルニチン、リジン、ホモリジン、ヒスチジン、１−メチルヒスチジン、ピリジルアラニン（Ｐａｌ）、アスパラギン、Ｎ−エチルアスパラギン、グルタミン、および４−アミノフェニルアラニン、ならびにこれらの側鎖修飾誘導体が含まれる。
本明細書で使用される、「ホモ」という用語は、アミノ酸に言及する場合、さらなる炭素がその側鎖に付加されていることを意味し、「ノル」という用語は、アミノ酸に言及する場合、炭素が、その側鎖から差し引かれていることを意味する。故に、ホモリジンとは、側鎖−（ＣＨ２）５ＮＨ２を指す。
例えば、Ｘａａがグルタミン酸もしくはアスパラギン酸であるアニオン性ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物が調製され得る。
また、該アミノ酸側鎖がイオン性基もしくは置換基を含む、カチオン性およびアニオン性ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物が、調製され得る。
例えば、Ｘａａがロイシン、バリン、アラニン、もしくはセリンである非カチオン性ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物が調製され得る。
幾つかの実施形態において、Ｘａａは、ＮＧ−メチルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジメチルアルギニン、ＮＧ−メチル−ホモアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジメチル−ホモアルギニン、ＮＧ−メチル−ノルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジメチル−ノルアルギニン、またはＮＧ−メチル−ノル−ノルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジメチル−ノル−ノルアルギニンである。
幾つかの実施形態において、Ｘａａは、ＮＧ−エチルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジエチルアルギニン、ＮＧ−エチル−ホモアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジエチル−ホモアルギニン、ＮＧ−エチル−ノルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジエチル−ノルアルギニン、またはＮＧ−エチル−ノル−ノルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジエチル−ノル−ノルアルギニンである。
ある実施形態において、Ｘａａは、ＮＧ−アルキルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジアルキルアルギニン、ＮＧ−アルキル−ホモアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジアルキル−ホモアルギニン、ＮＧ−アルキル−ノルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジアルキル−ノルアルギニン、またはＮＧ−アルキル−ノル−ノルアルギニン、対称もしくは非対称のＮＧ，ＮＧ−ジアルキル−ノル−ノルアルギニンである。
幾つかの実施形態において、Ｘａａは、グアニジンもしくはアミジンを含有する側鎖を有するアミノ酸である。例えば、該Ｘａａ残基の側鎖は、グアニド、アミジノ、ジヒドロイミダゾール、４−グアニド−フェニル、４−アミジノ−フェニル、Ｎ−アミジノ−ピペリジン、Ｎ−アミジノ−ピペラジン、４，５−ジヒドロイミダゾール、２−（Ｎ−アミジノ）−ピロリジニル、もしくは４−［（２−アミノピリミジニル）］エチルのような基を含み得る。
Ｘａａ側鎖の例には、以下の構造物およびそれらの塩形態が含まれる。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の放出可能な形態に適したアミノ酸の置換された側鎖の例には、約５〜約７．５、または約６〜約７のｐＫａを有する放出官能基（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）が含まれる。一般に、弱塩基である放出官能基は、ｐＫａより高い局所的ｐＨにおいて顕著な中性形態を示し得、ｐＫａより低い局所的ｐＨにおいて顕著なイオン性形態を示し得る。弱酸である放出官能基は、ｐＫａより高い局所的ｐＨにおいてイオン性形態を示し得、ｐＫａより低い局所的ｐＨにおいて中性形態を示し得る。例えば、Ｐ．Ｈｅｉｎｒｉｃｈ Ｓｔａｈｌ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ（２００２）を参照のこと。
幾つかの実施形態において、Ｘａａは、５〜７．５のｐＫａを有する官能基を含む側鎖を有し得る。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の放出可能な形態に好適なアミノ酸の置換された側鎖の例は、１−メチルヒスチジンを含む。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の放出可能な形態に好適なアミノ酸の置換された側鎖の例は、３，５−ジヨード−チロシンを含む。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の放出可能な形態に好適なアミノ酸の置換された側鎖の例は、以下の構造物を含む。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例は、以下の構造物を含む。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の放出可能な形態に適したアミノ酸の側鎖上の置換基の例には、以下に由来する放出官能基が含まれる：３，５−ジヨード−チロシン、１−メチルヒスチジン、２−メチル酪酸、２−ｏ−アニシルプロパン酸、ｍｅｓｏ−酒石酸、４，６−ジメチルピリミジンアミン、ｐ−フタル酸、クレアチニン、酪酸、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−ナフチルアミン、ペンタン酸、４−メチルペンタン酸、Ｎ−メチルアニリン、１，１０−フェナントロリン、３−ピリジンカルボン酸、ヘキサン酸、プロパン酸、４−アミノ安息香酸、２−メチルプロパン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、シクロヘキサンカルボン酸、キノリン、３−キノリンアミン、２−アミノ安息香酸、４−ピリジンカルボン酸、ノナン酸（Ｎｏｎａｎｉｃ ａｃｉｄ）、メラミン、８−キノリノール、トリメチル酢酸、６−メトキシキノリン、４−（メチルアミノ）安息香酸、ｐ−メチルアニリン、３−（メチルアミノ）安息香酸、リンゴ酸、Ｎ−エチルアニリン、２−ベンジルピリジン、３，６−ジニトロフェノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、２，５−ジメチルピペラジン、ｐ−フェネチジン、５−メチルキノリン、２−フェニルベンゾイミダゾール、ピリジン、ピコリン酸、３，５−ジヨードチロシン（ｄｉｉｏｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅ）、ｐ−アニシジン、２−（メチルアミノ）安息香酸、２−チアゾールアミン、グルタル酸、アジピン酸、イソキノリン、イタコン酸、ｏ−フタル酸、ベンゾイミダゾール、ピペラジン、ヘプタン二酸、アクリジン、フェナントリジン、コハク酸、メチルコハク酸、４−メチルキノリン、３−メチルピリジン、７−イソキノリノール、マロン酸、メチルマロン酸、２−メチルキノリン、２−エチルピリジン、２−メチルピリジン、４−メチルピリジン、ヒスタミン、ヒスチジン、マレイン酸、ｃｉｓ−１，２−シクロヘキサンジアミン、３，５−ジメチルピリジン、２−エチルベンゾイミダゾール、２−メチルベンゾイミダゾール、カコジル酸、ペリミジン、クエン酸、イソクエン酸、２，５−ジメチルピリジン、パパベリン、６−ヒドロキシ−４−メチルプテリジン、Ｌ−チロキシン、３，４−ジメチルピリジン、メトキシピリジン、ｔｒａｎｓ−１，２−シクロヘキサンジアミン、２，５−ピリジンジアミン、ｌ−１−メチルヒスチジン、ｌ−３−メチルヒスチジン、２，３−ジメチルピリジン、キサントプテリン、１，２−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、アロキサン酸（Ａｌｌｏｘａｎｉｃ ａｃｉｄ）、２，６−ジメチルピリジン、Ｌ−カルノシン、２−ピリジンアミン、Ｎ−ｂ−アラニルヒスチジン、ピロカルピン、１−メチルイミダゾール、１Ｈ−イミダゾール、２，４−ジメチルピリジン、４−ニトロフェノール、２−ニトロフェノール、チロシンアミド、５−ヒドロキシキナゾリン、１，１−シクロプロパンジカルボン酸、２，４，６−トリメチルピリジン、ベロナール、２，３−ジクロロフェノール、１，２−エタンジアミン、１−イソキノリンアミン、ならびにこれらの組み合わせ。
幾つかの実施形態において、式Ｉに対応する様々なＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、以下の構造によって表され、
Figure 0006126072
 式中、Ｒ１、Ｒ２、ＲＮ、Ｒ３、およびＲ４は、上記の通りに定義される。
幾つかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４は独立して、十分な親油性特徴もしくは親油性（例えば、水／オクタノール分配によって定義される）を付与して、膜を横断する送達もしくは細胞による取り込みを提供する選択された親油性尾部である。これらの尾部は、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物に使用する場合、両親媒性分子を提供する。親油性尾部は、とりわけ、リン脂質、糖脂質、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド、もしくはガングリオシドに由来し得、ステロイドを含み得る。
ある実施形態において、Ｒ３およびＲ４は独立して、グリセロール骨格を有する親油性尾部であり得る。
幾つかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ１９アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２１アルキル、もしくはＣ２２アルキルであり得る。
幾つかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４は独立して、以下の構造のうちの１つを有する親油性尾部であり得る。
Figure 0006126072
 上記の構造において、Ｘは、該アミノ酸残基末端に直接結合され、かつ数字の名称（例えば、「１８：３」）における原子のうちの１つとして計数される、該尾部の原子を表す。幾つかの実施形態において、Ｘは、炭素、窒素、もしくは酸素原子であり得る。
幾つかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４は独立して、以下の構造のうちの１つを有する親油性尾部であり得る。
Figure 0006126072
 ここでＸは、上で定義される通りである。
幾つかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４は独立して、コレステロール、ステロール、もしくはステロイド（例えば、ゴナン、エストラン、アンドロスタン、プラグナン、コラン、コレスタン、エルゴスタン、カンペスタン、ポリフェラスタン、スチグマスタン、ゴルゴスタン、ラノスタン、シクロアルタン、および前述のうちのいずれかのステロール誘導体もしくは動物ステロール誘導体、ならびにそれらの生物学的中間体および前駆体）を含み得る選択された親油性尾部であり、これらには、例えば、コレステロール、ラノステロール、スチグマスタノール、ジヒドロラノステロール、チモステロール、チモステノール、デスモテロール、７−デヒドロコレステロール、ならびにこれらの混合物および誘導体が含まれ得る。
ある実施形態において、Ｒ３およびＲ４は独立して、脂肪酸様尾部（例えば、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）アルケニル、パルミチン酸（Ｃ１６：０）アルケニル、ステアリン酸（Ｃ１８：０）アルケニル、オレイン酸（Ｃ１８：１，炭素９において二重結合）アルケニル、リノール酸（Ｃ１８：２，炭素９もしくは炭素１２において二重結合）アルケニル、リノレン酸（ｌｉｎｏｎｅｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ｃ１８：３，炭素９、炭素１２、もしくは炭素１５において二重結合）アルケニル、アラキドン酸（Ｃ２０：４，炭素５、炭素８、炭素１１、もしくは炭素１４において二重結合）アルケニル、およびエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，炭素５、炭素８、炭素１１、炭素１４、もしくは炭素１７において二重結合）アルケニルに由来する尾部）に由来し得る。脂肪酸様尾部の他の例は、Ｄｏｎａｌｄ Ｖｏｅｔ ａｎｄ Ｊｕｄｉｔｈ Ｖｏｅｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５），ｐ．３８３に見出される。
幾つかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４は独立して、イソプレノイドに由来し得る。
本明細書で使用される、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含む。故に、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、遺伝的にコードされるアミノ酸、天然に存在する遺伝的にコードされていないアミノ酸、もしくは合成アミノ酸から作製され得る。
アミノ酸の例には、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌが含まれる。
アミノ酸の例には、アゼチジン、２−アミノオクタデカン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、２，３−ジアミノ酪酸、２，４−ジアミノ酪酸、２−アミノイソ酪酸、４−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、６−アミノヘキサン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、デスモシン、オルニチン、シトルリン、Ｎ−メチルイソロイシン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、フェニルグリシン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン（ｓａｃｒｏｓｉｎｅ）、Ｎ−エチルグリシン、シクロヘキシルグリシン、４−オキソ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、シクロヘキシルアラニン、ｔ−ブチルアラニン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３−クロロアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−ハロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、２−チエニルアラニン、メチオニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、ノルアルギニン、ノル−ノルアルギニン、Ｎ−アセチルリジン、４−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、６−Ｎ−メチルリジン、ノルバリン、Ｏ−アリル−セリン、Ｏ−アリル−スレオニン、α−アミノヘキサン酸、α−アミノ吉草酸、ピログルタミン酸が含まれる。
本明細書で使用される、「アミノ酸」という用語は、α−アミノ酸およびβ−アミノ酸を含む。
他のアミノ酸残基は、Ｆａｓｍａｎ，ＣＲＣ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８９）において見出され得る。
一般に、化合物は、１個以上のキラル中心を含み得る。１個以上のキラル中心を含有する化合物は、「異性体」、「立体異性体」、「ジアステレオマー」、「鏡像異性体」、「光学異性体」、もしくは「ラセミ混合物」として記載されるものを含み得る。立体化学的命名法の約束ごとは、例えば、Ｃａｈｎ，ＩｎｇｏｌｄおよびＰｒｅｌｏｇの立体異性体命名規則、ならびに立体化学の決定および立体異性体の分離のための方法が、当該分野において公知である。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１を参照のこと。本開示の化合物および構造物は、特定された化合物もしくは構造物について存在すると理解される、全ての考えられる異性体、立体異性体、ジアステレオマー、鏡像異性体、および／もしくは光学異性体を包含することを意味し、これには、その任意の混合物、ラセミ混合物もしくは他のものを含む。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、Ｒ３−（Ｃ＝Ｏ）−Ａｒｇ−ＮＨ−Ｒ４が含まれ、ここでＡｒｇは、Ｄ−アルギニンもしくはＬ−アルギニンであり、Ｒ３およびＲ４は独立して、アルキルもしくはアルケニルである。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、Ｒ３−（Ｃ＝Ｏ）−ノルＡｒｇ−ＮＨ−Ｒ４が含まれ、ここでノルＡｒｇは、Ｄ−ノルアルギニンもしくはＬ−ノルアルギニンであり、Ｒ３およびＲ４は独立して、アルキルもしくはアルケニルである。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、Ｒ３−（Ｃ＝Ｏ）−ノルノルＡｒｇ−ＮＨ−Ｒ４が含まれ、ここでノルノルＡｒｇは、Ｄ−ノル−ノルアルギニンもしくはＬ−ノル−ノルアルギニンであり、Ｒ３およびＲ４は独立して、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、およびウンデシル等のアルキルである。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、Ｒ３−（Ｃ＝Ｏ）−ホモＡｒｇ−ＮＨ−Ｒ４が含まれ、ここでホモＡｒｇは、Ｄ−ホモアルギニンもしくはＬ−ホモアルギニンであり、Ｒ３およびＲ４は独立して、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、およびウンデシル等のアルキルである。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、Ｒ３−（Ｃ＝Ｏ）−４−ピリジルアラニン−ＮＨ−Ｒ４が含まれ、ここで該ピリジルアラニンは、Ｄ−ピリジルアラニンもしくはＬ−ピリジルアラニンであり、Ｒ３およびＲ４は独立して、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、およびウンデシル等のアルキルである。Ｒ３−（Ｃ＝Ｏ）−ピリジルアラニン−ＮＨ−Ｒ４ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例は、４−［Ｎ−メチルピリジル］アラニンクロリド等の薬学的に許容されるピリジル塩を含む。ピリジルアラニンＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、Ｒ３−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌｙｓ−ＮＨ−Ｒ４が含まれ、ここでＲ３およびＲ４は独立して、アルキルもしくはアルケニルである。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
Figure 0006126072
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、Ｒ３−（Ｃ＝Ｏ）−Ｈｉｓ−ＮＨ−Ｒ４が含まれ、ここでＲ３およびＲ４は独立して、アルキルもしくはアルケニルである。Ｈｉｓ ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、Ｒ３−（Ｃ＝Ｏ）−Ｘａａ−Ｏ−Ｒ４が含まれ、ここでＲ３はアルキルであり、Ｒ４はスフィンゴイド（ｓｐｈｉｎｇｏｉｄ）である。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、Ｒ３−（Ｃ＝Ｏ）−Ｘａａ−ＮＨ−Ｒ４が含まれ、ここでＲ３およびＲ４は、アルキルもしくはアルケニルである。ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、（Ｃ１０アシル）−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）（配列番号１１）、（Ｃ１２アシル）−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）（配列番号１１）、（Ｃ１４アシル）−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）（配列番号１１）、（Ｃ１６アシル）−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）（配列番号１１）、（Ｃ１８アシル）−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）（配列番号１１）、（Ｃ１０アシル）−ホモＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−ホモＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−ホモＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−ホモＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−ホモＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−ノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−ノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−ノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−ノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−ノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−ノルノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−ノルノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−ノルノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−ノルノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−ノルノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−４−Ｐａｌ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−４−Ｐａｌ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−４−Ｐａｌ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−４−Ｐａｌ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−４−Ｐａｌ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−４−Ｐａｌ（Ｍｅ）−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−４−Ｐａｌ（Ｍｅ）−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−４−Ｐａｌ（Ｍｅ）−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−４−Ｐａｌ（Ｍｅ）−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、および（Ｃ１８アシル）−４−Ｐａｌ（Ｍｅ）−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）が含まれる。
一般に、名称「Ｃ１４−ノルＡｒｇ−Ｃ１４」とは、例えば、（Ｃ１３アルキル）−（Ｃ＝Ｏ）−ノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）を指し、これは、（Ｃ１４アシル）−ノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）と同一である。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、（Ｃ１０アシル）−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−Ｄ−ホモＡｒｇ−Ｌ−ホモＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｄ−ホモＡｒｇ−Ｌ−ホモＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｄ−ホモＡｒｇ−Ｌ−ホモＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｄ−ホモＡｒｇ−Ｌ−ホモＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｄ−ホモＡｒｇ−Ｌ−ホモＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−Ｄ−ノルＡｒｇ−Ｌ−ノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｄ−ノルＡｒｇ−Ｌ−ノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｄ−ノルＡｒｇ−Ｌ−ノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｄ−ノルＡｒｇ−Ｌ−ノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｄ−ノルＡｒｇ−Ｌ−ノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−Ｄ−ノルノルＡｒｇ−Ｌ−ノルノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｄ−ノルノルＡｒｇ−Ｌ−ノルノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｄ−ノルノルＡｒｇ−Ｌ−ノルノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｄ−ノルノルＡｒｇ−Ｌ−ノルノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｄ−ノルノルＡｒｇ−Ｌ−ノルノルＡｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）が含まれる。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、（Ｃ１０アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）が含まれる。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、（Ｃ１０アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）が含まれる。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、（Ｃ１０アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）、（Ｃ１０アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１２アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１２アルキル）、（Ｃ１４アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１４アルキル）、（Ｃ１６アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１６アルキル）、（Ｃ１８アシル）−Ｐａｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−（Ｃ１８アルキル）が含まれる。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、二量体、三量体、もしくは四量体等のポリマーもしくはマルチマーとして調製され得る。該ポリマーもしくはマルチマーは、単一のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物から調製され得るか、または１つより多くの種から調製され得る。ポリマーもしくはマルチマーのＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、幾つかの実施形態において、該アミノ酸の側鎖上にスルフヒドリル基もしくは他の架橋可能な基を、またはデスモシンもしくはシトルリン等の連結されるか、もしくは固定された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）アミノ酸構造物を提供することによって、調製され得る。他の実施形態において、ポリマーもしくはマルチマーのＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、生体結合体リンカー化合物で調製され得る。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
 ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、該アミノ酸側鎖に共有結合したペプチドもしくはポリマー鎖を有する結合体として調製され得る。ペプチドもしくはポリマー鎖は、該アミノ酸側鎖の反応性基を用いて、例えば、システインもしくはメチオニンの、それぞれ、チオール基もしくはメチルメルカプタン基を、またはセリンのアルコール基、もしくはリジンのアミノ基を用いて、結合され得る。該ペプチドもしくはポリマー鎖は、置換されたかもしくは修飾されたアミノ酸側鎖の任意の反応性基を用いて結合され得る。ＮＨＳ、マレイミド、ならびに生体結合体技術およびリンカー等の種々のリンカー基が、使用され得る。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、オリゴマーもしくはポリマーフレームワークに結合された構築物として調製され得る。例えば、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、オリゴヌクレオチドネットワークもしくは格子、ポリ（アミノ酸）、炭水化物、デキストラン、ヒドロゲル、またはデンプンに結合され得る。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、薬学的薬物化合物もしくは組成物、または生物学的に活性な薬剤に結合された構築物として調製され得る。例えば、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、制御性ＲＮＡもしくは干渉ＲＮＡ等の核酸薬物に結合体化され得る。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物の例には、以下の構造物が含まれる。
Figure 0006126072
