KR101797168B1

KR101797168B1 - 신규의 프로테인 트랜스덕션 도메인을 함유하는 구형 구조체

Info

Publication number: KR101797168B1
Application number: KR1020160149622A
Authority: KR
Inventors: 장상호; 이길환; 황정순; 김지안; 박주희; 이정옥; 조현종; 정재영
Original assignee: 주식회사 바이오셀트란; 제이앤팜유한책임회사
Priority date: 2016-11-10
Filing date: 2016-11-10
Publication date: 2017-11-13
Also published as: WO2018088734A3; WO2018088734A2

Abstract

본 발명은 신규의 프로테인 트랜스덕션 도메인이 자가조립된 구형 구조체에 관한 것으로, 본 발명의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 이용할 경우, 세포 또는 피부 침투성이 한층 증진된 구형 구조체 (일 예로, 리포좀)를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에서 제조된 구형 구조체 (일 예로, 리포좀)를 이용할 경우, 난용성 물질 (피부기능성 물질 또는 약리학적 효능 물질)을 구조체 내부에 탑재시켜 피부 또는 세포로 효율적으로 수송할 수 있다.

Description

신규의 프로테인 트랜스덕션 도메인을 함유하는 구형 구조체 {Vesicle with novel protein transduction domain}

본 발명은 활성 성분 또는 유용 성분을 세포 또는 피부로 전달할 수 있는 구형 구조체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신규의 프로테인 트랜스덕션 도메인을 함유하는 구형 구조체에 관한 것이다.

PTD(Protein transduction domain)는 자신의 분자량의 수배에 이르는 거대분자를 세포 안으로 운반할 수 있는데, 다양한 세포 형태에 대해서도 효율적이라는 점에서 의약품, 기능성 식품 또는 기능성 화장품에 함유되어 있는 활성 성분 또는 유효 성분을 효율적으로 세포 안으로 침투시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있는 것으로 평가된다.

예를 들어, 표적 물질과 결합한 PTD는 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 세포막을 전위시켜 세포 및/또는 세포 핵 내로 진입할 수 있다. 항원성 펩타이드, 펩타이드 핵산, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 전장 단백질, 나노 입자, 리포좀과 같은 다양한 생체 분자들은 PTD를 통하여 전달될 수 있는 것으로 알려져 있다.

대부분의 펩타이드 또는 핵산 기반의 의약품이 세포 내로의 유입이 곤란하여 이들 물질의 치료제로서의 개발에 한계로 작용하고 있다는 점을 고려해 볼 때, PTD는 이들 의약품의 생체 내에서의 효율을 배가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

이러한 PTD는 피부로의 약물 전달에 있어서도 단순 혼합물이나 약물에 직접 화학 결합시켜 적용된 바 있다. 하지만, PTD와 약물을 혼합한 경우에는 PTD와 약물의 피부 투과 시간 격차가 발생할 수 있으며, 난용성 약물은 적용에 한계가 존재하고, 투여 조건에 따라 큰 편차를 야기할 수 있다. 또한, 화학 결합 역시 활성 물질과 펩타이드와의 결합의 용이성 및 활성 물질의 활성 유지 여부에 문제점이 발생하여 그 활용이 매우 제한적이다.

한편, 난용성 약물은 화합물의 구조상 소수성 부위를 포함하고 있어 물에 잘 녹지 않는데, 난용성으로 인해 그 실용성이 제한되는 경우가 많다. 예를 들어, 신약으로 개발되는 약물 중 약 41% 이상이 난용성으로 인하여 중도에 포기되고 있으며, 미국 약전(US Pharmacopeia)에 등재된 약물의 약 ⅓이상이 난용성 약물로 분류되고 있다.

난용성 약물의 대표적인 예로, 카페익산 (Caffeic acid), 코엔자임큐텐(coenzyme Q10), 우르소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid), 일라프라졸(ilaprazol), 파클리탁셀(paclitaxel), 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate) 등이 있으며, 이러한 약물들은 우수한 효능에도 불구하고 난용성으로 인하여 사용이 제한된다.

이러한 난용성 약물을 사용하기 위해서는 난용성을 해결하기 위한 부가적인 물질이 첨가되어야 한다. 예컨대, 일반적으로 난용성 물질을 수용화하기 위해서는 유화제를 이용한 유화, 리포좀을 이용한 포집 등이 널리 이용되고 있다.

한편, 리포좀과 PTD를 결합시킬 경우, 리포좀의 피부 투과 기능(vesicular skin penetration), 투과 촉진 기능(penetration enhancing effect), 땀샘을 포함한 부속기관을 통한 침투(penetration of liposomes through the transappendageal route) 기능과, PTD의 피부 세포 내 약물 이입 촉진 및 이에 의한 농도 구배 형성 작용에 의한 피부 침투 증가 기전이 함께 적용됨으로써, 약물의 피부 침투성을 상승적으로 향상시킬 수 있다.

대한민국 특허공개번호 제10-2011-0046961호 (공개일자 2011.05.06)에는, 세포투과성 펩타이드 표면 결합 나노 리포좀 및 이를 포함하는 항-아토피 조성물이 기재되어 있다.

본 발명에서는 본 발명자들이 개발한 새로운 PTD를 이용하여, 세포 또는 피부 침투성이 한층 증진된 구형 구조체를 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 친수성 부위와 소수성 부위를 갖는 양친매성 분자가 자가응집하여 형성되는 구형 구조체에 있어서, 상기 구형 구조체에는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 함유된 것을 특징으로 하는 구형 구조체를 제공한다.

