JP6122146B2 - マイコプラズマワクチン作製方法 - Google Patents
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Description
本発明は先行技術に固有の問題を解決し、当該技術の現況に明確な進歩を提供する。
本発明は、概して対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供する。前記方法は、a)血清を削減させた真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養、b)該マイコプラズマ菌の抗原の入手、及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含む。
有利には、本発明が提供する実験データは、マイコプラズマ菌は血清削減真核細胞系で生産できることを示す。
通常は、“免疫学的応答”は以下の作用の1つ以上を含む(ただしこれらに限定されない):本発明の免疫原性組成物に含まれる1つの抗原又は複数の抗原を特異的に指向する、抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、及び/又は細胞傷害性T細胞、及び/又はガンマ-デルタT細胞の産生又は活性化。好ましくは、該宿主細胞は防御性免疫学的応答又は治療性応答を示すであろう。
“防御性免疫学的応答”は、感染宿主が通常示す臨床徴候の軽減又は欠如、迅速な回復期間、及び/又は感染性を示す期間の減少、又は感染宿主の組織若しくは体液若しくは分泌物中の病源体力価の低下によって明示される。
新規感染に対する抵抗性が強化され、及び/又は当該疾患の臨床重篤度が軽減されるように宿主が防御性免疫学的応答を示す場合に、該免疫原性組成物を“ワクチン”と言う。
“治療及び/又は予防”は概して、その必要があるか又はそのような治療/予防により利益を受け得る対象動物又は対象動物の群れに有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む。“治療”という用語は、ひとたび対象動物又は群れの少なくとも数匹の動物がそのようなマイコプラズマに感染したら、さらにそのような動物がそのようなマイコプラズマ感染によって引き起こされるか若しくは前記感染に付随するいくつかの臨床徴候を示す場合に該免疫原性組成物の有効量を投与することを指す。“予防”という用語は、対象動物のマイコプラズマによるいずれの感染よりも前に、又は少なくともそのような動物若しくは一群の動物のいずれもがそのようなマイコプラズマによる感染によって引き起こされるか若しくは前記感染に付随するいずれの臨床徴候も示さない場合に、そのような対象動物に投与することを指す。
好ましくは、臨床徴候の発生率又は重篤度は、治療されていないか又は本発明より前に利用可能であった免疫原性組成物で治療されたが続いて特定のマイコプラズマ菌に感染した対象動物と比較して、少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも%、さらに好ましくは少なくとも90%、もっとも好ましくは少なくとも95%軽減される。
対象動物における特定のマイコプラズマ感染によって引き起こされるか又は前記感染に付随する臨床徴候の発生率の低下又は重篤度の軽減は、本発明の免疫原性組成物の1用量以上をその必要がある対象動物に投与することによって達成できる。実施例2及び3で示されるように、本明細書で提供する免疫原性組成物は、その必要がある対象動物への単一用量の投与後に有効であることが証明された。
“マイコプラズマ”という用語は当業者には公知である。“マイコプラズマ”は例えば以下に記載された細菌の属を指す:Blanchard, A., and G. F. Browning (eds.). 2005. Mycoplasmas: Molecular biology, pathogenicity and strategies for control. Horizon Bioscience, Wymondham U.K.;Kobisch M. and Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci.Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605。細菌は、それらの生化学的及び生物学的特性の他にそれらの形態学に基づいて分類できる。これらの分類基準は当業界で周知である。概して、当該マイコプラズマ感染は本記述の他の個所に記載した臨床徴候を伴う。
本明細書で用いられる“マイコプラズマ”という用語は、M.ヒオリーニス又はM.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエ又はM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエを指す。しかしながら、マイコプラズマという用語はまたM.ボビスを包含する。M.ヒオリーニスの完全なゲノム配列は、代表例として例えば以下に提供されている:Liu, W. et al., J. Bacteriol. 2010, vol. 192 (21), 5844-45 doi: 10.1128/JB.00946-10. Epub 2010 Aug 27;又はCalcutt MJ. et al., 2012, J. Bacteriol. Vol. 194 (7), 1848 doi: 10.1128/JB.00033-12。M.ヒオシノビアエの単離株は、代表例としてアメリカ培養細胞系統保存機関にアクセッション番号ATCC 25591又はATCC 27095で寄託されている。マイコプラズマ・ヒオニューモニアエの単離株は、代表例としてアメリカ培養細胞系統保存機関にアクセッション番号ATCC 25095、ATCC 25617及びATCC 25934で寄託されている。マイコプラズマ・ヒオニューモニアエJ-株のゲノムDNAは、アメリカ培養細胞系統保存機関にアクセッション番号ATCC 25934Dで寄託されている。マイコプラズマ・ボビスの単離株は当業者には周知であり、いくつかの単離株が代表例としてアメリカ培養細胞系統保存機関にアクセッション番号ATCC 25025、ATCC 25523及びATCC 27368で寄託されている。
