JP6124347B2 - ＴＧＦ−βシグナリング阻害剤および／またはＹ−２７６３２による肝前駆細胞の誘導方法および製造方法、並びに当該肝前駆細胞から肝細胞の製造方法 - Google Patents
ＴＧＦ−βシグナリング阻害剤および／またはＹ−２７６３２による肝前駆細胞の誘導方法および製造方法、並びに当該肝前駆細胞から肝細胞の製造方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、誘導肝幹細胞を特定の培養条件下にて培養することにより、誘導肝前駆細胞を作製すること、及び、さらには誘導肝幹細胞又は誘導肝前駆細胞から初代培養肝細胞と同様の特徴を有し、かつ非臨床試験において使用することができる肝細胞を継続的に作製するための方法を提供することに関する。
新薬の研究開発に際して、現在の非臨床試験において、薬物の安全性や毒性等の評価のために多数・多種類の動物を用いた試験を行う必要があり、それが新薬の開発費を高騰させる一つの要因となっている。また、ヒトと動物の種差によって薬物の生体内動態が異なる場合があり、動物を用いた試験では、安全性や毒性等について充分な評価を行うことができず、臨床試験段階に入って医薬品候補化合物の副作用が発現する場合もある。
そのため、研究開発の早期段階において、候補化合物のヒト生体内における動態等を予測及び評価する系の確立が強く望まれており、現在では、ヒト肝細胞を用いた評価システムを構築すべく、日々の研究がなされている。このような評価システムは、医薬品開発の早いステージで安全性の高い候補薬を正確に絞り込むことができるため、特に製薬企業に大きな需要がある。
従来のヒト培養細胞を用いた非臨床試験では、外国人の初代培養肝細胞又は既存細胞株などが用いられている。しかしながら、初代培養肝細胞については圧倒的にドナーが不足しており、ロット差が非常に大きいという問題がある。とりわけ、日本人の初代培養肝細胞は、倫理的問題及び法規制のために入手が著しく困難であり、安定的な供給が不可能であるという問題もある。
また、肝臓中に発現している薬物代謝系に関連する酵素は、薬物代謝に重要な役割を果たしているが、遺伝子多型も存在し、その発現量及び活性には大きな個体差が存在するので、初代培養肝細胞を用いた非臨床試験においては、この様なばらつきの問題も解決しなければならない。
このような状況であるため、遺伝子多型や個体差を平準化するために、複数のドナー由来の初代培養肝細胞を代表細胞として、各種試験に繰り返し使用することが望ましい。しかしながら、初代培養肝細胞を培養皿で培養しても、ほとんど増殖培養できないため、ある肝細胞を継代培養して、繰り返し、様々な試験に使用することは事実上不可能である。
一方、既存の樹立細胞株は核型異常を起こした細胞であることが多く、また遺伝子多型や個体差を網羅するに足る数の細胞株も存在しない。更に、従来の方法で長期継代培養された既存の細胞株では、初代培養肝細胞と同様の薬物代謝酵素活性及び誘導能やトランスポーター誘導能を示さないため、この結果から臨床におけるヒトでの安全性・毒性、代謝等を予測することは不可能である。
このような諸事情から、肝細胞の性質を有し、長期にわたって提供可能である細胞が望まれていた。
この様な有用な肝細胞を継続的に供給するためには、肝臓を継続的に供給することができる幹細胞が必要になる。これまでも、胚性幹細胞や誘導多能性幹細胞などの多能性幹細胞から、様々な培養条件を利用することにより、肝細胞への分化を誘導する方法が検討されてきた。しかしながら、これまでの方法では、肝細胞への分化誘導は特に煩雑かつ困難であると考えられている。
一方で、肝臓の幹細胞として、肝細胞への分化能を有する肝幹細胞を作製することが期待されていた。鋭意検討を行った結果、本発明の発明者は、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞のように自己複製遺伝子を発現し、かつ肝細胞に特徴的な性質をも示す、長期にわたって生体外で継代培養可能である誘導肝幹細胞を作製することができることを明らかにした（PCT/JP2011/000621：WO2011/096223として2011年8月11日に公開）。しかし、この誘導肝幹細胞そのものを、初代培養肝細胞と同様の細胞として使用するのが最適とは云えない。
本発明は、誘導肝幹細胞から、誘導肝前駆細胞または肝細胞を分化させる方法、または誘導肝前駆細胞から肝細胞を分化する方法及び新規な細胞である誘導肝前駆細胞を提示するものである。より具体的には、本発明は、誘導肝幹細胞または誘導肝前駆細胞を、TGF-β阻害剤の存在下にて1〜4週間培養することにより、誘導肝幹細胞から誘導肝前駆細胞または肝細胞を分化させる方法、あるいは誘導肝前駆細胞から肝細胞を分化させる方法である。
本発明の原料となる誘導肝幹細胞は、いずれかの哺乳動物から細胞を採取し、作製される。起源となる哺乳動物としては、たとえば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ミニブタなどのブタ、ウシ、ウマ、カニクイザルなどのサル等の霊長類、ヒト等を挙げることができるが、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ミニブタ、ウマ、カニクイザル、ヒトが好ましく、特にヒトが好ましく用いられる。
また、誘導肝幹細胞を作製する際の哺乳動物の細胞としては、どのような組織由来の細胞であってもよい。例えば、脳、肝臓、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、結腸、膵臓、腎臓、肺などの各臓器や、骨髄液、筋肉、脂肪組織、末梢血、皮膚、骨格筋の細胞などを例示することができるが、これらに制限されることはない。
また、臍帯組織（臍帯、臍帯血）、羊膜、胎盤、羊水由来細胞などの出産時に付随する組織、体液由来の細胞も用いることが可能であり、特に新生仔（児）の各組織のような、出生直後の組織（新生仔（児）の皮膚等）由来の細胞を用いてもよい。
また、前記哺乳動物の細胞として、成体由来の細胞、新生仔（児）由来の細胞、新生仔（児）皮膚由来の細胞、発がん個体の細胞などを用いることができる。
本発明の発明者は、以前に出願した国際出願（PCT/JP2011/000621：WO2011/096223として2011年8月11日に公開）において、胚性幹細胞などの多能性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現すると同時に、肝細胞に特徴的な遺伝子をも発現する、誘導肝幹細胞を作製する方法を開発し、その方法により、胚性幹細胞などの多能性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現するにもかかわらず、肝細胞に特徴的な遺伝子を発現する誘導肝幹細胞を提供することができることを明らかにした。この誘導肝幹細胞は、胚性幹細胞などの多能性幹細胞のマーカー遺伝子である下記表1の遺伝子群の中から少なくともNANOG遺伝子、POU5F1（OCT3/4）遺伝子、SOX2遺伝子を発現することを特徴の一つとしている。
本発明において使用する誘導肝幹細胞は、上述した胚性幹細胞の性質を示す遺伝子を発現することに加えて、肝細胞としての性質を有するか、または肝細胞としての性質に関連した遺伝子発現を特徴とする。本発明の誘導肝幹細胞における肝細胞としての性質としては、肝細胞に特徴的な性質であれば、特に制限されることはない。肝細胞としての性質に関連する遺伝子としては、肝細胞で特徴的に発現している遺伝子であり、胎児性肝細胞又は成熟肝細胞（成人肝細胞）のような肝細胞としての性質に関連する遺伝子であればよい（下記表2を参照）。本発明において使用する誘導肝幹細胞においては、主に、肝細胞に特徴的な遺伝子発現が挙げられる。具体的には、DLK1遺伝子、AFP遺伝子、ALB遺伝子、AAT遺伝子、TTR遺伝子、FGG遺伝子、AHSG遺伝子、FABP1遺伝子、RBP4遺伝子、TF遺伝子、APOA4遺伝子などが挙げられる。
誘導肝幹細胞は、上述したいずれかの細胞を、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1（OCT3/4）遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように、誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1（OCT3/4）遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が存在する状態におく工程を行うことが望ましい。一例としては、遺伝子導入をSOX2遺伝子に対してPOU5F1（OCT3/4）遺伝子の比率が大きくなるように行うことである。POU5F1（OCT3/4）遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の各遺伝子シンボルに対するジェンバンクアセッション番号は表3の通りである。
誘導肝幹細胞の作製において、誘導多能性幹細胞の誘導技術として公知の様々な遺伝子の内、１種類から複数種類の遺伝子、又はそれらの遺伝子産物（タンパク質やmRNAなど）或いは薬剤などを前記哺乳動物の細胞中に発現又は導入或いは添加をすることができる。必要に応じて、前記哺乳動物の細胞内へ導入するベクターの量、導入する遺伝子の量、培地に添加する遺伝子産物の量などを調節することによって、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように調節することが可能である。
本発明において使用する誘導肝幹細胞を作製する際には、誘導肝幹細胞への誘導効率を上げるために、誘導多能性幹細胞を誘導することが知られている薬剤、化合物、抗体、例えば、FGFレセプターチロシンキナーゼ、MEK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）／ERK（細胞外シグナル制御キナーゼ1および2）経路、GSK（グリコーゲンシンターゼキナーゼ）3の三つの低分子阻害剤〔SU5402、PD184352及びCHIR99021〕、MEK/ERK経路及びGSK3の二つの低分子阻害剤〔PD0325901及びCHIR99021〕、ヒストンメチル化酵素G9aの阻害剤である低分子化合物〔BIX-01294（BIX）〕、アザシチジン、トリコスタチンA（TSA）、7-hydroxyflavone、lysergic acid ethylamide、kenpaullone、TGFβ receptorI kinase/activin-like kinase 5 （ALK5）の阻害剤〔EMD 616452〕、TGF-βreceptor 1（TGFBR1）kinaseの阻害剤〔E-616452及びE-616451〕、Src-family kinaseの阻害剤〔EI-275〕、thiazovivin、PD0325901、CHIR99021、SU5402、PD184352、SB431542、抗TGF-β中和抗体、TGF-β阻害剤A-83-01、Nr5a2、p53阻害化合物、p53に対するsiRNA、p53経路の阻害剤等を、本発明の誘導肝幹細胞を誘導する際に用いられる培地中に添加することができる。
また、本発明において使用する誘導肝幹細胞を作製する際には、誘導肝幹細胞への誘導効率を上げるため、更に、誘導多能性幹細胞を作製するのに使用するマイクロRNA（microRNA）を用いることも可能である。
前記哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞又は誘導肝前駆細胞に誘導する工程においては、本発明の誘導肝幹細胞を培養する培地に添加される、TGF-βなどの活性を阻害又は中和する各々の阻害剤又は抗体などを使用することもできる。TGF-βの阻害剤としては、例えば、TGF-βシグナリングの阻害剤としてはALK阻害剤（A-83-01など）、TGF-βRI阻害剤、TGF-βRIキナーゼ阻害剤などが挙げられる。
これらの成分は、前記哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程において用いられる培地中に添加することが好ましい。
このような特徴を有する誘導肝幹細胞は、3日以上増殖培養または継代培養可能であるという特徴を示し、好ましくは14日以上、さらに好ましくは1カ月以上増殖培養または継代培養可能であるという特徴を有する。
これまでは、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞そして誘導肝幹細胞などの幹細胞について培養する場合、1カ月以上長期培養した場合でも分化しないように、TGF-βなどの活性を阻害又は中和する各種の阻害剤又は抗体、を培地に添加していた。しかしながら、本発明の胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞そして誘導肝幹細胞などの幹細胞においては、TGF-βなどの活性を阻害又は中和する各種の阻害剤又は抗体（本発明においては、これらをまとめてTGF-β阻害剤という）を添加した培養液中で胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞そして誘導肝幹細胞などの幹細胞の培養を行うことにより、高効率で肝分化することを見出した。好ましくは、前記TGF-β阻害剤を添加した培養液中で誘導肝幹細胞の培養を行うことにより、高効率で誘導肝前駆細胞へ肝分化することを見出した。具体的には、TGF-β阻害剤の添加された条件下での培養は、胚性幹細胞や誘導多能性幹細胞の培養に使用される培養液に対して、TGF-β阻害剤を添加することにより行う。本発明において使用するTGF-β阻害剤としては、TGF-βの機能またはシグナル伝達を阻害するためのいずれかの薬剤のことをいい、低分子化合物、抗体、またはアンチセンス化合物などの形態のものであってもよい。
例えば、本発明において使用することができるTGF-β阻害剤としては、以下のものを挙げることができる：
＜低分子化合物＞
TGF-β RI Kinase Inhibitor IX (ALK4, 5 and 7) Inhibitor、A-83-01
（3-（6-メチル-2-ピリジニル）-N-フェニル-4-（4-キノリニル）-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド）、
＜低分子化合物＞
TGF-β RI Kinase Inhibitor IX (ALK4, 5 and 7) Inhibitor、A-83-01
（3-（6-メチル-2-ピリジニル）-N-フェニル-4-（4-キノリニル）-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド）、
＜アンチセンスオリゴヌクレオチド＞
AP12009（TGF-β2アンチセンス化合物“Trabedersen”）、
Belagenpumatucel-L（TGF-β2アンチセンス遺伝子修飾同種異系腫瘍細胞ワクチン）、