또한, 본 발명은 지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 결합시킴으로써 제조한 양친매성 분자가 자가응집하여 형성되는 구형 구조체를 제공한다. 이때, 상기 지질은, 일 예로, 말레이미드, N-하이드록시석시니미드, 아민, 카르복실산, 하이드록실과 같은 관능기가 결합되어 있는 포스파티딜콜린; 포스파티딜에탄올아민; 포스파티딜글리세롤; 포스파티딜세린; 포스파티딜이노시톨; 세라마이드; 스핑가닌; 파이토스핑고신; 스핑고신; 디메틸디옥타데실암모늄; 디올레오일트리메틸암모늄프로판; 및 디옥타데세닐트리메틸암모늄프로판; 중 선택되는 어느 하나 또는 이들의 유도체일 수 있다.

본 발명의 구형 구조체에 있어서, 상기 구형 구조체는, 바람직하게 양친매성 분자의 소수성 분자들이 서로 맞닿도록 배향되어 이중막 형태의 테둘레를 구성하는 것을 특징으로 하는 구형 구조체일 수 있다. 이때, 상기 구형 구조체는, 일 예로, 리포좀일 수 있다.

본 발명의 구형 구조체에 있어서, 상기 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는, 바람직하게 구형 구조체의 외부 방향으로 배향되어 것이 좋다.

본 발명의 구형 구조체에 있어서, 상기 구형 구조체는, 바람직하게 콜레스테롤이 소수성 부위에 함유되어 있는 것이 좋다.

본 발명의 구형 구조체에 있어서, 상기 구형 구조체는, 바람직하게 내부에 포집대상물질을 내포하고 있는 것일 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 본 발명의 구형 구조체를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 구형 구조체를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명은 양친매성 분자, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 포집대상물질을 용매에 용해시키는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 용매를 증발시켜 필름을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b) 후, 필름에 정제수 또는 완충액을 첨가하여, 수화시킨 후, 에너지를 가해 입자 크기를 감소시키는 단계 (c);를 포함하는 것을 특징으로 하는 구형 구조체의 제조방법을 제공한다. 이때, 상기 양친매성 분자는, 일 예로, 인지질일 수 있다.

본 발명은 지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 결합시킴으로써 제조한 양친매성 분자 및 포집대상물질을 용매에 용해시키는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 용매를 증발시켜 필름을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b) 후, 필름에 정제수 또는 완충액을 첨가하여, 수화시킨 후, 에너지를 가해 입자 크기를 감소시키는 단계 (c);를 포함하는 것을 특징으로 하는 구형 구조체의 제조방법을 제공한다. 이때, 상기 단계 (a)는, 바람직하게 지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 결합시킴으로써 제조한 양친매성 분자 외에, 별도의 양친매성 분자를 용매에 더 첨가하여 용해시키는 것이 좋다. 이때, 상기 별도의 양친매성 분자는, 일 예로, 인지질일 수 있다.

본 발명의 구형 구조체 제조방법에 있어서, 상기 지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 결합시킴으로써 제조한 양친매성 분자는, 일 예로, 필름 형태의 지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 함유하는 용액을 첨가하여, 지질과 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 간의 결합 반응을 유도함으로써 제조하되, 상기 필름 형태의 지질은, 지질을 소수성 유기용매에 녹인 후, 유기용매를 휘발시켜 필름 형태로 제조한 것이고, 상기 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 함유하는 용액은, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암모니움 카르보네이트과 함께 증류수에 녹인 후, pH 8~10로 조절하여 제조한 것일 수 있다. 이때, 상기 지질은, 일 예로, 말레이미드, N-하이드록시석시니미드, 아민, 카르복실산, 하이드록실과 같은 관능기가 결합되어 있는 포스파티딜콜린; 포스파티딜에탄올아민; 포스파티딜글리세롤; 포스파티딜세린; 포스파티딜이노시톨; 세라마이드; 스핑가닌; 파이토스핑고신; 스핑고신; 디메틸디옥타데실암모늄; 디올레오일트리메틸암모늄프로판; 및 디옥타데세닐트리메틸암모늄프로판; 중 선택되는 어느 하나 또는 이들의 유도체일 수 있다.

본 발명의 구형 구조체 제조방법에 있어서, 상기 단계 (a)는, 바람직하게 콜레스테롤을 추가로 용매에 용해시키는 것이 좋다.

본 발명의 구형 구조체 제조방법에 있어서, 상기 용매는, 일 예로, 클로로포름과 메탄올의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 이용할 경우, 세포 또는 피부 침투성이 한층 증진된 구형 구조체 (일 예로, 리포좀)를 제조할 수 있다.

또한, 상기와 같이 본 발명에서 제조된 구형 구조체 (일 예로, 리포좀)를 이용할 경우, 난용성 물질 (피부기능성 물질 또는 약리학적 효능 물질)을 구조체 내부에 탑재시켜 피부 또는 세포로 효율적으로 수송할 수 있다.