“細胞系”という用語は当業者には公知である。特に、“細胞系”という用語は、微生物(例えばマイコプラズマ菌)の培養のためのin vitro細胞培養系である。そのような細胞系は、宿主細胞及び当該生物の外部でそのような細胞を増殖させるために適切な細胞培養培養液を含む。特に、宿主細胞は、マイコプラズマ菌の感染に感受性であることもないこともある。そのような宿主細胞は、生きている細胞として、不活化形で又は細胞フラグメントとして存在し得る。好ましくは、そのような宿主細胞は真核細胞系の真核細胞である。
本明細書で用いられる“無細胞培養系”という用語は、マイコプラズマ菌を除いて細胞を全く含まない培養系を指す。
MDCK細胞を含む真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養のための好ましい血清量は、約0−6%(v/v)、より好ましくは約1−5%(v/v)、さらに好ましくは約2−4%(v/v)、さらに好ましくは約2−3%(v/v)の間の血清濃度、もっとも好ましくは約2%(v/v)の血清濃度を含む。
マッコイ細胞を含む真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養のための好ましい血清量は、約0−10%(v/v)、より好ましくは約1−9%(v/v)、さらに好ましくは約2−8%(v/v)、さらに好ましくは約3−7%(v/v)、さらに好ましくは約4−6%(v/v)の間の血清濃度、もっとも好ましくは約5%(v/v)の血清濃度を含む。
“採集”という用語はマイコプラズマ菌の抗原をトランスフェクトした真核細胞系から収集又は回収することを指す。当業界で公知の任意の通常的方法(例えば任意の分離方法)を前記マイコプラズマ抗原の回収に用いることができる。当業界で周知の方法は遠心分離又はろ過(例えば一定の孔サイズを有する半透膜を用いる)を含む。
“単離”という用語はマイコプラズマ抗原の単離工程を含む。マイコプラズマ菌の抗原を感染真核細胞系から単離する方法は当業者には公知である。そのような方法は物理的及び/又は化学的方法を含み、凍結融解の繰り返し、超音波処理などが含まれる(ただしこれらに限定されない)。
単離株から抗原を“精製”する方法は当業者には公知であり、前記精製は例えば以下に記載の方法による:Protein purification methods - a practical approach, E.L.V. Harris and S. Angel, eds., IRL Press at Oxford University Press。そのような方法には、遠心分離又はろ過による分離、沈殿、サイズ排除(ゲルろ過)クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。抗原は、精製された純粋な形態で入手し得るか、或いは他の細胞性物質若しくは培養液などを含まないか又は実質的に前記を含まない状態であり得る。前記単離及び/又は精製後、抗原は、少なくとも80%、好ましくは80%−90%、より好ましくは90%−97%、もっとも好ましくは97%から夾雑物を全く含まない完全に純粋な形態までの純度を示す。
任意の通常的な“不活化”方法を本発明の目的のために用いることができる。したがって、不活化は、当業者に公知の化学的及び/又は物理的処置によって実施できる。好ましい不活化方法には、2-ブロモエチレンアミンヒドロブロミド(BEA)(環化されて二元性エチレンイミンを形成している)の溶液の添加を含む環化二元性エチレンイミンの添加が含まれる。さらに別の好ましい化学的不活化剤は、トリトンX-100、デオキシコール酸ナトリウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、β-プロピオラクトン、チメロサール、フェノール及びホルムアルデヒド(ホルマリン)を含むが、ただし前記に限定されない。しかしながら、不活化はまた中和工程を含むことができる。好ましい中和剤にはチオ硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウムなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
好ましいホルマリン不活化条件は、約0.02%(v/v)−2.0%(v/v)、より好ましくは約0.1%(v/v)−1.0%%(v/v)、さらに好ましくは約0.15%(v/v)−0.8%(v/v)、さらに好ましくは約0.16%(v/v)−0.6%(v/v)、もっとも好ましくは約0.2%(v/v)−0.4%(v/v)のホルマリン濃度を含む。インキュベーション時間はマイコプラズマ種の耐性に左右される。概して、不活化プロセスは、適切な培養系でマイコプラズマの増殖が検出できなくなるまで実施される。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記免疫原性組成物はマイコプラズマ免疫原性組成物である。
本発明のある特徴では、マイコプラズマ菌の培養に用いられる血清はブタ血清を含まない。“ブタ血清を含まない”という用語は、真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養プロセス中にブタ血清が添加されないことを意味する。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記血清はブタ血清を含まない。更なる特徴にしたがえば、マイコプラズマ菌の抗原の全てがブタ血清を含まない真核細胞系で生成される。