AP12009（TGF-β2アンチセンス化合物“Trabedersen”）、
Belagenpumatucel-L（TGF-β2アンチセンス遺伝子修飾同種異系腫瘍細胞ワクチン）、
＜抗体＞
CAT-152（Glaucoma - lerdelimumab（抗-TGF-β-2モノクローナル抗体））、
CAT-192（Metelimumab（TGFβ1を中和するヒトIgG4モノクローナル抗体）、
GC-1008（抗-TGF-βモノクローナル抗体）、
から選択することができる。
CAT-152（Glaucoma - lerdelimumab（抗-TGF-β-2モノクローナル抗体））、
CAT-192（Metelimumab（TGFβ1を中和するヒトIgG4モノクローナル抗体）、
GC-1008（抗-TGF-βモノクローナル抗体）、
から選択することができる。
これらのTGF-β阻害剤のうち、本発明においては、TGF-βRIキナーゼ阻害剤IX（ALK4、5および7阻害剤）であるA-83-01（3-（6-メチル-2-ピリジニル）-N-フェニル-4-（4-キノリニル）-1H-ピラゾロ-1-カルボチオアミド）を使用することが好ましい。A-83-01は、I型TGF-β／アクチビン受容体様キナーゼ（ALK5）、I型アクチビン／Nodal受容体様キナーゼ（ALK4）、I型Nodal受容体様キナーゼ（ALK7）の選択的阻害剤である。Smad2/3のリン酸化やTGF-β誘導性の上皮間充織転換を阻害する。A-83-01は骨形成因子I型レセプター、p38 MAPキナーゼ、細胞外制御キナーゼにほとんど、あるいは全く影響を与えないことが知られている。また、ラットiPS細胞培養培地に加えることで、ラットiPS細胞を分化させずに均一に増殖させ、長期にわたり培養することができることも報告されている。さらに、Smad2のリン酸化をブロックし、TGF-β誘導性の上皮間葉移行を阻害する。A-83-01のTGF-β阻害剤としての作用は、ALK4、ALK5、ALK7の選択的阻害剤である（それぞれIC50＝12、45、7.5 nM）。そして、従来の当該技術分野においては、このTGF-β阻害剤を使用することにより、ラットiPS細胞を、分化させずに、均一に長期間培養できることが知られていた。
本発明の方法におけるTGF-β阻害剤存在下での培養に際しては、bFGF非存在下にて行うことが好ましい。培養液がbFGFを含まない条件下にて誘導肝幹細胞の培養を行うことにより、TGF-β阻害剤存在下での培養による誘導肝前駆細胞又は肝細胞への肝分化が促進される。
本発明の方法におけるTGF-β阻害剤存在下の培養に際しては、ステロイド骨格を有する化合物、脂肪酸及び血清から選択される物質の存在下にて行うこともまた好ましい。ステロイド骨格を有する化合物は、ステロイドホルモン、胆汁酸、コレステロール、デキザメタゾンのような合成ステロイドが例示される。ステロイド骨格を有する化合物、脂肪酸及び血清から選択される物質の存在下にて誘導肝幹細胞培養を行うことにより、TGF-β阻害剤存在下での培養による誘導肝前駆細胞または肝細胞への肝分化が促進される。
本発明の方法におけるTGF-β阻害剤存在下での培養に際しては、フィーダー細胞の非存在下にて行うこともまた好ましい。フィーダー細胞の非存在下にて誘導肝幹細胞または誘導肝前駆細胞の培養を行うことにより、TGF-β阻害剤存在下での培養による幹細胞の肝細胞への分化が促進される。
本発明の方法におけるTGF-β阻害剤存在下での培養に際しては、コーティングをした培養ディッシュ上にて培養を行うこともまた好ましい。コーティングをした培養ディッシュ上にて誘導肝幹細胞または誘導肝前駆細胞の培養を行うことにより、TGF-β阻害剤存在下での培養による誘導肝幹細胞または誘導肝前駆細胞の肝細胞への分化が促進される。本発明においては、コーティングとして、マトリゲルコート、コラーゲンコート、ゼラチンコート、ラミニンコート、フィブロネクチンコート等を使用することができる。好ましくは、コーティングとして、マトリゲルコートを使用する。
本発明は、誘導肝幹細胞または誘導肝前駆細胞から選択される幹細胞を、上述したTGF-β阻害剤のいずれかの存在下にて、1〜4週間培養する工程を行うことを特徴とする。
この培養に際しては、胚性幹細胞、多能性幹細胞等を増殖培養又は継代培養することが可能な培地を使用することができる。このような培地としては、例えば、ES培地〔40％ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、40％のF12培地（シグマ社製）、2 mM L-グルタミン又はGlutaMAX（シグマ社製）、１％のnon essential amino acid（シグマ社製）、0.1 mMのβ-メルカプトエタノール（シグマ社製）、15〜20％のKnockout Serum Replacement（インビトロジェン社製）、10μg/ｍlのゲンタマイシン（インビトロジェン社製）、4〜10 ng/mlのbFGF（FGF2）〕（以下ES培地という）、0.1 mMのβ-メルカプトエタノールを除いたES培地で、マウス胚性繊維芽細胞MEFを24時間培養した上清である馴化培地に、0.1 mMのβ-メルカプトエタノール及び10 ng/mlのbFGF（FGF2）を加えた培地（以下MEF馴化ES培地）、iPS細胞用最適培地（iPSellon社製）、フィーダー細胞用最適培地（iPSellon社製）、StemPro〔登録商標〕hESC SFM（インビトロジェン社製）、mTeSR1（ステムセルテクノロジー・ベリタス社製）、アニマルプロテインフリーのヒトES/iPS細胞維持用無血清培地TeSR2〔ST-05860〕（ステムセルテクノロジー・ベリタス社製）、霊長類ES/iPS細胞用培地（リプロセル社）、ReproStem（リプロセル社）、ReproFF（リプロセル社）、ReproFF2（リプロセル社）などを例示することができるが、これらの培地に制限されることはない。ヒトの細胞を用いる場合には、ヒト胚性幹細胞・多能性幹細胞の培養に適した培地を用いるのが好ましい。
本発明において誘導肝幹細胞または誘導肝前駆細胞を増殖培養又は継代培養する手法については、胚性幹細胞、多能性幹細胞等の培養において当業者が通常用いるいずれかの方法を使用することができる。例えば、細胞から培地を除きPBS（-）で洗浄し、細胞剥離液を加えて静置した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を加えて遠心分離し、更に、上清を除去した後、1×抗生物質-抗真菌剤、mTeSR1及び10μM Y-27632を加え、MEFが播種してあるマトリゲルコート、ゼラチンコート又はコラーゲンコート培養皿に細胞懸濁液を播種することによって、継代培養する方法などを具体的に例示することができる。
本発明の誘導肝幹細胞からの誘導肝前駆細胞または肝細胞の分化の方法においては、誘導肝幹細胞をTGF-β阻害剤の存在下にて培養する前に、これらの細胞を、多能性幹細胞培養用培地中、フィーダー細胞の存在下にて事前培養したのち、TGF-β阻害剤の存在下での培養を行ってもよい。このような事前培養を経ることにより、誘導肝幹細胞が、誘導肝前駆細胞または肝細胞への分化の準備段階に導入されるためである。
この様な培養を行うことにより、誘導肝幹細胞から誘導肝前駆細胞が分化誘導され、さらに培養を継続することにより、誘導肝前駆細胞から肝細胞への分化が誘導される。
前述したように、本発明において使用することができる誘導肝幹細胞は、表1の遺伝子群の中から選択される少なくともPOU5F1（OCT3/4）遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子を発現することを特徴の一つとし、そして表2の遺伝子の発現が誘導されることも特徴とする細胞である。この誘導肝幹細胞を、本発明の方法にしたがってTGF-β阻害剤の存在下にて培養を行うことにより、まず誘導肝前駆細胞が分化誘導される。誘導肝前駆細胞は、肝細胞としての性質に関連する遺伝子として、肝幹/前駆細胞マーカーであるDLK1またはAFP遺伝子の発現が著しく上昇し、そして肝細胞マーカーであるALB遺伝子、AAT遺伝子、TTR遺伝子、FGG遺伝子、AHSG遺伝子、FABP1遺伝子、RBP4遺伝子、TF遺伝子、APOA4遺伝子、などの発現が著しく上昇することを特徴とする。一方で、誘導肝前駆細胞では、誘導肝幹細胞において発現していた表1に示す遺伝子（少なくとも、POU5F1（OCT3/4）遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子など）の発現が1/10〜1/100程度にまで減少することもまた、特徴とする。
本発明においては、上述した方法により得られた誘導肝前駆細胞をさらに継続的に培養することにより、肝細胞が分化誘導される。このようにして得られた肝細胞は、誘導肝幹細胞において誘導多能性幹細胞とほぼ同等（1/8〜8倍）に発現していた表1に示される遺伝子の発現が、誘導肝前駆細胞と比べてもさらに著しく低下するか、実質的に無くなり、一方誘導肝前駆細胞において発現が著しく誘導されていた表2に示す遺伝子、肝幹/前駆細胞マーカーであるDLK1及びAFP遺伝子が著しく低下するか、実質的に無くなり、肝細胞マーカーであるALB遺伝子、AAT遺伝子、TTR遺伝子、FGG遺伝子、AHSG遺伝子、FABP1遺伝子、RBP4遺伝子、TF遺伝子、APOA4遺伝子などの発現がさらに著しく上昇する。さらに、誘導肝幹細胞から誘導肝前駆細胞への分化誘導に伴い、内胚葉系細胞に特徴的なSOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GATA4遺伝子から選択される少なくとも１種の遺伝子が発現していてもよく、また、誘導肝前駆細胞から肝細胞への分化誘導に伴い、下記表4の遺伝子について、それらの発現が誘導される。
本発明の実験結果を概略的にまとめると、以下の表5に記載されるように示すことができる。
これらの遺伝子の核酸配列を増幅するために使用されるプライマーとしては、以下の表6に記載のものを使用した。
これらの結果に基づき、本発明においては、前述した誘導肝幹細胞を、TGF-β阻害剤の存在下にて1〜4週間培養することにより分化させて作製される、誘導肝前駆細胞を提供することができる。この細胞は、少なくとも、下記（1）および（2）の要件：
（1） 胚性幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT3/4、SOX2、及びNANOG遺伝子を発現し、そして
（2） 肝幹/前駆細胞マーカーであるDLK1およびAFP、並びに肝細胞マーカーであるALB、AAT、およびTTRを発現する、
ことを特徴とする。
（1） 胚性幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT3/4、SOX2、及びNANOG遺伝子を発現し、そして
（2） 肝幹/前駆細胞マーカーであるDLK1およびAFP、並びに肝細胞マーカーであるALB、AAT、およびTTRを発現する、
ことを特徴とする。
本発明の好ましい態様において、さらに、前記マーカーに加えて、肝細胞マーカーであるFGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、およびAPOA4を発現する細胞も本発明の誘導肝前駆細胞に含まれる。すなわち、本発明の好ましい細胞として、下記（1）および（2）の要件：
（1） 胚性幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT3/4、SOX2、及びNANOG遺伝子を発現し、そして
（2） 肝幹/前駆細胞マーカーであるDLK1およびAFP、並びに肝細胞マーカーであるALB、AAT、TTR、FGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、およびAPOA4を発現する、
ことを特徴とする細胞が含まれる。
（1） 胚性幹細胞のマーカー遺伝子であるOCT3/4、SOX2、及びNANOG遺伝子を発現し、そして
（2） 肝幹/前駆細胞マーカーであるDLK1およびAFP、並びに肝細胞マーカーであるALB、AAT、TTR、FGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、およびAPOA4を発現する、
ことを特徴とする細胞が含まれる。
誘導肝前駆細胞は、誘導肝幹細胞の特徴である表1に示す遺伝子（例えば、POU5F1（OCT3/4）遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子など）の発現が胚性幹細胞または誘導肝幹細胞で発現しているこれらの遺伝子の発現量と比較して1/10〜1/100という非常にわずかな程度にまで減少することが明らかになった。
一方、誘導肝幹細胞においては発現が誘導された表2に示される遺伝子の発現が著しく上昇することを特徴としている。表2に示される遺伝子としてはたとえば、肝幹/前駆細胞マーカーであるDLK1、およびAFPの発現量、または肝細胞マーカーであるALB、AAT、TTR、FGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、およびAPOA4の発現量が、胚性幹細胞または誘導肝幹細胞で発現しているこれらの遺伝子の発現量と比較して著しく上昇していてもよく、例えば10〜50,000倍に上昇することを特徴とする。
本発明の誘導肝前駆細胞は、表2に示される遺伝子に加えて、肝細胞としての性質に関連する遺伝子、たとえば胆管上皮細胞マーカーKRT7、KRT19、肝細胞転写因子HNF1A、HNF4Aまたは肝細胞増殖因子HGFなどの肝細胞に関連するマーカー遺伝子の発現が上昇していてもよい。
実施例１ フィーダー細胞フリーによる肝分化誘導と誘導肝前駆細胞の作製
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、1時間）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.377：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTA（invitrogen, 25200-056）で培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞はmTeSR1/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、1時間）した6 wellプレートに播種された（約4×104細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地をmTeSR1（100 ng/mLのbFGFを含む）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.390と呼ぶ（表7Aを参照）。