 ここでＲは、任意のアミノ酸側鎖である。
本開示の化合物および組成物は、ポリマー構造を含む、可溶化もしくは官能化する基もしくは構造を組み込み得る。例えば、Ｒ．Ｌ．Ｄｕｎｎ ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｏｔｔｅｎｂｒｉｔｅ，Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４６９（１９９１）を参照のこと。ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、可溶性を増強するために、例えば、ジオールを結合するために、四級アンモニウムもしくは荷電した基を調製するために、アルコール、ポリオール、もしくはポリエーテル等のヒドロキシルもしくはアミン基を結合するために、またはポリエチレンイミン、ポリエチレングリコールもしくはポリプロピレングリコールを結合するために、誘導体化され得る。ポリエチレングリコール等の結合されたポリマー成分の分子量は、例えば、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、７５００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、または３０，０００Ｄａもしくはそれ以上の任意の値であり得る。例えば、ポリエチレングリコール鎖は、アミノ酸側鎖のアミノ基もしくは他の反応性基を介して結合され得る。
一般に、本明細書で使用される、一般的な化学用語は、別段特定されない限り、原子の任意の数およびタイプを有する基を含む特定されたタイプのうちの全ての基を指す。例えば、「アルケニル」は、広義に、下で定義されるように、２〜２２個の炭素原子を有するアルキルを指し、（Ｃ１８：１）アルケニルは、１８個の炭素原子および１個の二重結合を有するアルケニルを指す。
本明細書で使用される、「アルキル」という用語は、飽和、分枝もしくは非分枝の、置換もしくは非置換の、１〜２２個の炭素原子を含有する脂肪族基を指す。この定義は、例えば、アルコキシ、アルカノイル、アラルキル、および以下に定義される他の基等の他の基のアルキル部分に適用される。本明細書で使用される、「シクロアルキル」という用語は、飽和の、置換もしくは非置換の、３〜１２個の炭素原子を含有する環式アルキル基を指す。
本明細書で使用される、「アルケニル」という用語は、不飽和の、分枝もしくは非分枝の、置換もしくは非置換の、２〜２２個の炭素原子および少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有するアルキルもしくはシクロアルキルを指す。本明細書で使用される、「アルキニル」という用語は、不飽和の、分枝もしくは非分枝の、置換もしくは非置換の、２〜２２個の炭素原子および少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有するアルキルもしくはシクロアルキルを指す。
本明細書で使用される、「アルコキシ」という用語は、酸素原子に共有結合されたアルキル、シクロアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基を指す。本明細書で使用される、「アルカノイル」という用語は、−Ｃ（＝Ｏ）−アルキルを指し、これは、代替として、「アシル」とも称され得る。本明細書で使用される、「アルカノイルオキシ」という用語は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル基を指す。本明細書で使用される、「アルキルアミノ」という用語は、基−ＮＲＲ’を指し、ここでＲおよびＲ’は、各々、水素もしくはアルキルのいずれかであり、かつＲおよびＲ’のうちの少なくとも一方は、アルキルである。アルキルアミノは、ピペリジノ等の基を含み、ここでＲおよびＲ’は環を形成する。「アルキルアミノアルキル」という用語は、−アルキル−ＮＲＲ’を指す。
本明細書で使用される、「アリール」という用語は、各環中に４〜１２個の原子の任意の安定な単環式、二環式、もしくは多環式の炭素環系を指し、ここで少なくとも１個の環は、芳香族である。アリールの幾つかの例には、フェニル、ナフチル、テトラヒドロ−ナフチル、インダニル、およびビフェニルが含まれる。アリール置換基が、二環式であり、かつ一方の環が非芳香族である場合、結合は、該芳香族環に対してであることが理解される。アリールは、置換もしくは非置換であり得る。
本明細書で使用される、「ヘテロアリール」という用語は、各環において４〜１２個の原子の任意の安定な単環式、二環式、もしくは多環式の炭素環系を指し、ここで少なくとも一方の環が芳香族であり、かつ酸素、窒素および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む。ヘテロアリールの幾つかの例には、アクリジニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、およびテトラヒドロキノリニルが含まれる。ヘテロアリールとしては、窒素含有ヘテロアリールのＮ−オキシド誘導体が含まれる。
本明細書で使用される、「複素環」もしくは「ヘテロシクリル」という用語は、５〜２２個の原子の芳香族もしくは非芳香族の環系を指し、ここで該環原子のうちの１〜４個は、酸素、窒素、および硫黄から選択されるヘテロ原子である。故に、複素環は、そのヘテロアリールまたはジヒドロもしくはテトラヒドロ形態であり得る。
本明細書で使用される、「アロイル」という用語は、置換された安息香酸等の芳香族カルボン酸に由来するアリールラジカルを指す。本明細書で使用される、「アラルキル」という用語は、例えば、ベンジル基等のアルキル基に結合したアリール基を指す。
本明細書で使用される、「カルボキシル」という用語は、式−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨもしくは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−の基を表す。本明細書で使用される、「カルボニル」および「アシル」という用語は、酸素原子が炭素原子に二重結合している基＞Ｃ＝Ｏを指す。本明細書で使用される、「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨもしくは−Ｏ−を指す。本明細書で使用される、「ニトリル」もしくは「シアノ」という用語は、−ＣＮを指す。「ハロゲン」もしくは「ハロ」という用語は、フルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）、およびヨード（−Ｉ）を指す。
本明細書で使用される、「置換されている」という用語は、１個以上の置換もしくは置換基を有する原子を指し、これらは、同じであっても異なっていてもよく、かつ水素置換基を含み得る。故に、本明細書で使用される、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アルキルアミノ，アルキルアミノアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アロイル、およびアラルキルという用語は、置換されている変形を含む基を指す。置換されている変形は、直鎖状の、分枝状の、および環式の形態、ならびに該基のうちの任意の炭素原子に結合された１個以上の水素を置換する置換基を有する基を含む。該基のうちの炭素原子に結合され得る置換基としては、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アロイル、アラルキル、アシル、ヒドロキシル、シアノ、ハロ、ハロアルキル、アミノ、アミノアシル、アルキルアミノアシル、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、メルカプト、ニトロ、カルバミル、カルバモイル、および複素環が含まれる。例えば、エチルという用語としては、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨＦＣＨ３、−ＣＦ２ＣＨ３、−ＣＨＦＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦＣＨＦ２、−ＣＨＦＣＦ３、−ＣＦ２ＣＨ２Ｆ、−ＣＦ２ＣＨＦ２、−ＣＦ２ＣＦ３、および上記の他の変形が含まれるが、これらに限定されない。一般に、置換基は、任意の原子もしくは原子の基でさらに置換され得る。
ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、当該分野において公知の方法によって合成され得る。
種々の有機基および保護基を調製するための方法は、当該分野において公知であり、それらの使用および修飾は、一般に、当業者の能力の範囲内である。例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｒ．Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｗｏｌｆ Ｋａｒｏ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（１９８９）、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）、Ｌｅｒｏｙ Ｇ．Ｗａｄｅ，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ Ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）を参照のこと、保護基の例は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（３ｒｄ ｅｄ．１９９１）において見出される。
例えば、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物ＰＯＮＡは、以下のスキームに従って合成され得る。
Figure 0006126072
Figure 0006126072
 十分に塩基性である本発明のペプチドおよびタンパク質組成物の薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、クロロスルホン酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、フマル酸、もしくは酒石酸等の無機酸もしくは有機酸、ならびにメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、クロロベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、およびカンファースルホン酸等のアルカンスルホン酸もしくはアレーンスルホン酸との酸付加塩であり得る。
十分に酸性である本発明のペプチドおよびタンパク質組成物の薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩もしくはカリウム塩、またはアルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム塩もしくはマグネシウム塩、または亜鉛塩もしくはマンガン塩、またはアンモニウム塩もしくは生理学的に許容されるカチオンを提供する有機塩基との塩、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミン、ピペリジン、モルホリンもしくはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンとの塩であり得、アルギネート等のアミノ酸の塩、およびグルクロン酸もしくはガラクツロン酸等の有機酸との塩を含む。例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９，１９７７を参照のこと。
他の成分の中でも、干渉ＲＮＡ薬剤、およびＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、脂質、ペプチド、もしくはタンパク質を含む本開示の組成物の塩もしくは薬学的に許容される塩は、該干渉ＲＮＡ薬剤、および該ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、脂質、ペプチド、もしくはタンパク質の塩複合体を含み得る。該干渉ＲＮＡ薬剤、および該ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、脂質、ペプチド、もしくはタンパク質の塩複合体は、干渉ＲＮＡ薬剤の薬学的に許容される塩から、または該ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、脂質、ペプチド、もしくはタンパク質の薬学的に受容可能な塩から形成され得る。
本開示の幾つかの化合物は、該化合物を塩基付加塩もしくは酸付加塩のいずれかへと作製させ得る塩基性官能基および酸性官能基の両方を含み得る。
本発明の幾つかの化合物、ペプチドおよび／もしくはタンパク質組成物は、１個以上のキラル中心および／もしくは幾何異性中心（Ｅ−異性体およびＺ−異性体）を有し得、本発明は、全てのこのような光学異性体、ジアステレオマー、幾何異性体、およびこれらの混合物を包含することが理解されるべきである。
本開示は、本明細書で開示される化合物、ペプチド、および／もしくはタンパク質組成物の任意のおよび全ての、互変異形態、溶媒和もしくは非溶媒和の形態、水和もしくは非水和の形態、ならびに任意の原子同位体形態を包含する。
脂質
本発明の幾つかの態様において、１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および１つ以上の脂質は、調節性ＲＮＡ成分、ＲＮＡアンタゴニスト、干渉ＲＮＡ、もしくは核酸の送達および投与のために使用され得る。さらに具体的には、本発明の組成物は、カチオン性脂質および非カチオン性脂質と共に、１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を含み得る。
カチオン性脂質は、モノカチオン性またはポリカチオン性であり得る。幾つかのカチオン性脂質は、中性脂質および特定のｐＨにおいてほぼゼロの正味の荷電を有する脂質、例えば、双性イオン性脂質を含む。非カチオン性脂質はまた、アニオン性脂質も含む。
幾つかの実施形態において、組成物は、ＲＮＡ成分と、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物およびカチオン性脂質との混合物もしくは複合体である。幾つかの実施形態において、組成物は、１つ以上の調節性もしくは干渉ＲＮＡ薬剤と、１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および１つ以上のカチオン性脂質との混合物もしくは複合体であり得る。
本開示の化合物および組成物は、種々の標的化リガンドもしくは薬剤と混合もしくは結合されて、生物の細胞、組織、器官、もしくは領域へと、活性薬剤を送達し得る。標的化剤の例には、抗体、受容体のリガンド、ペプチド、タンパク質、レクチン、（ポリ）サッカリド、ガラクトース、マンノース、シクロデキストリン、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、およびポリアミノ酸が含まれる。
カチオン性脂質の例には、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ビス（ジミリストイルオキシ（ｄｉｍｙｒｓｔｏｙｌｏｘｙ））−３−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＭＴＡＰ）；１，２−ジミリスチルオキシ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｙ）プロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；３β−［Ｎ’，Ｎ’−ジグアニジノエチル−アミノエタン）カルバモイルコレステロール（ＢＧＴＣ）；２−（２−（３−（ビス（３−アミノプロピル）アミノ）プロピルアミノ）アセトアミド）−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルアセトアミド（ＲＰＲ２０９１２０）；これらの薬学的に許容される塩、およびこれらの混合物が含まれる。
カチオン性脂質の例には、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン等の１，２−ジアルカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＥＰＣ）、これらの薬学的に許容される塩、およびこれらの混合物が含まれる。
カチオン性脂質の例には、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、および１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）が含まれる。
ポリカチオン性脂質の例には、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）、テトラメチルテトラオレイルスペルミン（ＴＭＴＯＳ）、テトラメチルテトララウリルスペルミン（ＴＭＴＬＳ）、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン（ＴＭＴＭＳ）、テトラメチルジオレイルスペルミン（ＴＭＤＯＳ）、これらの薬学的に許容される塩、およびこれらの混合物が含まれる。
ポリカチオン性脂質の例には、２，５−ビス（３−アミノプロピルアミノ）−Ｎ−（２−（ジオクタデシルアミノ）−２−オキソエチル）ペンタンアミド（ＤＯＧＳ）；２，５−ビス（３−アミノプロピルアミノ）−Ｎ−（２−（ジ（Ｚ）−オクタデカ−９−ジエニルアミノ）−２−オキソエチル）ペンタンアミド（ＤＯＧＳ−９−エン）；２，５−ビス（３−アミノプロピルアミノ）−Ｎ−（２−（ジ（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルアミノ）−２−オキソエチル）ペンタンアミド（ＤＬｉｎＧＳ）；３−β−（Ｎ４−（Ｎ１，Ｎ８−ジカルボベンゾキシスペルミジン）カルバモイル）コレステロール（ＧＬ−６７）；（９Ｚ，９’Ｚ）−２−（２，５−ビス（３−アミノプロピルアミノ）ペンタンアミド）プロパン−１，３−ジイル−ジオクタデカ−９−エノエート（ＤＯＳＰＥＲ）；２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウム（ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｉｕｍ）トリフルオロ−アセテート（ＤＯＳＰＡ）；これらの薬学的に許容される塩、およびこれらの混合物が含まれる。
カチオン性脂質の例には、ＤＳ４０４−２８ ＢＧＴＣ（ＣＡＳ １８２０５６−０６−０）、ＤＯＳＰＥＲ（ＣＡＳ １７８５３２−９２−８）、ＧＬ−６７（１７９０７５−３０−０）、ＲＰＲ２０９１２０（ＣＡＳ ４３３２９２−１３−８）、ＤＯＧＳ（１２０５０−７７−７）、ＤＯＧＳ（９−エン，Ｃ１８：１）、ＤＬｉｎＧＳ（Ｃ１８：２）、およびＤＯＴＭＡ（１０４１６２−４８−３）が含まれる。
カチオン性脂質の例は、米国特許第４，８９７，３５５号；同第５，２７９，８３３号；同第６，７３３，７７７号；同第６，３７６，２４８号；同第５，７３６，３９２号；同第５，３３４，７６１号；同第５，４５９，１２７号；同第２００５／００６４５９５号；同第５，２０８，０３６号；同第５，２６４，６１８号；同第５，２７９，８３３号；同第５，２８３，１８５号；同第５，７５３，６１３号；同第５，７８５，９９２号に記載されている。
幾つかの実施形態において、該組成物は、ＲＮＡ成分と、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および非アミノ酸非カチオン性脂質との混合物もしくは複合体である。幾つかの実施形態において、該組成物は、１つ以上のＲＮＡ成分と、１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および１つ以上の非カチオン性脂質との混合物もしくは複合体である。
非カチオン性脂質としては、中性、双イオン性、およびアニオン性の脂質が含まれる。故に、非カチオン性の双イオン性脂質は、カチオン性のヘッド基を含み得る。
非カチオン性脂質の例には、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＬＧ）；１，２−ジミルストイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＭＧ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＰＧ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＳＧ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ナトリウム塩；ＤＬＰＡ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ナトリウム塩；ＤＭＰＡ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ナトリウム塩；ＤＰＰＡ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ナトリウム塩；ＤＳＰＡ）；１，２−ジアラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＡＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−０−エチル−３−ホスホコリン（クロリドもしくはトリフレート；ＤＰｅＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ナトリウム塩；ＤＬＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ナトリウム塩；ＤＭＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｓｎ−１−グリセロール（アンモニウム塩；ＤＭＰ−ｓｎ−１−Ｇ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ナトリウム塩；ＤＰＰＧ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロ（ナトリウム塩；ＤＳＰＧ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｓｎ−１−グリセロール（ナトリウム塩；ＤＳＰ−ｓｎ−１−Ｇ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ナトリウム塩；ＤＰＰＳ）；１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＬｉｎｏＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ナトリウム塩；ＰＯＰＧ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ナトリウム塩；ＰＯＰＧ）；１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（アンモニウム塩；ＰＯＰＧ）；１−パルミトイル−２−４ｏ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｐ−ｌｙｓｏ−ＰＣ）；１−ステアロイル−２−ｌｙｓｏ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｓ−ｌｙｓｏ−ＰＣ）；およびこれらの混合物が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、ポリマー化合物およびポリマー脂質結合体もしくはポリマー脂質（例えば、３００、５００、１０００、１５００、２０００、３５００、もしくは５０００の分子量のＰＥＧ領域を有するｐｅｇ化脂質（ポリエチレングリコール、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ナトリウム塩；ＤＭＰＥ−ＭＰＥＧ−２０００）；Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００）−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ナトリウム塩；ＤＭＰＥ−ＭＰＥＧ−５０００）；Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ナトリウム塩；ＤＰＰＥ−ＭＰＥＧ−２０００）；Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール５０００）−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ナトリウム塩；ＤＰＰＥ−ＭＰＥＧ−５０００）；Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール７５０）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ナトリウム塩；ＤＳＰＥ−ＭＰＥＧ−７５０）；Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ナトリウム塩；ＤＳＰＥ−ＭＰＥＧ−２０００）；Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール５０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ナトリウム塩；ＤＳＰＥ−ＭＰＥＧ−５０００）；コレステリル硫酸ナトリウム（ＳＣＳ）；これらの薬学的に許容される塩、およびこれらの混合物が含まれる））が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＤＰＥ−ＰＥＧ ＤＬｉｎＰＥ−ＰＥＧ、およびジアシルグリセロール−ＰＥＧ−２０００もしくは−５０００等のポリマー脂質が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＴＥ０２０およびＤＳＰＥ−ＡＭ０５３０Ｋ等の複数分枝のｐｅｇ化化合物等のポリマー脂質が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、ＤＳＰＥ−ＰＧ８Ｇポリグリセリン脂質等のポリマー脂質が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、および１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、コレステロール、ステロール、およびステロイド（例えば、ゴナン、エストラン、アンドロスタン、プラグナン、コラン、コレスタン、エルゴスタン、カンペスタン、ポリフェラスタン、スチグマスタン、ゴルゴスタン、ラノスタン、シクロアルタン）、ならびに前述のうちのいずれかのステロールもしくは動物ステロール誘導体、ならびにこれらの生物学的中間体および前駆体が含まれ、これらとしては、例えば、コレステロール、ラノステロール、スチグマステロール、ジヒドロラノステロール、チモステロール、チモステノール、デスモテロール、７−デヒドロコレステロール、ならびにこれらの混合物もしくは誘導体が含まれ得る。
非カチオン性脂質の例には、ｐｅｇ化コレステロール、およびコレスタン３−オキソ（Ｃ１−２２アシル）−誘導体（例えば、コレステリルアセテート、コレステリルアラキドネート、コレステリルブチレート、コレステリルヘキサノエート、コレステリルカプリレート、コレステリル ｎ−デカノエート、コレステリルドデカノエート、コレステリルミリステート、コレステリルパルミテート、コレステリルベヘネート、コレステリルステアレート、コレステリルネルボネート、コレステリルペラルゴネート、コレステリルｎ−バレレート、コレステリルオレエート、コレステリルエライデート、コレステリルエルケート、コレステリルヘプタノエート、コレステリルリノレライデート、コレステリルリノレエート）、ならびにこれらの混合物および誘導体が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、植物ステロール（フィトステロール、β−シトステロール、カンペステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、δ−７−スチグマステロール、δ−７−アベナステロール、ならびにこれらの混合物および誘導体を含む）に由来する化合物が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、胆汁酸、コール酸、ケノデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、メチル−リトコール酸、ならびにこれらの混合物および誘導体が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、ステロイド（グルココルチコイド、コルチゾール、ヒドロコルチゾン、コルチコステロン、Δ５−プレグネノロン、プロゲステロン、デオキシコルチコステロン、１７−ＯＨ−プレグネノロン、１７−ＯＨ−プロゲステロン、１１−ジオキシコルチゾール、デヒドロエピアンドロステロン、硫酸デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、アルドステロン、１８−ヒドロキシコルチコステロン、テトラヒドロコルチゾール、テトラヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニゾン、６α−メチルプレドニゾン、９α−フルオロ−１６α−ヒドロキシプレドニゾロン、９α−フルオロ−１６α−メチルプレドニゾロン、９α−フルオロコルチゾール、ならびにこれらの混合物および誘導体を含む）に由来する化合物が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、ステロイド（アンドロゲン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオール、アンドロステンジオン、アンドロステンジオン、３α，５α−アンドロスタンジオール、ならびにこれらの混合物および誘導体を含む）に由来する化合物が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、ステロイド（エストロゲン、エストリオール、エストロン、エストラジオール、ならびにこれらの混合物および誘導体を含む）に由来する化合物が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、ルミステロールおよびビタミンＤ化合物に由来する化合物が含まれる。
非カチオン性脂質の例には、例えば、ＤＤＰＥ（Ｃ１０：０）（ＣＡＳ ２５３６８５−２７−７）、ＤＬＰＥ（Ｃ１２：０）（ＣＡＳ ５９７５２−５７−７）、ＤＳＰＥ（Ｃ１８：０）（ＣＡＳ １０６９−７９−０）、ＤＯＰＥ（Ｃ１８：１）（ＣＡＳ ４００４−０５−１）、ＤＬｉｎＰＥ（Ｃ１８：２）（ＣＡＳ ２０７０７−７１−５）、ＤＬｅｎＰＥ（Ｃ１８：３）（ＣＡＳ ３４８１３−４０−６）、ＤＡＲＡＰＥ（Ｃ２０：４）（ＣＡＳ ５６３４−８６−６）、ＤＤＨＡＰＥ（Ｃ２２：６）（ＣＡＳ １２３２８４−８１−１）、ＤＰｈＰＥ（１６：０［（ＣＨ３）４］）（ＣＡＳ ２０１０３６−１６−０）等のＣ１０：０〜Ｃ２２：６に及ぶ尾部を有する脂質が含まれる。
アニオン性脂質の例には、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトール（ｐｉ（４）ｐ，ｐｉ（４，５）ｐ２）、カルジオリピン（ナトリウム塩）、リゾホスファチド、水素化リン脂質、スフィンゴ脂質、ガングリオシド、フィトスフィンゴシン、スフィンガニン、これらの薬学的に許容される塩、およびこれらの混合物が含まれる。
ＲＮＡ治療薬を送達するための使用
幾つかの態様において、本開示は、一般に、調節性ＲＮＡおよびＲＮＡ干渉、アンチセンス治療薬、ならびにＲＮＡ治療薬の送達の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、リボ核酸のための組成物および製剤、ならびに医薬のためおよび治療薬としての送達のためのこれらの使用に関する。本発明は、一般に、細胞における遺伝子発現の遺伝子特異的阻害のためのＲＮＡ干渉において、または疾患状態もしくは表現型を変化させるための哺乳動物において、リボ核酸を使用するための方法に関する。