도 1은 일반적인 GFP 발현 벡터의 맵이다.
도 2는 TAT-GFP 발현 벡터의 맵이다.
도 3은 PEP1-GFP 발현 벡터의 맵이다.
도 4는 STeP-GFP 발현 벡터의 맵이다.
도 5는 GFP 재조합 단백질의 발현 결과이다.
도 6은 GFP 재조합 단백질의 정제 결과이다.
도 7은 GFP 단백질의 세포 투과력 비교 결과이다.
도 8은 GFP 단백질의 피부 투과력 비교 결과이다.
도 9는 지질(DSPE-PEG3.4K-maleimide)-PTD(STeP 펩타이드)의 화학적 구조를 보여준다.
도 10은 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)의 입자 특성 평가 결과이다.
도 11은 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)의 입자 모양 (TEM image) 관찰 결과이다 (좌: 리포좀-(카페익산), 우: 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)).
도 12는 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)의 입자 안정성 평가 결과이다.
도 13은 산화스트레스에 의한 세포 손상에서 카페익산의 세포 보호 효과를 비교한 결과이다.
도 14는 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)의 피부 투과력 비교 결과이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 목적 물질을 세포 내로 전달할 수 있는 보다 효율적인 펩타이드 및 이를 이용한 약물전달체(drug delivery system)를 개발하고자 노력한 결과, 서열번호 1에 기재된 세포투과 펩타이드 및 이를 함유한 원형의 구형체 (예로써, 리포좀)를 개발하였다.

서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 펩타이드는 양친매성 특성의 띄며, 목적 물질의 세포 내 전달에 효율적으로 적용될 수 있는 것이 하기 본 발명의 실험을 통해 확인되었다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은, 바람직하게 서열번호 2에 기재된 핵산 서열로 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 필요 목적에 따라, 본 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 필요 목적의 구현을 위한 펩타이드를 결합시킬 수도 있다.

본 발명은 친수성 부위와 소수성 부위를 갖는 양친매성 분자가 자가응집하여 형성되는 구형 구조체에 있어서, 상기 구형 구조체에는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 함유된 것을 특징으로 하는 구형 구조체를 제공한다. 또한, 본 발명은 지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 결합시킴으로써 제조한 양친매성 분자가 자가응집하여 형성되는 구형 구조체를 제공한다.

분자 내에 친수성 부위와 소수성 부위를 갖는 양친매성 분자를, 일 예로써 수용성 용액 중에 분산시키면, 소수성 부분끼리 자가응집(회합)하여 소수성 부분이 중심으로 모이는 구형의 구조체를 형성하게 된다. 이를 소위 '마이셀(micelle)'이라 하는데, 이와 같이 형성된 구형의 구조체는 소수성 부분에 지용성 물질을 탑재시켜 해당 지용성 물질의 이송을 위한 수단으로 활용될 수가 있다. 또한, 양친매성 분자들은 수용성 용액 중에 분산 시, 소수성 분자들이 서로 맞닿도록 배향되어 이중막 형태의 테둘레를 구성할 수도 있는데, 양친매성 분자로써 인지질이 사용되어 이중막 형태로 제조된 것을 리포좀(liposome)이라 한다. 리포좀은 안쪽에 친수성 부분의 공간이 존재하고, 그 주변을 소수성의 인지질 이중막이 형성되어 있는 구조이다. 리포좀은 그 내부에 수용성 물질을 탑재시켜, 해당 수용성 물질의 이송을 위한 수단으로 많이 활용되고 있다. 특히, 여러가지 유용한 수용성 물질의 인체 내 전달을 위한 수단으로 화장품 또는 의약품 분야에서 많이 활용되고 있다.

한편, 본 발명의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 양친매성을 가지는데, 지질에 결합될 경우, 전체 지질에 양친매성을 부여할 수 있는 파트너로써의 역할을 수행하게 된다. 이렇게 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 결합되어 양친매성을 나타내게 되는 지질은 수용액에 분산시 자가응집 (또는 자가조립)되어 단일막의 구형 구조체 (소위, '마이셀') 또는 이중막의 구형 구조체 (대표적인 예로써, '인지질')을 형성하게 된다. 이때, 상기 지질은 일 예로서, 말레이미드, N-하이드록시석시니미드, 아민, 카르복실산, 하이드록실과 같은 관능기가 결합되어 있는 포스파티딜콜린; 포스파티딜에탄올아민; 포스파티딜글리세롤; 포스파티딜세린; 포스파티딜이노시톨; 세라마이드; 스핑가닌; 파이토스핑고신; 스핑고신; 디메틸디옥타데실암모늄; 디올레오일트리메틸암모늄프로판; 및 디옥타데세닐트리메틸암모늄프로판; 중 선택되는 어느 하나 또는 이들의 유도체일 수 있다.

한편, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 구형 구조체에 함유되어 본 발명 구형 구조체의 세포 내 또는 피부 내 침투를 도우는 역할을 수행하기도 한다.

한편, 본 발명의 '서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드'는, 바람직하게 구형 구조체의 외부 방향으로 배향될 수 있다. 이와 같은 구조에 의해 구형 구조체의 외부 방향으로 배향된 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 PTD(protein transduction domaim)로써 역할을 수행하게 되고, 구형 구조체를 세포 또는 피부 내로 용이하게 이송하게 된다.

한편, 본 발명의 구형 구조체는, 콜레스테롤이 소수성 부위에 함유되어 있을 수 있는데, 그를 통해 구형 구조체의 구조를 안정화시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 구형 구조체에 있어서, 상기 구형 구조체는, 바람직하게 내부에 포집대상물질을 내포하고 있는 것일 수 있다. 포집대상물질은 다양할 수 있는데, 마이셀 형태의 구형 구조체에서는 소수성 물질을 내부에 탑재할 수 있고, 이중막 형태의 구형 구조체 (일 예로써, 리포좀)에서는 친수성 물질을 내부에 탑재할 수 있다. 포집대상물질은 일 예로, 생리기능성물질, 피부기능성물질, 약학물질 등이 있을 수 있고, 그 형태로는 화합물, 펩타이드, 단백질 등이 있을 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 본 발명의 구형 구조체를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 구형 구조체를 함유하기만 하면 특정의 화장품 제형으로 반드시 한정되는 것은 아니고, 모든 제형을 다 포함한다.