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、1時間）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.377：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTA（invitrogen, 25200-056）で培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞はmTeSR1/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、1時間）した6 wellプレートに播種された（約4×104細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地をmTeSR1（100 ng/mLのbFGFを含む）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.390と呼ぶ（表7Aを参照）。
播種3日後、5日後に同組成の新鮮培地に交換して分化培養を行い、その後、播種12日後まで、毎日、培地交換して分化培養を継続した。播種後13日後、培養上清について胎児性肝細胞のマーカータンパク質（肝幹前駆細胞及び肝芽細胞のマーカータンパク質、成熟肝細胞には発現しない）であるα-フェトプロテイン（AFP）の測定（SRL）を行った結果、NO.390では、163 ng/mLであった（表8Aを参照）。
細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、細胞溶解液から、キアゲンのmiRNeasy Mini Kitにより、全RNAを調製した。InvitrogenのSuperScript III First-StrandSynthesis System （18080-051）、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（for any instrument）（11733-038）、ABI7300 RealTime PCR Systemを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、肝前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）、肝細胞マーカー（ALB、TTR、AAT）であった。
定量RT-PCRの結果から、ヒト誘導肝前駆細胞（NO.390）は肝幹/前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）の発現（NO.377を1として、NO.390は順に264倍、126倍）と肝細胞マーカー（ALB、AAT、TTR）の発現（NO.377を1として、NO.390は順に19倍、14倍、675倍）は126〜675倍に上昇した。すなわち、ヒト誘導肝前駆細胞は、ヒト誘導肝幹細胞と比較して、肝幹/前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）の発現と肝細胞マーカー（ALB、AAT、TTR）の発現が上昇している細胞であった（表8Aを参照）。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞を効率よく作製するには、フィーダー細胞を含まない培養方法が適していた。
実施例2 bFGF無添加による肝分化誘導と誘導肝前駆細胞の作製
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、1時間）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.377：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞はmTeSR1/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、1時間）した6 wellプレートに播種された（約4×104細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地をaFGF［10 ng/mL］/ReproStem（bFGF不含）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.391と呼ぶ（表7Aを参照）。
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、1時間）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.377：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞はmTeSR1/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、1時間）した6 wellプレートに播種された（約4×104細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地をaFGF［10 ng/mL］/ReproStem（bFGF不含）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.391と呼ぶ（表7Aを参照）。
播種3日後、5日後に同組成の新鮮培地に交換して分化培養を行い、その後、播種12日後まで、毎日、培地交換して分化培養を継続した。播種後13日後、培養上清について胎児性肝細胞のマーカータンパク質（肝幹前駆細胞及び肝芽細胞のマーカータンパク質）であるα-フェトプロテイン（AFP）の測定（SRL）を行った結果、NO.391では、3,300 ng/mLであった（表8Aを参照）。
細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、細胞溶解液から、キアゲンのmiRNeasy Mini Kitにより、全RNAを調製した。InvitrogenのSuperScript III First-StrandSynthesis System（18080-051）、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG （for any instrument）（11733-038）、ABI7300 RealTime PCR Systemを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、肝前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）、肝細胞マーカー（ALB、TTR、AAT）であった。
定量RT-PCRの結果から、ヒト誘導肝前駆細胞（NO.391）は肝幹/前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）の発現（NO.377を1として、NO.391は順に786倍、3,420倍）と肝細胞マーカー（ALB、AAT、TTR）の発現（NO.377を1として、NO.391は順に3,172倍、220倍、3,910倍）は220〜3,910倍に上昇した。すなわち、ヒト誘導肝前駆細胞は、ヒト誘導肝幹細胞と比較して、肝幹/前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）の発現と肝細胞マーカー（ALB、AAT、TTR）の発現が上昇している細胞であった（表8Aを参照）。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞を効率よく作製するには、aFGFを含み、bFGFを実質的に含まない培養方法が適していた。
実施例3：TGF-βシグナリング阻害剤による肝分化誘導と誘導肝前駆細胞の作製（1）
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、1時間）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.377：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞はmTeSR1/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、1時間）した6 wellプレートに播種された（約4×104細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地を0.1μM A-83-01（TOCRIS Cat. No. 2939）/mTeSR1（100 ng/mLのbFGFを含む）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.393と呼ぶ（表7Aを参照）。
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、1時間）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.377：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞はmTeSR1/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、1時間）した6 wellプレートに播種された（約4×104細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地を0.1μM A-83-01（TOCRIS Cat. No. 2939）/mTeSR1（100 ng/mLのbFGFを含む）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.393と呼ぶ（表7Aを参照）。
播種3日後、5日後に同組成の新鮮培地に交換して分化培養を行った、その後、播種12日後まで、毎日、培地交換して分化培養を継続した。播種後13日後、培養上清について胎児性肝細胞のマーカータンパク質（肝幹前駆細胞及び肝芽細胞のマーカータンパク質、成熟肝細胞には発現しない）であるα-フェトプロテイン（AFP）の測定（SRL）を行った結果、NO.393では、3,120 ng/mLであった（表8Aを参照）。
細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、細胞溶解液から、キアゲンのmiRNeasy Mini Kitにより、全RNAを調製した。InvitrogenのSuperScript III First-StrandSynthesis System（18080-051）、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（for any instrument）（11733-038）、ABI7300 RealTime PCR Systemを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、肝前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）、肝細胞マーカー（ALB、TTR、AAT）であった。
定量RT-PCRの結果から、ヒト誘導肝前駆細胞（NO.393）は肝幹/前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）の発現（NO.377を1として、NO.393は順に404倍、1,791倍）と肝細胞マーカー（ALB、AAT、TTR）の発現（NO.377を1として、NO.393は順に1,925倍、240倍、2,871倍）は240〜2,871倍に上昇した。すなわち、ヒト誘導肝前駆細胞は、ヒト誘導肝幹細胞と比較して、肝幹/前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）の発現と肝細胞マーカー（ALB、AAT、TTR）の発現が上昇している細胞であった（表8Aを参照）。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞を効率よく作製するには、TGF-βシグナリング阻害剤A-83-01を添加する培養方法が適していた。
実施例4 マトリゲルコート上での、フィーダー細胞及びbFGF無添加、TGF-β阻害剤添加での肝分化誘導と誘導肝前駆細胞の作製
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、1時間）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.377：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞はmTeSR1/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、1時間）した6 wellプレートに播種された（約4×104細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地を0.1μM A-83-01/aFGF［10 ng/mL］/ReproStem（bFGF不含）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.394と呼ぶ（表7Aを参照）。
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、1時間）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.377：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞はmTeSR1/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、1時間）した6 wellプレートに播種された（約4×104細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地を0.1μM A-83-01/aFGF［10 ng/mL］/ReproStem（bFGF不含）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.394と呼ぶ（表7Aを参照）。
播種3日後、5日後に新鮮培地に交換して分化培養を行った、その後、播種12日後まで、毎日、培地交換して分化培養を継続した。播種後13日後、培養上清について胎児性肝細胞のマーカータンパク質（肝幹前駆細胞及び肝芽細胞のマーカータンパク質、成熟肝細胞には発現しない）であるα-フェトプロテイン（AFP）の測定（SRL）を行った結果、NO.394では、14,400 ng/mLであった（表8Aを参照）。