ＲＮＡ干渉は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される配列特異的な転写後遺伝子発現抑制の方法に関する。Ｆｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６，１９９８およびＨａｍｉｌｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：９５０‐９５１，１９９９を参照のこと。ＲＮＡｉは、多様な叢（ｆｌｏｒａ）および門（ｐｈｙｌａ）によって共有され、外来遺伝子の発現に対する、進化的に保存された細胞性防御機序であると考えられる。Ｆｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１５：３５８，１９９９を参照のこと。
したがって、ＲＮＡｉは、小さな非コードＲＮＡを使用して、遺伝子発現を抑制する、遍在性の内因性機序である。Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｊ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．８：３７７−４０２，２００６を参照のこと。ＲＮＡｉは、細胞死、分化、および発生に関与する重要な遺伝子を制御し得る。ＲＮＡｉはまた、トランスポゾンおよびウイルスによってコードされる侵入遺伝的要素からゲノムを防御し得る。ｓｉＲＮＡが細胞に導入されると、内因性ＲＮＡｉ機序に結合して、相補的配列を含むｍＲＮＡの発現を高い特異性で妨害する。任意の疾患を引き起こす遺伝子および任意の細胞型もしくは組織が、潜在的に標的とされ得る。この技術は、遺伝子機能分析、ならびに薬物標的発見および確認のために迅速に利用されている。ＲＮＡｉの利用はまた、治療に非常に有望であるが、ｓｉＲＮＡを生体内で細胞へ導入することには、重大な障害が未だ残っている。
ＲＮＡｉの機序は、未だ完全には特徴付けられていないものの、標的ｍＲＮＡの切断を介している。該ＲＮＡｉ応答には、ＲＮＡ誘発発現抑制複合体（ＲＩＳＣ）として公知であるエンドヌクレアーゼ複合体が関与し、これは、該ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。該標的ＲＮＡの切断は、該ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な領域の中央部で起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８，２００１）。
ＲＮＡｉを行うための１つの方法は、細胞内にｓｉＲＮＡを導入するかまたは発現させることである。もう１つの方法は、ダイサーと称される内因性リボヌクレアーゼＩＩＩ酵素を使用することである。ダイサーの１つの活性は、長いｄｓＲＮＡをｓｉＲＮＡへと処理することである。Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：９５０−９５１，１９９９、Ｂｅｒｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３，２００１を参照のこと。ダイサーに由来するｓｉＲＮＡは、典型的には、全体的な長さが約２１〜２３ヌクレオチドであり、約１９塩基対が二重鎖になっている。Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，上記を参照；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８，２００１を参照のこと。本質的に、長いｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体として細胞内に導入され得る。
本発明は、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、脂質、および中性もしくは合成のポリマーを含む種々の成分と組み合わせて、調節性ＲＮＡ、干渉核酸、もしくはその前駆体を含む、様々な組成物、製剤、および方法を提供する。
本明細書で使用される、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、例えば、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」もしくは「ｉＲＮＡ」）、または配列特異的様式で遺伝子発現抑制を促進することによって、遺伝子発現を阻害もしくは下方制御することができる任意の二本鎖ＲＮＡ分子を指す。本開示のｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉによる遺伝子発現抑制を媒介するために、ダイサーのため、またはＲＩＳＣと会合するために好適な基質であり得る。該ｄｓＲＮＡの一方のもしくは両方の鎖は、５’−ホスフェートまたは５’，３’−ジホスフェート等の末端ホスフェート基をさらに含むことができる。本明細書で使用される、ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのリボヌクレオチドに加えて、置換、化学的に修飾されたヌクレオシド、および非ヌクレオチドをさらに含むことができる。
ｄｓＲＮＡ分子の例には、例えば、米国特許出願第１１／６８１，７２５号、米国特許第７，０２２，８２８号および第７，０３４，００９号、ならびにＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ／２００３／０７０８９７号において見出され得る。
本開示の核酸薬剤の例は、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２００８／１４７８２４号に記載の１つ以上の非環式モノマーを含み得る。非環式モノマーの例は、第ＷＯ２００８／１４７８２４号の図１および２に示されるモノマーＤ〜Ｊを含む。
本開示の活性薬剤の例は、第ＷＯ２００８／１４７８２４号の非環式モノマーを含有する核酸分子を含む。
本開示の活性薬剤の例は、ＵｓｉＲＮＡを含む。ＵｓｉＲＮＡは、ＵＮＡ含有ｓｉＲＮＡであり、ここでＵＮＡは、「ロックされない核酸塩基アナログ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ ａｎａｌｏｇ）」である。第ＷＯ２００８／１４７８２４号の非環式モノマーＤ〜Ｊは、ＵＮＡの例である。
修飾されたヌクレオシドの例は、米国特許第６，４０３，５６６号、同第６，５０９，３２０号、同第６，４７９，４６３号、同第６，１９１，２６６号、同第６，０８３，４８２号、同第５，７１２，３７８号、および同第５，６８１，９４０号に見出される。修飾されたヌクレオシドは、以下の構造を有し得る。
Figure 0006126072
 ここでＸは、ＯもしくはＣＨ２であり、ＹはＯであり、ＺはＣＨ２であり；Ｒ１は、アデニン、シトシン、グアニン、ヒポキサンチン、ウラシル、チミン、および複素環の群から選択され、ここで該複素環は、置換１，３−ジアジン、非置換１，３−ジアジン、および非置換７Ｈ イミダゾ［４，５］１，３ジアジンの群から選択され；Ｒ２、Ｒ３は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＤＭＴＯ、ＴＢＤＭＳＯ、ＢｎＯ、ＴＨＰＯ、ＡｃＯ、ＢｚＯ、ＯＰ（ＮｉＰｒ２）Ｏ（ＣＨ２）２ＣＮ、ＯＰＯ３ Ｈ、ジホスフェート、およびトリホスフェートの群から選択され、ここでＲ２およびＲ３は一緒になって、ＰｈＣＨＯ２、ＴＩＰＤＳＯ２もしくはＤＴＢＳＯ２であり得る。本明細書で使用される、「Ａｃ」という略語は、アセチルを指す、「Ｂｎ」という略語は、ベンジルを指す、「Ｂｚ」という略語は、ベンゾイルを指す、「ＤＭＴ」という略語は、ジメトキシトリチルを指す、「ＴＨＰ」という略語は、テトラヒドロピラニルを指す、「ＴＢＤＭＳ」という略語は、ｔ−ブチルジメチルシリルを指す、「ＴＩＰＤＳ」という略語は、テトライソプロピルジシリルを指す、「ＤＴＢＳ」という略語は、ジ（ｔ−ブチル）シリルを指す。
加えて、本明細書で使用される、「ｄｓＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ誘導剤」、および「ＲＮＡｉ薬剤」という用語は、部分二重鎖ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）、ニック形成（ｎｉｃｋｅｄ）ｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）、ギャップ形成（ｇａｐｐｅｄ）ｄｓＲＮＡ（ｇｄｓＲＮＡ）、短い干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短い干渉オリゴヌクレオチド、短い干渉置換オリゴヌクレオチド、短い干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｄｓＲＮＡ、および転写後遺伝子発現抑制ＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、ならびに上記のうちのいずれかの前駆体を含む、配列特異的ＲＮＡｉを誘導することが可能な核酸分子を記載するために使用される他の用語と同義であることを意味する。
「大きな二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ」という用語は、約４０塩基対（ｂｐ）〜約１００ｂｐ以上、特に、最大約３００ｂｐ〜約５００ｂｐまでより長い任意の二本鎖ＲＮＡを指す。大きなｄｓＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡのセグメントまたはｍＲＮＡ全体を表し得る。二本鎖構造は、自己相補性核酸分子によって、または２つ以上の別個の相補的核酸分子鎖のアニーリングによって形成され得る。
幾つかの態様において、ｄｓＲＮＡは、第１鎖（アンチセンス）および第２鎖（センス）を含む２つの別個のオリゴヌクレオチドを含み、ここで該アンチセンス鎖およびセンス鎖は、自己相補的であり（すなわち、各鎖は、二重鎖もしくは二本鎖構造を形成する、他方の鎖および２つの別個の鎖中のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、例えば、ここで該二本鎖領域は、約１５〜約２４塩基対もしくは約２６〜約４０塩基対である）、該アンチセンス鎖は、標的核酸分子もしくはその一部分（例えば、ヒトｍＲＮＡ）におけるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、該センス鎖は、標的核酸配列もしくはその一部分に対応する（すなわち、相同な）ヌクレオチド配列（例えば、約１５〜約２５ヌクレオチドもしくは約２６〜約４０ヌクレオチドのセンス鎖は、標的核酸もしくはその一部分に対応する）を含む。
幾つかの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ得、該ｄｓＲＮＡの自己相補的センス鎖およびアンチセンス鎖は、核酸ベースのリンカーもしくは非核酸ベースのリンカーによって一緒に連結される。幾つかの実施形態において、該ｄｓＲＮＡ分子の第１（アンチセンス）鎖および第２（センス）鎖は、本明細書において記載され、かつ当該分野において公知のヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーによって共有結合される。幾つかの実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ分子は、当該分野において公知のヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーによって、少なくとも１つの第２のｄｓＲＮＡ分子に共有結合され、ここで該第１のｄｓＲＮＡ分子は、同じであるかもしくは異なり得る複数の他のｄｓＲＮＡ分子、またはこれらの任意の組み合わせに連結され得る。幾つかの実施形態において、連結されたｄｓＲＮＡは、連結されたｄｓＲＮＡとの部分二重鎖（ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を形成する第３の鎖を含み得る。
幾つかの点で、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ分子は、３本以上の鎖、例えば、「Ａ」（第１のもしくはアンチセンス）鎖、「Ｓ１」（第２の）鎖、および「Ｓ２」（第３の）鎖、ここで「Ｓ１」鎖および「Ｓ２」鎖は、「Ａ」鎖の重複しない領域と相補的であり、かつ塩基対（ｂｐ）を形成する（例えば、ｍｄＲＮＡは、Ａ：Ｓ１Ｓ２の形態を有し得る）を有する部分二重鎖ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）を形成する。Ｓ１、Ｓ２、またはより多くの鎖は一緒に、「Ａ」鎖に対するセンス鎖を本質的に含む。「Ｓ１」鎖および「Ａ」鎖のアニーリングによって形成される二本鎖領域は、「Ｓ２」鎖および「Ａ」鎖のアニーリングによって形成される二本鎖領域と異なり、かつ重複しない。ｍｄＲＮＡ分子は、「ギャップ形成」分子であり、これは、０ヌクレオチドから最大約１０ヌクレオチドまでの範囲に及ぶ「ギャップ」を意味する。幾つかの実施形態において、Ａ：Ｓ１二重鎖は、Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖との間に位置する、該「Ａ」鎖において少なくとも１つの不対ヌクレオチド（最大約１０個までの不対ヌクレオチド）から生じ、該「Ａ」鎖、「Ｓ１」鎖、もしくは「Ｓ２」鎖のうちの１つ以上の３’末端において任意の１つ以上の不対ヌクレオチドとは異なるギャップによって、該Ａ：Ｓ２二重鎖から分離される。幾つかの実施形態において、Ａ：Ｓ１二重鎖は、Ａ：Ｂ２二重鎖から、Ａ：Ｓ１二重鎖と、Ａ：Ｓ２二重鎖との間でゼロヌクレオチドのギャップ（すなわち、２つのヌクレオチドの間のホスホジエステル結合のみがポリヌクレオチド分子において破壊されているかもしくは失われているニック）によって隔てられており、これはまた、ニック形成ｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）とも称され得る。例えば、Ａ：Ｓ１Ｓ２は、合計約１４塩基対〜約４０塩基対を合わせた少なくとも２つの二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡからなり得、該二本鎖領域は、約０〜約１０ヌクレオチド（任意に、平滑末端を有する）のギャップによって分離されるか、またはＡ：Ｓ１Ｓ２は、最大１０個のヌクレオチドのギャップによって分離される少なくとも２つの二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡを含み得、ここで該二本鎖領域のうちの少なくとも一方は、約５塩基対〜１３塩基対を含む。
本明細書で記載される、３本以上の鎖を含むｄｓＲＮＡ分子は、「ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ」ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）と称され得る。ｍｄＲＮＡ分子の例は、米国仮特許出願第６０／９３４，９３０号および第６０／９７３，３９８号において見出され得る。
ｄｓＲＮＡまたは大きなｄｓＲＮＡは、置換もしくは修飾を含み得、ここで該置換もしくは修飾は、ホスフェート骨格結合、糖、塩基、もしくはヌクレオシドにおいて存在し得る。かかるヌクレオシド置換は、天然の標準でないヌクレオシド（例えば、５−メチルウリジンもしくは５−メチルシチジンもしくは２−チオリボチミジン）を含み得、かかる骨格、糖、もしくはヌクレオシド修飾は、メチル、アルコキシアルキル、ハロゲン、窒素もしくは硫黄等のアルキルもしくはヘテロ原子置換または付加、または当該分野において公知の他の修飾を含み得る。
加えて、本明細書で使用される、「ＲＮＡｉ」という用語は、転写後遺伝子発現抑制、翻訳阻害、もしくはエピジェネティクス等の配列特異的ＲＮＡ干渉を記載するために使用される他の用語と等価であることを意味する。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、転写後レベルもしくは転写前レベルまたはこれらの任意の組み合わせにおいて、遺伝子をエピジェネティクス的に（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ）発現抑制するために使用され得る。
幾つかの態様において、本発明は、１つ以上の送達成分と共に、１つ以上の遺伝子もしくは標的転写物に対して標的化される１つ以上のＲＮＡｉ誘導薬剤を含有する組成物を提供する。送達成分の例には、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、脂質、ペプチド、ポリマー、ポリマー脂質、およびこれらの結合体が含まれる。
本開示の組成物および製剤は、無傷の哺乳動物対象において、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｄＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはＲＮＡｉ誘導ベクター等のＲＮＡｉ誘導実体の細胞への送達のために使用され得、また、培養物中の細胞へのこれら薬剤の送達のためにも使用され得る。
本開示はまた、哺乳動物の身体内の細胞、器官、および組織への、１つ以上のＲＮＡ誘導薬剤もしくは実体の送達のための方法も提供する。幾つかの点において、ＲＮＡｉ誘導実体を含む組成物は、身体内に輸送されるべき種々の経路によって導入され得、標的転写物の発現を調節する１つ以上の器官もしくは組織内の細胞によって取り込まれ得る。
一般に、本開示は、種々の異常なプロセスによって特徴付けられる疾患もしくは障害を予防および治療するために有用な治療薬であるＲＮＡ誘導薬剤を包含する。例えば、哺乳動物に感染するウイルスは、宿主細胞の細胞機序を支配することによって、複製することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）を参照のこと。故に、ｄｓＲＮＡは、ウイルス生成もしくは複製を制御するウイルス経路を妨害するために有用である。
本開示は、標的ウイルス株に対して広範囲の効力を有する１つ以上の治療的ＲＮＡ誘導薬剤を使用することによって、対象におけるウイルス感染を処置もしくは予防するための方法を含む。本発明のＲＮＡ誘導薬剤は、公知の変異株もしくはウイルスの変異体におけるウイルス遺伝子の配列に標的化され得、これら変異体の標的化されたウイルス遺伝子の配列特異的な遺伝子発現抑制を示し得る。例えば、ＲＮＡｉ誘導薬剤は、季節性インフルエンザウイルス株、およびインフルエンザの変異株に対して標的化され得、これらに対する効力を示し得る。
本開示の組成物および製剤は、体外で、種々の細胞へ薬物薬剤もしくは生物学的に活性な薬剤を送達するために使用され得る。体外送達が包含される細胞の例には、とりわけ、Ａ５４９等の上皮細胞、ＨｅＬａ等の不死化細胞株、ＨｅｐＧ２等の肝癌細胞、９Ｌ／ＬａｃＺ等のラット神経膠肉腫細胞、ＴＨＰ−１等のヒト単球、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、種々の線維芽細胞株、および種々の血清の存在もしくは非存在下で初代培養細胞が含まれる。
本開示の組成物および製剤は、生体内で、種々の細胞、組織、もしくは器官に薬物薬剤もしくは生物学的に活性な薬剤を送達するために使用され得る。生体内で薬剤を送達するための様式としては、局所経路、経腸経路、および非経口経路が含まれる。薬剤を生体内で送達するための様式の例には、粒子もしくは小滴の吸入、経鼻液滴もしくは経鼻−咽頭（ｐｈａｒｎｇｙｌ）液滴、粒子、または懸濁液の送達、経皮的および経粘膜経路、ならびに筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、心臓内、鞘内、骨内、腹腔内、および硬膜外経路による注射もしくは注入が含まれる。
幾つかの実施形態において、薬剤は、哺乳動物対象に由来する細胞、組織、もしくは器官への直接的な暴露によって、生体外で投与され得る。
本開示の組成物もしくは製剤を使用して送達されるべき薬物薬剤または生物学的に活性な薬剤は、例えば、純粋な形態、結晶形態、固体形態、ナノ粒子、濃縮形態、複合体化形態、もしくは結合体化形態を含む任意の形態において見出され得る。
本発明はまた、哺乳動物の身体内の器官および組織への１つ以上のＲＮＡｉ誘導実体の送達のための方法も提供する。幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉ誘導実体、１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、および１つ以上の脂質成分を含有する組成物は、種々の経路によって導入されて、身体内に輸送され、１つ以上の器官もしくは組織内の細胞によって取り込まれ、ここで標的転写物の発現が調節される。
本開示は、核酸および遺伝子発現抑制ＲＮＡの治療的送達に有用な種々のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物または脂質を含む薬学的に許容される核酸組成物を提供する。特に、本発明は、標的核酸配列の翻訳または遺伝子の発現をを低下させるか、下方制御するか、または発現抑制するための、ｄｓＲＮＡｓの体外および生体内での送達のための組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法は、哺乳動物において、疾患の予防および／または治療のために使用され得る。本発明の例示的方法において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ等のリボ核酸分子を、細胞または哺乳動物等の対象に投与され得る組成物を製剤化するために、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物と接触させる。幾つかの実施形態において、本発明は、核酸含有組成物と、細胞とを接触させることによって、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを細胞内に送達するための方法を提供する。
例示的な実施形態において、本発明は、核酸分子の細胞内送達を増強する組成物を形成するために、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、およびポリマー脂質と混合または複合体化されて、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、もしくは短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等の核酸分子を含有する組成物を含む。幾つかの実施形態において、本発明の送達組成物は、ｄｓＲＮＡ、および１つ、２つ、またはそれ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を含有し得、これは、カチオン性または非カチオン性であり得る。幾つかの変形において、送達組成物は、ｄｓＲＮＡ、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、および１つ以上のポリマー脂質を含有し得る。幾つかの実施形態において、送達組成物は、ｄｓＲＮＡ、１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、１つ以上の脂質、および１つ以上のポリマー脂質を含有し得る。本発明の組成物は、干渉ＲＮＡ薬剤としてｄｓＲＮＡを組み込み得る安定な粒子を形成することができる。本発明の組成物および製剤は、さらなる送達増強成分または賦形剤を含み得る。
幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、約５ｎｍ〜約４００ｎｍの直径を有する安定なＲＮＡ含有粒子を含有する。幾つかの実施形態において、該粒子は、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍの均一な直径を有し得る。幾つかの実施形態において、該粒子は、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍの均一な直径を有し得る。
本発明の例示的な組成物において、二本鎖ＲＮＡは、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物と混合もしくは複合体化されて、標的細胞と裸のｄｓＲＮＡとを接触させることに比較して、該ｄｓＲＮＡの細胞内送達を増強する組成物を形成し得る。
幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を含有し得、これは、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および脂質、ならびに、もしあれば、任意のポリマー成分を含むが、該ＲＮＡ成分は含まない、送達増強成分の総量の約０．５％〜約７０％（モル％）である。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、約１０％〜約５５％の１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を含有し得る。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、約１５％〜約３５％の１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を含有し得る。
ある実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上の非カチオン性脂質を含有し得、ここで該非カチオン性脂質は、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および脂質、ならびに、もしあれば、任意のポリマー成分を含むが、該ＲＮＡ成分は含まない、送達増強成分の総量の約２％〜約９５％（モル％）である。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、約２０％〜約７５％、または約４５％〜約７５％、または約４５％〜約５５％の１つ以上の非カチオン性脂質を含有し得る。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、約１０％〜約５０％の１つ以上の非カチオン性脂質を含有し得る。
幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上のポリマー脂質を含有し得、ここで該ポリマー脂質は、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および脂質、ならびに、もしあれば、任意のポリマー成分を含むが、該ＲＮＡ成分は含まない、送達増強成分の総量の約０．２％〜約２０％（モル％）である。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、約０．５％〜約１０％の１つ以上のポリマー脂質を含有し得る。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、該組成物の約１％〜約５％の１つ以上のポリマー脂質を含有し得る。
核酸治療薬の組成物および使用
幾つかの実施形態において、本発明は、哺乳動物対象において、疾患もしくは障害を治療する方法を提供する。干渉ＲＮＡ、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、非カチオン性脂質、ポリマー脂質、および１つ以上の送達増強成分または賦形剤を含有する本発明の治療上有効な量の組成物は、該組成物によって減少され得るか、低下され得るか、下方制御され得るか、または発現抑制され得る遺伝子の発現または過剰発現と関連する疾患または障害を有する対象に、投与され得る。
本発明は、該対象に治療上有効な量の組成物を投与することによって、呼吸窮迫、喘息、嚢胞性線維症、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、または肺気腫等の肺の疾患を治療するための方法を包含する。
本発明は、癌、膀胱癌、肝臓癌、肝疾患、高コレステロール血症、炎症性疾患、代謝性疾患、炎症、関節炎、リウマチ性関節炎、脳炎、骨折、心臓疾患、ウイルス性疾患、肝炎、およびインフルエンザを含む疾患を治療するための方法を包含する。
リポソームを作製するための方法は、例えば、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８４）、およびＭ．Ｊ．Ｏｓｔｒｏ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ １９８７）に与えられる。
核酸成分、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、および他の成分は、最初に、細胞培養培地等の好適な培地中で一緒に混合され得、その後、１つ以上の脂質または化合物が、該混合物に添加され得る。代替として、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、最初に、細胞培養培地等の好適な培地中で一緒に混合され得、その後、核酸成分が、添加され得る。
本発明のある実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、または１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物と非アミノ酸非カチオン性脂質との組み合わせと混合される。
干渉ＲＮＡ薬剤はまた、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物またはポリマー脂質と複合体化され得るか、または結合体化され得、１つ以上の非カチオン性脂質、または１つ以上の非カチオン性とカチオン性脂質との組み合わせと混合され得る。
干渉ＲＮＡ薬剤およびＤＩＬＡ２アミノ酸化合物は、最初に、一緒に混合され得、続いて、１つ以上の非カチオン性脂質が添加されるか、または非カチオン性脂質とカチオン性脂質との組み合わせが、細胞培養培地等の好適な培地中で添加され得る。代替として、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および脂質成分は、最初に、混合され得、続いて、好適な培地中でＲＮＡ薬剤が添加され得る。
幾つかの実施形態において、本開示は、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および分散剤と混合または複合体化されて、薬物または活性薬剤の細胞内送達を提供する組成物を形成する薬物または活性薬剤を含有するミセル分散組成物を含む。
ある実施形態において、本開示の分散組成物は、１つ以上の薬物または活性薬剤、１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、および１つ以上の分散剤を含有し得る。幾つかの変形において、送達組成物は、薬物または活性薬剤、分散剤、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、および任意のポリマー脂質を含有し得る。本開示の分散組成物は、該薬物または活性薬剤を組み込み得る安定な粒子を形成することができる。
幾つかの態様において、本開示の分散組成物は、約５ｎｍ〜約４００ｎｍの直径を有する安定な核酸分散粒子を含有し得る。幾つかの実施形態において、該粒子は、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍの均一な直径を有し得る。幾つかの実施形態において、該粒子は、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍの均一な直径を有し得る。
ミセル分散物は、ＲＮＡｉ治療薬を含む薬物または活性薬剤を製剤化し、そのバイオアベイラビリティーを改善するために使用することができる。ミセル分散物は、疎水性油様コアを有する分散液滴またはナノ粒子を提供することができる。分散ナノ粒子は、連続水相に懸濁され得る。分散構造は、活性薬剤を送達するためにリポソーム構造を使用することに本来伴うの幾つかの欠点を回避することができ、親油性コアのため、送達における利点を提供することができる。
本開示は、薬物または医薬のために、およびＲＮＡ薬剤の送達および投与のために、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物または脂質および分散剤を含有する様々なミセル分散組成物を提供する。