또한, 본 발명의 구형 구조체를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물의 경우도 본 발명의 구형 구조체를 함유하기만 하면 특정의 약학 제형으로 반드시 한정되는 것은 아니고, 모든 제형을 다 포함한다.

또한, 본 발명은 지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 결합시킴으로써 제조한 양친매성 분자 및 포집대상물질을 용매에 용해시키는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 용매를 증발시켜 필름을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b) 후, 필름에 정제수 또는 완충액을 첨가하여, 수화시킨 후, 에너지를 가해 입자 크기를 감소시키는 단계 (c);를 포함하는 것을 특징으로 하는 구형 구조체의 제조방법을 제공한다. 이때, 상기 단계 (a)는, 바람직하게 지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 결합시킴으로써 제조한 양친매성 분자 외에, 별도의 양친매성 분자를 용매에 더 첨가하여 용해시키는 것이 좋다. 이때, 상기 별도의 양친매성 분자는, 일 예로, 인지질일 수 있다. 또한, 상기 에너지를 가해 입자 크기를 감소시키는 단계는 초음파를 가함으로써 수행할 수 있다.

본 발명은 상기 과정을 통해 포집대상물질이 내포된 구형 구조체를 제조할 수 있는데, 양친매성 분자로 인지질을 사용할 경우, 리포좀으로 제조할 수 있다. 상기 본 발명의 구형 구조체 제조방법은, 원형 구조체의 구조적 안정성을 증대시키기 위하여, 단계 (a)에서 콜레스테롤을 추가로 용매에 용해시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 구형 구조체 제조방법에서, 상기 용매는, 일 예로 클로로포름과 메탄올의 혼합물을 사용할 수 있다.

본 발명의 구형 구조체 제조방법은, '서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드'를 사용함에 특징이 있는 것으로써, 양친매성 분자를 사용하여 구형 구조체를 제조하는 방법(일 예로써, 인지질을 사용하여 리포좀을 제조하는 것을 포함)은 당업계에 널리 알려져 있기 때문에, 상기 구형 구조체의 제조를 위한 각 단계에 대한 구체적인 설명은 생략하기로 한다.

한편, 본 발명의 구형 구조체의 제조방법에 있어서, 상기 지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 결합시킴으로써 제조한 양친매성 분자는, 일 예로, 필름 형태의 지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 함유하는 용액을 첨가하여, 지질과 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 간의 결합 반응을 유도함으로써 제조할 수 있다. 이때, 상기 필름 형태의 지질은, 지질을 소수성 유기용매에 녹인 후, 유기용매를 휘발시켜 필름 형태로 제조한 것이고, 상기 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 함유하는 용액은, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암모니움 카르보네이트과 함께 증류수에 녹인 후, pH 8~10로 조절하여 제조한 것일 수 있다. 이때, 상기 지질은, 일 예로, 말레이미드, N-하이드록시석시니미드, 아민, 카르복실산, 하이드록실과 같은 관능기가 결합되어 있는 포스파티딜콜린; 포스파티딜에탄올아민; 포스파티딜글리세롤; 포스파티딜세린; 포스파티딜이노시톨; 세라마이드; 스핑가닌; 파이토스핑고신; 스핑고신; 디메틸디옥타데실암모늄; 디올레오일트리메틸암모늄프로판; 및 디옥타데세닐트리메틸암모늄프로판; 중 선택되는 어느 하나 또는 이들의 유도체일 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은, 서열번호 1에 기재된 27개의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 통해 한층 증진된 세포투과 또는 피부투과성을 보이며, 구조체 내부에 목적물질을 탑재하여 세포 또는 피부 내로 이송 가능하다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

[ 실시예 1. 세포 및 피부 투과성 GFP 단백질 발현 벡터의 제작]

거대 분자 단백질 또는 펩타이드를 세포 및 피부 내로 용이하게 전달할 수 있도록 하기 위하여 세포 및 피부 투과능을 갖는 펩타이드와 전달하고자 하는 단백질(cargo)을 융합하여 재조합 단백질 발현 벡터를 제조하였다.

본 실시예에서는 이러한 융합 단백질이 얼마나 세포 및 피부에 전달될 수 있는지의 전달 능력을 용이하게 분석하기 위하여 전달하고자 하는 목적 단백질(cargo)로써, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescence Protein: 이하“GFP”라 약칭함)을 선택하였다.

기존에 잘 알려진 PTD인 TAT 또는 PEP1을 GFP에 융합하여, 본 발명에서 신규로 개발된 STeP (서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2의 핵산 서열로 암호화됨)와 세포 및 피부 내 전달 능력을 비교하고자 하였다.

(1) pGFP 벡터 제작

GFP의 염기서열에 해당하는 DNA 절편을 플라스미드 pET15b의 XhoI, BamHI 자리에 서브클론하여 GFP 단백질을 발현시키는 pGFP를 제조하였다. pGFP 발현 벡터에는 세포 및 피부투과능을 갖는 펩타이드가 융합되지 않았고, GFP는 약 29kDa의 친수성 고분자 단백질이기 때문에, 이 벡터에서 발현된 GFP는 세포 및 피부에 전달할 수 있는 능력이 없다고 할 수 있다. 따라서, 세포 및 피부 투과성 비교를 위한 대조군으로써 제작한 것이다.