細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、これら細胞溶解液から、キアゲンのmiRNeasy Mini Kitにより、全RNAを調製した。InvitrogenのSuperScript III First-StrandSynthesis System（18080-051）、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（for any instrument）（11733-038）、ABI7300 RealTime PCR Systemを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、胚性幹細胞マーカー（OCT3/4［POU5F1］、SOX2、NANOG）、内胚葉マーカー（SOX17、FOXA2、GATA4）、肝幹/前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）、肝細胞マーカー（ALB、TTR、AAT、FGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、APOA4）、肝細胞転写因子（HNF1A、HNF4A）、胆管上皮細胞マーカー（KRT7）、肝細胞増殖因子（HGF）であった。
定量RT-PCRの結果から、ヒト誘導肝幹細胞（NO.377）は胚性幹細胞マーカー（OCT3/4［POU5F1］、SOX2、NANOG）、内胚葉マーカー（SOX17、FOXA2、GATA4）、肝幹/前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）、肝細胞転写因子（HNF1A、HNF4A）、肝細胞マーカー（ALB、TTR、AAT、FGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、APOA4）、胆管上皮細胞マーカー（KRT7）、肝細胞増殖因子（HGF）を発現する細胞であった。一方、ヒト誘導肝前駆細胞（NO.394）は胚性幹細胞マーカー［OCT3/4（POU5F1）、SOX2、NANOG］の発現は1〜8％（NO.377を1として、NO.394は順に0.07倍、0.08倍、0.01倍）に低下し、内胚葉マーカー（SOX17、FOXA2、GATA4）の発現は3〜20％（NO.377を1として、NO.394は順に0.03倍、0.19倍、0.20倍）に低下し、肝細胞転写因子（HNF1A、HNF4A）を発現（NO.377を1として、NO.394は順に0.88倍、0.39倍）し、肝幹/前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）の発現（NO.377を1として、NO.394は順に804倍、12,812倍）と肝細胞マーカー（ALB、AAT、TTR、FGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、APOA4）の発現（NO.377を1として、NO.394は順に45,698倍、3,812倍、9,113倍、10,138倍、14,079倍、3,034倍、4,326倍、9,126倍、966倍）は804〜45,698倍に上昇し、胆管上皮細胞マーカー（KRT7）の発現（NO.377を1として、NO.394は37.5倍）、HGFの発現（NO.377を1として、NO.394は11倍）も上昇した。すなわち、ヒト誘導肝前駆細胞は、ヒト誘導肝幹細胞と比較して胚性幹細胞マーカー（OCT3/4［POU5F1］、SOX2、NANOG）と内胚葉マーカー（SOX17、FOXA2、GATA4）の発現は各々10％以下、25％以下に低下し、肝幹/前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）の発現と肝細胞マーカー（ALB、AAT、TTR、FGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、APOA4）の発現は100倍以上に上昇し、胆管上皮細胞マーカー（KRT7）の発現、肝細胞増殖因子（HGF）の発現も10倍以上に上昇している細胞であった（表8Aを参照）。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞を効率よく作製するには、マトリゲルでコートした培養皿で、フィーダー細胞なし、培地は実質的にbFGFを含まず（マトリゲルコート由来分を考慮しても0.01 pg/mL以下）、A-83-01を添加する培養方法が適していた。
なお、誘導多能性幹細胞は、ヒト誘導肝幹細胞と比較し、胚性幹細胞マーカー（OCT3/4［POU5F1］、SOX2、NANOG）をほぼ同等（1/4〜4倍）に発現し、肝幹/前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）、肝細胞マーカー（ALB、AAT、TTR、FGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、APOA4）、胆管上皮細胞マーカー（KRT7）、肝細胞増殖因子（HGF）を実質的に発現していない細胞である。誘導多能性幹細胞の中にも発現異常により、胚性幹細胞マーカーに加えて上記遺伝子の何れかの2〜3種類の遺伝子が発現することがあり得るが、ヒト誘導肝幹細胞のように肝幹/前駆細胞マーカー（DLK1、AFP）、肝細胞マーカー（ALB、AAT、TTR、FGG、AHSG、FABP1、RBP4、TF、APOA4）、胆管上皮細胞マーカー（KRT7）、肝細胞増殖因子（HGF）の全てが発現している細胞株は報告されていない。
実施例5 bFGF非存在下での浮遊（三次元）培養による肝分化誘導
マトリゲルでコート（15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.451：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞はReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）に懸濁後、低接着性6 well培養プレート（コーニング3471）に播種（約8×104細胞/5 mL培地/well）し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.472と呼ぶ（表7Bを参照）。
マトリゲルでコート（15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.451：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞はReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）に懸濁後、低接着性6 well培養プレート（コーニング3471）に播種（約8×104細胞/5 mL培地/well）し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.472と呼ぶ（表7Bを参照）。
播種6日後に遠心回収後、ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）の新鮮培地2 mLに懸濁して同上の培養プレートで肝分化培養を継続した。翌日、遠心後培養上清について胎児性肝細胞のマーカータンパク質（肝幹前駆細胞及び肝芽細胞のマーカータンパク質、成熟肝細胞には発現しない）であるα-フェトプロテイン（AFP）の測定（SRL）を行った結果、NO.472では、349ng/mLであった。細胞ペレットは1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解した（表8Bを参照）。
以上の様に、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞又はヒト肝細胞を効率よく作製するため、bFGF非存在下での浮遊（三次元）培養による肝分化誘導を行った。
実施例6 TGF-β阻害剤存在下での浮遊（三次元）培養による肝分化誘導
マトリゲルでコート（15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.451：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞はTGF-β阻害剤（A-83-01）0.1μM添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種（約8×104細胞/5 mL培地/well）し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.473と呼ぶ（表7Bを参照）。
マトリゲルでコート（15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.451：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞はTGF-β阻害剤（A-83-01）0.1μM添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種（約8×104細胞/5 mL培地/well）し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.473と呼ぶ（表7Bを参照）。
播種6日後に遠心回収後、TGF-β阻害剤（A-83-01）0.1μM添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）の新鮮培地2 mLに懸濁して同上の培養プレートで肝分化培養を継続した。翌日、遠心後培養上清について胎児性肝細胞のマーカータンパク質（肝幹前駆細胞及び肝芽細胞のマーカータンパク質、成熟肝細胞には発現しない）であるα-フェトプロテイン（AFP）の測定（SRL）を行った結果、NO.473では、324 ng/mLであった。細胞ペレットは1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解した（表8Bを参照）。
以上の様に、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞又はヒト肝細胞を効率よく作製するため、TGF-β阻害剤存在下での浮遊（三次元）培養による肝分化誘導を行った。
実施例7 オンコスタチンM及びデキサメサゾン存在下での肝分化誘導
マトリゲルでコート（15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.451：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は10 ng/mLオンコスタチンM（OsM）及び0.1μMデキサメサゾン（DEX）添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種（約8×104細胞/5 mL培地/well）し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.474と呼ぶ（表7Bを参照）。
マトリゲルでコート（15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.451：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は10 ng/mLオンコスタチンM（OsM）及び0.1μMデキサメサゾン（DEX）添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種（約8×104細胞/5 mL培地/well）し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.474と呼ぶ（表7Bを参照）。
播種6日後に遠心回収後、10 ng/mLオンコスタチンM（OsM）及び0.1μMデキサメサゾン（DEX）添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）の新鮮培地2 mLに懸濁して同上の培養プレートで肝分化培養を継続した。翌日、遠心後培養上清について胎児性肝細胞のマーカータンパク質（肝幹前駆細胞及び肝芽細胞のマーカータンパク質、成熟肝細胞には発現しない）であるα-フェトプロテイン（AFP）の測定（SRL）を行った結果、NO.474では、341 ng/mLであった。細胞ペレットは1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解した（表8Bを参照）。
以上の様に、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞又はヒト肝細胞を効率よく作製するため、オンコスタチンM及びデキサメサゾン存在下での浮遊（三次元）培養による肝分化誘導を行った。
実施例8 オンコスタチンM、デキサメサゾン、及びTGF-β阻害剤存在下での肝分化誘導
マトリゲルでコート（15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.451：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は10 ng/mLオンコスタチンM（OsM）、0.1μMデキサメサゾン（DEX）及び0.1μM TGF-β阻害剤A-83-01添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種（約8×104細胞/5 mL培地/well）し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.475と呼ぶ（表7Bを参照）。
マトリゲルでコート（15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.451：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は10 ng/mLオンコスタチンM（OsM）、0.1μMデキサメサゾン（DEX）及び0.1μM TGF-β阻害剤A-83-01添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種（約8×104細胞/5 mL培地/well）し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.475と呼ぶ（表7Bを参照）。
播種6日後に遠心回収後、10 ng/mLオンコスタチンM（OsM）、0.1μMデキサメサゾン（DEX）及び0.1μM TGF-β阻害剤A-83-01添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）の新鮮培地2 mLに懸濁して同上の培養プレートで肝分化培養を継続した。翌日、遠心後培養上清について胎児性肝細胞のマーカータンパク質（肝幹前駆細胞及び肝芽細胞のマーカータンパク質、成熟肝細胞には発現しない）であるα-フェトプロテイン（AFP）の測定（SRL）を行った結果、NO.475では、262 ng/mLであった。細胞ペレットは1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解した（表8Bを参照）。