分散剤の例には、ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌａｔｅｄ）カプリルグリセリド等のポリオキシグリセリド、エトキシジグリコール、ｐｅｇ化脂肪グリセリド、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、およびこれらの混合物を含む合成化合物が含まれる。分散剤の例には、ＬＡＢＲＡＦＩＬ、ＬＡＢＲＡＳＯＬ、ＡＲＬＡＴＯＮＥ、ＴＲＡＮＳＣＵＴＯＬ、およびこれらの混合物が含まれる。分散剤の例には、アルキルホスホ−Ｎ−メチルエタノールアミンおよびアルコキシサルコシン等の合成化合物が含まれる。分散剤の例には、ＦＯＳ−ＭＥＡおよびＣＲＯＤＡＳＩＮＩＣが含まれる。
幾つかの実施形態において、本開示の送達組成物は、薬物または活性薬剤、１つ以上の油、１つ以上のＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、ならびに乳化剤および安定化脂質（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ ｌｉｐｉｄ）を含有し得る。幾つかの変形において、送達組成物は、薬物または活性薬剤、油、脂質乳化剤、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、非カチオン性脂質、およびポリマー脂質を含有し得る。
本開示の組成物は、薬物または活性薬剤を組み込み得る安定な粒子を形成することができる。幾つかの態様において、本開示の組成物は、約５ｎｍ〜約４００ｎｍの直径を有する、安定な薬物または活性薬剤のエマルジョン粒子を含有する。幾つかの実施形態において、該粒子は、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍの均一な直径を有し得る。幾つかの実施形態において、該粒子は、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍの均一な直径を有し得る。
幾つかの実施形態において、薬物または活性薬剤は、油、乳化剤、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物、およびポリマー安定化脂質と混合または複合体化されて、該薬物または活性薬剤の細胞内送達を増強する組成物を形成し得る。
水中油型エマルジョンは、ＲＮＡｉ治療薬を含む薬物または活性薬剤を製剤化し、そのバイオアベイラビリティーを改善するために使用することができる。
水中油型エマルジョンは、疎水性油コアを囲んでいるＤＩＬＡ２アミノ酸化合物または脂質層を有するエマルジョン液滴またはナノ粒子を提供することができる。エマルジョン液滴またはナノ粒子は、連続水相に懸濁され得る。エマルジョン構造は、活性薬剤を送達するためにリポソーム構造を使用することに本来伴うの幾つかの欠点を回避することができ、親油性コアのため、送達における利点を提供することができる。
油、乳化剤、ならびにＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および脂質成分と干渉ＲＮＡ薬剤との新規な組成物および使用を含む様々な新規なエマルジョン組成物が、本開示において提供される。
油の例には、合成油、プロピレングリコールの脂肪酸エステル、エチレングリコールのエーテル、グリセリル油、コレステリル油、植物性油、堅果油、精油、鉱油、トコフェロールおよびビタミンＥ等の脂溶性化合物、およびこれらの混合物が含まれる。油の例には、ＣＡＰＲＹＯＬ９０（プロピレングリコールモノエステル）、ＣＡＰＲＹＯＬ ＰＧＭＣ（プロピレングリコールモノエステル）、ＬＡＢＲＡＦＡＣ ＰＣ（プロピレングリコールモノエステル）、ＬＡＢＲＡＦＡＣ ＰＧ（プロピレングリコールジエステル）、ＬＡＵＲＯＧＬＹＣＯＬ９０（プロピレングリコールモノエステル）、ＬＡＵＲＯＧＬＹＣＯＬ ＦＣＣ（プロピレングリコールモノエステル）、ＰＬＵＲＯＬ ＯＬＥＩＱＵＥ ＣＣ４９７（プロピレングリコールモノエステル）、ＬＡＢＲＡＦＡＣ ＬＩＰＯＰＨＩＬＥ ＷＬ１３４９（トリグリセリド）、ＰＥＣＥＯＬ（グリセリルモノエステル）、ＭＡＩＳＩＮＥ３５−１（グリセリルモノエステル）、およびこれらの混合物等の合成油が含まれる。
ＲＮＡ治療薬のための組成物および方法
本発明は、ＲＮＡ干渉等による調節性ＲＮＡを用いて、遺伝子発現を調節するための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、リボ核酸薬剤を、ＲＮＡｉの応答を生じ得る細胞に送達することができる。本発明にとって有用な核酸薬剤の例には、二本鎖核酸、修飾または分解耐性核酸、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ＲＮＡアンタゴニスト、一本鎖核酸、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、アンチセンス核酸、およびリボザイムが含まれる。本明細書で使用される、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡという用語は、それぞれ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡの前駆体を含む。例えば、ｓｉＲＮＡという用語は、ダイサー酵素の基質として好適な、ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡを含む。
本発明にとって有用なリボ核酸薬剤は、種々の遺伝子に標的化され得る。標的として好適なヒト遺伝子の例には、とりわけ、ＴＮＦ、ＦＬＴ１、ＶＥＧＦファミリー、ＥＲＢＢファミリー、ＰＤＧＦＲファミリー、ＢＣＲ−ＡＢＬ、およびＭＡＰＫファミリーが含まれる。標的およびそれに対する核酸配列として好適なヒト遺伝子の例には、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３３３、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３３９、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３４０、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３４１、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３５０、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３５３、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３５６、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３５７、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３６０、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３６２、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３６５、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３６６、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３６９、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３７０、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３７１、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３７２、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３７３、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３７４、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３７５、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３７６、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３７７、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３７８、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３８０、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３８１、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３８２、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３８３、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３８５、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５３８６、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５０５、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５１１、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５１５、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５１６、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５１９、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５２４、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５２６、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５２７、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５３２、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５３３、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５４２、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５４８、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５５０、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５５１、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５５４、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５５６、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５６０、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５６３、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５９７、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５５９９、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６０１、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６０３、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６０４、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６０６、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６０８、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６１１、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６１２、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６１５、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６１８、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６２２、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６２５、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６２７、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６３１、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６３５、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６４４、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６４９、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６５１、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６６２、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６７２、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６７６、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６７８、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６９５、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６９７、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５６９８、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５７０１、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５７０４、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５７０８、ＰＣＴ／ＵＳ０８／５５７０９、およびＰＣＴ／ＵＳ０８／５５７１１に開示されているものが含まれる。
送達されるべき本開示のＲＮＡは、ウイルス遺伝子の領域に相補的な配列を有し得る。例えば、本発明の幾つかの組成物および方法は、インフルエンザウイルスのウイルスゲノムの発現を制御するために有用である。幾つかの実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉によるインフルエンザの発現および感染活性を調節するための組成物および方法を提供する。インフルエンザの発現および／または活動は、例えば、インフルエンザのＲＮＡポリメラーゼサブユニットの領域に相補的な配列を有する短い干渉ＲＮＡ分子を細胞に送達することによって調節され得る。インフルエンザウイルスに標的化されるＲＮＡの例は、米国特許公開第２００７０２１３２９３ Ａ１号に与えられる。
幾つかの実施形態において、本発明は、対象に、短い干渉オリゴヌクレオチド分子、またはその前駆体等の有効量のＲＮＡｉ誘導化合物を含む組成物を投与することによって、対象における標的転写物の発現を阻害するための組成物および方法を提供する。ＲＮＡｉは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的化し、翻訳を減少させるために、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用する。本発明において使用される、ｓｉＲＮＡは、例えば、ｓｉＲＮＡに処理される長いｄｓＲＮＡ等のダイサープロセシングのための前駆体であり得る。本発明は、標的転写物の発現または該標的転写物によってコードされるペプチドまたはタンパク質の活性と関連する疾患または状態を治療または予防する方法を提供する。
ＲＮＡｉに基づく治療戦略は、ウイルスまたは微生物の増殖または機能を停止することによって、および疾患の経路における内因性遺伝子産物の機能を停止することによって、広範囲の疾患を治療するために使用することができる。
幾つかの実施形態において、本発明は、短い干渉オリゴヌクレオチド分子、およびその前駆体等のＲＮＡｉ誘導実体の送達のための新規の組成物および方法を提供する。特に、本発明は、対象の細胞、組織、および／または器官の１つ以上の転写物に標的化されるＲＮＡｉ誘導実体を含有する組成物を提供する。
ｓｉＲＮＡは、相補性約１９ヌクレオチド長の領域を有する２つのＲＮＡ鎖であり得る。ｓｉＲＮＡは、任意に、１つまたは２つの一本鎖オーバーハングまたはループを含む。
ｓｈＲＮＡは、自己相補性の領域を有する単一のＲＮＡ鎖であり得る。該単一のＲＮＡ鎖は、ステムおよびループを有し、必要に応じて、該ＲＮＡの５’部分および／または３’部分において１つ以上の不対部分を有するヘアピン構造を形成し得る。
活性治療薬剤は、生体内でのヌクレアーゼ分解に対して改善された耐性、および／またはＲＮＡｉ活性を維持する改善された細胞取り込みを有する、化学的に修飾されたＲＮＡであり得る。
本発明のｓｉＲＮＡ薬剤は、標的遺伝子の領域に相補的な配列を有し得る。本発明のｓｉＲＮＡは、２９〜５０塩基対、例えば、標的遺伝子の領域に相補的な配列を有するｄｓＲＮＡを有し得る。代替として、二本鎖核酸は、ｄｓＤＮＡであり得る。
ある実施形態において、活性薬剤は、遺伝子産物の発現を調節させ得る短い干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。
発現が、選択される疾患状態と関連する原因因子または寄与因子として異常に増大することが公知である多数の遺伝子のうちのいずれかを含む、対象において、特定の疾患状態と関連する１つ以上の異なる遺伝子の発現を標的とする、類似の方法および組成物が、提供される。
本発明のＲＮＡｉ誘導化合物は、疾患状態のための他の公知の処置と共に投与され得る。
幾つかの実施形態において、本発明は、送達増強化合物と混合または複合体化されるか、または結合体化される、短い干渉核酸、短い干渉ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、または短いヘアピンＲＮＡ等の小さな核酸分子を含有する組成物を特徴とする。
本明細書で使用される、「調節性ＲＮＡ」、「短い干渉核酸」、「ｓｉＲＮＡ」、「短い干渉ＲＮＡ」、「短い干渉オリゴヌクレオチド分子」、および「化学的に修飾された短い干渉核酸分子」という用語は、配列特異的様式においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または遺伝子発現抑制を媒介することによって、遺伝子発現、または例えば、ウイルス複製を制御、阻害または下方制御することができる任意の核酸分子を指す。調節性ＲＮＡには、一本鎖ＲＮＡアンタゴニストが含まれる。
幾つかの実施形態において、該ｓｉＲＮＡは、自己相補性のセンス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり、ここでアンチセンス領域は、発現、またはその一部を下方制御するための標的リボ核酸分子におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的リボ核酸配列またはその一部に対応する（すなわち、標的リボ核酸配列またはその一部に配列において実質的に同一である）ヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用される、「ｓｉＲＮＡ」とは、比較的短い二本鎖核酸である小さい干渉リボ核酸、または必要に応じてそのより長い前駆体を意味する。本発明内の有用なｓｉＲＮＡの長さは、幾つかの実施形態において、約２０〜５０ｂｐの長さであることが好ましい。しかしながら、ｓｉＲＮＡを含む有用なｓｉＲＮＡの長さに特定の限定はない。例えば、ｓｉＲＮＡは、最初に、ｓｉＲＮＡの最終的または処理された形態とは実質的に異なる前駆体形態にある細胞へと示され得、これは、送達する際に、または送達後、標的細胞への遺伝子発現抑制活性が存在し、発揮し得る。ｓｉＲＮＡの前駆体形態は、例えば、送達時にまたは送達した後、処理、分解、修飾、または切断されて、遺伝子発現抑制を媒介するために細胞内で活性であるｓｉＲＮＡを生じる前駆体配列要素を含み得る。幾つかの実施形態において、有用なｓｉＲＮＡは、該標的細胞内で活性な処理されたｓｉＲＮＡを生じる、例えば、約１００〜２００塩基対、または５０〜１００塩基対、または約５０塩基対未満の前駆体長を有する。他の実施形態において、有用なｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ前駆体は、約１０〜４９ｂｐ、または１５〜３５ｂｐ、または約２１〜３０ｂｐの長さである。
本発明のある実施形態において、ポリヌクレオチド送達増強ポリペプチドは、ｓｉＲＮＡの大きな核酸前駆体を含む核酸分子の送達を促進するために使用され得る。例えば、本明細書中の方法および組成物は、所望のｓｉＲＮＡに「前駆体」を示すより大きな核酸の送達を増強するために使用され得、ここで前駆体アミノ酸は、切断され得るか、またはそうでなければ、標的細胞への送達前、送達の間、または送達後、処理されて、標的細胞内での遺伝子発現を調節するために活性なｓｉＲＮＡを形成し得る。
例えば、ｄｓＲＮＡ前駆体ポリヌクレオチドは、２つ以上のループ構造、ならびに自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含むステムを有する環状の一本鎖ポリヌクレオチドとして選択され得、ここでアンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部分におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を有し、ここで環状ポリヌクレオチドは、生体内または体外のいずれかで処理されて、ＲＮＡｉを誘導することが可能である活性ｄｓＲＮＡ分子を生成し得る。
本発明のｓｉＲＮＡ分子、特に、非前駆体形態は、３０塩基対未満、または約１７〜１９ｂｐ、または１９〜２１ｂｐ、または２１〜２３ｂｐであり得る。
ｓｉＲＮＡは、哺乳動物系において選択的遺伝子発現抑制を媒介することができる。短いループおよびステム中に１９〜２７塩基対を有するヘアピンＲＮＡはまた、選択的に、二本鎖ステム中の配列に相同的な遺伝子の発現を抑制する。哺乳動物細胞は、短いヘアピンＲＮＡをｓｉＲＮＡに変換して、選択的遺伝子発現抑制を媒介することができる。
ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域内で起こる。２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖は、典型的には、２つのヌクレオチド３’オーバーハングを含む場合に最も活性である。
２−ヌクレオチド３’オーバーハングを有する２１量体ｓｉＲＮＡ二重鎖の３’オーバーハングセグメントを、デオキシリボヌクレオチドで置き換えることは、ＲＮＡｉ活性に悪影響を与えない可能性がある。ｓｉＲＮＡの各鎖上の最大４ヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置き換えることは、許容され得る。
代替として、ｓｉＲＮＡは、単一または複数のｓｉＲＮＡをコードし、標的細胞内のそれらの発現を指向するポルヌクレオチドベクターによって発現される単一または複数の転写生成物として送達され得る。これらの実施形態において、標的細胞内で発現されるべきｓｉＲＮＡの最終転写産物の二本鎖部分は、例えば、１５〜４９ｂｐ、１５〜３５ｂｐ、または約２１〜３０ｂｐの長さであり得る。
本発明の幾つかの実施形態において、２つの鎖が対形成されるｓｉＲＮＡの二本鎖領域は、突出またはミスマッチ部分、またはその両方を含み得る。２つの鎖が対形成されるｓｉＲＮＡの二本鎖部分は、完全に対形成されたヌクレオチドセグメントに限定されず、例えば、ミスマッチ（対応するヌクレオチドが相補的でない）、突出（一方の鎖で対応する相補的ヌクレオチドを欠いている）、またはオーバーハングに起因して、不対部分を含み得る。不対部分は、これらがｓｉＲＮＡ形成を干渉しない程度まで含まれ得る。幾つかの実施形態において、「突出（ｂｕｌｇｅ）」は、１〜２個の不対ヌクレオチドを含み得、２つの鎖が対形成するｓｉＲＮＡの二本鎖領域が、約１〜７個、または約１〜５個の突出を含み得る。加えて、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域に含まれる「ミスマッチ」部分は、約１〜７、または約１〜５の数で存在し得る。ほとんどの場合、ミスマッチの場合には、ヌクレオチドのうちの１つは、グアニンであり、他方はウラシルである。かかるミスマッチ形成は、例えば、センスＲＮＡをコードする対応するＤＮＡ中のＣからＴへの変異、ＧからＡへの変異、またはこれらの混合物に起因し得るが、他の原因もまた、企図される。
本発明のｓｉＲＮＡの末端構造は、ｓｉＲＮＡが、標的遺伝子の発現を抑制するためにその活性を保持する限りにおいて、平滑または粘着性（オーバーハング）のいずれかであり得る。粘着性（オーバーハング）末端構造は、３’オーバーハングに制限されず、遺伝子発現抑制を誘導するための活性を保持する限りにおいて、５’オーバーハング構造を含む。加えて、オーバーハングヌクレオチドの数は、２ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドに制限されず、遺伝子発現抑制を誘導するための活性を保持する限りにおいて、任意のヌクレオチド数であり得る。例えば、オーバーハングは、１〜約８ヌクレオチド、または２〜４ヌクレオチドを含み得る。
オーバーハング末端構造を有するｓｉＲＮＡの長さは、対形成された二重鎖部分および各末端の任意のオーバーハング部分に関して表され得る。例えば、２−ｂｐ ３’アンチセンスオーバーハングを有する２５／２７量体ｓｉＲＮＡ二重鎖は、２５量体センス鎖および２７量体アンチセンス鎖を有し、ここで対形成された部分は、２５ｂｐの長さを有する。
任意のオーバーハング配列は、標的遺伝子に対して低い特異性を有し得、上記標的遺伝子配列に対して相補的（アンチセンス）でなくてもよいし、同一（センス）でなくてもよい。ｓｉＲＮＡが遺伝子発現抑制についての活性を保持している限りにおいて、ｓｉＲＮＡは、オーバーハング部分において、低分子量構造、例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または人工ＲＮＡ分子等の天然のＲＮＡ分子を含み得る。
ｓｉＲＮＡの末端構造は、二本鎖核酸のうちの一方側の末端がリンカー核酸、例えば、リンカーＲＮＡによって接続されているステム−ループ構造を有し得る。二本鎖領域（ステム部分）の長さは、例えば、１５〜４９ｂｐ、または１５〜３５ｂｐ、または約２１〜３０ｂｐの長さであり得る。代替として、標的細胞内で発現されるべきｓｉＲＮＡの最終転写産物である二本鎖領域の長さは、例えば、約１５〜４９ｂｐ、または１５〜３５ｂｐ、または約２１〜３０ｂｐの長さであり得る。
ｓｉＲＮＡは、標的核酸分子内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはその一部分を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み得、ここで一本鎖ポリヌクレオチドは、５’−ホスフェート（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１１０：５６３−５７４，２００２、およびＳｃｈｗａｒｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ １０：５３７−５６８，２００２を参照のこと）、または５’，３’−ジホスフェート等の末端ホスフェート基を含み得る。
本明細書で使用される、ｓｉＲＮＡという用語は、天然に存在するＲＮＡまたはＤＮＡのみを含む分子に限定されず、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドも包含する。幾つかの実施形態において、本発明の短い干渉核酸分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いている。短い干渉核酸は、ＲＮＡｉを媒介するための２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を要せず、よって、本発明の短い干渉核酸分子は、任意に、いかなるリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）をも含まない。しかしながら、ＲＮＡｉを補助するためにｓｉＲＮＡ分子内にリボヌクレオチドの存在を要しないｓｉＲＮＡ分子は、２’−ＯＨ基を有する１つ以上のヌクレオチドを含む結合されたリンカーまたは他の結合または会合された基、部分、または鎖を有し得る。ｓｉＲＮＡ分子は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％のヌクレオチド位置においてリボヌクレオチドを含み得る。
本明細書で使用される、ｓｉＲＮＡという用語は、例えば、とりわけ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子、マイクロＲＮＡ分子、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、短い干渉オリゴヌクレオチド分子、短い干渉核酸分子、短い干渉修飾オリゴヌクレオチド分子、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子、および転写後遺伝子発現抑制ＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）分子等の配列特異的ＲＮＡｉを媒介することが可能な核酸分子を包含する。
幾つかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、別個のセンス配列または領域およびアンチセンス配列または領域を含み、ここでセンス領域およびアンチセンス領域は、ヌクレオチドリンカー分子または非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合されるか、またはイオン性共有結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および／または積み重ね（ｓｔａｃｋｉｎｇ）相互作用によって、非共有結合的に連結される。
「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子ｍＲＮＡに結合することによってＲＮＡｉを誘導し得る、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡ鎖である。
「センスＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡ鎖であり、その相補的アンチセンスＲＮＡにアニールして、ｓｉＲＮＡを形成する。
本明細書で使用される、「ＲＮＡｉ構築物」または「ＲＮＡｉ前駆体」という用語は、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ等のＲＮＡｉ誘導化合物、および生体内で切断されて、ｓｉＲＮＡを形成し得る他のＲＮＡ種を指す。本明細書中のＲＮＡｉ前駆体はまた、細胞内でｄｓＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡを形成する転写物および／または生体内でｓｉＲＮＡを生じ得る転写物を生じ得る発現ベクター（ＲＮＡｉ発現ベクターとも称される）を含む。