本発明のある特徴では、マイコプラズマ抗原は全不活化マイコプラズマバクテリンである。マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化マイコプラズマバクテリンであり得ることは理解されよう。
全不活化バクテリンは、マイコプラズマ菌全体を丸ごと好ましくは上記に記載の方法によって不活化することにより入手できる。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)マイコプラズマ菌の抗原の入手及び該マイコプラズマ抗原の不活化;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記マイコプラズマ抗原は完全なマイコプラズマ菌である。
本発明の更なる特徴では、真核細胞系はマッコイ細胞株を含む。マッコイ細胞株は当業者には公知である。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記真核細胞系はマッコイ細胞株を含む。繰り返せば、前記マイコプラズマ抗原は全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化され得る。
本発明の更なる特徴では、マイコプラズマ菌はM.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択される。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、前記マイコプラズマ菌はM.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択される。好ましくは、前記マイコプラズマ抗原は全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化され得る。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのM.ヒオリーニス菌の培養;b)M.ヒオリーニス菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、M.ヒオリーニスの抗原は全不活化M.ヒオリーニスバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化され得る。前記M.ヒオリーニス抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化M.ヒオリーニスバクテリンであり得ることは理解されよう。
更なる特徴にしたがえば、免疫原性組成物は、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ抗原を含む。マイコプラズマ免疫原性組成物の調製に用いられる、上記記載のマイコプラズマ種(例えばM.ヒオニューモニアエ又はM.ヒオリーニス又はM.ヒオシノビアエ)の少なくとも1つの細菌が、本発明にしたがって血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系で培養される。好ましくは、マイコプラズマ免疫原性組成物の調製に用いられるマイコプラズマ菌の全てが、本発明にしたがって血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系で培養される。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及び/又は前記の任意の組み合わせのマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系での少なくともM.ヒオニューモニアエ菌の培養;b)該マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、該M.ヒオニューモニアエ菌の全てが本発明にしたがって血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系で培養される。好ましくは、該M.ヒオニューモニアエ抗原の少なくとも1つは全不活化M.ヒオニューモニアエバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記M.ヒオニューモニアエ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及び/又は前記の任意の組み合わせのマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系での少なくともM.ヒオシノビアエ菌の培養;b)該マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、該M.ヒオシノビアエ菌の全てが本発明にしたがって血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系で培養される。好ましくは、該M.ヒオシノビアエ抗原の少なくとも1つは全不活化M.ヒオシノビアエバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記M.ヒオシノビアエ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
有利には、本発明が提供する実験データは、本発明の免疫原性組成物の一用量投与が防御性免疫応答を確実にかつ効果的に刺激したことを示す。特に、測定可能な抗体応答がM.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエについて示された。
本明細書で用いられる“対象動物”という用語は、動物(好ましくは哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、サル若しくはウシ、好ましくはまたヒト)に関する。