以上の様に、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞又はヒト肝細胞を効率よく作製するため、オンコスタチンM、デキサメサゾン及びTGF-β阻害剤存在下での浮遊（三次元）培養による肝分化誘導を行った。
実施例9 オンコスタチンM、デキサメサゾン、TGF-β阻害剤、ジメチルスルフォキシド存在下での肝分化誘導
マトリゲルでコート（15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.451：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は10 ng/mLオンコスタチンM（OsM）、0.1μMデキサメサゾン（DEX）、0.1μM TGF-β阻害剤A-83-01、0.1％DMSO添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種（約8×104細胞/5 mL培地/well）し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.476と呼ぶ（表7Bを参照）。
マトリゲルでコート（15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.451：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は10 ng/mLオンコスタチンM（OsM）、0.1μMデキサメサゾン（DEX）、0.1μM TGF-β阻害剤A-83-01、0.1％DMSO添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種（約8×104細胞/5 mL培地/well）し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.476と呼ぶ（表7Bを参照）。
播種6日後に遠心回収後、10 ng/mLオンコスタチンM（OsM）、0.1μMデキサメサゾン（DEX）、0.1μM TGF-β阻害剤A-83-01、0.1％DMSO添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）の新鮮培地2 mLに懸濁して同上の培養プレートで肝分化培養を継続した。翌日、遠心後培養上清について胎児性肝細胞のマーカータンパク質（肝幹前駆細胞及び肝芽細胞のマーカータンパク質、成熟肝細胞には発現しない）であるα-フェトプロテイン（AFP）の測定（SRL）を行った結果、NO.476では、417 ng/mLであった。細胞ペレットは1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解した（表8Bを参照）。
以上の様に、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞又はヒト肝細胞を効率よく作製するため、オンコスタチンM、デキサメサゾン、TGF-β阻害剤及びジメチルスルフォキシド存在下での浮遊（三次元）培養による肝分化誘導を行った。
実施例10 bFGF非存在下、オンコスタチンM、デキサメサゾン、TGF-β阻害剤、ジメチルスルフォキシド存在下での浮遊（三次元）培養による肝分化誘導
マトリゲルでコート（15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.451：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は10 ng/mLオンコスタチンM（OsM）、0.1μMデキサメサゾン（DEX）、0.1μM TGF-β阻害剤A-83-01、1％DMSO添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種（約8×104細胞/5 mL培地/well）し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.477と呼ぶ（表7Bを参照）。
マトリゲルでコート（15μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）（100 ng/mLのbFGFを含む）を用いてフィーダー細胞（1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（NO.451：約50％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は10 ng/mLオンコスタチンM（OsM）、0.1μMデキサメサゾン（DEX）、0.1μM TGF-β阻害剤A-83-01、1％DMSO添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）に懸濁後、低接着性6 well培養プレートに播種（約8×104細胞/5 mL培地/well）し、フィーダー細胞なしで培養された。本発明においては、この細胞を、NO.477と呼ぶ（表7Bを参照）。
播種6日後に遠心回収後、10 ng/mLオンコスタチンM（OsM）、0.1μMデキサメサゾン（DEX）、0.1μM TGF-β阻害剤A-83-01、1％DMSO添加ReproStem（bFGF不含）/Y-27632（5μM）の新鮮培地2 mLに懸濁して同上の培養プレートで肝分化培養を継続した。翌日、遠心後培養上清について胎児性肝細胞のマーカータンパク質（肝幹前駆細胞及び肝芽細胞のマーカータンパク質、成熟肝細胞には発現しない）であるα-フェトプロテイン（AFP）の測定（SRL）を行った結果、NO.477では、427 ng/mLであった。細胞ペレットは1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解した（表8Bを参照）。
以上の様に、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞又はヒト肝細胞を効率よく作製するため、bFGF非存在下、オンコスタチンM、デキサメサゾン、TGF-β阻害剤及びジメチルスルフォキシド存在下での浮遊（三次元）培養による肝分化誘導を行った。
実施例11：TGF-βシグナリング阻害剤による肝分化誘導と誘導肝前駆細胞への分化（2）
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/STEMCELL Technologies）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60 cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞NGC1-1（No.1133（45継代）：約50〜80％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1.2×106を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/STEMCELL Technologies）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60 cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞NGC1-1（No.1133（45継代）：約50〜80％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1.2×106を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
そのヒト誘導肝幹細胞は、培地ReproStem（10 ng/mL aFGF添加）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間）した6 wellプレートに播種された（約2×105細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地を0.5μMの各々の阻害剤を含むReproStem（10 ng/mL aFGF添加）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしでヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞へ分化培養させた。この細胞をNo.1140〜1145と称する。No.1140には、阻害剤を添加せず、No.1141〜1145には以下の阻害剤が添加された。
No.1141：A-83-01（TOCRIS Cat. No.2939）
No.1142：ALK5 Inhibitor I, [3-(Pyridin-2-yl)-4-(4-quinonyl)]-1H-pyrazole, MERCK Calbiochem 616451
No.1143：TGF-β RI Kinase Inhibitor II 616452 MERCK Calbiochem
2-(3-(6-Methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine
No.1144：SB431542 Cayman 13031
4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl] benzamide, Dihydrate,
No.1145：LY-364947 Cayman 13341 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline
No.1141：A-83-01（TOCRIS Cat. No.2939）
No.1142：ALK5 Inhibitor I, [3-(Pyridin-2-yl)-4-(4-quinonyl)]-1H-pyrazole, MERCK Calbiochem 616451
No.1143：TGF-β RI Kinase Inhibitor II 616452 MERCK Calbiochem
2-(3-(6-Methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine
No.1144：SB431542 Cayman 13031
4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl] benzamide, Dihydrate,
No.1145：LY-364947 Cayman 13341 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline
播種3日後、5日後、6日後に各々の阻害剤を含む同組成の新鮮培地に交換して分化培養を行った。播種7日後、細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、細胞溶解液から、miRNeasy Mini Kit（QIAGEN）により、全RNAを調製した。バイオラッドのiScript Advanced cDNA synthesis kit、SsoAdvanced SYBR Green Supremix 2ml、CFX96 Real-Time System C1000 Thermal Cyclerを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、アルブミン（ALB）、α1−アンチトリプシン（AAT）、トランスサイレチン（TTR）、α-フェトプロテイン（AFP）であった。
定量RT-PCRの結果から、ヒト誘導肝幹細胞（No.1133）の発現量を1としてヒト誘導肝前駆細胞（No.1140、1141、1142、1142、1144、1145）を比較したところ、
ALBの発現は、各々、24.11、393.55、163.71、296.67、94.46、114.78倍に、
AATの発現は、各々、3.00、19.83、13.45、22.18、12.15、14.36倍に、
TTRの発現は、各々、128.22、935.16、966.14、1,262.14、614.17、482.45倍に、
AFPの発現は、各々、33.02、655.37、747.65、720.03、394.40、369.23倍に、
それぞれ上昇した。
ALBの発現は、各々、24.11、393.55、163.71、296.67、94.46、114.78倍に、
AATの発現は、各々、3.00、19.83、13.45、22.18、12.15、14.36倍に、
TTRの発現は、各々、128.22、935.16、966.14、1,262.14、614.17、482.45倍に、
AFPの発現は、各々、33.02、655.37、747.65、720.03、394.40、369.23倍に、
それぞれ上昇した。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞を効率よく作製するには、TGF-βシグナリング阻害剤を添加する培養方法が適していた。同様に、ヒト誘導肝幹細胞又はヒト誘導肝前駆細胞からヒト肝細胞を作製するにも、TGF-βシグナリング阻害剤を添加する培養方法が適していると考えられる。
実施例12：TGF-βシグナリング阻害剤による肝分化誘導と誘導肝前駆細胞への分化（3）
液体窒素で凍結保存してあったヒト誘導肝幹細胞AFB1-1 No.1543（36継代）を、マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cmの培養皿上で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60 cm2培養皿）と共培養した。
液体窒素で凍結保存してあったヒト誘導肝幹細胞AFB1-1 No.1543（36継代）を、マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cmの培養皿上で、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60 cm2培養皿）と共培養した。
50〜70％コンフルエントに達した後、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1.2×106を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は、培地ReproStem（bFGF無添加）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した6 wellプレートに播種された（約2×105細胞/1 mL培地/well）。