ｓｉハイブリッド分子は、ｓｉＲＮＡに類似の機能を有する二本鎖核酸である。二本鎖ＲＮＡ分子の代わりに、ｓｉハイブリッドは、ＲＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖からなる。好ましくは、該ＲＮＡ鎖は、標的ｍＲＮＡに結合するアンチセンス鎖である。ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖のハイブリダイゼーションによって作製されたｓｉハイブリッドは、ハイブリダイズした相補的部分および好ましくは、少なくとも１つの３’オーバーハング末端を有する。
本発明において使用するためのｓｉＲＮＡは、２つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立てられ得、ここで一方の鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、自己相補性である（すなわち、各鎖は、他方の鎖におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；例えば、アンチセンス鎖およびセンス鎖が二重鎖または二本鎖構造（例えば、二本鎖領域が、約１９塩基対である）を形成する）。該アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部分におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を含み得る。代替として、ｓｉＲＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ得、ここでｓｉＲＮＡの自己相補性のセンス領域およびアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結される。
幾つかの実施形態において、細胞内送達のためのｓｉＲＮＡは、自己相補性のセンス領域およびアンチセンス領域を有する二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであり得、ここでアンチセンス領域は、別個の標的核酸分子またはその一部分におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を含む。
ｓｉＲＮＡにおいてなされ得る化学的修飾の例には、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、ならびに末端グリセリルおよび／または逆方向（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）デオキシ脱塩基残基の組み込みが含まれる。
ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域は、該アンチセンス領域の３’末端においてホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み得る。該アンチセンス領域は、該アンチセンス領域の５’末端において約１〜約５個のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み得る。ｓｉＲＮＡ分子の３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、核酸の糖、塩基、または骨格において化学的に修飾されている、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含み得る。３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上のユニバーサル塩基リボヌクレオチドを含み得る。３’末端ヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上の非環式ヌクレオチドを含み得る。
例えば、化学的に修飾されているｓｉＲＮＡは、１つの鎖において１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有し得るか、または各鎖において１〜８個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有し得る。ホスホロチオエートヌクレオチド間連結は、ｓｉＲＮＡ二重鎖の一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の鎖に、存在し得る。
ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の、３’末端、５’末端、または３’末端および５’末端の両方において１個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み得る。例えば、例示的なｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の鎖の５’末端において１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上の連続するホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み得る。
ある実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の鎖において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
幾つかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の鎖において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
ｓｉＲＮＡ分子は、環状核酸分子を含み得、ここでｓｉＲＮＡは、約３８〜約７０ヌクレオチド、例えば、約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ヌクレオチド長であり、約１８〜約２３塩基対、例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、または２３を有し、ここで環状オリゴヌクレオチドは、約１９塩基対を有するダンベル形構造および２つのループを形成する。
環状ｓｉＲＮＡ分子は、２つのループモチーフを含み得、ここでｓｉＲＮＡ分子の一方または両方のループ部分は生分解性である。例えば、環状ｓｉＲＮＡ分子のループ部分は、約２ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハング等の３’末端オーバーハングを有する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生じるように、生体内で形質転換され得る。
ｓｉＲＮＡ分子において、修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖、センス鎖、またはその両方に存在し得る。例えば、修飾ヌクレオチドは、ノーザンコンフォメーション（例えば、ノーザン疑回転サイクル（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｐｓｅｕｄｏｒｏｔａｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅ）；例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ．，１９８４を参照のこと）を有し得る。ノーザンコンフォメーションを有するヌクレオチドの例には、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが含まれる。
化学的に修飾されているヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対して耐性であり得ると同時に、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持し得る。
二本鎖ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、センス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端および５’末端の両方において、逆方向デオキシ脱塩基部分等の末端キャップ部分を有し得る。
結合体の例には、Ｖａｒｇｅｅｓｅら、２００３年４月３０日出願の米国特許出願第１０／４２７，１６０号に記載の結合体およびリガンドが含まれ、これは、参照することにより、図面を含め、その全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の幾つかの実施形態において、結合体は、化学的に修飾されているｓｉＲＮＡ分子に、生分解性リンカーを介して共有結合され得る。例えば、結合体分子は、化学的に修飾されているｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の鎖のいずれかの３’末端において付着され得る。
ある実施形態において、結合体分子は、化学的に修飾されているｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の鎖のいずれかの５’末端において付着される。幾つかの実施形態において、結合体分子は、化学的に修飾されているｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の鎖のいずれかの３’末端および５’末端の両方、またはこれらの任意の組み合わせに付着される。
幾つかの実施形態において、結合体分子は、化学的に修飾されているｓｉＲＮＡ分子を細胞等の生物学的系への送達を促進する分子を含む。
幾つかの実施形態において、化学的に修飾されているｓｉＲＮＡ分子に付着された結合体分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、または細胞取り込みを媒介し得る細胞受容体のリガンドである。化学的に修飾されているｓｉＲＮＡ分子に付着され得る、本発明によって企図される特定の結合体分子の例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅら、米国特許公開第２００３０１３０１８６号および同第２００４０１１０２９６号に記載されている。
ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのセンス領域を、ｓｉＲＮＡのアンチセンス領域につなぐ、ヌクレオチドリンカー、非ヌクレオチドリンカー、または混合したヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを含み得る。幾つかの実施形態において、ヌクレオチドリンカーは、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長であり得る。幾つかの実施形態において、該ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーであり得る。本明細書で使用される、「アプタマー」または「核酸アプタマー」という用語は、標的分子に特異的に結合する核酸分子を包含し、ここで核酸分子は、その天然の状況において、標的分子によって認識される配列を含有する。代替として、アプタマーは、標的分子に結合する核酸分子であって、標的分子が核酸に天然には結合しないものであり得る。
例えば、アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合し、それによって、天然に存在するリガンドと、タンパク質との相互作用を妨げるために使用され得る。例えば、Ｇｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３，１９９５、Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：５，２０００、Ｓｕｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：１００，２０００、Ｋｕｓｓｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７，２０００、Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０，２０００、およびＪａｙａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１６２８，１９９９を参照のこと。
非ヌクレオチドリンカーは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、または他のポリマー化合物（例えば、２〜１００の間のエチレングリコール単位を有するもの等のポリエチレングリコール）であり得る。具体的な例には、Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６３５３，１９９０、およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３１１３，１９８７、Ｃｌｏａｄ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６３２４，１９９１、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：５１０９，１９９１、Ｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２５８５，１９９３、およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１７５１，１９９３、Ｄｕｒａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６３５３，１９９０、ＭｃＣｕｒｄｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １０：２８７，１９９１、Ｊａｓｃｈｋｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：３０１−３０４，１９９３、Ｏｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：９９１４，１９９１、Ａｒｎｏｌｄら、国際公開ＷＯ第８９／０２４３９号、Ｕｓｍａｎら、国際公開ＷＯ第９５／０６７３１号、Ｄｕｄｙｃｚら、国際公開ＷＯ第９５／１１９１０号、ならびにＦｅｒｅｎｔｚ ａｎｄ Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：４０００，１９９１によって記載されるものが含まれる。
「非ヌクレオチドリンカー」は、糖および／またはホスフェート置換のいずれかを含み、その残りの塩基がそれらの酵素活性を示すことを可能にする、１つ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖へ組み込まれ得る基もしくは化合物を指す。基もしくは化合物は、例えば、糖のＣ１位において、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルもしくはチミン等の一般に認識されるヌクレオチド塩基を含まない点において脱塩基性であり得る。
幾つかの実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、ホスフェート骨格修飾を有し得、これには、１つ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデートカルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、および／もしくはアルキルシリル置換を含む。オリゴヌクレオチド骨格修飾の例は、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｍａｎｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，ｐｐ．３３１−４１７，１９９５、およびＭｅｓｍａｅｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，ｐｐ．２４−３９，１９９４に与えられる。
化学的に修飾され得るｓｉＲＮＡ分子は、（ａ）該ｓｉＲＮＡ分子の２つの相補鎖の合成；および（ｂ）該２つの相補鎖を、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を得るのに好適な条件下で一緒にアニールすることによって合成され得る。幾つかの実施形態において、該ｓｉＲＮＡ分子の相補性部分の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成によって、または固相直列オリゴヌクレオチド合成によってである。
オリゴヌクレオチド（例えば、特定の修飾されたオリゴヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを欠いているオリゴヌクレオチドの一部）は、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１：３−１９，１９９２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ第９９／５４４５９号、Ｗｉｎｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：２６７７−２６８４，１９９５、Ｗｉｎｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９，１９９７、Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． ６１：３３−４５，１９９８、およびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号に記載されているように、当該分野において公知のプロトコルを使用して合成される。本発明の特定のｓｉＲＮＡ分子を含むＲＮＡの合成は、例えば、Ｕｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５，１９８７、Ｓｃａｒｉｎｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：５４３３，１９９０、およびＷｉｎｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７−２６８４，１９９５、Ｗｉｎｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９，１９９７に記載されるように、一般的手順に従う。
本明細書で使用される、「非対称ヘアピン」とは、アンチセンス領域、ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドを含み得るループ部分、およびセンス領域が該アンチセンス領域と塩基対形成して、ループを有する二重鎖を形成するに十分相補的なヌクレオチドを有する程度にまで、該アンチセンス領域より少ないヌクレオチドを含むセンス領域を含む直鎖状のｓｉＲＮＡ分子である。
本明細書で使用される、「非対称二重鎖」とは、センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの別個の鎖を有するｓｉＲＮＡ分子であって、ここで該センス領域は、該アンチセンス領域と塩基対形成して、二重鎖を形成するに十分相補的なヌクレオチドを有する程度にまで、該アンチセンス領域より少ないヌクレオチドを含むものである。
本明細書で使用される、「遺伝子発現を調節する」こととは、細胞に存在するｍＲＮＡレベルの、またはｍＲＮＡ翻訳の、または標的遺伝子によってコードされるタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの合成の、上方制御もしくは下方制御を含み得る、該標的遺伝子の発現を上方制御するか下方制御することである。
本明細書で使用される、「阻害する」、「下方制御する」、もしくは「発現を低下させる」という用語は、該遺伝子の発現、または１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または標的遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットのレベルもしくは活性が、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）の非存在下で認められるものより低く低下させることを意味する。
本明細書で使用される、「遺伝子発現抑制」とは、細胞内の遺伝子発現の部分的もしくは完全な阻害を指し、「遺伝子ノックダウン」とも称され得る。遺伝子発現抑制の程度は、当該分野において公知の方法によって決定され得、これらのうちの幾つかは、国際公開ＷＯ第９９／３２６１９号にまとめられている。
本明細書で使用される、「リボ核酸」および「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を指す。リボヌクレオチドは、β−Ｄ−リボ−フラノース部分の２’部分においてヒドロキシル基を有するヌクレオチドである。これらの用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ（例えば、部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生成ＲＮＡ、ならびに１個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、修飾、および／もしくは変化によって、天然に存在するＲＮＡとは異なる、修飾および変化させたＲＮＡ）が含まれる。ＲＮＡの変化は、例えば、ｓｉＲＮＡの末端に対してまたは内部に、例えば、ＲＮＡの１個以上のヌクレオチドにおいて、非ヌクレオチド物質を付加することを含み得る。
ＲＮＡ分子中のヌクレオチドには、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド等の標準的でないヌクレオチドが含まれる。これらの変化させられたＲＮＡは、アナログと称され得る。
「高度に保存された配列領域」とは、標的遺伝子中の１つ以上の領域のヌクレオチド配列が、一方の世代から他方の世代へ、または一方の生物学的系から他方の生物学的系へ顕著に変動していないことを意味する。
「センス領域」とは、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を有するｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて、ｓｉＲＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含み得る。
「アンチセンス領域」とは、標的核酸配列に対して相補性を有するｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域は、該ｓｉＲＮＡ分子のセンス領域に対して相補性を有する核酸配列を含み得る。
「標的核酸」とは、発現もしくは活性が調節されるべき任意の核酸配列を意味する。標的核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡであり得る。
「相補性」とは、伝統的なワトソン−クリックあるいは他の非伝統的な結合モードのいずれかによって、核酸が別の核酸配列と水素結合を形成し得ることを意味する。
本明細書で使用される、「生分解性リンカー」という用語は、一方の分子を別の分子に、例えば、生物学的活性分子をｓｉＲＮＡ分子もしくはｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖につなぐための生分解性リンカーとして設計される、核酸もしくは非核酸リンカー分子を指す。生分解性リンカーは、その安定性が特定の組織もしくは細胞型への送達等の特定の目的のために調節され得るように設計される。核酸ベースの生分解性リンカー分子の安定性は、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ならびに２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、および他の２’−修飾もしくは塩基修飾ヌクレオチド等の化学的に修飾されているヌクレオチドの組み合わせによって、種々に調節され得る。該生分解性核酸リンカー分子は、二量体、三量体、四量体、もしくはそれより長い核酸分子、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり得るか、またはリンベースの結合、例えば、ホスホルアミデートもしくはホスホジエステル結合を有する単一のヌクレオチドを含み得る。該生分解性核酸リンカー分子はまた、核酸骨格、核酸糖、もしくは核酸塩基の修飾も含み得る。
本明細書に記載される、２’−修飾ヌクレオチドとの関連において、「アミノ」とは、修飾され得るかもしくは非修飾であり得る２’−ＮＨ２もしくは２’−Ｏ−ＮＨ２を意味する。かかる修飾された基は、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、米国特許第５，６７２，６９５号およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃら、米国特許第６，２４８，８７８号に記載されている。
本発明において使用するために核酸分子を送達するための補助的もしくは補完的方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ２：１３９，１９９２，、“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，” ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６：１２９−１４０，１９９９、Ｈｏｆｌａｎｄ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３７：１６５−１９２，１９９９、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７５２：１８４−１９２，２０００に記載されている。Ｓｕｌｌｉｖａｎら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ第９４／０２５９５号は、酵素性核酸分子の送達のための一般的方法をさらに記載する。
核酸分子は、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、乳化剤、緩衝化剤、安定化剤、もしくは保存剤等の１つ以上の成分を含む製剤内で投与され得る。
本明細書で使用される、「担体」という用語は、薬学的に許容される固体もしくは液体希釈剤、溶媒、充填剤、または封入物質（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）を意味する。担体の例には、生理食塩水、生物学的および薬学的緩衝系、および生物学的に許容される媒体が含まれる。水含有液体担体は、薬学的に許容される添加剤（例えば、酸性化剤、アルキル化剤、抗微生物性保存剤、抗酸化剤、緩衝化剤、キレート化剤、錯化剤、可溶化剤、保湿剤、溶媒、懸濁剤および／もしくは増粘剤、張性剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ａｇｅｎｔ）、湿潤剤、または他の生物適合性の物質を含み得る。上記の分類の成分の例は、Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，１９９０，ｐｐ．１８５７−１８５９、ならびにＲａｙｍｏｎｄ Ｃ．Ｒｏｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，５ｔｈ ｅｄ．，２００６、および“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”２１ｓｔ ｅｄ．，２００６，ｅｄｉｔｏｒ Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙにおいて見出され得る。
保存剤の例には、フェノール、メチルパラベン、パラベン、ｍ−クレゾール、チオメルサール（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）、塩化ベンザルコニウム、およびこれらの混合物が含まれる。
界面活性剤の例には、オレイン酸、ソルビタントリオレエート、ポリソルベート、レシチン、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、種々の長鎖ジグリセリドおよびリン脂質、ならびにこれらの混合物が含まれる。
リン脂質の例には、ホスファチジルコリン、レシチン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルエタノールアミン、ならびにこれらの混合物が含まれる。
分散剤の例には、エチレンジアミン四酢酸が含まれる。
気体の例には、窒素、ヘリウム、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、ヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）、二酸化炭素、空気、およびこれらの混合物が含まれる。
ある実施形態において、ｓｉＲＮＡおよび／もしくはポリペプチドは、リポソーム中にカプセル化され得るか、またはリポソームに対して内部もしくは外部のいずれかに存在し得るか、またはリポソーム層内に存在し得るか、またはイオン導入法によって投与され得るか、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノ粒子、生体接着性ミクロスフェア、もしくはタンパク質性ベクター等の他のビヒクルに組み込まれ得る。例えば、Ｏ’Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｎｏｒｍａｎｄ，ＰＣＴ国際公開ＷＯ第００／５３７２２号を参照のこと。代替として、核酸組成物は、直接注射によって、もしくは注入ポンプの使用によって、局所的に送達され得る。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下、筋肉内、もしくは皮内であろうと、標準的な針およびシリンジの方法を使用して、またはＣｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：２３３０−２３３７，１９９９、およびＢａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開ＷＯ第９９／３１２６２号に記載されているもの等のニードルレス技術によって行い得る。
本発明の組成物は、薬学的薬剤として有効に使用され得る。薬学的薬剤は、患者における疾患状態もしくは他の有害な状態の発生もしくは重篤度を予防させるか、調節させるか、またはこれらを治療する（検出可能なもしくは測定可能な程度にまで１つ以上の症状を緩和する）。
幾つかの実施形態において、本発明は、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物もしくは脂質と組み合わせるか、複合体化させるか、または結合体化され、希釈剤、安定化剤、もしくは緩衝剤等の薬学的に許容される担体と共にさらに製剤化され得る、１つ以上のポリ核酸、典型的には、１つ以上のｓｉＲＮＡの存在もしくは投与を特徴とする薬学的組成物および方法を提供する。
典型的には、該ｓｉＲＮＡは、該対象の疾患状態もしくは有害な状態と関連する原因因子もしくは寄与因子として、上昇したレベルで発現される遺伝子を標的とする。この文脈において、該ｓｉＲＮＡは、１つ以上の関連する疾患症状の重篤度もしくは再発を予防するか、緩和するか、または低下させるレベルまで、遺伝子の発現を効率的に下方制御する。代替として、該標的遺伝子の発現が疾患もしくは他の有害な状態の結果もしくは結末として必ずしも上昇するわけではない種々の異なる疾患モデルについて、該標的遺伝子の下方制御は、それでもなお、遺伝子発現を低減させる（すなわち、該標的遺伝子の選択されたｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質産物のレベルを低下させる）ことによって、治療的結果を生じ得る。代替として、本発明のｓｉＲＮＡは、ある遺伝子の発現を低減させるために標的化され得、発現が該標的遺伝子の産物もしくは活性によって負に調節される「下流」遺伝子の上方調節を生じ得る。