本発明の更なる特徴では、対象動物はウシである。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)該マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、対象動物はウシである。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
本発明の更なる特徴では、対象動物はイヌである。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)該マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、対象動物はイヌである。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
“医薬的に許容できる担体”という用語には、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、被覆剤、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、並びに前記の組み合わせが含まれる。
本発明のある特徴では、医薬的に許容できる担体はアジュバントである。
例えば、SPTエマルジョン(以下の文献の147ページに記載されている:Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach (M. Powell and M. Newman eds.), Plenum Press, 1995)及びエマルジョンMF59(同書の183ページに記載されている)を用いることが可能である。さらにまた別の適切なアジュバントには、多くのものの中でとりわけRIBIアジュバント系(RIBI Inc.)、ブロックコポリマー(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M(Chiron, Emeryville CA)、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミンアジュバント、大腸菌の易熱性エンテロトキシン(組換え体又はそうでないもの)、コレラトキシン、IMS 1314又はムラミルジペプチドが含まれるが、ただしこれらに限定されない。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーの中ではとりわけEMA(Monsanto)(無水マレイン酸とエチレンとのコポリマー)が含まれる。これらのコポリマーの水への溶解は酸性溶液を生じ、好ましくは生理学的pHに中和されてアジュバント溶液が得られ、前記に免疫原性組成物、免疫学的組成物又はワクチン組成物そのものが取り込まれるであろう。
本発明の好ましい実施態様では、アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョン、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマー、RIBIアジュバント系、ブロックコポリマー、SAF-M、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミン、大腸菌の易熱性エンテロトキシン(組換え又はそうでないもの)、コレラトキシン、IMS1314、ムラミルジペプチド、並びに前記の組み合わせから成る群から選択される。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)該マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、医薬的に許容できる担体はアジュバントである。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
本発明のある特徴では、水中油中水エマルジョンはモンタニド(Montanido)ISA207 VGである。モンタニドISA207 VGは、非鉱物油中に溶液の無水マンニトールのオレイン酸エステルを含むアジュバントであり、水中油中水ワクチンエマルジョンを生成するように考案されている。モンタニドISA207 VGは当業者に周知であり利用することができる。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防する免疫原性組成物の調製方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)該マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、医薬的に許容できる担体はモンタニドISA207 VG又はCARBOPOL(商標)である。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、抗原の免疫原性を増大させる方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)該マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含む。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
本発明のある特徴では、抗原は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から入手される抗原と比較して免疫原性が増大している。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、抗原の免疫原性を増大させる方法を提供し、前記方法は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)該マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含み、ここで、該免疫原性組成物は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から入手される同じ抗原を含む免疫原性組成物と比較して免疫原性が増大している。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