GFP의 염기서열에 해당하는 DNA 절편을 플라스미드 pEGFP-C2(클론텍)를 이용하여 Pfu DNA 중합효소로 중합효소 연쇄반응(PCR)시켜 GFP의 완전한 서열을 증폭하였다. 정방향 개시체(sense primer)는 5'- CTCGAGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3'이고, 역방향 개시체(antisense primer)의 서열은 5'-GGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCC ATGCCGAG-3'이다. PCR산물은 Xho I- Bam HI으로 잘리며, pET15b(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 XhoI - BamHI 자리에 서브클론되어 일반적인 GFP 단백질을 발현시키는 pGFP를 제조하였다. 도 1은 일반적인 GFP 발현 벡터의 맵이다.

(2) pTAT - GFP 벡터 제작

HIV-1 TAT와 융합된 GFP를 발현시키는 pTAT-GFP는 다음의 방법으로 제작하였다. 첫째, 두 개의 올리고뉴클레오타이드가 제조되어 HIV-1 TAT의 9개의 아미노산을 코딩하는 이중사슬 올리고뉴클레오타이드로 합성되었다. HIV-1 TAT의 9개 아미노산을 코딩하는 서열은 위쪽 사슬 5'-TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC-3'과 아래쪽 사슬 5'-TCGAGTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC-3'이다. 이중사슬 올리고뉴클레오타이드는 직접 pGFP의 NdeI - XhoI으로 서브클론되어 TAT-GFP 단백질을 발현시키는 pTAT-GFP를 제작하였다. 도 2는 TAT-GFP 발현 벡터의 맵이다.

(3) pPEP1 - GFP 벡터 제작

PEP1이 융합된 GFP를 발현시키는 pPEP1-GFP는 다음의 방법으로 제작하였다. 첫째, 두 개의 올리고뉴클레오타이드 위쪽사슬 5'-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGAGCCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC-3'과 아래쪽 사슬 5'-TCGAGCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGAGACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3'이 합성되어 PEP1 펩타이드를 코딩하는 이중사슬 올리고뉴클레오타이드를 만들었다.

이중사슬 올리고뉴클레오타이드는 직접 pGFP의 NdeI - XhoI으로 서브클론되어 PEP1-GFP 단백질을 발현시키는 pPEP1-GFP를 제작하였다. 도 3은 PEP1-GFP 발현 벡터의 맵이다.

(4) pSTeP - GFP 벡터 제작

본 발명의 STeP이 융합된 GFP를 발현시키는 pSTeP-GFP는 다음의 방법으로 제작하였다. 첫째, 두 개의 올리고뉴클레오타이드 위쪽사슬 5'-TATG AAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCCCAGCCGTATGGCCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTC-3'과 아래쪽 사슬 5'- TCGAGACGACGACGCTGACGACGTTTTTTACGGCCATACGGCTGGGACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3'이 합성되어 STeP 펩타이드를 코딩하는 이중사슬 올리고뉴클레오타이드를 만들었다. 이중사슬 올리고뉴클레오타이드는 직접 pGFP의 NdeI - XhoI으로 서브클론되어 STeP-GFP 단백질을 발현시키는 pSTeP-GFP를 제작하였다. 도 4는 STeP-GFP 발현 벡터의 맵이다.

[ 실시예 2. GFP 재조합 단백질의 발현]

본 실시예에서는 상기 실시예에서 제작된 재조합 벡터들로부터 해당 단백질을 발현하고자 하였다. 네 종류의 발현 벡터들을 각각 E. coli Rosetta-gami 2(DE3) 세포 내로 형질 전환시켰다. 형질 전환된 박테리아 세포는 엠피실린이 포함된 1,000ml의 LB배지를 이용하여 OD₆₀₀ 값이 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양하였고, 22℃에서 0.5mM IPTG를 도입하여 24시간 동안 추가 배양하여 GFP 단백질의 발현을 유도하였다.

각각의 GFP 단백질 발현 유무 확인은 IPTG의 첨가에 의한 목적 단백질의 유도 발현 전과 후의 배양 세포들을 수확하여 SDS-PAGE 전기영동을 한 뒤, 쿠마시 브릴리언트블루 (Coomassie brilliant blue)로 단백질을 염색하여 관찰하였다.

그 결과, 도 5에서 확인되는 바와 같이, GFP는 29.35kDa, TAT-GFP는 30.54kDa, PEP1-GFP는 32.18kDa, STeP-GFP는 32.95kDa의 크기를 가지는 단백질이 발현됨을 확인할 수 있었다. 도 5는 GFP 재조합 단백질의 발현 결과이다.

[ 실시예 3. GFP 재조합 단백질의 정제]

본 실시예에서는 상기 실시예에서 각각 발현된 단백질에 대하여 세포 파쇄 공정 실시 후, His tag 친화 컬럼을 이용하여 GFP 단백질만을 순수 분리 정제하고자 하였다. 4가지 GFP 단백질의 정제 방법은 아래와 같이 동일한 방법을 이용하여 정제하였다.

pET15-GFP, pTAT-GFP, pPEP1-GFP, pSTeP-GFP 형질 전환 세포를 1X Native 완충액(50mM NaPO5, 0.5M NaCl)에서 초음파기를 이용하여 파괴한 후, 이것을 원심분리하여 응집체(inclusion body)와 세포질(상청액)로 분리하였다.

4가지 GFP 단백질에는 모두 His₆ 태깅되어(tagging) 있으므로 이러한 특성을 이용하여 세포 파쇄 후 원심분리에 의해 분리된 각각의 상청액을 Ni² ⁺-NTA 친화 컬럼(Nitrilotriacetic acid Sepharose affinity column, GE Healthcare, USA)으로 정제하였다.