約6時間後、培地を0.5μMの各々の阻害剤を含むReproStem（bFGF無添加）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしでヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞へ分化培養させた。この細胞をNo.1545〜1549と称する。No.1544には、阻害剤を添加せず、No.1545〜1549には以下の阻害剤が添加された。
No.1545：A-83-01（TOCRIS 2939）
No.1546：SB-505124（SIGMA S4696）
2-（5-benzo[1,3]dioxol-5-yl-2-tert-butyl-3H-imidazol-4-yl）-6-methylpyridine hydrochloride
No.1547： TGF-β RI Inhibitor III 616453 MERCK Calbiochem
2-（5-Benzo[1,3]dioxol-4-yl-2-tert-butyl-1H-imidazol-4-yl）-6-methylpyridine, HCl
No.1548：SD-208, TGF-β RI Inhibitor V 616456 MERCK Calbiochem
2-（5-Chloro-2-fluorophenyl）pteridin-4-yl）pyridin-4-yl amine
No.1549：TGF-β RI Kinase Inhibitor VIII 616459 CALBIO
6-（2-tert-Butyl-5-（6-methyl-pyridin-2-yl）-1H-imidazol-4-yl）-quinoxaline
No.1545：A-83-01（TOCRIS 2939）
No.1546：SB-505124（SIGMA S4696）
2-（5-benzo[1,3]dioxol-5-yl-2-tert-butyl-3H-imidazol-4-yl）-6-methylpyridine hydrochloride
No.1547： TGF-β RI Inhibitor III 616453 MERCK Calbiochem
2-（5-Benzo[1,3]dioxol-4-yl-2-tert-butyl-1H-imidazol-4-yl）-6-methylpyridine, HCl
No.1548：SD-208, TGF-β RI Inhibitor V 616456 MERCK Calbiochem
2-（5-Chloro-2-fluorophenyl）pteridin-4-yl）pyridin-4-yl amine
No.1549：TGF-β RI Kinase Inhibitor VIII 616459 CALBIO
6-（2-tert-Butyl-5-（6-methyl-pyridin-2-yl）-1H-imidazol-4-yl）-quinoxaline
播種後、2〜3日毎に各々の阻害剤を含む同組成の新鮮培地に交換して分化培養を行った。播種後13日後、細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、細胞溶解液から、miRNeasy Mini Kit（QIAGEN）により、全RNAを調製した。バイオラッドのiScript Advanced cDNA synthesis kit、SsoAdvanced SYBR Green Supremix 2 ml、CFX96 Real-Time System C1000 Thermal Cyclerを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、ALB、AAT、TTR、AFP、サイトケラチン7（KRT7）、サイトケラチン19（KRT19）、DLK1（Delta-like 1 homolog）であった。
定量RT-PCRの結果から、ヒト誘導肝前駆細胞（No.1545、1546、1547、1548、1549）を比較して、Ct値で表記すると、
ALBの発現は、各々、20.95、23.2、25.55、21.35、24.67であり、
AATの発現は、各々、23.57、23.56、24.09、23.54、23.54、
TTRの発現は、各々、16.96、17.24、18.13、17.4、17.24、
AFPの発現は、各々、17.21、18.61、20.24、17.48、19.25、
KRT7の発現は、各々、20.51、19.8、19.45、20.05、19.89、
KRT19の発現は、各々、22.05、20.33、20.29、20.45、20.36、
DLK1の発現は、各々、18.15、18.77、18.74、19.1、18.66、
GAPDHの発現は、各々、14.22、13.25、13.76、13.72、14.24、
であった。このように、肝細胞マーカー、肝前駆細胞マーカー、胆管上皮マーカーの発現が検出された。従って、TGF-βシグナリング阻害剤による肝分化誘導が行われ、誘導肝前駆細胞へ分化した。
ALBの発現は、各々、20.95、23.2、25.55、21.35、24.67であり、
AATの発現は、各々、23.57、23.56、24.09、23.54、23.54、
TTRの発現は、各々、16.96、17.24、18.13、17.4、17.24、
AFPの発現は、各々、17.21、18.61、20.24、17.48、19.25、
KRT7の発現は、各々、20.51、19.8、19.45、20.05、19.89、
KRT19の発現は、各々、22.05、20.33、20.29、20.45、20.36、
DLK1の発現は、各々、18.15、18.77、18.74、19.1、18.66、
GAPDHの発現は、各々、14.22、13.25、13.76、13.72、14.24、
であった。このように、肝細胞マーカー、肝前駆細胞マーカー、胆管上皮マーカーの発現が検出された。従って、TGF-βシグナリング阻害剤による肝分化誘導が行われ、誘導肝前駆細胞へ分化した。
また、ヒト誘導肝幹細胞（No.1543）の発現量を1としてヒト誘導肝前駆細胞（No.1544、1545、1546、1547、1548、1549）のKRT7（肝前駆細胞マーカー又は胆管上皮マーカー）の発現は、各々655、3291、2768、4761、3186、4905倍に顕著に上昇した。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞を効率よく分化させるには、TGF-βシグナリング阻害剤を添加する培養方法が適していた。同様に、ヒト誘導肝幹細胞又はヒト誘導肝前駆細胞からヒト肝細胞を分化させるにも、TGF-βシグナリング阻害剤を添加する培養方法が適していると考えられる（表10を参照）。
実施例13：bFGF/aFGF無添加による肝分化誘導と誘導肝前駆細胞の作製
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60 cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.806（42継代）：約50〜80％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60 cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.806（42継代）：約50〜80％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
そのヒト誘導肝幹細胞は、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した直径10 cm培養皿に培養されたフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60 cm2培養皿）上に播種して共培養した。
ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1）で毎日新しく培地を交換し、50〜80％コンフルエント/培養皿まで培養を継続させた。そのヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.834（43継代））を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1.2×106を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は、培地ReproStem（bFGF無添加）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した6 wellプレートに播種された（約2×105細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地を0.5μMのA-83-01を含むReproStem（bFGF無添加）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしでヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞へ分化培養させた。この細胞をNo.835と称する。
播種後、2〜3日毎に0.5μMのA-83-01を含む同組成の新鮮培地に交換して分化培養を行った。播種後6日と13日後、培養上清についてAFPの測定（臨床検査センター/SRL）を行った結果、播種後6日のNo.835では、6,430 ng/mLであった。播種後13日のNo.835では、30,900 ng/mLであった。
播種13日後、細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、細胞溶解液から、miRNeasy Mini Kit（QIAGEN）により、全RNAを調製した。バイオラッドのiScript Advanced cDNA synthesis kit、SsoAdvanced SYBR Green Supremix 2ml、CFX96 Real-Time System C1000 Thermal Cyclerを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、ALB、AAT、TTR、AFP、であった。
定量RT-PCRの結果から、ヒト誘導肝幹細胞（No.806）の発現量を1としてヒト誘導肝前駆細胞（No.835）のALBの発現は、11,300倍に上昇した。同様にAATは98.1倍に上昇、TTRは312.2倍に上昇、AFPは145.0倍に上昇した。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞を効率よく分化させるには、A-83-01を添加する培養方法が適していた。同様に、ヒト誘導肝幹細胞又はヒト誘導肝前駆細胞からヒト肝細胞を分化させるにも、A-83-01を添加する培養方法が適していると考えられる（表11を参照）。
実施例14：ステロイドホルモン添加による肝分化誘導と誘導肝前駆細胞の作製
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞NGC1-1（No.946（37継代）：約50〜80％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞NGC1-1（No.946（37継代）：約50〜80％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
そのヒト誘導肝幹細胞は、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した直径10 cm培養皿に播種されたフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）上に播種して共培養した。
ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1）で毎日新しく培地を交換し、50〜80％コンフルエント/培養皿まで培養を継続させた。そのヒト誘導肝幹細胞NGC1-1（No.947（38継代））を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1.2×106を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は、培地ReproStem（bFGF無添加）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した6 wellプレートに播種された（約2×105細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地にA-83-01 0.5μMに加えて、エストロン0.1μM、エストラジオール0.1μM、エストリオール0.1μM、プロゲステロン10μM、コルチゾン0.1μM、アルドステロン0.1μM、トリヨードサイロニン0.01 nM、サイロキシン0.01 nM、テストステロン0.1μM、デヒドロエピアンドロステロン0.1μMを含むReproStem（bFGF無添加）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしでヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞へ分化培養させた。この細胞を各々No.949と称する。
播種後、2〜3日毎に同組成の新鮮培地に交換して分化培養を行った。播種13日後、細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、細胞溶解液から、miRNeasy Mini Kit（QIAGEN）により、全RNAを調製した。バイオラッドのiScript Advanced cDNA synthesis kit、SsoAdvanced SYBR Green Supremix 2ml、CFX96 Real-Time System C1000 Thermal Cyclerを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、ALB、AAT、TTR、AFP、CYP1A2であった。
定量RT-PCRの結果から、ヒト誘導肝幹細胞（No.946）の発現量を1としてヒト誘導肝前駆細胞（No.949）のALBの発現は、7,212倍に上昇した。同様にAATは34倍に上昇、TTRは725倍に上昇、AFPは86倍に上昇、CYP1A2は12.280倍に上昇した。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞を効率よく分化させるには、ステロイドホルモンを添加する培養方法が適していた。同様に、ヒト誘導肝幹細胞又はヒト誘導肝前駆細胞からヒト肝細胞を分化させるにも、ステロイドホルモンを添加する培養方法が適していると考えられる（表12を参照）。