本開示のこのｓｉＲＮＡは、任意の形態において、例えば、経皮的にもしくは局所注射によって（例えば、乾癬を治療するための乾癬斑（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ｐｌａｑｕｅ）の部位での、または乾癬性関節炎もしくはＲＡに罹患している患者の関節への局所投与）投与され得る。より詳細な実施形態において、本発明は、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡに対して向けられる治療上有効な量のｓｉＲＮＡ（これは、該ＴＮＦ−αのＲＮＡを効率的に下方調節し、それによって、１つ以上のＴＮＦ−α関連炎症状態を低下させる、もしくは予防する）を投与するための製剤および方法を提供する。発現が、選択される疾患状態と関連する原因因子もしくは寄与因子として異常に増大することが公知である多数の遺伝子のうちのいずれかを含む、動物対象において、選択される疾患状態と関連する１つ以上の異なる遺伝子の発現を標的とする、類似する方法および組成物が、提供される。
本発明の組成物はまた、経口投与のための錠剤、カプセル剤、もしくはエリキシル剤、直腸投与のための坐剤、滅菌液剤、注射用投与のための懸濁液、および当該分野において公知の他の形態として製剤化および使用され得る。
薬理学的組成物または製剤は、細胞もしくは例えば、ヒトを含む患者への投与、例えば、全身投与に好適な形態にある組成物もしくは製剤を指す。好適な形態は、部分的に、例えば、経口、経皮、経上皮、または注射によって、用途もしくは侵入経路に依存する。かかる形態は、該組成物もしくは製剤が標的細胞（すなわち、負に荷電した核酸が送達に望ましい細胞）に達しないように妨げないことが必要である。例えば、血流に注射された薬理学的組成物は、可溶性でなければならない。他の因子は、当該分野において公知であり、毒性等の考慮事項を含む。
「全身投与」とは、血流における薬物の生体内の全身吸収もしくは蓄積、続いて、身体全体への分布を意味する。全身吸収をもたらす投与経路としては、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内、および筋肉内が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の核酸分子を有する製剤に好適な薬剤の例としては、ＣＮＳへの薬物の侵入を増強し得るＰ−糖タンパク質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５等）（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ ａｎｄ Ｔｉｌｌｅｍｅｎｔ，Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３：１６−２６，１９９９）；脳内移植後の徐放性送達のための生分解性ポリマー（例えば、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ８：４７−５８，１９９９，Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）；および血液脳関門を超えて薬物を送達し得、かつ神経取り込み機序を変化させ得る充填されたナノ粒子（例えば、ポリブチルシアノアクリレートから作製されたもの）（Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２３：９４１−９４９，１９９９）が含まれる。本発明の核酸分子の送達戦略の他の例には、Ｂｏａｄｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１３０８−１３１５，１９９８、Ｔｙｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４２１：２８０−２８４，１９９９、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ． ９２：５５９２−５５９６，１９９５、Ｂｏａｄｏ，Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１５：７３−１０７，１９９５、Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：４９１０−４９１６，１９９８、およびＴｙｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．９６：７０５３−７０５８，１９９９に記載の物質が含まれる。
本発明はまた、薬学的に有効な量の所望の化合物を薬学的に許容される担体または希釈剤中に含む、保管または投与のために調製された組成物も含む。治療的使用のための受容可能な担体または希釈剤は、薬学分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．１９８５）に記載されている。例えば、保存剤、安定化剤、色素、および香料添加剤が提供され得る。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。加えて、抗酸化剤および懸濁剤が使用され得る。
薬学的に有効な用量は、疾患状態の症状の発生を予防、阻害、または疾患状態を治療、またはある程度の疾患状態にまで、緩和するために必要とされる用量である。活性核酸の０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の量が、投与されるべきである。
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合した状態で、活性な物質を含む。かかる賦形剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、およびアカシアガム等の懸濁剤である。分散剤もしくは湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えば、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合産物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合産物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合産物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸由来の部分エステルおよびヘキシトール無水物との縮合産物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。該水性懸濁液はまた、例えば、エチル、もしくはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート等の１つ以上の保存剤、１つ以上の着色剤、１つ以上の香料添加剤、およびスクロースもしくはサッカリン等の１つ以上の甘味剤も含み得る。
油性懸濁液は、該活性成分を、植物性油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ごま油、もしくはココナツ油中で、または流動パラフィン等の鉱油中で懸濁することによって製剤化され得る。該油性懸濁液は、濃化剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィン、もしくはセチルアルコールを含み得る。甘味剤および香料添加剤は、味の良い経口調製物を提供するために添加され得る。これらの組成物は、アスコルビン酸等の抗酸化剤の添加によって保存され得る。
水を添加することによって水性懸濁液の調製に好適な分散性の粉末および顆粒は、分散剤もしくは湿潤剤、懸濁液および１つ以上の保存剤と混合した状態で、該活性成分を提供する。他の賦形剤、例えば、甘味剤、香料添加剤、および着色剤もまた、存在し得る。
本発明の薬学的組成物はまた、水中油エマルジョンの形態で存在し得る。該油相は、植物性油もしくは鉱油またはこれらの混合物であり得る。好適な乳化剤は、天然に存在するガム（例えば、アカシアガムもしくはトラガカントガム）、天然に存在するホスファチド（例えば、ダイズ、レシチン、および脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルもしくは部分エステル（例えば、ソルビタンモノオレエート））、およびエチレンオキシドとの該部分エステルの縮合産物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。該エマルジョンはまた、甘味剤および香料添加剤を含み得る。
該薬学的組成物は、滅菌注射用水性もしくは滅菌注射用油性懸濁液の形態で存在し得る。この懸濁液は、上で言及した好適な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁剤を用いて、公知の技術に従って製剤化され得る。該滅菌注射用懸濁液はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤もしくは溶媒中の、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としての、滅菌注射用溶液もしくは懸濁液であり得る。使用され得る該許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル溶液、および等張性の塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌の固定油が、溶媒もしくは懸濁媒体として使用され得る。この目的のために、合成ものグリセリドもしくはジグリセリドを含む任意の刺激の少ない固定油が使用され得る。加えて、オレイン酸等の脂肪酸は、注射用調製物中での使用が見出される。
該ｓｉＲＮＡはまた、例えば、薬物の直腸投与のために坐剤の形態で投与され得る。これらの組成物は、該薬物と、常温で固体であるが、直腸温で液体であり、したがって、直腸で溶解して、該薬物を放出する好適な非刺激性賦形剤と混合することによって、調製され得る。かかる物質には、カカオ脂およびポリエチレングリコールが含まれる。
該ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈでの修飾によって安定性を増強するために広範囲に修飾され得る。概説については、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴＩＢＳ １７：３４，１９９２、Ｕｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３，１９９４を参照のこと。ｓｉＲＮＡ構築物は、一般的な方法を用いてゲル電気泳動によって精製され得るか、または高速液体クロマトグラフィーによって精製され得、水に再懸濁され得る。
修飾（塩基、糖、および／もしくはホスフェート）を有する化学合成されている核酸分子は、血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防止し得、それらの効力を増大させ得る。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際公開ＷＯ第９２／０７０６５号、Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：５６５，１９９０、Ｐｉｅｋｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４，１９９１、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４，１９９２、Ｕｓｍａｎら、国際公開ＷＯ第９３／１５１８７号、およびＲｏｓｓｉら、国際公開ＷＯ第９１／０３１６２号、Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５，３３４，７１１号、およびＧｏｌｄら、米国特許第６，３００，０７４号を参照のこと。上記参考文献の全ては、本明細書に記載される核酸分子の塩基、ホスフェート、および／または糖部分に対して行われ得る種々の化学的修飾を記載する。
それらのヌクレアーゼ安定性および効力において顕著な増強を有する、核酸分子へと導入され得る糖、塩基、およびホスフェート修飾を記載している当該分野の幾つかの例がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾等のヌクレアーゼ耐性基での修飾によって、安定性を増強、および／もしくは生物学的活性を増強するために修飾される。概説については、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴＩＢＳ １７：３４，１９９２、Ｕｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３，１９９４、Ｂｕｒｇｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４０９０，１９９６を参照のこと。核酸分子の糖修飾は、当該分野において広範囲に記載されている。Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際公開ＰＣＴ ＷＯ第９２／０７０６５号、Ｐｅｒｒａｕｌｔ，ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３４４：５６５−５６８，１９９０、Ｐｉｅｋｅｎ，ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４‐３１７，１９９１、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４−３３９，１９９２、Ｕｓｍａｎら、国際公開ＰＣＴ ＷＯ第９３／１５１８７号、Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５，３３４，７１１号およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５７０２，１９９５、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ第９７／２６２７０号、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許第５，７１６，８２４号、Ｕｓｍａｎら、米国特許第５，６２７，０５３号、Ｗｏｏｌｆら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ第９８／１３５２６号、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３９：１１３１，１９９８、Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）４８：３９−５５，１９９８、Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４，１９９８、ならびにＢｕｒｌｉｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：１９９９−２０１０，１９９７を参照のこと。かかる刊行物は、触媒作用を調節することなく、糖、塩基、および／またはホスフェート修飾等を核酸分子に組み込む位置を決定するための一般的な方法および戦略を記載する。かかる教示に鑑みると、類似の修飾が、細胞内のＲＮＡｉを促進するｓｉＲＮＡの能力が顕著に阻害されない限りにおいて、本発明のｓｉＲＮＡ核酸分子を修飾するために本明細書に記載されるように使用され得る。
オリゴヌクレオチドヌクレオチド間連結の、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および／または５’−メチルホスホネート連結での化学的修飾が、安定性を改善する一方で、過剰な修飾は、幾つかの毒性もしくは低下した活性を引き起こし得る。したがって、核酸分子を設計する場合、これらのヌクレオチド間連結の量は、最小化されるべきである。これらの連結の濃度の低下は、毒性を低減させるはずであり、これらの分子の増大した有効性およびより高い特異性を生じる。
幾つかの実施形態において、本発明は、１つ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデートカルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、および／またはアルキルシリル置換を含むホスフェート骨格修飾による修飾ｓｉＲＮＡ分子を特徴とする。骨格修飾の概説については、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，１９９５，ｐｐ．３３１−４１７、およびＭｅｓｍａｅｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，” ＡＣＳ，１９９４，ｐｐ．２４−３９を参照のこと。
核酸分子の送達のための方法は、Ａｋｈｔａｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２：１３９，１９９２、“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５、Ｍａｕｒｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６：１２９−１４０，１９９９、Ｈｏｆｌａｎｄ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３７：１６５−１９２，１９９９、およびＬｅｅ，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７５２：１８４−１９２，２０００に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許第６，３９５，７１３号、およびＳｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ ＷＯ第９４／０２５９５号は、核酸分子の送達のための一般的方法をさらに記載する。これらのプロトコルは、実質的にいかなる核酸分子の送達のためにも利用され得る。核酸分子は、当業者に公知の種々の方法によって、細胞に投与され得る（リポソームによって、イオン導入法によって、または他のビヒクル（例えば、生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：１０６８‐１０７４，１９９９、Ｗａｎｇら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ第０３／４７５１８号およびＷＯ第０３／４６１８５号を参照のこと）、ポリ（乳酸−コ−グリコール）酸（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡマイクロスフェア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号および米国特許出願公開第ＵＳ２００２１３０４３０号を参照のこと）、生分解性ナノカプセル、ならびに生体接着性マイクロスフェア）への組み込みによって、あるいはタンパク質性ベクターによって（Ｏ’Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｎｏｒｍａｎｄ，国際ＰＣＴ公開ＷＯ第００／５３７２２号）、内部もしくは外部へカプセル化されることが挙げられるが、これらに限定されない）。代替として、核酸／ビヒクルの組み合わせは、直接注射によって、または注入ポンプの使用によって、局所的に送達される。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下、筋肉内、もしくは皮内であろうと、標準的な針およびシリンジの方法を使用して、またはＣｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：２３３０−２３３７，１９９９、およびＢａｒｒｙら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ第９９／３１２６２号に記載されるもの等のニードルレス技術によって行い得る。本発明の分子は、薬学的薬剤として使用され得る。薬学的薬剤は、対象における疾患状態の発生を予防するか、調節するか、または対象における疾患状態を治療する（ある程度まで症状を緩和し、好ましくは、該症状の全てを緩和する）。
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボ−フラノース部分の２’位においてヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ（例えば、部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生成ＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、修飾、および／もしくは変化によって、天然に存在するＲＮＡとは異なる、変化させたＲＮＡが含まれる。かかる変化は、例えば、該ｓｉＲＮＡの末端に対して、または内部に（例えば、該ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおいて）、非ヌクレオチド物質を付加することを含み得る。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド等の標準的ではないヌクレオチドも含み得る。これらの変化させられたＲＮＡは、アナログもしくは天然に存在するＲＮＡのアナログとして言及され得る。
「キャップ構造」とは、該オリゴヌクレオチドのいずれかの末端において組み込まれている化学的修飾を意味する（例えば、Ａｄａｍｉｃら、米国特許第５，９９８，２０３号を参照のこと、参照することにより本明細書に組み込まれる）。これらの末端修飾は、該核酸分子がエキソヌクレアーゼ分解しないように保護し、細胞内の送達および／もしくは局在化を補助し得る。該キャップは、５’末端（５’キャップ）もしくは３’末端（３’キャップ）において存在してもよいし、または両方の末端に存在していてもよい。非限定的な例において、該５’キャップとしては、グリセリル、逆方向デオキシ脱塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート連結；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆方向ヌクレオチド部分；３’−３’−逆方向脱塩基部分；３’−２’−逆方向ヌクレオチド部分；３’−２’−逆方向脱塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋もしくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられるが、これらに限定されない。
該３’キャップの例としては、グリセリル、逆方向デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート；３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピル；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆方向ヌクレオチド部分；５’−５’−逆方向脱塩基部分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；架橋および／もしくは非架橋５’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋もしくは非架橋メチルホスホネートならびに５’−メルカプト部分（より詳細については、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｌｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９：１９２５，１９９３を参照のこと、参照することにより本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
「非ヌクレオチド」という用語は、糖および／またはホスフェート置換のいずれかを含み、その残りの塩基が、それらの酵素活性を示すことを可能にする、１つ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖へ組み込まれ得る任意の基もしくは化合物を意味する。該基または化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミン等の一般に認識されるヌクレオチド塩基を含まず、したがって、１’位において塩基を欠いているという点で、脱塩基である。
本明細書で使用される、「ヌクレオチド」とは、当該分野で認識されているように、天然の塩基（標準的）および当該分野において周知の修飾塩基を含む。かかる塩基は、一般に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは、一般に、塩基、糖、およびホスフェート基を含む。該ヌクレオチドは、該糖、ホスフェート、および／または塩基部分において非修飾であり得るか、または修飾であり得る（また、ヌクレオチドアナログ、修飾ヌクレオチド、非天然のヌクレオチド、非標準的なヌクレオチド等として交換可能に言及される；例えば、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，上記参照；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ第９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ第９３／１５１８７号；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，上記参照を参照のこと、全ては、参照することにより本明細書に組み込まれる）。当該分野において公知の修飾された核酸塩基の幾つかの例があり、Ｌｉｍｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３，１９９４によってまとめられる。核酸分子に導入され得る塩基修飾の非限定的な例の幾つかには、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、プソイドウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン等が含まれる（Ｂｕｒｇｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４０９０，１９９６；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，上記参照）。本態様における「修飾された塩基」とは、１’位のアデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルまたはその等価物以外のヌクレオチド塩基を意味する。
「標的部位」または「標的配列」または「標的化配列」とは、該標的配列に相補的なそのアンチセンス領域内の配列を含むｓｉＲＮＡ構築物によって媒介される切断に対して「標的化」される標的核酸（例えば、ＲＮＡ）内の配列を意味する。
ｓｉＲＮＡ分子は、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物またはカチオン性脂質と複合体化され得るか、リポソーム内にパッケージされ得るか、または別の方法で標的細胞または組織に送達され得る。核酸または核酸複合体は、生体ポリマー中へのそれらの組み込みありまたはなしで、注射、注入ポンプ、またはステントを介して局所投与され得る。別の実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、本発明のｓｉＲＮＡ化合物、ポリペプチドに、または両方に共有結合され得る。該結合されたＰＥＧは、任意の分子量、好ましくは、約２，０００〜約５０，０００ダルトン（Ｄａ）であり得る。
該センス領域は、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカー等のリンカー分子を介して、アンチセンス領域に接続され得る。
「逆方向反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ）」とは、該反復が転写された場合に、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成することができるように位置したセンス要素およびアンチセンス要素を含む核酸配列を指す。該逆方向反復は、任意に、該反復の２つの要素の間に、リンカー、または自己切断リボザイム等の異種配列を含み得る。該逆方向反復の要素は、二本鎖ＲＮＡを形成するに十分な長さを有する。典型的には、該逆方向反復の各要素は、約１５〜約１００ヌクレオチド長、好ましくは約２０〜３０塩基ヌクレオチド長、好ましくは、約２０〜２５ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖形態または二本鎖形態のそれらのポリマーを指す。この用語は、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾骨格残基または連結を含む核酸を包含し、これらは、合成、天然に存在する、および天然に存在しない、参照核酸と類似の結合特性を有し、該参照ヌクレオチドに類似の様式で代謝される。かかるアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
「大きな二本鎖ＲＮＡ」とは、約４０ｂｐより大きい、例えば、１００ｂｐより大きい、またはさらに具体的には、３００ｂｐより大きいサイズを有する任意の二本鎖ＲＮＡを指す。大きなｄｓＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡのセグメントまたはｍＲＮＡ全体を表し得る。大きなｄｓＲＮＡの最大サイズは、本明細書において限定されない。該二本鎖ＲＮＡは、該修飾が該ホスフェート糖骨格に対してまたは該ヌクレオシドに対してであり得る修飾塩基を含み得る。かかる修飾は、窒素または硫黄、ヘテロ原子または当該分野において公知の任意の他の修飾を含み得る。
該二本鎖構造は、ヘアピンまたはマイクロＲＮＡに対して生じるような自己相補的ＲＮＡ鎖によって、または２つの異なる相補的ＲＮＡ鎖のアニーリングによって、形成され得る。
「重複（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）」とは、２つのＲＮＡフラグメントが、一方の鎖上の複数のヌクレオチドによって重複する配列を有する場合であり、例えば、該複数のヌクレオチド（ｎｔ）が２〜５ヌクレオチド程度の、または５〜１０ヌクレオチドまで、またはそれ以上に達する場合を指す。
「１つ以上のｄｓＲＮＡ」とは、一次配列に基づいて互いに異なるｄｓＲＮＡを指す。
「標的遺伝子またはｍＲＮＡ」とは、対象となる任意の遺伝子またはｍＲＮＡを指す。標的遺伝子またはｍＲＮＡは、発生的遺伝子および調節性遺伝子、ならびに代謝遺伝子または構造遺伝子または酵素をコードする遺伝子を含み得る。標的遺伝子は、内因性、または外因性であり得る。標的遺伝子は、表現型が調査されているこれらの細胞において、または生物において、表現型の特徴に直接的または間接的に影響を及ぼす様態において発現され得る。かかる細胞には、不死化細胞株または一次細胞培養物中に生じるような配偶子または任意の単離された細胞を含む、成体もしくは胚性動物、または植物の体の任意の細胞が含まれる。
活性薬剤の送達のための使用
本発明の化合物および組成物は、上記のように、または当該分野において公知のように、任意の生理学的もしくは生物学的に活性な薬剤、ならびに活性薬剤の任意の組み合わせの送達のために使用され得る。該活性薬剤は、所望の生理学的または改善効果を提供するに十分な量において、本発明の組成物および使用において存在し得る。
本発明の化合物および組成物は、低分子化合物および薬物、ペプチド、タンパク質、抗体、モノクローナル抗体、抗体系薬物、およびワクチン薬剤を含む、哺乳動物対象において、様々な薬物薬剤および生物学的に活性な薬剤の送達を増強することに関する。