컬럼의 평형 및 GFP 단백질의 결합은 1X Native 완충액을 사용하였으며, 세척(Washing)과 용출(Elution)은 1X Native 완충액에 농도별 이미다졸(Imidazole)을 제조하여 사용하였다. 순수 분리 정제된 GFP 단백질은 안정화 버퍼 (50mm NaPO4, 0.1M NaCl, 10% Glycerol, pH 7.5)를 이용하여 투석을 실시하였다. 여기서 얻어진 최종 산물을 각각 GFP, Tat-GFP, PEP1-GFP, STeP-GFP라 명명하였다. 도 6은 GFP 재조합 단백질의 정제 결과이다.

[ 실시예 4. 세포 및 피부 투과성 GFP 단백질의 세포 투과 분석]

본 실시예에서는 상기 실시예에서 정제된 4가지의 GFP 단백질의 세포 투과 능력을 비교하고자 HaCaT(human keratinocyte) 세포에서 GFP 녹색 형광을 이용한 세포 내 투과를 관찰하였다.

HaCaT(human keratinocyte) 세포는 배양용 슬라이드에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배양 배지를 제거한 후, HBSS로 3회 세척 후 GFP 및 세포투과성 GFP 단백질(PEP1-GFP, TAT-GFP, STeP-GFP)을 세포에 처리하였다. 세포에 처리 시 각각의 단백질의 농도가 10mM이 되도록 스탁(stock)을 만들어 배지에 1/10로 희석하여 최종 10μM이 되도록 처리한 후 2시간 동안 배양하였다. 2시간 뒤 배지를 제거하고 PBS를 이용하여 세포를 세척한 후, 냉각 메탄올을 이용하여 10분간 -20℃에서 세포를 고정하였다. 세포는 PBS로 충분히 세척한 뒤 PBS에 1/5000으로 희석된 핵 염색 시약 (DAPI)를 넣고 빛이 차단된 상태에서 10분간 염색시켰다. PBS로 충분히 세척하고, 마운팅(mounting) 한 뒤 컨포칼 스캐닝 레이저 현미경을 이용하여 분석하였다.

그 결과, STeP-GFP 단백질 처리 그룹의 세포 내 녹색 형광이 가장 밝게 보이는 것으로 보아, STeP가 세포 내 투과 효과를 크게 향상시켜줌을 알 수 있었다. 도 7은 GFP 단백질의 세포 투과력 비교 결과이다.

[ 실시예 5. 세포 및 피부 투과성 GFP 단백질의 피부 투과 분석]

세포뿐만 아니라 피부에서도 STeP에 의해 GFP 단백질의 투과가 향상되는지 알아보기 위해, 프란츠 셀(Franz cell, 직경 9mm)을 이용하였다.

셀의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 그 상단에 50μM GFP 단백질을 300μl 처리하였다. 24시간 후, 돼지 피부를 빼낸 뒤 PBS로 3회 세척하였다. 세척 후, 크라이요 몰드 (cryo mold)에 OCT 임베딩 매트릭스 (OCT embedding matrix, Cell Path Ltd., UK)를 처리하여 조직을 -70℃에서 동결하였다. 동결 조직은 크라이요톰(cryotome, HM520, Germany)을 이용하여 -20℃에서 7 μm의 두께로 크로스 섹션 (cross-section)하여 절편 슬라이드를 제작하였다. 피부 세포의 핵을 염색하기 위하여 슬라이드 글라스 (slide glass)에 고정시킨 조직 절편은 PBS에 1/5000으로 희석된 핵 염색 시약 (DAPI)을 넣고 빛이 차단된 상태에서 10분간 염색한 후 PBS로 3회 세척하였다. 마운팅(mounting) 한 뒤 콘포칼 스캐닝 레이저 현미경을 이용하여 분석하였다.

실험결과, GFP는 돼지 피부 조직 내로 전혀 전달되지 않음에 반해, 본 발명의 STeP-GFP는 피부 내로 효율적으로 전달이 가능함을 확인할 수 있었다. 도 8은 GFP 단백질의 피부 투과력 비교 결과이다. 도 8에서 'LUT Image'는 LUT(Look Up Table)을 이용하여 명암 대비를 향상시킨 이미지이다.

[ 실시예 6. 지질- PTD(DSPE-PEG-PTD)의 제조]

본 실시예에서는 자가조립 PTD-리포좀 제조 기술을 개발하였다.

본 발명의 자가조립 PTD-리포좀에서, '자가조립'은, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 인지질에 결합된 상태로 리포좀의 막을 형성하게 됨으로써, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 막 성분의 일원으로 리포좀의 제조에 참여된 것을 의미한다.

본 실시예의 자가조립 PTD-리포좀은 지질에 PTD가 결합되어 있어 따로 생리활성물질에 PTD를 연결하는 합성 과정의 번거로움 없이, 다양한 생리활성물질을 바로 자가조립 PTD-리포좀에 봉입하여, 효율적으로 피부 내로 전달시킬 수 있게 해준다.

자가조립 PTD-리포좀의 제조를 위해, 지질-PTD는 다음 방법을 통해 제조하였다. 우선, DSPE-PEG3.4K-maleimide (지질, 1 equiv,)을 디클로로메탄(dichloromethane)에 녹인 후, 50℃에서 증발시켜 유기용매를 제거함으로써, 필름 형태의 DSPE-PEG3.4K-maleimide를 제조하여 준비하였다. 또한, PTD (STeP 펩타이드: KETWWETWWTEWSQPYGRKKRRQRRRC, 서열번호 1) (3 equiv.) 및 암모니움 카르보네이트 (3 equiv.)을 증류수에 녹인 후 완충액 (pH 9.6)으로 pH 9 정도가 되도록 조절하여 PTD 용액을 별도로 제조하여 준비하였다.