実施例15：胆汁酸、脂肪酸、コレステロール添加による肝分化誘導と誘導肝前駆細胞の作製
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞NGC1-1（No.946（37継代）：約50〜80％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞NGC1-1（No.946（37継代）：約50〜80％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
そのヒト誘導肝幹細胞は、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した直径10 cm培養皿に播種されたフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）上に播種して共培養した。ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1）で毎日新しく培地を交換し、50〜80％コンフルエント/培養皿まで培養を継続させた。そのヒト誘導肝幹細胞NGC1-1（No.947（38継代））を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1.2×106を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は、培地ReproStem（bFGF無添加）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した6 wellプレートに播種された（約2×105細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地にA-83-01 0.5μMに加えて、No.951コール酸 5μM、ケノデオキシコール酸 5μM、250倍 脂肪酸濃縮液（Invitrogen 11905-031） X1/250、250倍コレステロール濃縮液（Invitrogen 12531-018
） X1/250を含むReproStem（bFGF無添加）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしでヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞へ分化培養させた。この細胞をNo.951と称する。
） X1/250を含むReproStem（bFGF無添加）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしでヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞へ分化培養させた。この細胞をNo.951と称する。
播種後、2〜3日毎に同組成の新鮮培地に交換して分化培養を行った。播種13日後、細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、細胞溶解液から、miRNeasy Mini Kit（QIAGEN）により、全RNAを調製した。バイオラッドのiScript Advanced cDNA synthesis kit、SsoAdvanced SYBR Green Supremix 2ml、CFX96 Real-Time System C1000 Thermal Cyclerを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、ALB、AAT、TTR、AFP、CYP1A2であった。
定量RT-PCRの結果から、ヒト誘導肝幹細胞（No.946）の発現量を1としてヒト誘導肝前駆細胞（No.951）のALBの発現は、9,306倍に上昇した。同様にAATは144倍に上昇、TTRは948倍に上昇、AFPは220倍に上昇、CYP1A2は7.235倍に上昇した。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞を効率よく分化させるには、胆汁酸、脂肪酸、コレステロールを添加する培養方法が適していた。同様に、ヒト誘導肝幹細胞又はヒト誘導肝前駆細胞からヒト肝細胞を分化させるにも、胆汁酸、脂肪酸、コレステロールを添加する培養方法が適していると考えられる。
実施例16：血清及びデキサメサゾン添加による肝分化誘導と誘導肝前駆細胞の作製
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
そのヒト誘導肝幹細胞は、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した直径10 cm培養皿に播種されたフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）上に播種して共培養した。ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1）で毎日新しく培地を交換し、50〜80％コンフルエント/培養皿まで培養を継続させた。
そのヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.664（35継代））を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1.2×106を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は、培地ReproStem（bFGF無添加）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した6 wellプレートに播種された（約2×105細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地を0.5μM のA-83-01を含むDMEM−10％FBS 2 mLで置換し、フィーダー細胞なしでヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞へ分化培養させた。
播種後、2〜3日毎に0.5μMのA-83-01を含む同組成の新鮮培地に交換して分化培養を行った。播種後6日後、各々0.1（No.683）、0.5（No.684）、2（No.685）μMのデキサメサゾン（DEX）を含み、かつ0.5μM のA-83-01を含む10％ウシ胎児血清（FBS）含有DMEM培地に変え、2〜3日毎に培地を新しく交換した。播種14日後、細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、細胞溶解液から、miRNeasy Mini Kit（QIAGEN）により、全RNAを調製した。バイオラッドのiScript Advanced cDNA synthesis kit、SsoAdvanced SYBR Green Supremix 2ml、CFX96 Real-Time System C1000 Thermal Cyclerを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、ALB、AAT、TTR、AFP、CYP3A4であった。
定量RT-PCRの結果から、ヒト誘導肝幹細胞（No.663）の発現量を1としてヒト誘導肝前駆細胞（No.683、684、685）を比較すると、
ALBの発現は、11,284、16,667、13,278倍に
AATの発現は、70.4、90.9、78.3倍に、
TTRの発現は、59.3、83.3、78.6倍に、
AFPの発現は、7,178、10,000、6931倍に
それぞれ上昇した。そして、CYP3A4はヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.664）の発現量を1として1,003、1,389、1,038倍に上昇した。
ALBの発現は、11,284、16,667、13,278倍に
AATの発現は、70.4、90.9、78.3倍に、
TTRの発現は、59.3、83.3、78.6倍に、
AFPの発現は、7,178、10,000、6931倍に
それぞれ上昇した。そして、CYP3A4はヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.664）の発現量を1として1,003、1,389、1,038倍に上昇した。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞又は肝細胞を効率よく分化させるには、血清及びデキサメサゾン（DEX）を添加する培養方法が適していた。同様に、誘導肝前駆細胞からヒト肝細胞を分化させるにも、血清及びデキサメサゾン（DEX）を添加する培養方法が適していると考えられる。
実施例17：TGF-βシグナリング阻害剤及びデキサメサゾン添加による肝分化誘導と誘導肝前駆細胞の作製
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
そのヒト誘導肝幹細胞は、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した直径10 cm培養皿に播種されたフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）上に播種して共培養した。ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1）で毎日新しく培地を交換し、50〜80％コンフルエント/培養皿まで培養を継続させた。そのヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.664（35継代））を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1.2×106を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は、培地ReproStem（bFGF無添加）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した6 wellプレートに播種された（約2×105細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地を0.5μM のA-83-01を含むReproStem（bFGF無添加）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしでヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞へ分化培養させた。
播種後、2〜3日毎に0.5μM のA-83-01を含む同組成の新鮮培地に交換して分化培養を行った。播種後6日後、各々0.1（No.686）、0.5（No.687）、2（No.688）μMのデキサメサゾン（DEX）を含み、かつ0.5μM のA-83-01を含む培地ReproStem（bFGF無添加）に変え、2〜3日毎に培地を新しく交換した。播種14日後、細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、細胞溶解液から、miRNeasy Mini Kit（QIAGEN）により、全RNAを調製した。バイオラッドのiScript Advanced cDNA synthesis kit、SsoAdvanced SYBR Green Supremix 2ml、CFX96 Real-Time System C1000 Thermal Cyclerを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、ALB、AAT、TTR、AFP、CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4であった。
定量RT-PCRの結果から、ヒト誘導肝幹細胞（No.663）の発現量を1としてヒト誘導肝前駆細胞（No.686、687、688）を比較すると、
ALBの発現は、3,706、4,306、2,559倍に、
AATの発現は、201、224、129倍に、
TTRの発現は、156、166、89倍に、
AFPの発現は、4,414、4,227、3,414倍に
それぞれ上昇した。また、ヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.664 ）の発現量を1として、
CYP1A2の発現は、6.4、4.9、10.8倍に、
CYP2C9の発現は、9.0、6.6、4.5倍に、
CYP3A4の発現は、12.8、9.7、5.3倍に
それぞれ上昇した。
ALBの発現は、3,706、4,306、2,559倍に、
AATの発現は、201、224、129倍に、
TTRの発現は、156、166、89倍に、
AFPの発現は、4,414、4,227、3,414倍に
それぞれ上昇した。また、ヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.664 ）の発現量を1として、
CYP1A2の発現は、6.4、4.9、10.8倍に、
CYP2C9の発現は、9.0、6.6、4.5倍に、
CYP3A4の発現は、12.8、9.7、5.3倍に
それぞれ上昇した。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞又は肝細胞を効率よく分化させるには、デキサメサゾン（DEX）を添加する培養方法が適していた。同様に、誘導肝前駆細胞からヒト肝細胞を分化させるにも、デキサメサゾン（DEX）を添加する培養方法が適していると考えられる。
実施例18：bFGF/aFGF無添加による肝分化誘導と誘導肝前駆細胞の作製（2）
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.663（35継代）：約50〜80％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.663（35継代）：約50〜80％コンフルエント/培養皿）を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
そのヒト誘導肝幹細胞は、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した直径10 cm培養皿に培養されたフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）上に播種して共培養した。ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1）で毎日新しく培地を交換し、50〜80％コンフルエント/培養皿まで培養を継続させた。
そのヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.704（36継代））を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1.2×106を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は、培地ReproStem（bFGF無添加）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した6 wellプレートに播種された（約2×105細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地を0.5μM のA-83-01を含むReproStem（bFGF無添加）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしでヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞へ分化培養させた。この細胞をNo.705と称する。
播種後、2〜3日毎に0.5μMのA-83-01を含む同組成の新鮮培地に交換して分化培養を行った。播種後8日と13日後、培養上清についてAFPの測定（臨床検査センター/SRL）を行った結果、播種後8日のNo.705では、5,540 ng/mLであった。播種後13日のNo.705では、2,320 ng/mLであった。播種13日後、細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、細胞溶解液から、miRNeasy Mini Kit（QIAGEN）により、全RNAを調製した。バイオラッドのiScript Advanced cDNA synthesis kit、SsoAdvanced SYBR Green Supremix 2ml、CFX96 Real-Time System C1000 Thermal Cyclerを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、ALB、AAT、TTR、AFP、GATA4、SOX17、FOXA2、HNF4A、 OCT3/4、NANOG、SOX2であった。
定量RT-PCRの結果から、ヒト誘導肝幹細胞（No.663）の発現量を1としてヒト誘導肝前駆細胞（No.705）のALBの発現は、51,653倍に上昇、AATは310倍に上昇、TTRは2,282倍に上昇、AFPは30,649倍に上昇、GATA4は1.44倍に上昇、SOX17は32.93倍に上昇、FOXA2は1.19倍に上昇、HNF4Aは5.42倍に上昇、OCT3/4は0.06倍に減少、NANOGは0.01倍に減少、SOX2は0.01倍に減少した。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞を効率よく分化させるには、A-83-01を添加する培養方法が適していた。同様に、ヒト誘導肝幹細胞又はヒト誘導肝前駆細胞からヒト肝細胞を分化させるにも、A-83-01を添加する培養方法が適していると考えられる。また、ヒト誘導肝幹細胞は、ALB、AAT、TTR、AFP、GATA4、SOX17、FOXA2、HNF4A、OCT3/4、NANOG、SOX2を発現し、ヒト誘導肝前駆細胞は、ALB、AAT、TTR、AFPの発現が上昇し、GATA4、SOX17、FOXA2、HNF4Aを発現し、OCT3/4、NANOG、SOX2の発現が減少した細胞であった。
実施例19：コラーゲンコート上での肝分化誘導と誘導肝前駆細胞の作製
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
マトリゲルでコート（60μLマトリゲル/6 mL PBS/培養皿、約1時間静置）した直径10 cm培養皿で、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ ReproCell）を用いてフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）と共培養したヒト誘導肝幹細胞AFB1-1を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して1/10量を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。
そのヒト誘導肝幹細胞は、ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1/ STEMCELL Technologies）/Y-27632（10μM）に懸濁後、マトリゲルでコート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した直径10 cm培養皿に培養されたフィーダー細胞（約1.5×106マウス胚性線維芽細胞MEF/60cm2培養皿）上に播種して共培養した。ヒトES・iPS細胞用培地（mTeSR1）で毎日新しく培地を交換し、50〜80％コンフルエント/培養皿まで培養を継続させた。そのヒト誘導肝幹細胞AFB1-1（No.631（34継代））を、PBS（-）で洗浄後、0.25％トリプシン-1 mM EDTAで培養皿から剥離し、ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem/ReproCELL）に懸濁して2.4×106を遠心洗浄（1,000 rpm、5分間）した。そのヒト誘導肝幹細胞は、培地ReproStem（bFGF無添加）/Y-27632（10μM）に懸濁後、IWAKIコラーゲンプレート（No.634）又はコラーゲンプレートにマトリゲル（No.637）コート（10μLマトリゲル/1 mL PBS/well、約1時間静置）した6 wellプレートに播種された（約4×105細胞/1 mL培地/well）。約3時間後、培地を0.1μM のA-83-01を含むReproStem（bFGF無添加）2 mLで置換し、フィーダー細胞なしでヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞へ分化培養させた。この細胞を各々No.634又はNo.637と称する。
播種後、2〜3日毎に0.1μM のA-83-01を含む同組成の新鮮培地に交換して分化培養を行った。播種後6日と14日後、培養上清についてα-フェトプロテイン（AFP）の測定（臨床検査センター/SRL）を行った結果、播種後6日のNo.634及びNo.637では、各々2,890 ng/mL及び3,040 ng/mLであった。播種後14日のNo.634及びNo.637では、各々24,900 ng/mL及び30,000 ng/mLであった。播種14日後、細胞は1 mL/wellのQIA zol試薬で溶解し、細胞溶解液から、miRNeasy Mini Kit（QIAGEN）により、全RNAを調製した。バイオラッドのiScript Advanced cDNA synthesis kit、SsoAdvanced SYBR Green Supremix 2 ml、CFX96 Real-Time System C1000 Thermal Cyclerを用いて定量RT-PCRを行った。定量した遺伝子は、ALB、AAT、TTR、AFPであった。
定量RT-PCRの結果から、10 ng/mL bFGF含有ヒトES・iPS細胞用培地（ReproStem）で培養したヒト誘導肝幹細胞（No.631）の発現量を1としてヒト誘導肝前駆細胞（No.634及びNo.637）のALBの発現は、246,304倍及び244,450倍、に上昇した。同様にAATは236.13倍及び236.51倍に上昇、TTRは9,499倍及び8,350倍に上昇、AFPは5,066倍及び6,011倍に上昇した。
以上の結果から、ヒト誘導肝幹細胞からヒト誘導肝前駆細胞を効率よく分化させるには、コラーゲンコート又はコラーゲン/マトリゲルコート上で培養する方法が適していた。同様に、ヒト誘導肝幹細胞又はヒト誘導肝前駆細胞からヒト肝細胞を分化させるにも、コラーゲンコート又はコラーゲン/マトリゲルコート上で培養方法が適していると考えられる。
Claims (11)
- 胚性幹細胞などの多能性幹細胞のマーカー遺伝子である表１：
前記誘導肝幹細胞から、肝細胞で特徴的に発現している遺伝子である表２：
- 前記誘導肝幹細胞が、以下：
（ａ）多能性幹細胞のマーカー遺伝子であるNANOG遺伝子、POU5F1（OCT3/4）遺伝子、およびSOX2遺伝子を発現することに加えて、肝細胞で特徴的に発現している遺伝子である、DLK1遺伝子、AFP遺伝子、ALB遺伝子、AAT遺伝子、TTR遺伝子、FGG遺伝子、AHSG遺伝子、FABP1遺伝子、RBP4遺伝子、TF遺伝子、およびAPOA4遺伝子を発現する、
（ｂ）多能性幹細胞のマーカー遺伝子である表１に記載の遺伝子をすべて発現することに加えて、肝細胞で特徴的に発現している遺伝子である、DLK1遺伝子、AFP遺伝子、ALB遺伝子、AAT遺伝子、TTR遺伝子、FGG遺伝子、AHSG遺伝子、FABP1遺伝子、RBP4遺伝子、TF遺伝子、およびAPOA4遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子を発現する、または
（ｃ）多能性幹細胞のマーカー遺伝子である表１に記載の遺伝子をすべて発現することに加えて、肝細胞で特徴的に発現している遺伝子である、DLK1遺伝子、AFP遺伝子、ALB遺伝子、AAT遺伝子、TTR遺伝子、FGG遺伝子、AHSG遺伝子、FABP1遺伝子、RBP4遺伝子、TF遺伝子、およびAPOA4遺伝子を発現する、
細胞である、請求項１に記載の方法。 - 前記誘導肝幹細胞が、さらに以下：
（ａ）内胚葉マーカー遺伝子であるSOX17、FOXA2、およびGATA4からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子を発現する、または
（ｂ）内胚葉マーカー遺伝子であるSOX17、FOXA2、およびGATA4を発現する、
細胞である、請求項１または２に記載の方法。 - 前記TGF-βシグナリング阻害剤またはTGF-β阻害剤が、
・A-83-01（3-（6-メチル-2-ピリジニル）-N-フェニル-4-（4-キノリニル）-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド）、
・ALK5 Inhibitor I（3-（ピリジン-2-イル）-4-（4-キノニル）］-1H-ピラゾール）、
・LDN193189（4-（6-（4-（ピペラジン-1-イル）フェニル）ピラゾロ［1,5-a］ピリミジン-3-イル）キノリン）、
・SB431542（4-［4-（1,3-ベンゾジオキソール-5-イル）-5-ピリジン-2-イル-1H-イミダゾール-2-イル］ベンズアミド）、
・SB-505124（2-（5-ベンゾ［1,3］ジオキソール-5-イル-2-tert-ブチル-3H-イミダゾール-4-イル）-6-メチルピリジン塩酸塩水和物）、
・SD-208（2-（5-クロロ-2-フルオロフェニル）プテリジン-4-イル］ピリジン-4-イル-アミン）、
・SB-525334（6-［2-（1,1-ジメチルエチル）-5-（6-メチル-2-ピリジニル）-1H-イミダゾール-4-イル］キノキサリン）、
・LY-364947（4-［3-（2-ピリジニル）-1H-ピラゾール-4-イル］-キノリン）、
・LY2157299（4-［2-（6-メチル-ピリジン-2-イル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ［1,2-b］ピラゾール-3-イル］-キノリン-6-カルボン酸アミド）、
・TGF-β RI Kinase Inhibitor II 616452（2-（3-（6-メチルピリジン-2-イル）-1H-ピラゾール-4-イル）-1,5-ナフチリジン）、
・TGF-β RI Kinase Inhibitor III 616453（2-（5-ベンゾ［1,3］ジオキソール-4-イル-2-tert-ブチル-1H-イミダゾール-4-イル）-6-メチルピリジン, HCl）、
・TGF-β RI Kinase Inhibitor IX 616463（4-（（4-（（2,6-ジメチルピリジン-3-イル）オキシ）ピリジン-2-イル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド）、
・TGF-β RI Kinase Inhibitor VII 616458（1-（2-（（6,7-ジメトキシ-4-キノリル）オキシ）-（4,5-ジメチルフェニル）-1-エタノン）、
・TGF-β RI Kinase Inhibitor VIII 616459（6-（2-tert-ブチル-5-（6-メチル-ピリジン-2-イル）-1H-イミダゾール-4-イル）-キノキサリン）、
・AP12009（TGF-β2アンチセンス化合物“Trabedersen”）、
・Belagenpumatucel-L（TGF-β2アンチセンス遺伝子修飾同種異系腫瘍細胞ワクチン）、
・CAT-152（Glaucoma - lerdelimumab（抗-TGF-β-2モノクローナル抗体））、
・CAT-192（Metelimumab（TGFβ1を中和するヒトIgG4モノクローナル抗体）、
・GC-1008（抗-TGF-βモノクローナル抗体）、
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法を実施する工程を含む、誘導肝前駆細胞の製造方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法を実施して誘導肝前駆細胞を得る工程、および当該誘導肝前駆細胞を肝細胞へ分化させる工程、を含む、肝細胞の製造方法。
- ステロイド骨格を有する化合物、脂肪酸及び血清から選択される物質の存在下にて分化させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ステロイド骨格を有する化合物が、ステロイドホルモン、胆汁酸、コレステロール、および／または合成ステロイドである、請求項７に記載の方法。
- 前記合成ステロイドがデキザメタゾンである、請求項８に記載の方法。
- 前記ステロイドホルモンが、エストロン、エストラジオール、エストリオール、プロゲステロン、コルチゾン、アルドステロン、トリヨードサイロニン、サイロキシン、テストステロン、および/またはデヒドロエピアンドロステロンであり、そして、
前記胆汁酸が、コール酸および／またはケノデオキシコール酸である、
請求項８に記載の方法。 - 請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法を実施する工程を含む、誘導肝前駆細胞または肝細胞の製造方法。
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