“増大した”という用語は、細胞性及び/又は抗体媒介免疫応答が、同じ抗原を含む参照免疫原性組成物(参照免疫原性組成物の抗原は無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から調製される)によって誘引される細胞性及び/又は抗体媒介免疫応答と比較して少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも75%、もっとも好ましくは少なくとも100%増加することを意味する。細胞性及び/又は抗体媒介免疫応答の測定の仕方は当業者の一般的な知識である。特に、問題の免疫原性組成物の細胞媒介免疫応答と参照物の細胞媒介免疫応答との比較、又は問題の免疫原性組成物の抗体媒介免疫応答と参照物のそれとの比較はそのような当業者には明白であるが、問題の免疫原性組成物の細胞媒介免疫応答と参照物の抗体媒介免疫応答との比較又はその逆は自明ではない。さらにまた、細胞媒介免疫応答は、例えば問題の免疫原性組成物/抗原による細胞傷害性T細胞の活性化の測定によって測定できる。抗体媒介免疫応答は、例えば、当該抗原を含む免疫原性組成物を動物に投与することによって生成される抗原特異的抗体の量の測定によって測定できる。細胞及び/又は抗体媒介免疫応答は、マウスモデル、ネコモデル、ウシモデル又はブタモデルを用いることによって測定できる。しかしながら、実施例4及び5に記載するアッセイは、M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエに対する免疫学的応答を検出する参照アッセイとして用いられるであろう。
“参照”免疫原性組成物という用語は、本発明の血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でマイコプラズマ菌を培養することによって入手されたものではない免疫原性組成物を指す。
より適切な言い方をすれば“参照”免疫原性組成物という用語は、血清補充無細胞培養系でマイコプラズマ菌を培養することによって入手された、同じ抗原を用いる免疫原性組成物を指す。血清補充無細胞培養系でのマイコプラズマ菌の培養は当業者には周知である。血清の由来及び血清濃度は、培養されるマイコプラズマ菌及び得られるマイコプラズマ菌の収量に左右される。M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエは、概して10−20%(v/v)ブタ血清及び5−10%(v/v)酵母抽出物を補充した無細胞培養系で培養され、高収量が得られる。しかしながら、血清濃度は変更可能であり、酵母抽出物を欠いていてもよく、血清の由来は例えばウシ胎児血清に変更できることは理解されよう。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は参照免疫原性組成物と比較して増大した免疫原性を示し、ここで、参照免疫原性組成物の抗原は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から調製される。
したがって更なる特徴にしたがえば、本出願は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)該マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含む方法によって入手できる免疫原性組成物を提供する。更なる特徴にしたがえば、そのような免疫原性組成物は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から調製される同じ抗原を含む参照免疫原性組成物と比較して増大した免疫原性を示す。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
“真核細胞の成分”という用語は前記真核細胞の細胞全体及びフラグメントを含む。“フラグメント”という用語は、真核細胞の任意の部分(例えば細胞膜の部分)又は細胞内小器官をその全体若しくは部分として含む。しかしながら、フラグメントという用語はまた、脂質、タンパク質、糖、DNA、RNA及びその類似物並びに前記の組み合わせを含む前記真核細胞の任意の部分を包含する。さらにまた、真核細胞成分及びマイコプラズマ抗原は、別々に若しくは互いに付着して又は前記の組み合わせで免疫原性組成物中に存在し得る。
したがってある特徴にしたがえば、本出願は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)該マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含む方法によって入手できる免疫原性組成物を提供し、ここで免疫原性組成物は前記真核細胞系の真核細胞の成分を含む。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
更なる特徴では、前記真核細胞の成分はマイコプラズマ抗原に付着している。
したがってある特徴にしたがえば、本出願は、a)血清を削減した又はブタ血清を含まない真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養;b)該マイコプラズマ菌の抗原の入手;及びc)医薬的に許容できる担体の添加を含む方法によって入手できる免疫原性組成物を提供し、ここで、前記真核細胞の成分はマイコプラズマ抗原に付着している。好ましくは、該マイコプラズマ抗原の少なくとも1つは全不活化マイコプラズマバクテリンであり、好ましくはホルマリンで不活化される。前記マイコプラズマ抗原のただ1つ、いくつか又は全てが全不活化バクテリンであり得ることは理解されよう。