상기에서 제조한 PTD 용액을, 상기에서 필름 형태로 제조한 DSPE-PEG3.4K-maleimide에 넣고, 37℃에서 수화 및 교반 과정 (4 시간)을 수행함으로써, DSPE-PEG3.4K-maleimide의 maleimide와 STeP 펩타이드의 'C' 아미노산 사이에 maleimide-thiol 반응을 유도시켰다. 반응 완료 후, 동결건조 및 분리·정제 과정을 진행하였다. 도 9는 본 실시예에서 제조한 지질(DSPE-PEG3.4K-maleimide)-PTD(STeP 펩타이드)의 화학적 구조를 보여준다.

[ 실시예 7. 카페익산이 봉입된 자가조립 PTD - 리포좀의 제조]

리포좀은 인지질로 구성된 인위적인 막으로써, 액상 상태의 내부 물질을 감싸는 캡슐화된 구조체로 이용될 수 있다. 리포좀 안에 가둬진 물질의 보유는 지질의 조성에 의해 영향을 받을 수 있다. 그 중 두 가지 중요한 지질 종류는 인지질과 콜레스테롤이다. 인지질은 리포좀의 막을 구성하는 역할을 수행하고, 콜레스테롤은 친수성 수산기와 소수성 고리를 가지고 있어, 반데르발스 결합으로 세포막 내의 포화 지방산의 사슬을 안정화시키는 작용을 하여 세포막의 유동성을 감소시키며 견고성을 부여하는 기능을 담당한다.

한편, 상기 제조 방법으로 만들어진 지질-PTD와 인지질, 콜레스테롤, 카페익산을 혼합하여 카페익산(caffeic acid)이 봉입된 자가조립 PTD-리포좀(자가조립 PTD-리포좀-(카페익산))을 제조하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다. 인지질 : 콜레스테롤 : 지질-PTD : 카페익산을 8:2:1:1 (중량비)로 클로로포름:메탄올 혼합물 (1:1, 용적비)에 용해시킨 후, 용매를 증발시켜 지질/약물 필름을 제조하였다. 정제수로 수화시킨 후 초음파 처리(sonication)를 통해 리포좀을 제조하였고, 동결건조 후 보관하였다.

한편, 제조한 리포좀의 입자 크기, 입도 분포, 봉입률을 확인하여 자가조립 PTD-리포좀-카페익산의 물리화학적 특성을 분석하고자 하였다. 이때, 자가조립 PTD-리포좀에 의한 카페익산의 피부 투과력 우월성을 입증하기 위한 대조군으로, 일반 리포좀에 봉입된 카페익산(리포좀-카페익산)을 함께 분석하였다.

입자 크기, 입도 분포, 표면 전하는 전기영동광산란법 (electrophoretic light scattering; ELS)을 이용하여 확인하였으며, 그 결과는 도 10과 같았다. 도 10의 결과에 따르면, 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)은 평균 직경이 250nm 정도로 비교적 균일한 입도분포를 갖는 리포좀이 제조된 것을 확인할 수 있었다. 도 10은 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)의 입자 특성 평가 결과이다.

또한, 일반 리포좀-카페익산에 비해 자가조립 PTD-리포좀의 표면 전하가 음의 값에서 양의 값으로 변하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명의 자가조립 PTD-리포좀에서 PTD가 외부 표면에 배향하고 있다는 것을 암시해 준다. 본 발명의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드(STeP)는 양친매성 펩타이드이지만, 소수성보다는 친수성의 성향이 강하다. 이러한 친수성 펩타이드의 경우, 리포좀 제조시 외부 또는 내부의 친수성 환경에 위치할 것이라 예상되는데, 도 10의 제타 전위 분석 결과 (-에서 +로 변화)를 통해, STeP가 리포좀의 외부 표면 환경에 노출되어 있음을 알 수 있었다.

한편, 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 자가조립 PTD-리포좀의 입자 모양을 관찰하였다. 그 결과, 리포좀-카페익산에 비해 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)의 입자 크기가 다소 커진 것을 확인할 수 있었으며, 또한, PTD-지질이 포함된 리포좀을 제조하였음에도 불구하고, 이의 입자 모양이 일반적인 리포좀과 구조적으로 유사하다는 것을 확인할 수 있었다. 도 11은 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)의 입자 모양 (TEM image) 관찰 결과이다 (좌: 리포좀-(카페익산), 우: 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)).

한편, 수용액 상에서 입자 안정성을 확인하기 위해, 전기영동광산란법을 이용하여 입자 크기 변화를 관찰하였다. 그 결과, 도 12와 같이, 리포좀-(카페익산), 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산) 모두 24시간까지 입자 크기와 입도 분포 양상에 큰 변화가 없어 안정함을 확인하였다. 도 12는 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)의 입자 안정성 평가 결과이다.

[ 실시예 8. 자가조립 PTD - 리포좀 -( 카페익산 )의 세포 내 항산화 효능 평가]

자가조립 PTD-리포좀-카페익산이, 카페익산과 리포좀-카페익산보다 세포 내 투과가 증가하여 항산화 효능이 증진됨을 확인하고자 산화스트레스(과산화수소, H₂O₂)에 의한 세포 손상에서 카페익산의 세포 보호 효과를 비교 관찰하였다.