活性薬剤の例には、ペプチド、タンパク質、核酸、二本鎖ＲＮＡ、増血剤、抗感染剤；抗痴呆剤；抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、解熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗潰瘍剤、抗アレルギー剤、抗鬱剤、向精神薬、強心剤、抗不整脈薬（ａｎｔｉａｒｒｙｔｈｍｉｃ）、血管拡張薬、抗高血圧薬、降圧利尿薬、抗糖尿病薬、抗凝固薬、コレステロール低下剤、骨粗鬆症のための治療剤、ホルモン、抗生物質、ワクチン、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、心血管因子、細胞接着因子、中枢もしくは末梢神経系因子、体液性電解質因子（ｈｕｍｏｒａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｆａｃｔｏｒ）、血管の有機物質（ｈｅｍａｌ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、骨増殖因子、胃腸因子、腎臓因子、結合組織因子、感覚器官因子、免疫系因子、呼吸器系因子、生殖器因子、アンドロゲン、エストロゲン、プロスタグランジン、ソマトトロピン、ゴナドトロピン、インターロイキン、ステロイド、細菌トキソイド、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体フラグメント、および免疫グロブリンが含まれる。
活性薬剤の例には、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、インターフェロン、ヘパリン、ヒルゲン（ｈｉｒｕｇｅｎ）、ヒルロス、およびヒルジンが含まれる。
活性薬剤の例には、モルフィン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、ラボルファノール（ｌｏｖｏｒｐｈａｎｏｌ）、レバロルファン、コデイン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロゾン（ｎａｌｏｚｏｎｅ）、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、またはナルブフィン（ｎａｌｂｕｆｉｎｅ）、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、パラメタゾン（ｐａｒａｍｅｔｈｏｓｏｎｅ）、フルオシノロン、コルヒチン、アセトアミノフェン、非ステロイド性抗炎症剤 ＮＳＡＩＤ、アシクロビル、リババリン（ｒｉｂａｖａｒｉｎ）、トリフルオロチミジン、Ａｒａ−Ａ アラビノフラノシルアデニン、アシルグアノシン、ノルデオキシグアノシン、アジドチミジン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシシチジン、スピロノラクトン、テストステロン、エストラジオール、プロゲスチン、ゴナドトロピン、エストロゲン、プロゲステロン、パパベリン、ニトログリセリン、血管作動性腸管ペプチド、カルシトニン関連遺伝子ペプチド、シプロヘプタジン、ドキセピン、イミプラミン、シメチジン、デキストロメトルファン、クロザリル、スーパーオキシドジスムターゼ、ニューロエンケファリナーゼ（ｎｅｕｒｏｅｎｋｅｐｈａｌｉｎａｓｅ）、アムホテリシンＢ、グリセオフルビン、ミコナゾール、ケトコナゾール、チオコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、セファロスポリン、テトラサイクリン、アミノグルコシド、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢ、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、メトトレキセート、ヒドロキシ尿素、ジデオキシイノシン、フロクスウリジン、６−メルカプトプリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、タキソール、パクリタキセル、トコフェロール、キニジン、プラゾシン、ベラパミル、ニフェジピン、ジルチアゼム、組織プラスミノゲン活性化因子ＴＰＡ、上皮増殖因子ＥＧＦ、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−酸性または塩基性、血小板由来増殖因子ＰＤＧＦ、トランスホーミング増殖因子ＴＧＦ−αまたはβ、血管作動性腸管ペプチド、腫瘍壊死因子ＴＮＦ、視床下部放出因子（ｈｙｐｏｔｈａｌｍｉｃ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモンＴＳＨ、副腎皮質刺激ホルモンＡＣＴＨ、副甲状腺ホルモンＰＴＨ、濾胞刺激ホルモンＦＳＦ、黄体形成ホルモン放出ホルモンＬＨＲＨ、エンドルフィン、グルカゴン、カルシトニン、オキシトシン、カルベトシン、アルドエテコン（ａｌｄｏｅｔｅｃｏｎｅ）、エンケファリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、α−メラニン細胞刺激ホルモン、リドカイン、スフェンタニル（ｓｕｆｅｎｔａｉｎｉｌ）、テルブタリン、ドロペリドール、スコポラミン、ゴナドレリン、シクロピロックス、ブスピロン、クロモリンナトリウム、ミダゾラム、シクロスポリン、リシノプリル、カプトプリル、デラプリル、ラニチジン、ファモチジン、スーパーオキシドジスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼリボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ボンベシン、サブスタンスＰ、バソプレッシン、α−グロブリン、トランスフェリン、フィブリノゲン、β−リポタンパク質、β−グロブリン、プロトロンビン、セルロプラスミン、α２−糖タンパク質、α２−グロブリン、フェチュイン、α１−リポタンパク質、α１−グロブリン、アルブミン、およびプレアルブミンが含まれる。
活性薬剤の例には、モルフィン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、ラボルファノール（ｌｏｖｏｒｐｈａｎｏｌ）、レバロルファン、コデイン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロゾン（ｎａｌｏｚｏｎｅ）、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、およびナルブフィン（ｎａｌｂｕｆｉｎｅ）等のオピオイドまたはオピオイドアンタゴニスト；コルチゾン、ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、パラメタゾン（ｐａｒａｍｅｔｈｏｓｏｎｅ）、およびフルオシノロン等のコルチコステロン；コルヒチン、イブプロフェン、インドメタシン、およびピロキシカム等の他の抗炎症剤；アシクロビル、リババリン（ｒｉｂａｖａｒｉｎ）、トリフルオロチリジン、アラ−Ａ（アラビノフラノシルアデニン）、アシルグアノシン、ノルデオキシグアノシン、アジドチミジン、ジデオキシアデノシン、およびジデオキシシチジン等の抗ウイルス剤；スピロノラクトン等の抗アンドロゲン；テストステロン等のアンドロゲン；エストラジオール等のエストロゲン；プロゲスチン；パパベリン等の筋弛緩剤；ニトログリセリン、血管作動性腸管ペプチド、およびカルシトニン関連遺伝子ペプチド等の血管拡張剤；シプロヘプタジン等の抗ヒスタミン剤；ドキセピン、イミプラミン、およびシメチジン等のヒスタミン受容体部位遮断活性を有する薬剤；デキストロメトルファン等の鎮咳剤；クロザリル等の神経遮断薬；抗不整脈剤；抗てんかん薬；スーパーオキシドジスムターゼおよびニューロエンケファリナーゼ（ｎｅｕｒｏｅｎｋｅｐｈａｌｉｎａｓｅ）等の酵素；アムホテリシンＢ、グリセオフルビン、ミコナゾール、ケトコナゾール、チオコナゾール、イトラコナゾール、およびフルコナゾール等の抗真菌剤；ペニシリン、セファロスポリン、テトラサイクリン、アミノグルコシド、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢ等の抗菌薬；５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、メトトレキセート、およびヒドロキシ尿素、ジデオキシイノシン、フロクスウリジン、６−メルカプトプリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、タキソール、およびパクリタキセル等の抗癌剤；トコフェロール、レチノイド、カロテノイド、ユビキノン、金属キレート剤、およびフィチン酸等の抗酸化剤；キニジン等の抗不整脈剤；ならびにプラゾシン、ベラパミル、ニフェジピン、およびジルチアゼム等の血圧降下薬；アセトアミノフェンおよびアスピリン等の鎮痛薬；ヒト化抗体、および抗体フラグメントを含む、モノクローナルおよびポリクローナル抗体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；ならびに、ＲＮＡ、調節性ＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、ＤＮＡ、ならびに治療用ペプチドおよびタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスベクターが含まれる。
投与のための組成物および製剤
本明細書で使用される、「投与する」および「投与」という用語は、化合物または組成物を作用部位に直接的にまたは間接的に送達するための全ての手段を包含する。本開示の化合物および組成物は単独、または本明細書で開示されていない他の化合物、組成物、もしくは治療剤と組み合わせて投与され得る。
本発明の組成物および方法は、経口、直腸、膣、経鼻、肺内、もしくは皮内送達によるもの、または眼、耳、皮膚、もしくは他の粘膜表面への局所送達によるものを含む種々の粘膜投与様式によって、対象に投与され得る。本発明の幾つかの態様において、該粘膜組織層は、上皮細胞層を含む。該上皮細胞は、肺、気管、気管支、肺胞、鼻、口内、表皮、または胃腸のものであり得る。本発明の組成物は、機械式スプレーデバイス、および加圧式、電子作動式、または他のタイプの作動器等の作動器を用いて、投与することができる。
本発明の組成物は、鼻または肺スプレーとして水溶液中で投与され得、当業者に公知の種々の方法によって、スプレー形態で分注され得る。本発明の組成物の肺送達は、小滴、粒子、またはスプレーの形態において、達成され得、これらは、例えば、エアロゾル化、霧状、または噴霧され得る。肺送達は、該組成物を、小滴、粒子、またはスプレーの形態において、鼻または気管支経路を介して投与することによって行われ得る。該組成物、スプレー、またはエアロゾルの粒子は、液体形態または固体形態のいずれかにおいて存在し得る。鼻スプレーとして液体を分注するために好ましいシステムは、米国特許第４，５１１，０６９号において開示されている。かかる製剤は、本発明に従う組成物を水中に溶解して、水溶液を生成し、該溶液を滅菌状態にすることによって、従来通りに調製され得る。該製剤は、複数用量容器において、例えば、米国特許第４，５１１，０６９号で開示されている密封分注システムにおいて、示され得る。他の好適な鼻スプレー送達システムは、Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ，Ｙ．Ｗ．Ｃｈｉｅｎ ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５、および米国特許第４，７７８，８１０号において記載されている。さらなるエアロゾル送達形態には、例えば、圧縮空気式、ジェット、超音波式、および圧電式ネブライザーが含まれ得、これらは、薬学的溶媒、例えば、水、エタノール、またはこれらの混合物に溶解または懸濁される該生物学的に活性な薬剤を送達する。
本発明の鼻および肺スプレー溶液は、典型的には、送達される薬物、任意に、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート−８０）等の表面活性剤および１つ以上の緩衝液と共に製剤化される薬物を含む。本発明の幾つかの実施形態において、鼻スプレー溶液は、噴射剤をさらに含む。該鼻スプレー溶液のｐＨは、約ｐＨ６．８〜７．２であり得る。使用される薬学的溶媒はまた、ｐＨ４〜６の弱酸性の水性緩衝液であり得る。他の成分は、保存剤、界面活性剤、分散剤またはガスを含む、化学的安定性を増強または維持するために添加され得る。
幾つかの実施形態において、本発明は、本発明の組成物を含有する溶液と、肺、粘膜、または鼻内スプレーもしくはエアロゾルのための作動器と、を含む薬学的製品である。
本発明の組成物の投薬形態は、液滴またはエマルジョンの形態の、またはエアロゾルの形態の、液体であり得る。
本発明の組成物の投薬形態は、固体であり得、これは、投与前に液体中で再構成され得る。該固体は、粉末剤として投与され得る。該固体は、カプセル剤、錠剤、またはゲルの形態で存在し得る。
本発明の範囲内の肺送達のための組成物を製剤化するために、該生物学的に活性な薬剤は、種々の薬学的に許容される添加剤または送達増強成分、ならびに該活性薬剤の分散のための基剤または担体と合わせられ得る。添加剤または送達増強成分の例には、アルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸、およびこれらの混合物等のｐＨ制御薬剤が含まれる。他の添加剤または送達増強成分には、局所麻酔剤（例えば、ベンジルアルコール）、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）、溶解度増強剤（例えば、シクロデキストリンおよびその誘導体）、安定化剤（例えば、血清アルブミン）、ならびに還元剤（例えば、グルタチオン）が含まれる。粘膜送達のための組成物が液体である場合、該製剤の等張性は、統一性として投与される０．９％（ｗ／ｖ）生理食塩水溶液の等張性に関して測定される場合、典型的には、実質的な、不可逆的な組織損傷が投与部位の粘膜において誘導されない値に調節される。一般には、該溶液の等張性は、約１／３〜３、より典型的には、１／２〜２、および最も頻繁には、３／４〜１．７の値に調節される。
該生物学的に活性な薬剤は、基剤またはビヒクル中に分散され得、これは、該活性薬剤を分散させる能力を有する親水性化合物および任意の所望の添加剤を含み得る。基剤は、ポリカルボン酸またはその塩、カルボン酸無水物（例えば、マレイン酸無水物と、他のモノマー（例えば、メチル（メタ）アクリレート、アクリル酸等）とのコポリマー、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等の親水性ビニルポリマー、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体、ならびにキトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸、およびこれらの非毒性金属塩等の天然のポリマーが挙げられるが、これらに限定されない、広い範囲の好適な担体から選択され得る。生分解性ポリマーは、基剤または担体として選択され得、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸−グリコール酸）コポリマー、およびこれらの混合物が挙げられる。ポリグリセリン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル等の合成脂肪酸エステルは、担体として使用され得る。親水性ポリマーおよび他の担体は、単独で、または組み合わせて使用され得、増強された構造完全性が、部分的結晶化、イオン結合、架橋等によって、該担体に付与され得る。担体は、流体または粘性の溶液、ゲル、ペースト、粉末剤、マイクロスフェア、および鼻粘膜への直接適用のためのフィルムを含む種々の形態に提供され得る。この文脈において選択される担体の使用は、該生物学的に活性な薬剤の吸収の促進を生じ得る。
該生物学的に活性な薬剤は、種々の方法に従って該基剤または担体と合わせられ得、該活性薬剤の放出は、拡散、担体の分解、または水チャネルの関連製剤によってであり得る。幾つかの状況において、該活性薬剤は、好適なポリマー（例えば、イソブチル２−シアノアクリレート）から調製されたマイクロカプセル（マイクロスフェア）またはナノ粒子（ナノスフェア）に分散され（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３：１−５，１９９１を参照のこと）、鼻粘膜に適用される生体適合性分散媒体中に分散され、これにより、長時間にわたる徐放性送達および生物学的活性を生じる。
粘膜、鼻、または肺送達のための製剤は、基剤または賦形剤として、親水性低分子量化合物を含み得る。かかる親水性低分子量化合物は、通過媒体（ｐａｓｓａｇｅ ｍｅｄｉｕｍ）を提供し、この媒体を介して、生理学的に活性なペプチドまたはタンパク質等の水溶性活性薬剤が、該基剤を介して、該活性薬剤が吸収される体表面へと拡散され得る。該親水性低分子量化合物は、任意に、該粘膜または該投与雰囲気から水分を吸収し、該水溶性活性ペプチドを溶解する。該親水性低分子量化合物の分子量は、一般に、１０，０００以下であり、好ましくは、３０００以下である。親水性低分子量化合物の例には、オリゴ糖、二糖、および単糖（スクロース、マンニトール、ラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−エリトロース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、ラクツロース、セロビオース、ゲンチビオース（ｇｅｎｔｉｂｉｏｓｅ）、グリセリン、ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物を含む）等のポリオール化合物が含まれる。親水性低分子量化合物のさらなる例には、Ｎ−メチルピロリドン、アルコール（例えば、オリゴビニルアルコール、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール等）、およびこれらの混合物が含まれる。
本発明の組成物は、代替として、生理学的条件に近づけるために必要とされる、薬学的に許容される担体物質として、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、等張性調節剤、および湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、およびこれらの混合物を含み得る。固体組成物については、非毒性の薬学的に許容される担体が使用され得、これには、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が含まれる。
本発明のある実施形態において、該生物学的に活性な薬剤は、持続放出製剤、例えば、遅延放出ポリマーを含む組成物において投与され得る。活性薬剤は、急速な放出に対して保護する担体、例えば、ポリマー、マイクロカプセル化送達系、または生体接着性ゲル等の制御放出ビヒクルと共に調製され得る。活性薬剤の長期送達は、本発明の種々の組成物において、吸収を遅延させる組成物薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレートヒドロゲルおよびゼラチン中に含めることによって、もたらされ得る。
本発明のある実施形態において、組成物は、１つ以上の天然または合成界面活性剤を含有し得る。特定の天然界面活性剤は、ヒト肺（肺界面活性剤）中に見出され、肺胞の空気−液体界面において単層を形成し、呼息時に表面張力をほぼゼロへと低下させ、肺胞虚脱を防止するリン脂質およびタンパク質の複合混合物である。肺界面活性剤のうちの９０％超（重量で）が、約４０〜８０％がＤＰＰＣであり、その残りが不飽和ホスファチジルコリンＰＯＰＧ、ＰＯＰＣ、およびホスファチジルグリセロールである、リン脂質から構成される。界面活性剤の残りの１０％（重量で）は、表面タンパク質（ＳＰ）−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ、およびＳＰ−Ｄ等の血漿タンパク質およびアポプロテインから構成される。
本発明において使用され得る天然界面活性剤の例には、ＳＵＲＶＡＮＴＡ（商標）（ベラクタント）、ＣＵＲＯＳＵＲＦ（商標）（ポラクタントα）、およびＩＮＦＡＳＵＲＦ（商標）（カルファクタント）、ならびにこれらの混合物が含まれる。
合成界面活性剤の例には、シナプルチド（ｓｉｎａｐｕｌｔｉｄｅ）；ジパルミトイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール、およびパルミチン酸の混合物；ＳＵＲＦＡＸＩＮ（商標）（ルシナクタント（ｌｕｃｉｎａｃｔａｎｔ））；ならびにＥＸＯＳＵＲＦ（商標）（コルフォスセリル（ｃｏｌｆｏｓｃｅｒｉｌ））；チロキサポール、ＤＰＰＣ、およびヘキサデカノールを含有し得る成分；ならびにこれらの混合物が含まれる。
送達組成物を作製する方法には、エタノール注入法、および規定された細孔径の積層（ｓｔａｃｋｅｄ）ポリカーボネート膜フィルタを備えるＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒシステムを用いる押し出し法が含まれる。プローブチップおよびバス超音波処理器を使用する超音波処理は、均一の大きさの脂質粒子を生成するために使用され得る。均質かつ単分散性粒径は、該核酸成分を添加することなく得られ得る。体外の形質移入組成物については、該核酸成分は、形質移入剤が作製され、緩衝剤成分によって安定化した後に、添加され得る。生体内の送達組成物については、該核酸成分は、該製剤の一部である。
本発明の組成物および製剤は、種々の経路によって、例えば、静脈内経路、非経口経路、または腹腔内経路を介した全身送達をもたらすために投与され得る。幾つかの実施形態において、薬剤は、細胞内に、例えば、肺もしくは肝臓等の標的組織の細胞に、または炎症組織に送達され得る。対象の細胞を取り出し、取り出された細胞に薬剤を送達し、該細胞を対象に再導入することによる、薬剤の送達のための組成物および方法が、本開示内に含まれる。幾つかの実施形態において、本発明は、生体内で薬剤を送達するための方法を提供する。組成物は、対象に、静脈内、皮下、または腹腔内投与され得る。幾つかの実施形態において、本発明は、哺乳動物対象の肺へ薬剤を生体内で送達するための方法を提供する。
本開示の活性薬剤リポソーム組成物は、生体内で薬学的組成物において使用され得る。対象への本開示の活性薬剤リポソーム組成物の投与は、非経口、経口、吸入による、局所、粘膜、直腸、または口腔経路であり得る。非経口用は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内（ｉｎｔｅｒｓｔｅｒｎａｌ）、くも膜下内、病巣内、および頭蓋内注射もしくは注入技術を含む。
特定の疾患を治療するための本開示の有効な量の活性薬剤リポソーム組成物は、一般に、疾患の症状を改善するか、または軽減するのに十分な量である。該組成物は、単回投与として投与され得るか、または繰り返し投与によって投与され得る。
さらなる実施形態
本明細書に引用される全ての刊行物、参考文献、特許、特許公開、および特許出願はそれぞれ、その全体が参照することにより本明細書に具体的に組み込まれる。
本発明は、特定の実施形態に関連して記載し、多くの詳細が例示目的で示されたが、本発明がさらなる実施形態を含み、本明細書に記載される詳細のうちの幾つかが、本発明から逸脱することなく、大幅に変化し得ることは、当業者にとって明らかであろう。本発明は、このようなさらなる実施形態、修飾、および等価物を含む。特に、本発明は、種々の例示的成分および例の特徴、用語、または要素の任意の組み合わせを含む。
本発明および特許請求の範囲を記載するにあたって、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語、および類似の用語の本明細書での使用は、単数形および複数形の両方を含むと解釈されるべきである。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、例えば、「〜が挙げられるが、これらに限定されない」を意味する、限定的でない用語として解釈されるべきである。故に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語は、包括的であって、排他的ではないと解釈されるべきである。
本明細書中の値の範囲の記載は、範囲内の値のうちの幾つかが明確に記載されようとそうでなかろうと、本明細書に個々に記載されているかのように、範囲内に入る各値および任意の別個の値に個々に言及する。例えば、「４〜１２」という範囲は、値５、５．１、５．３５、および４以上１２以下の任意の他の自然数、整数、分数、または有理数を含むが、これらに限定されない。本明細書において使用される特定の値は、例示として理解され、本発明の範囲を限定するとは理解されない。
本明細書中の炭素原子数の範囲の記載は、範囲内の値のうちの幾つかが明確に記載されようとそうでなかろうと、本明細書に個々に記載されているかのように、範囲内に入る各値および任意の別個の値に個々に言及する。例えば、「Ｃ１−２２」という用語は、種Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、およびＣ２２を含むが、これらに限定されない。
本明細書に提供される技術用語の定義は、記載されていなくても、当業者に公知のこれらの用語と関連した意味を含むと解釈されるべきであって、本発明の範囲を限定するとは意図されない。本明細書に提供される技術用語の定義は、代替的な定義が本明細書に提供される定義と矛盾する限りにおいて、当該分野での代替的な定義または参照することにより本明細書に組み込まれる定義に優先すると解釈されるものとする。
本明細書に与えられる実施例、および本明細書に使用される例示的な言葉は、例示目的に過ぎず、本発明の範囲を限定することは意図しない。
例の列挙（例えば、本発明に好適な化合物または分子の列挙）が与えられる場合、列挙された化合物または分子の混合物もまた好適であることは、当業者に明らかであろう。
実施例
実施例１
ＲＮＡ含有リポソーム製剤を調製するための方法
本実施例は、ＲＮＡ含有リポソーム製剤を作製するための方法の実施形態を記載する。この方法に使用される幾つかの材料を以下にまとめる。
Ｃ１８：１−ノルＡｒｇ−Ｃ１６（パルミトイルオレイルノルアルギニン、ＰＯＮＡ）（ＭＤＲＮＡ，Ｉｎｃ．）（式量６８３．３）
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）
コレステロール（Ｓｏｌｖａｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）
コレステリルヘミサクシネート（ＣＨＥＭＳ）ＧＭＰ（Ｍｅｒｃｋ Ｅｐｒｏｖａ ＡＧ）
エタノール（無水，２００ 試験済み強度）；注射用滅菌水
リン酸ナトリウム：一塩基、無水、二塩基、無水
スクロース、９９＋％
５Ｎ 水酸化ナトリウム；２Ｎ 塩酸；氷酢酸
トロメタミン（Ｔｒｉｓ）ＵＳＰ等級（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）
１５０ｍＬ 最大体積０．２μｍ フィルタボトル、ＰＥＳ
目盛り付きレイニン ２０μＬ、２００μＬ、および１ｍＬ ピペッター
Ｉｓｏディスクフィルタ ＰＴＦＥ２５−１０
コールパーマー（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）インライン静的ミキサー
Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ ５２０ Ｄｉポンプ；Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ ５２３ポンプ；Ｆｉｌｔｅｒｔｅｃポンプ
Ｖｉｖａｆｌｏｗ ５０ １００，００ ＭＷＣＯ ＰＥＳ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）
スライド−ａ−ライザー透析カセット１０，０００ ＭＷＣＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）
緩衝溶液スクロースリン酸塩（ＳＵＰ）製剤緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２１５ｍＭ スクロース、ｐＨ７．４）は、以下のように調製した。２．１７ｇ 無水一塩基リン酸ナトリウムおよび８．７９ｇ 無水二塩基リン酸ナトリウムを、目盛り付きメスシリンダー中の３６００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ ＤＩ水に添加し、撹拌棒で徹底的に混合した。ｐＨは、５Ｎ 水酸化ナトリウムまたは２Ｎ 塩化水素を用いてｐＨ７．４まで調節した。２９４．３８ｇ スクロースをゆっくりと添加し、完全に溶解させた。最終水体積は、４Ｌまで調節した。溶液を０．２μｍ フィルタで濾過した。
９０％ｖ／ｖエタノールＵＳＰ中のリポソーム形成分子の２５ｍＭ原液は、以下のように調製した。９０ｍＬのエタノールＵＳＰ（２００ ｐｒｏｏｆ）を、清潔な加圧滅菌した１００ｍＬパイレックス（登録商標）製のボトルに分注した。エタノールに、１２９１μｍｏｌのＣ１８：１−ノルＡｒｇ−Ｃ１６（ＰＯＮＡ）、７２１．６ｕｍｏｌのコレステリルヘミサクシネート（ＣＨＥＭＳ）粉末、６１．７ｕｍｏｌのＤＭＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ粉末、および５１５ｕｍｏｌのコレステロールを連続して添加した。材料を、溶液にそれぞれ添加し、撹拌棒で徹底的に混合した。混合物は、１５分間超音波処理した。１０ｍＬの注射用滅菌水ＵＳＰを、徹底的に混合しながら添加した。原液は、ＩＳＯ−ＤＩＳＣフィルタＰＴＦＥ−２５ｍｍ、１ｕｍ 細孔径を通して濾過した。原液は、８０℃で保管し、蒸発光散乱検出器を用いて逆相ＨＰＬＣによってＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および脂質成分について分析した。
ｓｉＲＮＡ原液は、注射用滅菌水中で以下のように調製した。５ｍＬの注射用滅菌水を、滅菌１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに分注した。１００ｍｇのｓｉＲＮＡ粉末を、チューブに添加し、徹底的にボルテックスで撹拌した。溶液は、１０ｍＬ 注射器を用いて、０．２２ｕＭ Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰフィルタユニットを通して濾過した。ｓｉＲＮＡ溶液は、−２０℃で保管し、純度および１：１０００の希釈での濃度についてＯＤ（Ａ２６０およびＡ２８０）によって試験した。
Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ ５２０Ｄｉ蠕動ポンプは、４０ｍＬ／分の流量に調整した。ポンプは、２１０ｒｐｍに設定され、チューブから取り外した。４０ｍＬの９０％エタノールを、ラインをすすぐために送り出した。エタノールは、１５秒間ビーカーに注入し、ｍＬ／分の流量を決定するために計量した。ポンプ速度は、４０±０．５ｍＬ／分の流量を供給するように調節した。ｓｉＲＮＡおよびスクロースリン酸塩溶液用のポンプは、同様の様態で調整した。
３つの溶液を用いて、以下のようにｓｉＲＮＡ製剤を調製した。（ａ）ポンプで流す第１の溶液は、ｓｉＲＮＡ溶液であった。第１の溶液は、５０ｍＬの円錐管中でＳＵＰ緩衝液を用いてｓｉＲＮＡを希釈し、徹底的にボルテックスで撹拌することによって作製した。（ｂ）ポンプで流す第２の溶液は、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物＋３つの脂質の溶液であった。以下の脂質：ＣＨＥＭＳ、コレステロール、およびＤＭＰＥ−ＰＥＧを含有する、９０％エタノール中の混合脂質ストックを調製した。脂質ストックに、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物を添加した。脂質ストックに、注射用滅菌水中でトリスのアリコートを添加し、溶液中で１：１ トリス：ＣＨＥＭＳモル濃度を作製した。ポンプで流す第２の溶液は、容積式ピペットを用いて、５０ｍＬの円錐管にピペットし、９０％エタノールで希釈し、徹底的にボルテックスで撹拌することによって、混合脂質ストックを用いて作製した。（ｃ）ポンプで流す第３の溶液は、ＳＵＰ緩衝溶液であった。
ｓｉＲＮＡ製剤は、以下のように調製した。第１のｓｉＲＮＡ溶液およびリポソーム形成分子の第２の溶液を、同時に、衝突流にポンプで注入した。流出する衝突流の初めの１ｍＬは、廃棄し、次いで、ｓｉＲＮＡ製剤を、容器内に収集した。Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ ３２３ポンプを用いて、ＳＵＰ緩衝溶液を容器に注入し、約３３％のエタノール濃度に調節した。容器内のｓｉＲＮＡ製剤は、磁気撹拌プレート上にて１時間、緩やかに撹拌させながら培養した。
培養した後、製剤は、１０，０００ＭＷＣＯで、Ｐｉｅｒｃｅスライド−ａ−ライザー透析カセットに取り込み、１００倍量のＳＵＰに対して、４℃で１２〜１８時間透析濾過した。
本実施例は、接線流および透析濾過によってＲＮＡ含有リポソーム製剤を作製するための方法の実施形態をさらに記載する。最後の透析濾過ステップを、接線流濾過（ＴＦＦ）プロセスに置き換えることを除いては、上記のようにｓｉＲＮＡ製剤が提供された。