例えば、M.ヒオニューモニアエの抗原を含む本発明の免疫原性組成物は、好ましくは1用量につき約102から約1010CFU、好ましくは1用量につき約103から約109CFUの量で、さらに好ましくは1用量につき約104から約108CFUの量で、もっとも好ましくは1用量につき約105から約107CFUの量で用いられる。M.ヒオリーニスの抗原を含む本発明の免疫原性組成物は、好ましくは1用量につき約102から約1010CFU、好ましくは1用量につき約103から約109CFUの量で、さらに好ましくは1用量につき約104から約108CFUの量で、もっとも好ましくは1用量につき約105から約107CFUの量で用いられる。M.ヒオシノビアエの抗原を含む本発明の免疫原性組成物は、好ましくは1用量につき約102から約1010CFU、好ましくは1用量につき約103から約109CFUの量で、さらに好ましくは1用量につき約104から約108CFUの量で、もっとも好ましくは1用量につき約105から約107CFUの量で用いられる。
本明細書に記載の免疫原性組成物を提供する方法の多様なプロセス工程を組み合わせて、本明細書に記載する発明を実施できることは当業者には理解されよう。
実施例
以下の実施例は本発明を詳述することのみを意図する。それらは特許請求の範囲を如何なる態様でも制限するものではない。
A.M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及びM.ヒオニューモニアエのMDCK細胞での培養
M.ヒオリーニス:
MDCK細胞のコンフルエントなT75フラスコをトリプシン処理し、MEM+5%FBSを用いて5枚のT150フラスコに継代培養する(1:10分割)。ほぼ95−100%コンフルエントな単層が認められるまで、37℃+5%CO2でフラスコをインキュベートする。培養液をデカントし、フラスコを1xPBSで2回洗浄する。4−5mLのM.ヒオリーニスを各フラスコに添加する(MOI=10−100)。上記と同じインキュベーション条件下で2時間を下まわらない時間でフラスコのコンフルエントな細胞を感染させる。感染期間後に、ほぼ37℃に予め温めた十分な感染培養液(MEM+2%FBS)を合計体積60mL/フラスコで各フラスコに添加する。CPE が90%を超えるまで(ほぼ3−7日)フラスコをインキュベートする。細胞懸濁物を各フラスコから収集し、一緒にプールする(継代=n)。前記プールした材料を用いて、ほぼ95−100%コンフルエントなMDCK細胞の新しいフラスコを先の感染と同じ態様で感染させ(継代=n+1)、用いるフラスコの数を増加させながら必要と考える十分な最終体積達成する(継代=n+2、継代=n+3)。
M.ヒオシノビアエ:
以下のようにいくらか改変しつつM.ヒオリーニスと同じ態様でM.ヒオシノビアエを培養する:感染培養液はDMEM+2%FBS+1%アルギニン溶液を含む、M.ヒオシノビアエは典型的なCPEを示さないので、培養液の色の変化及び濁度が次の継代培養への重要な指標である。
M.ヒオニューモニアエ:
M.ヒオニューモニアエをM.ヒオリーニスと同じ態様で培養する。感染に用いる株に応じて、CPEが提示されることもされないこともある。したがって、培養液の色の変化及び濁度を次の継代培養への指標として用いることができる。
B.マッコイ細胞でのM.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及びM.ヒオニューモニアエの培養条件
M.ヒオリーニス:
攪拌フラスコ中の10%FBS補充改変EMEMでマッコイ細胞を懸濁培養として増殖させる。105−106細胞/mLの最終濃度を有するように細胞を新しいフラスコに播種することによって継代する。M.ヒオリーニスの場合、3Lのフラスコに500mLの細胞懸濁物(105−106細胞/mL)を1mLの107−108CFUとともに播種する。磁気攪拌プレート上で3−7日間、5%CO2の存在下に37℃でフラスコをインキュベートする。マイコプラズマの増殖は眼に見える酸性pH変化及び濁度の増加によって確認される。マイコプラズマ増殖はまたPFUアッセイで評価して総数を決定する。
M.ヒオシノビアエ:
M.ヒオシノビアエはM.ヒオリーニスと類似の態様で培養される。 3Lのフラスコに500mLの細胞懸濁物(105−106細胞/mL)を1mLの105−107CFUとともに播種する。磁気攪拌プレート上でほぼ2週間、5%CO2の存在下に37℃でフラスコをインキュベートする。pH変化及び濁度の増加の両方を用いて増殖を決定し、さらにPFUアッセイで総数を決定する。
M.ヒオニューモニアエ:
M.ヒオニューモニアエは、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエと類似の態様で培養される。 3Lのフラスコに500mLの細胞懸濁物(105−106細胞/mL)を1mLの105−107CFUとともに播種する。磁気攪拌プレート上でほぼ2週間、5%CO2の存在下に37℃でフラスコをインキュベートする。pH変化及び濁度の増加の両方を用いて増殖を決定し、さらにPFUアッセイで総数を決定することができる。
C.種々の血清タイプによるマイコプラズマ種の培養
あるマイコプラズマ種が種々の種に由来する血清中で培養できるか否かを評価するために、MDCK細胞をM.ヒオリーニスに感染させ、ウシ胎児血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清又はウマ血清中で培養する。各血清タイプについて、MDCK細胞でのM.ヒオリーニスの培養を上記のように実施する(すなわち細胞増殖に5%血清及び感染に2%血清)。M.ヒオリーニスを標準的方法により感染後4日で採集する。CCU(色変化単位(color changing unit))アッセイを実施してM.ヒオリーニスの生力価を決定する。さらにまた、qPCR(定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応)を実施して、M.ヒオリーニスの総ゲノム含有量を決定する。例示的実験を表1に示す。