10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양된 HaCaT 세포를 2×10⁴씩 96웰 플레이트에 분주하여 16시간 배양한 후 HBSS로 2회 세척하여 주었다. 카페익산과 리포좀에 봉입된 카페익산, 자가조립 PTD 리포좀 카페익산을 최종농도가 12.5μM이 되도록 세포에 처리해 주고 24시간 동안 배양하였다. 상층액을 제거한 후, HBSS로 2회 세척한 뒤 H₂O₂를 0.75mM 농도로 2시간 30분 동안 처리하여 배양하였다. 배양 후, 상층액을 제거하고 WST 용액을 배지에 1:9 비율로 희석하여 세포에 처리해 주었다. 3시간 동안 배양 후, 450nm에서 흡광값을 측정하여 세포생존율을 계산해 카페익산, 리포좀에 봉입한 카페익산 및 자가조립 PTD 리포좀 카페익산의 처리에 따른 항산화 효능을 비교하였다.

그 결과, 도 13에 나타나는 바와 같이 카페익산에 비해 자가조립 PTD 리포좀 카페익산의 항산화효능이 동일 농도에서 대략 3배 정도 높은 것을 확인할 수 있었다. 도 13은 산화스트레스에 의한 세포 손상에서 카페익산의 세포 보호 효과를 비교한 결과이다. 이와 같은 결과로부터 카페익산과 일반 리포좀에 비해 자가조립 PTD 리포좀 카페익산이 PTD에 의해 세포투과가 용이해져서 항산화 효능이 높아진 것으로 해석할 수 있었다.

[ 실시예 9. 자가조립 PTD - 리포좀 -( 카페익산 )의 피부 투과 분석]

자가조립 PTD-리포좀에 의해 카페익산의 피부 투과가 향상되는지 알아보기 위해, 프란츠 셀(Franz cell, 직경 9mm)을 이용하였다.

셀의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 그 상단에 4mM 카페익산, 리포좀-(카페익산), 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)을 300μl 처리하였다. 하단에는 버퍼를 채워 주었다. 24시간 뒤, 하단에 있는 샘플을 채취하였다. 채취한 샘플은 HPLC를 이용하여 정량하였다. HPLC Column으로는 C18 (4.6 × 250 ㎜ reversed phase)을 사용하였고, 0.7 ㎖/min의 유속으로 흘려주었으며, UV absorbance detector를 사용하여 330㎚의 파장에서 검출하였다.

그 결과, 도 14에서 보듯이, 카페익산은 전혀 투과가 되지 않은 반면, 일반 리포좀은 로딩한 펩타이드 양 대비 3.9%, 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)은 5.84%로 나타나, 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)이 약 1.5배 높은 투과 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 도 14는 자가조립 PTD-리포좀-(카페익산)의 피부 투과력 비교 결과이다.

<110> Bioceltran <120> Vesicle with novel protein transduction domain <130> YP-16-230 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein transduction domain, STeP <400> 1 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Tyr 1 5 10 15 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Cys 20 25 <210> 2 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding protein transduction domain, STeP <400> 2 aaagaaacct ggtgggaaac ctggtggacc gaatggtccc agccgtatgg ccgtaaaaaa 60 cgtcgtcagc gtcgtcgttg t 81

Claims

인지질이 자가응집하여 형성되는 리포좀에 있어서,
상기 인지질은,
서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 씨오에테르(thioether) 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 리포좀.
삭제
제1항에 있어서,
상기 인지질은,
DSPE-PEG-말레이미드인 것을 특징으로 하는 리포좀.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는,
리포좀의 외부 방향으로 배향되는 것을 특징으로 하는 리포좀.
제1항에 있어서,
상기 리포좀은,
콜레스테롤이 소수성 부위에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 리포좀.
제1항에 있어서,
상기 리포좀은,
내부에 포집대상물질을 내포하고 있는 것을 특징으로 하는 리포좀.
제1항의 리포좀을 함유하는 것을 특징으로 하는 경피 투여용 화장료 조성물.
제1항의 리포좀을 함유하는 것을 특징으로 하는 경피 투여용 약학 조성물.
삭제
삭제
인지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 씨오에테르(thioether) 결합시킴으로써 제조한 양친매성 분자 및 포집대상물질을 용매에 용해시키는 단계 (a);
상기 단계 (a) 후, 용매를 증발시켜 필름을 제조하는 단계 (b);
상기 단계 (b) 후, 필름에 정제수 또는 완충액을 첨가하여, 수화시킨 후, 에너지를 가해 입자 크기를 감소시키는 단계 (c);를 포함하여 리포좀을 제조하되,
상기 인지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 씨오에테르(thioether) 결합시킴으로써 제조한 양친매성 분자는,
필름 형태의 인지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 함유하는 용액을 첨가하여, 인지질과 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 간의 씨오에테르(thioether) 결합 반응을 유도함으로써 제조하되, 상기 필름 형태의 인지질은, 인지질을 소수성 유기용매에 녹인 후, 유기용매를 휘발시켜 필름 형태로 제조한 것이고,
상기 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 함유하는 용액은, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 암모니움 카르보네이트과 함께 증류수에 녹인 후, pH 8~10로 조절하여 제조한 것임 특징으로 하는 리포좀의 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 단계 (a)는,
인지질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 씨오에테르(thioether) 결합시킴으로써 제조한 양친매성 분자 외에, 별도의 인지질을 용매에 더 첨가하여 용해시키는 것을 특징으로 하는 리포좀의 제조방법.
삭제
삭제
제13항에 있어서,
상기 인지질은,
DSPE-PEG-말레이미드인 것을 특징으로 하는 리포좀의 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 단계 (a)는,
콜레스테롤을 추가로 용매에 용해시키는 것을 특징으로 하는 리포좀의 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 용매는,
클로로포름과 메탄올의 혼합물인 것을 특징으로 하는 리포좀의 제조방법.