ｓｉＲＮＡ製剤を、磁気撹拌プレート上にて２分間、緩やかに撹拌させながら１０％（ｖ／ｖ）最終エタノール濃度に希釈した。
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｖｉｖａｆｌｏｗ ５０ １００，０００ ＭＷＣＯ ＰＥＳ膜を用いたＴＦＦシステムを、５０ｍＬの７０％エタノール ＵＳＰですすぎ、次いで、６０ｍＬ／分のポンプ流量で、１００ｍＬの７０％エタノールを用いて再循環した。ＴＦＦシステムを、５０ｍＬの滅菌水ですすぎ、次いで、６０ｍＬ／分のポンプ流量で、１００ｍＬの滅菌水を用いて再循環した。ＴＦＦシステムを、５０ｍＬのＳＵＰですすぎ、次いで、６０ｍＬ／分のポンプ流量で、１００ｍＬのＳＵＰを用いて再循環した。
希釈ｓｉＲＮＡ製剤を、ＴＦＦ容器に取り込み、０．５ｍｇ／ｍＬの最終ｓｉＲＮＡ濃度（フィード圧約２０ｐｓｉ、保持圧０．２ｐｓｉ未満、および約２ｍＬ／分の透過流量）になるまで５回濃縮した。膜の１ｃｍ２当たり、最大１ｍｇの、リポソーム組成物に製剤化されるｓｉＲＮＡを処理した。
濃縮ｓｉＲＮＡ製剤は、５倍量のＳＵＰに対して透析濾過することによって濾過し、２ｍＬ／分の流量で、エタノールを除去した。
濃縮ｓｉＲＮＡ製剤は、１ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡで、所望の倍量までさらに濃縮した。
本実施例は、ｓｉＲＮＡリポソーム製剤の除菌によってＲＮＡ含有リポソーム製剤を作製するための方法の実施形態をさらに記載する。ｓｉＲＮＡ製剤を、上記のように提供した。１０ｍＬのｓｉＲＮＡ製剤は、１０ｍＬ ポリプロピレン製注射器に吸い上げ、気泡を除去した。ｓｉＲＮＡ製剤は、０．２２ｕＭ Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰフィルタユニットを通して濾過した。１０ｍｇのｓｉＲＮＡ製剤（１ｍｇ ｓｉＲＮＡ／ｍＬ）は、注射器に中圧を伴い、Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰフィルタユニットを通して濾過した。本薬物産物の１ｍＬのアリコートを、使用前、８０℃で、３ｍＬのＩ型滅菌ガラス製バイアル中に保管した。
実施例２
ｓｉＲＮＡリポソーム製剤
本開示のリポソームｓｉＲＮＡ製剤の実施形態の一例を表６に示す。
Figure 0006126072
 実施例３
ＲＮＡ含有リポソーム組成物における、物理的プロセスパラメータの影響
本実施例において、ｓｉＲＮＡリポソーム組成物の特性における、収集、培養、および反応停止についての特定のプロセスパラメータの影響を、観察した。組成物は、実施例１に記載の基本プロトコルを用いることによって調製した。
各実施例において、組成物の活性薬剤は、ＡｐｏＢを発現抑制するためのｄｓＲＮＡであった。リポソーム形成成分は、脂質コレステリルヘミサクシネート（ＣＨＥＭＳ，Ａｎａｔｒａｃｅ，ＣＨ２１０）、コレステロール（Ａｎａｔｒａｃｅ ＣＨ２００）、およびＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）に加えて、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物Ｃ１８：１−ノルＡｒｇ（ＮＨ３Ｃｌ）−Ｃ１６を含有するエタノール−水溶液であった。
第１の実施例において、リポソーム粒径および分散度に対する、収集ステップでの有機溶媒の濃度の影響を、表７に示されるように観察した。有機溶媒エタノールの濃度は、流量および移送管径から算出した。表７の各製剤に対する培養時間は、４時間であった。
Figure 0006126072
 表７の結果は、一般に、収集リザーバ中の有機溶媒エタノールの濃度が増加するにつれて、リポソーム粒子の大きさが増加することを示した。また、有機溶媒の濃度が増加するにつれて、粒径分布の分散度も増加した。表７の結果は、活性ｓｉＲＮＡ薬剤の高レベルのカプセル化が、ｐＨ７．４で、衝突流および収集リザーバの混合物から調製されたリポソーム組成物で達成されたことを示した。
第２の実施例において、生体内マウスにおいて、リポソームｓｉＲＮＡ製剤の遺伝子発現抑制活性における培養時間の影響を観察した。ＡｐｏＢ遺伝子発現抑制活性は、リポソーム製剤に対する生体内マウス肝臓において決定した。ＡｐｏＢを発現抑制するための幾つかのＲＮＡｉ薬剤が、ＷＯ第０８／１０９３５７号に記載されている。
ＡｐｏＢ遺伝子発現抑制活性は、特定のリポソーム製剤に対する生体内マウス肝臓において決定し、マウス血清コレステロール値と比較した。生体内でのＡｐｏＢ ｍＲＮＡの低減活性および生体内での対応する血清コレステロールの低減を、表８に示す。表８の各リポソーム製剤は、［Ｃ１８−ノルＡｒｇ−Ｃ１６／ＣＨＥＭＳ／ｃｈｏｌ／ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋ（５０／２８／２０／２）］であった。それぞれの場合の用量は、１．０ｍｇ／ｋｇ／日であった。各製剤は、流量および移送管径に基づいて収集リザーバ中で３３％のエタノール濃度で調製した。
Figure 0006126072
 表８の結果は、培養時間が増加するにつれて、ＡｐｏＢ遺伝子発現抑制ＲＮＡｉ薬剤を含有するリポソーム製剤に対する生体内での遺伝子発現抑制ノックダウン活性が有利な値まで増加したことを示した。
第３の実施例において、リポソームｓｉＲＮＡ製剤の生体内での遺伝子発生の抑制活性に対する培養時間の影響を、表９に示されるように観察した。これらの実験において、リポソームｓｉＲＮＡ製剤は、ＴＦＦ濾過ではなく透析で調製した。組成物は、ｐＨ７．４で、衝突流および収集リザーバの混合物で調製した。収集リザーバ中の有機溶媒エタノールの濃度は、表９に示されるように３０〜３６％で変化させた。表９の各リポソーム製剤は、［Ｃ１８−ノルＡｒｇ−Ｃ１６／ＣＨＥＭＳ／ｃｈｏｌ／ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋ（５０／２８／２０／２）］であった。
Figure 0006126072
 表９の結果は、培養時間が使用された場合、ＡｐｏＢ遺伝子発現抑制ＲＮＡｉ薬剤を含有するリポソーム製剤における生体内マウス遺伝子発現抑制活性が、有利な値まで著しく増加したことを示した。
第４の実施例において、それらの生体内マウス遺伝子発現抑制活性に対するリポソームｓｉＲＮＡ製剤の反応停止処理の影響を、表１０に示されるように観察した。これらの実験において、リポソームｓｉＲＮＡ製剤は、ｐＨ７．４で、１時間の培養時間で、衝突流および収集リザーバの混合物で調製した。収集リザーバ中の有機溶媒エタノールの濃度を、表１０に示されるように、３３％からより低い濃度で反応停止処理した。表１０中の各リポソーム製剤は、［Ｃ１８−ノルＡｒｇ−Ｃ１６／ＣＨＥＭＳ／ｃｈｏｌ／ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋ］であった。製剤の安定性は、反応停止してから１時間後および４８時間後、平均粒径およびｓｉＲＮＡ活性薬剤のカプセル化を測定することによって決定した。
Figure 0006126072
 表１０の結果は、ＲＮＡｉ薬剤を含有するリポソーム製剤が、約２５％より低いエタノール濃度まで、反応停止してから４８時間にわたって安定した平均粒径およびＲＮＡｉ薬剤の高レベルのカプセル化を維持したことを示した。
実施例４
培養によって調製されるリポソーム組成物に対するｐＨの影響
本実施例において、リポソーム組成物の調製に対するｐＨの影響を観察した。組成物は、実施例１に記載の基本プロトコルを用いて、衝突および培養することによって調製した。
活性薬剤は、水溶液中で１ｍｇ／ｍＬに調製されたＡｐｏＢを発現抑制するためにｄｓＲＮＡであった。
リポソーム形成成分は、脂質コレステリルヘミサクシネート（ＣＨＥＭＳ，Ａｎａｔｒａｃｅ，ＣＨ２１０）、コレステロール（Ａｎａｔｒａｃｅ ＣＨ２００）、およびＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）に加えて、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物Ｃ１８：１−ノルＡｒｇ（ＮＨ３Ｃｌ）−Ｃ１６を含有するエタノール溶液であった。ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および脂質の相対量（５０／２８／２０／２）は、組成物（Ｃ１８：１−ノルＡｒｇ（ＮＨ３Ｃｌ）−Ｃ１６／ＣＨＥＭＳ／コレステロール／ＤＭＰＥ‐ＰＥＧ２ｋ）における、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物＋脂質の総量に対して各成分のパーセント（ｗ／ｗ）を示す。
表１１に示されるように、１２８〜１３７ｎｍのＺ平均粒径を有するｄｓＲＮＡ製剤を、ｐＨ７．４およびｐＨ４の両方で作製した。表１１の製剤を作製するためのプロトコルは、緩衝液を衝突流に添加し、約３３％にエタノール濃度を調節し、乱流混合することである。流れを収集し、収集混合物を、１時間培養した。
Figure 0006126072
 要約して言えば、表１１に示される結果、ならびに実施例３の表７、９、および１０に示される結果は、リポソームカプセル化ＲＮＡｉ誘導薬剤の製剤は、７．４のｐＨで調製されたことを示した。
実施例５
流量制御によるＲＮＡ含有リポソーム組成物の調製
本実施例において、リポソーム組成物は、ＲＮＡｉ薬剤溶液およびリポソーム形成成分の溶液の流量を用いて、衝突流の組成物を制御することによって調製した。組成物は、追加のＳＵＰ緩衝液を用いずに、ＲＮＡｉ薬剤溶液およびリポソーム形成成分の溶液の流量を調整して、収集リザーバ中の有機溶媒およびＲＮＡｉ薬剤の特定の濃度を達成することを除いては、実施例１に記載の基本プロトコルを用いて、衝突および培養することによって調製した。製剤は、収集され、１時間培養された、衝突流を用いて調製した。ｐＨは７．４であり、活性薬剤は、ＡｐｏＢを発現抑制するためにｄｓＲＮＡであった。
リポソーム形成成分は、脂質コレステリルヘミサクシネート（ＣＨＥＭＳ，Ａｎａｔｒａｃｅ，ＣＨ２１０）、コレステロール（Ａｎａｔｒａｃｅ ＣＨ２００）、およびＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）に加えて、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物Ｃ１８：１−ノルＡｒｇ（ＮＨ３Ｃｌ）−Ｃ１６を含有するエタノール溶液であった。ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および脂質の相対量は、（５０／２８／２０／２）であった。
表１２に示されるように、ｄｓＲＮＡ製剤は、ＲＮＡｉ薬剤溶液の流量／リポソーム形成成分の溶液の流量の比の１．７：１、３：１、および５：１を用いて調製した。
Figure 0006126072
 表１２の結果は、ＡｐｏＢ生体内マウスに対して活性薬剤の良好なカプセル化および遺伝子発現抑制活性を有するリポソーム組成物が、ＲＮＡｉ薬剤溶液の流量／リポソーム形成成分の溶液の流量比の約２〜約５で調製されたことを示した。
表１２の結果は、８０ｎｍ程度の低粒径分散度を有する平均粒径が、ＲＮＡｉ薬剤溶液の流量／リポソーム形成成分の溶液の流量の比の約３〜約５で達成されたことを示す。
実施例６
ＲＮＡ含有リポソーム組成物の濾過
本実施例において、リポソーム組成物の調製における、接線流濾過による活性ＲＮＡｉ薬剤の濃縮の効果を観察した。組成物は、収集リザーバ中で２２％のＥｔＯＨで衝突流を収集し、３０分間培養することによって、実施例１に記載の基本プロトコルを用いて、ｐＨ７．４で調製した。組成物は、接線流濾過のために、１０％のＥｔＯＨ濃度まで反応停止した。
リポソーム形成成分は、脂質コレステリルヘミサクシネート（ＣＨＥＭＳ，Ａｎａｔｒａｃｅ，ＣＨ２１０）、コレステロール（Ａｎａｔｒａｃｅ ＣＨ２００）、およびＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）に加えて、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物Ｃ１８：１−ノルＡｒｇ−Ｃ１６を含有するエタノール溶液であった。ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物および脂質の相対量は、（５０／２８／２０／２）であった。
製剤は、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＰＥＳカラムを用いて接線流濾過によって濾過した。表１３に示されるように、組成物は、接線流濾過下で、最大１６の因子で活性ＲＮＡｉ薬剤の濃縮を行って、粒径および活性ＲＮＡｉ薬剤のカプセル化について、安定性を保った。活性ＲＮＡｉ薬剤の最終濃度は、最大５ｍｇ／ｍｌであった。
Figure 0006126072
 実施例７
ＲＮＡ含有リポソーム組成物の安定性
本実施例において、リポソーム組成物の安定性を、昇温で７日間保持した後、観察した。組成物は、実施例１に記載の基本プロトコルを用いて、衝突させ、１時間培養っせることによって調製した。乱流混合管を使用し、収集リザーバ中のＥｔＯＨ濃度は、３３％であった。調製後、製剤は、４５℃の温度で、７日間保持した。７日後、平均粒径は、１１６ｎｍであり、カプセル化は、７１％であった。加熱処理した製剤については、ＡｐｏＢ生体内マウスの遺伝子発現抑制活性の喪失は、７日後には観察されなかった。
実施例８
ペプチド結合領域
カチオン性ペプチドのＲＮＡｉ誘導薬剤への結合の相対強度は、染色結合アッセイを用いて測定した。
ＲＮＡｉ誘導薬剤は、２０μｇ／ｍｌの原液を作製するために１０ｍｌ中で７．８μＬ、次いで、７５μＬ／ウェルで調製した。ＳＹＢＲ金の希釈は、２．５Ｘ原液のために、１：４０００の希釈で、１５ｍＬ中で３．７５μＬで調製した。
ペプチドは、５％ デキストロースを用いてＨｅｐｅｓ緩衝液中に溶解し、希釈した。ペプチドは、７５μＬを各ウェルに添加して、所望のＮ：Ｐ（０〜４の範囲）を得るようにさらに希釈した。ペプチドは、５０％の純度を有すると推定されたが、実際のペプチド量は、不明であった。
ＳＹＢＲ金の染色結合アッセイを行った。９６ウェルプレートは、１ウェル当たり１５０μＬの試料容量を用いてアッセイした。最終ｄｓＲＮＡ濃度は、ｐＨ７．４で、１０ｍＭ ｈｅｐｅｓ／５％デキストロース中で１０μｇ／ｍＬであった。ペプチドは、等容量を添加して、異なるＮ／Ｐ比を達するように、異なる作業用溶液に希釈した。添加手順については、ｄｓＲＮＡは、最初に、添加し（２０μｇ／ｍｌの７５μｌ）、次いで、１５０μｌの２．５Ｘ ＳＹＢＲ金を添加した。次いで、ペプチド（７５μＬ）を添加し、ＳＹＢＲ染色を完全に取り除いた。全容量は、３００μＬであった。蛍光は、緩衝液中で、単独で染色のバックグラウンドから修正された。ＳＹＢＲ金 ｅｘ／ｅｍは、４９５ｎｍ／５３７ｎｍであり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダー上で読み取った。
製剤粒径は、Ｗｙａｔｔ粒径測定装置を用いて試験するべき３８４ウェルプレートに移送することによって決定された。９６ウェルプレートの各ウェルは、二重で移送された。プレート中の残存している容量は、２００μｌであった。
ペプチド放出は、必要に応じて、ジスルフィド還元または酵素的切断によって引き起こされた。システイン終端ペプチドは、グルタチオン還元によって切断可能であった。Ｖ−Ｃｉｔ含有ペプチドは、カテプシンＢによる酵素的切断によって切断可能であった。グルタチオンは、細胞内に０．１〜１０ｍＭで存在し、カテプシンＢは、リソソーム中で１ｍＭであった。（０．１４ｎｇ／μｌで、カテプシンＢについては、Ｔｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ ＢＭＣ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００２， ２：１６を参照のこと）。
放出のために、適切な分子を、重複したウェルのうちの１つに、１ｍＭの最終濃度に添加し、次いで、経時的にＳＹＢＲ金の蛍光の測定を行った。
図６に示されるように、ポリアルギニン結合領域のｄｓＲＮＡへの結合は、ポリアルギニン結合領域の長さと共に増加した。図６において、最強の結合（ＳＹＢＲ金の染色を変位させる最大能力）が、ＰＮ３４９９、ペプチド（配列番号３５３）ＲＲＲＲＲＣＣＲＲＲＲＲで観察され、これは、合計１０個のアルギニンを含有する二量体ペプチドであった。
実施例９
Ａ５４９細胞におけるＰＰＩＢ遺伝子発現ノックダウンにおける体外アッセイ
シクロフィリンＢ（ＰＰＩＢ）遺伝子ノックダウン測定は、干渉ＲＮＡ送達製剤のための一次活性ベースの体外アッセイとして使用され得る。典型的には、測定は、軽微な変形を伴い、以下に記載されるようになされた。
シクロフィリンＢ（ＰＰＩＢ）遺伝子発現ノックダウンを、Ａ５４９ヒト肺胞基底上皮細胞において測定した。ＰＰＩＢ遺伝子ノックダウン測定のために、Ａ５４９細胞を、干渉ＲＮＡ製剤で形質移入し、総ＲＮＡを、形質移入から２４時間後に調製し、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。３６Ｂ４（酸性リボソームリンタンパク質ＰＯ）ｍＲＮＡ発現のＱＲＴ−ＰＣＲを、正規化のために行った。
Ａ５４９細胞を、７，５００細胞／ウェル（９６ウェル）で播種し、培地中で一晩培養した。形質移入時のコンフルエンシーは、約５０％であった。形質移入複合体を、干渉ＲＮＡを培地（ＯｐｔｉＭＥＭ（商標））に添加し、ボルテックスで撹拌し、送達製剤を培地（ＯｐｔｉＭＥＭ（商標））に別個に添加し、ボルテックスで撹拌し、最後に、該培地中の干渉ＲＮＡと、該培地中の送達製剤とを混合し、室温で２０分間培養して、該形質移入複合体を作製することによって、調製した。培養した細胞のための培地を、新たなＯｐｔｉＭＥＭ（商標）で置き換え、形質移入複合体を各ウェルに添加した。細胞を、５時間、３７℃および５％ ＣＯ２で培養し、次いで、完全培地を、（最終ウシ胎児血清濃度１０％になるまで）添加し、培養を、形質移入から２４時間後まで継続した。
ＰＰＩＢ遺伝子ノックダウンのために、細胞を溶解し、ＲＮＡを調製した（Ｉｎｖｉｓｏｒｂ ＲＮＡ Ｃｅｌｌ ＨＴＳ ９６−Ｋｉｔ／Ｃ，Ｉｎｖｉｔｅｋ，Ｂｅｒｌｉｎ、またはＲＮｅａｓｙ ９６ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ２サーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）でＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
ＰＰＩＢのために使用したプライマーは、以下であった。
（配列番号３５４）
５’−ＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＡＣ−３’（順方向）および
（配列番号３５５）
５’−ＣＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＣ−３’（逆方向）と、
（配列番号３５６）
該プローブのための、５’−ＦＡＭ−ＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧ−ＴＡＭＲＡ−３’。
３６Ｂ４については、プライマーは、以下であった。
（配列番号３５７）
５’−ＴＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡＣＡＡＡＣＧＡ−３’（順方向）および
（配列番号３５８）
５’−ＣＴＴＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧ−３’（逆方向）と、
（配列番号３５９）
該プローブのための、５’−ＦＡＭ−ＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡ−ＴＡＭＲＡ−３’。
本開示の幾つかの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の構造を表１４に示す。
Figure 0006126072
 表１４において、「ｍＵ」は、２’−Ｏ−メチルウリジンを表し、「ｓ」は、ホスホロチオエート連結を表す。
実施例１０
層状担体および刺激応答ペプチドを用いたＰＰＩＢ遺伝子発現ノックダウン
ＲＮＡｉ誘導薬剤のためのナノ粒子担体を、Ａ５４９細胞における、ＰＰＩＢ遺伝子ノックダウン活性に対して試験した。ｄｓＲＮＡ ＲＮＡｉ誘導薬剤と刺激応答ペプチドとの二元複合体は、まず、特定のＮ／Ｐ比で形成された。エンドソーム溶解性薬剤を添加し、Ｎ／Ｐ比を最終地に調整した。
層状担体の製剤は、一般に、最初に、ＨＥＰＥＳ／デキストロース緩衝液中にｄｓＲＮＡをボルテックスで撹拌することによって調製した。刺激応答ペプチドを、複合体ｄｓＲＮＡにボルテックスで撹拌しながら添加した。複合体は、１５分間培養した。グルタルアルデヒドを添加し、コアを１．５時間架橋させた。反応物を、１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ７．４を添加することにより反応停止させた。エンドソーム溶解性薬剤を添加し、担体混合物を、細胞に添加する前に、１５分間培養した。
刺激応答ペプチドを含む層状担体を用いて、ＰＰＩＢ遺伝子発現ノックダウン測定を、表１５に示す。表１５の結果は、刺激応答ペプチドを含む担体が、エンドソーム溶解性薬剤の存在下で、活性ｄｓＲＮＡ薬剤を細胞に送達するのに有効であり、有意な遺伝子発現抑制効果を生じることを示す。
Figure 0006126072
 本実施例において使用された物質は以下の通りであった。
ＰＮ４１１０
配列番号３７３
ＷＷＨＨＫＫＲＲＣＣＲＲＫＫＨＨＷＷ
ＰＮ３０３３（ｄｉＩＮＦ７）
配列番号３７４
ＮＨ２−ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣ−ＣＯ２Ｈ
刺激応答ペプチドを含む層状担体を用いて、ＰＰＩＢ遺伝子発現ノックダウン測定における最終Ｎ／Ｐ比の効果を、表１６に示す。表１６の結果は、刺激応答ペプチドを含む担体が、エンドソーム溶解性薬剤の存在下で、活性ｄｓＲＮＡ薬剤を細胞に送達するのに有効であり、有意な遺伝子発現抑制効果を生じることを示す。さらに、表１６の結果は、刺激応答ペプチドを含む層状担体に対する体外ノックダウンが、２．５〜３．５のさらに低い最終Ｎ／Ｐ比で増加されることを示す。
Figure 0006126072
 実施例１１
有利に低い送達効率比を有する担体粒子
担体ナノ粒子のバッチは、ＰＮ４１１０で濃縮したＤＸ４２２７を用いて調製した。バッチの送達効率比は、０．６３であった。粒径は、２２３ｎｍ（Ｚ平均、ＰＤＩ０．２）であった。
担体ナノ粒子のバッチは、ＰＮ１８３で濃縮したＤＸ４２２７を用いて調製した。バッチの送達効率比は、１．２８であった。粒径は、２０８ｎｍ（Ｚ平均、ＰＤＩ０．２）であった。
本実施例において使用された物質は以下の通りであった。
ＰＮ１８３
配列番号３７５
ＮＨ２−ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ
実施例１２
担体粒子を取り込んだアミノ酸脂質から調製されたリポソーム製剤
アミノ酸脂質を有するＲＮＡｉ薬剤のリポソーム製剤を、表１７に示す組成物で調製した。ＡｐｏＢを対象とするＲＮＡｉ薬剤は、ＷＯ第０８／１０９３５７号に記載される。
Figure 0006126072
 実施例１３
ペプチド縮合担体粒子を取り込んだアミノ酸脂質から調製されたリポソーム製剤を用いた体外ＨｅｐＧ２細胞におけるＡｐｏＢ遺伝子発現抑制ノックダウン
ＡｐｏＢ遺伝子発現抑制活性を、ペプチド縮合担体粒子を取り込んだアミノ酸脂質から調製されたリポソーム製剤のために体外において決定した。ＡｐｏＢ遺伝子ノックダウン活性は、ＨｅｐＧ２細胞における、体外アッセイから得られた。製剤のための正規化ＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現値を測定した。
ＨｅｐＧ２アッセイについての方法およびプロトコルは、以下の通りであった。
１日目：２５μＬの複合体を、ウェルに添加し、次いで、７５μＬ 細胞を、１０％ ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中または血清のないＯＰＴＩＭＥＭ中のウェルに添加した。血清のないＯＰＴＩＭＥＭ中の場合、２０％ 血清を有する１００μＬの完全培地を、最終１０％ ＦＢＳ濃度で、４〜５時間後に添加した。
２日目：３日目に、細胞を２４時間溶解し、ＲＮＡを調製し、ｑＲＴ−ＰＣＲを、ＡｐｏＢおよび３６Ｂ４に対して行うか、またはＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを行った。
リポソーム製剤［Ｃ１８：１−ノルＡｒｇ−Ｃ１６／ＣＨＥＭＳ／ｃｈｏｌ／ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋ（５０／３２／１６／２）］を調製し、Ｃ１８：１−ノルＡｒｇ−Ｃ１６は、米国特許出願第１２／１１４，２８４号に記載のアミノ酸脂質であった。リポソーム製剤は、ペプチド縮合担体粒子ＤＸ４２２７／ＰＮ４１１０を取り込んだ。初期Ｎ／Ｐ比は、０．８であった。本製剤は、１００ｎＭのＤＸ４２２７ ＲＮＡｉ薬剤の濃度に対するＱｎｅｇと比較して、９１％ノックダウンを示した。
さらなるリポソーム製剤［Ｃ１８：１−ノルＡｒｇ−Ｃ１６／ＣＨＥＭＳ／ｃｈｏｌ／ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋ（５０／３２／１６／２）］を調製し、表１８に示されるように、ペプチド縮合担体粒子ＤＸ４２２７／ＰＮ１８３を取り込んだ。
Figure 0006126072
 表１８に示されるように、これらの製剤は、２５ｎＭおよび２．５ｎＭのＤＸ４２２７ ＲＮＡｉ薬剤の濃度に対するＱｎｅｇと比較して、有利に高いノックダウン活性を示した。
実施例１４
ペプチド縮合担体粒子を取り込んだアミノ酸脂質から調製されたリポソーム製剤を用いた生体内でのＡｐｏＢ遺伝子発現抑制ノックダウン
リポソーム製剤を、ＡｐｏＢ遺伝子発現抑制ＲＮＡｉ薬剤を含有するペプチド縮合担体粒子を取り込んだアミノ酸脂質で調製した。ＡｐｏＢ遺伝子発現抑制活性は、これらのリポソーム製剤に対する生体内マウスにおいて決定し、マウス血清コレステロール値と比較した。生体内でのＡｐｏＢ ｍＲＮＡの低減活性および生体内での対応する血清コレステロールの低減を、表１９に示す。表１９のリポソーム製剤は、［Ｃ１８：１−ノルＡｒｇ−Ｃ１６／ＣＨＥＭＳ／ｃｈｏｌ／ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋ（５０／３２／１６／２）］であり、それぞれの場合の用量は、２ｍｇ／ｋｇであった。
Figure 0006126072
 表１９の結果は、ＡｐｏＢ遺伝子発現抑制ＲＮＡｉ薬剤を含有するペプチド縮合担体粒子を取り込んだリポソーム製剤が、ペプチド縮合担体粒子を有さない同一の製剤と比較して、投与から４８時間後に、一般に高い体重増加のため、マウスにおいて、有利に良好な耐容性を示すことを示す。
さらに、表１９の結果は、ペプチド縮合担体粒子を取り込んだリポソーム製剤が、ＡｐｏＢ ｍＲＮＡの低減および血清コレステロールの低減の両方に関して、生体内でのＡｐｏＢ遺伝子発現抑制に対して、有利に高い活性であったことを示す。表１９の結果は、より高い初期Ｎ／Ｐの１．０およびより低い最終Ｎ／Ｐの０．６〜０．７が好ましいことを示す。
さらなるリポソーム製剤は、ＡｐｏＢ遺伝子発現抑制ＲＮＡｉ薬剤を含有するペプチド縮合担体粒子を取り込んだアミノ酸脂質で調製した。ＡｐｏＢ遺伝子発現抑制活性は、これらのリポソーム製剤に対する生体内マウスにおいて決定し、マウス血清コレステロール値と比較した。生体内でのＡｐｏＢ ｍＲＮＡの低減活性および生体内での対応する血清コレステロールの低減を、表２０に示す。
Figure 0006126072
 表２０のペプチド縮合担体粒子を取り込んだリポソーム製剤については、製剤３の送達効率比が、９．２１であり、製剤４の送達効率比が、９．８６であった。
表２０の結果は、ＡｐｏＢ遺伝子発現抑制ＲＮＡｉ薬剤を含有するペプチド縮合担体粒子を取り込んだリポソーム製剤が、ペプチド縮合担体粒子を有さない同一の製剤の体重減少と比較して、投与から４８時間後に、一般に高い体重増加のため、マウスにおいて、有利に良好な耐容性を示すことを示す。
さらに、表２０の結果は、ペプチド縮合担体粒子を取り込んだリポソーム製剤が、ＡｐｏＢ ｍＲＮＡの低減および血清コレステロールの低減の両方に関して、生体内でのＡｐｏＢ遺伝子発現抑制に対して、有利に高い活性であったことを示す。

Claims (13)

  1. 活性薬剤を含む組成物を作製するためのプロセスであって、
    ａ） 活性薬剤の水性緩衝溶液を含む第１の流れを提供することと、
    ｂ） 水と混合できる有機溶媒、アルカノール、（Ｃ１−６）アルカノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｓｅｃブタノール、ｔ−ブタノール、アルカノール水、エタノール水、アセトニトリル、アセトン、ケトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤溶液、洗浄用溶液、またはこれらの組み合わせ中に１つ以上のリポソーム形成化合物の非水性溶液を含む第２の流れを提供することと、
    ｃ） 前記第１の流れと前記第２の流れとを衝突させ、それによって、２０％〜５０％ｖ／ｖの前記有機溶媒、アルカノール、（Ｃ１−６）アルカノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｓｅｃブタノール、ｔ−ブタノール、アルカノール水、エタノール水、アセトニトリル、アセトン、ケトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤溶液、洗浄用溶液、またはこれらの組み合わせの濃度を有し、６〜７．４のｐＨを有する、衝突流を形成することと、
    ｄ） ２０℃〜３５℃の温度で、０．５時間〜８時間、収集リザーバ中で前記衝突流を培養し、それによって、リポソームを含む培養物を形成することと、
    を含み、
    ここに、前記リポソーム形成化合物は、ＰＯＮＡであり、前記ＰＯＮＡは、Ｃ１８：１−ノルＡｒｇ−Ｃ１６である、プロセス。
  2. 前記第１の流れの体積流量は、前記第２の流れの体積流量の２倍以上である、請求項１に記載のプロセス。
  3. 前記衝突流の前記ｐＨを、３〜６であるように調節することと、
    ３〜６のｐＨで培養することと
    をさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
  4. 前記有機溶媒、アルカノール、（Ｃ１−６）アルカノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｓｅｃブタノール、ｔ−ブタノール、アルカノール水、エタノール水、アセトニトリル、アセトン、ケトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤溶液、洗浄用溶液、またはこれらの組み合わせの濃度を調節するために、前記収集リザーバに緩衝液を添加することをさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
  5. 前記活性薬剤が、５０％を上回るレベルでリポソーム中にカプセル化される、請求項１に記載のプロセス。
  6. 前記活性薬剤が、７０％を上回るレベルでリポソーム中にカプセル化される、請求項１に記載のプロセス。
  7. 前記活性薬剤は、遺伝子発現抑制剤、遺伝子調節剤、アンチセンス薬剤、ペプチド核酸薬剤、リボザイム薬剤、ＲＮＡ薬剤、ＤＮＡ薬剤、またはロックされない核酸塩基アナログを含有するｓｉＲＮＡである、請求項１に記載のプロセス。
  8. 接線流濾過後、前記リポソームは、直径１６０ｎｍ未満の均一の大きさである、請求項１に記載のプロセス。
  9. 接線流濾過後、前記リポソームは、４０ｎｍ〜１６０ｎｍの平均直径を有する、請求項１に記載のプロセス。
  10. 接線流濾過後、前記リポソームは、８０ｎｍ〜１５０ｎｍの平均直径を有する、請求項１に記載のプロセス。
  11. 前記有機溶媒は、注射用の滅菌水中で４０〜９９％ｖ／ｖの濃度の（Ｃ１−６）アルカノールである、請求項１に記載のプロセス。
  12. 前記培養時間は、１時間〜４時間である、請求項１に記載のプロセス。
  13. ヒトの細胞を除く生体細胞に治療核酸を送達するための方法であって、請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載のプロセスに従って組成物を調製することと、前記組成物で前記細胞を処置することと、を含む、方法。
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