最後の継代で採集できるようになった(90%を超えるCPEが存在する)ときに凍結融解を1回だけ実施する。凍結融解は以下の工程によって実施する:全フラスコをフリーザー(<-60℃)に2時間より長く静置する、37℃で急速融解する、溶解物を収集及びプールする、さらに数回ピペットで上下させて均質化する。概して、その後10−20%のグリセロールを懸濁物に添加し均質化する。懸濁物を作業に適した体積に小分けする。必要とされるまでストックを-60℃より低温で維持する。
上記ストックの適切な体積を0.2%のホルマリンで不活化する。ワクチンをブレンドするときに、過剰なホルマリンを重亜硫酸ナトリウムで中和する。ワクチンをモンタニドISA207 VG又はCARBOPOL(商標)アジュバントとブレンドする。ワクチンは2−7℃で保存する。
ワクチンの有効性は、ブタに投与した後で抗体応答を誘発する能力(及びELISAによる力価)を基準に評価する。
動物のケア:
動物は試験開始前まで良好な健康及び栄養状態にある。任意抽出手順の前に、健康審査を実施する。試験期間を通して医薬が添加されていない飼料を用いる。飼料比率は、施設の標準的作業手順にしたがい試験動物の齢、状態及び種について適切である。試験の間水は自由供給される。
ブタに投与後のM.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエワクチンの有効性の判定
M.ヒオリーニス:
D0及びD21に再度、通常の仔豚(6週齢±5日)の筋肉内にM.ヒオリーニスワクチンの2mL用量(7.1−7.3log10CCU/用量)を投与する。M.ヒオリーニスは上記のように調製する(すなわち上記のようにMDCK細胞で培養する)。ワクチンにモンタニドISA207VG又はCARBOPOL(商標)をアジュバントとして添加する。PBSをプラセボとして用いる。全身の健康状態についてブタを毎日観察する。ワクチン接種前D0、7、14、21、28、35及び42に血液を収集する。BIVI R&DインダイレクトELISAにより、M.ヒオリーニス特異抗体について血清を検査する。BIVI R&D ELISAの場合、0.200を超えるS/P比を陽性とみなす。
表2に示す例では、M.ヒオリーニスELISAは強い抗体応答を示す。M.ヒオリーニス-MDCK+モンタニドISA207VG でワクチン接種した6/6(100%)の動物が、第1回目の投与後2週間(D14)で陽性であった。全動物がD42までずっと陽性を維持し、2回目の投与後1週間(D28)で力価は上昇する。
ワクチン接種後に同様な抗体応答の結果が、マッコイ細胞で培養されたM.ヒオリーニスを用いて得られた(データは示されていない)。同様な結果は単一用量投与後に得られた(データは示されていない)。
D0及びD21に再度、通常の仔豚(6週齢±5日)の筋肉内にM.ヒオニューモニアエワクチンの2mL用量(8.0−8.5log10CCU/用量)を投与する。ワクチンにモンタニドISA207VGをアジュバントとして添加する。PBSをプラセボとして用いる。全身の健康状態についてブタを毎日観察する。ワクチン接種前D0、7、14、21、28、35及び42に血液を収集し、M.ヒオニューモニアエ抗体の存在について検査する。ある例では、市販のIDEXX ELISAを用い、0.400を超えるS/P比を陽性とみなした。
表3に示す例では、M.ヒオニューモニアエELISAは強い抗体応答を示した。M.ヒオニューモニアエMDCK+ISA207ワクチン接種動物の場合、D14で3/6(50%)の動物が、D21で5/6(83.3%)が、D28,35及び42で6/6(100%)が陽性であった。
54匹のCD/CD動物(8週齢±5日)を6グループに分ける。グループV1及びV2は各々、それぞれMDCK細胞及びCM(複合培養液:例えばブタ血清及び酵母抽出液を含むプロテオースペプトン系培養液又はフリース(Friis)系培養液)で培養された、不活化M.ヒオリーニスMHRN001単離株を投与され、グループV3及びV4は、それぞれMDCK細胞及びCMで培養された不活化M.ヒオリーニスMHRN002単離株を投与される。全てのワクチンはモンタニドISA207VGアジュバントを添加され、投与量及び経路は2x2mLの用量でD0に1用量及びD21に2回目の用量が筋肉内注射される。グループCC(コントロールグループ)には抗原を含まないプラセボ(PBS)が同じ態様で投与される。グループSC(厳密コントロール)は試験を通して全く処置を受けず、厳密なコントロール動物として供される。D42、43及び44に、グループV1−V4及びCCのブタをビルレントなM.ヒオリーニスでチャレンジする。投与の量及び経路は、それぞれ40mL腹腔内、15mL静脈内及び15mL鼻内である。M.ヒオリーニス特異的ELISA検査のためにD0から試験の終了(D58)まで毎週血液を収集する。R&D M.ヒオリーニスELISAの場合、0.200を超えるS/Pを陽性とみなした。表4に示す例示的な試験では、グループSCの全てのブタがこの試験を通して陰性を維持し、M.ヒオリーニスに曝露されていないことを示した。グループV1−V4及びCCはD0及び7では陰性であった。しかしながら血清学の結果はCM系及びMDCK系ワクチン間で変化を示した。CM系ワクチンと比較したとき、MDCK系ワクチンは、血清転換のより早期の開始、はるかに多数の血清陽性豚、及びより高い血清学的力価を示した。
M.ヒオリーニスをそれぞれ上記に記載したようにマッコイ細胞で培養するか、又はCM(複合培養液)で培養する。
未希釈抗原(未希釈)、1:10抗原及び1:100抗原を用いマッコイ抗原からワクチンを作製し、いずれもアジュバントとしてモンタニドISA207VGとブレンドする。CM由来抗原を用いるワクチンを同じ態様で作製する。
ブタ(ワクチン接種時に3週齢)を2mLの1用量でD0のIM投与によりワクチン免疫する。
表5に示すように、例示的試験のグループ平均はいずれもチャレンジ前(D0−D21)には“陰性”であったが、“マッコイ+ISA未希釈”及び“マッコイ+ISA1:10”は、陽性傾向の応答を示した。チャレンジ後1週間(D28)で、CM1:100を除いて全ワクチングループが応答した。
表5から、各抗原タイプ(マッコイ、CM)が標準的な滴定効果(未希釈>1:10>1:100)を示すことは明らかである。さらにまた表5から、“マッコイ+ISA未希釈”及び“マッコイ+ISA1:10”ワクチンは、“CM+ISA未希釈”抗原よりも高い平均スコアを有すること、及びD42の終了まで前記を維持することは明白である。チャレンジ後に陽性(S/Pが0.200以上)平均を有するグループは、“マッコイ+ISA未希釈”及び“マッコイ+ISA1:10”グループである。マッコイ未希釈ワクチン及び1:10稀釈は、チャレンジ前及びチャレンジ後の両方でCM未希釈ワクチンよりも高い血清応答を示した。さらにまた、マッコイ1:100でワクチン免疫した動物もまた、プラセボグループ(非ワクチン接種動物)及びCM1:100グループとは区別し得る応答を示した(CM1:100応答又はその欠如は非ワクチン接種動物と同等であった)。力価測定実験は、細胞培養系ワクチンは、無細胞系で培養したマイコプラズマ菌に由来するワクチンと比較してより良好な血清学的結果を有することを示した。
Claims (20)
- 以下を含む、対象動物でマイコプラズマ感染を治療及び/又は予防するための免疫原性組成物を作製する方法:
a.血清を削減した真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養であって、前記真核細胞系がマッコイ(Mc Coy)細胞株またはMDCK細胞株を含む前記培養;
b.該マイコプラズマ菌の抗原の入手。 - 血清がブタ血清を含まない、請求項1に記載の方法。
- マイコプラズマ菌が血清の非存在下で培養される、請求項1に記載の方法。
- 免疫原性組成物がマイコプラズマ免疫原性組成物である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 抗原が、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から入手される抗原と比較して増大した免疫原性を有する、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 抗原が不活化バクテリン全体である、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 不活化バクテリン全体がホルマリン不活化バクテリンである、請求項6に記載の方法。
- 真核細胞系がMDCK細胞株を含む、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
- マイコプラズマ菌が、M.ヒオニューモニアエ(M. hyopneumoniae)、M.ヒオリーニス(M. hyorhinis)、M.ヒオシノビアエ(M. hyosynoviae)、それらの任意の組み合わせ、及びM.ボビス(M. bovis)から成るリストから選択される、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- マイコプラズマ菌が、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエから成るリストから選択される、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 免疫原性組成物が単一用量投与用に処方される、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 対象動物がブタである、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 対象動物がウシである、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 対象動物がネコである、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 対象動物がイヌである、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- さらに医薬的に許容できる担体を添加すること含み、前記医薬的に許容できる担体が、溶媒、分散媒体、被覆剤、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、並びに前記の組み合わせから成る群から選択される、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
- 医薬的に許容できる担体が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョン、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマー、RIBIアジュバント系、ブロックコポリマー、SAF-M、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミン、大腸菌(E. coli)の易熱性エンテロトキシン(組換え体又はそうでないもの)、コレラトキシン、IMS1314、ムラミルジペプチド、並びに前記の組み合わせから成る群から選択されるアジュバントである、請求項16に記載の方法。
- 医薬的に許容できる担体が、水中油中水エマルジョン又はカルボマーである、請求項17に記載の方法。
- 抗原の免疫原性を増大させる、請求項1から18のいずれか1項に記載の方法。
- 抗原が、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から入手される抗原と比較して免疫原性の増大を示す、請求項19に記載の方法。
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