JP6095689B2 - 細胞、組織および器官の凍結保存 - Google Patents
細胞、組織および器官の凍結保存 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6095689B2 JP6095689B2 JP2014551650A JP2014551650A JP6095689B2 JP 6095689 B2 JP6095689 B2 JP 6095689B2 JP 2014551650 A JP2014551650 A JP 2014551650A JP 2014551650 A JP2014551650 A JP 2014551650A JP 6095689 B2 JP6095689 B2 JP 6095689B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hydrogel
- freezing
- cell
- biological sample
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0278—Physical preservation processes
- A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
本明細書で使用される場合、「凍結保護」、「凍結保存」または「凍結保持」という用語は、生物試料が劣化から保存されることによる凍結工程に関与するプロセスを指す。この用語は従来の凍結保存技術およびガラス化技術を包含する。
網状化剤を用いて多糖を架橋することによって直接得られるヒドロゲル、および
乾燥したヒドロゲル粒子の膨張後に得られるヒドロゲル
を独立して指してもよい。
a)30〜70℃、好ましくは40〜50℃、最も好ましくは50℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム(STMP)、オキシ塩化リン(POCl3)、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒド(glurataldehyde)からなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン(fucoidan)、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの多糖を化学的に架橋することによって得られる、方法に関する。
前記ヒドロゲルは、
a)30〜70℃、好ましくは40〜50℃、最も好ましくは50℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム(STMP)、オキシ塩化リン(POCl3)、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの多糖を化学的に架橋する工程、
b)ヒドロゲル粒子を得るためにa)において得られたヒドロゲルを研磨する工程、
c)任意に、工程b)において得られた前記ヒドロゲル粒子を洗浄する工程、
d)任意に、工程b)または工程c)において得られた前記ヒドロゲル粒子を篩にかける工程、
e)任意に、好ましくは生理食塩水、好ましくは蒸留水中で完全にリンスしたリン酸緩衝食塩水を用いて、工程b)または工程d)において得られた前記ヒドロゲル粒子を洗浄する工程、
f)工程b)または工程e)において得られた前記ヒドロゲル粒子を、好ましくはエタノール/水浴中で脱水する工程、
g)乾燥ヒドロゲル粒子を得るために、工程f)において得られた前記ヒドロゲル粒子を、好ましくは50℃にて乾燥する工程、
h)任意に、工程g)において得られた乾燥粒子を篩にかける工程、
i)ヒドロゲルを得るために、工程h)において得られた乾燥ヒドロゲル粒子を、膨張溶液中で膨張させる工程
によって得られる、方法に関する。
1.5Mの濃度にてPBSで3回、
0.15Mの濃度にてPBSで2回、
0.015Mの濃度にてPBSで3回。
70%のエタノールの濃度にてエタノール/PBS 0.015Mを有する2つの浴、
50%のエタノールの濃度にてエタノール/PBS 0.015Mを有する2つの浴、
無水エタノールを有する1つの浴。
i)溶液SGly、該溶液は好ましくは、1〜10%、最も好ましくは約5%のグリセロールの濃度にて生理食塩水およびグリセロールを含む;
ii)溶液SGLU、該溶液は好ましくは、5〜20%、最も好ましくは約10%のグルコースの濃度にて生理的血清およびグルコースを含む;および
iii)溶液SPEG15、該溶液は好ましくは、生理食塩水1リットル当たり15gのポリエチレングリコールの濃度にて生理食塩水およびポリエチレングリコールを含む。
SR=[(Ws−Wd)/Wd]×100
a)30〜70℃、好ましくは40〜50℃、最も好ましくは50℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム(STMP)、オキシ塩化リン(POCl3)、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの多糖を化学的に架橋する工程
によって得られる。
a)30〜70℃、好ましくは40〜50℃、最も好ましくは50℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム(STMP)、オキシ塩化リン(POCl3)、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの多糖を化学的に架橋する工程、
b)ヒドロゲル粒子を得るために、a)において得られたヒドロゲルを研磨する工程、
c)任意に、工程b)において得られた前記ヒドロゲル粒子を洗浄する工程、
d)任意に、工程b)または工程c)において得られたヒドロゲル粒子を篩にかける工程、
e)任意に、好ましくは生理食塩水、好ましくは蒸留水中で完全にリンスしたリン酸緩衝食塩水を用いて、工程b)または工程d)において得られたヒドロゲル粒子を洗浄する工程、
f)好ましくはエタノール/水浴中で、工程b)または工程e)において得られたヒドロゲル粒子を脱水する工程、
g)乾燥ヒドロゲル粒子を得るために、好ましくは50℃にて、工程f)において得られたヒドロゲル粒子を乾燥する工程、
h)任意に、工程g)において得られた乾燥粒子を篩にかける工程、
i)ヒドロゲルを得るために、膨張溶液中で、工程h)において得られた乾燥ヒドロゲル粒子を膨張させる工程
によって得られる。
多糖系ヒドロゲル粒子バンク(凍結生物ゲル)は、50℃にてアルカリ性条件下でトリメタリン酸三ナトリウム網状化剤(STMP、10%(w/w、Sigma))を用いて、プルラン(MW200,000 Hayashibara、岡山、日本)を化学的に架橋することによって得た。
a)プロトコル
膨張分析
生理環境中のヒドロゲル粒子の挙動を定義するために、これらのヒドロゲルの膨張比を生理的血清中で求めた。乾燥した凍結生物ゲルの重量をPBS中への浸漬前に記録した(Wd)。インキュベーションの1時間後、過剰な水を取り除き、膨張した凍結生物ゲルを秤量した(Ws)。膨張比を以下の式に従って計算した:
SR=[(Ws−Wd)/Wd]×100
生物バイオゲル中の結合したリン酸塩含有量を、リン酸塩アッセイを使用して定量した。手短に述べると、50mgのヒドロゲル粒子を、ヒドロゲルが完全に分解するまで105℃にて10%のHNO3中でインキュベートした。次いでメタバナジン酸アンモニウム溶液(NH4VO3、11mmol/L)およびヘプタモリブデン酸アンモニウム溶液((NH4)6Mo7O24、43mol/L)を分解したヒドロゲル溶液に加えた。校正範囲は0.4mmol/LのH3PO4溶液を使用して行った。試料のスペクトルはスペクトロメータを使用して405nmにて記録した。
ヒドロゲルを効果的に使用する方法を定義するために、まず、それらの組成に応じてそれらの熱特性を研究することが必要とされる。実際に、合成されたヒドロゲルのこの系統的な熱特性評価は凍結生物学におけるそれらの使用のための決定要因である。
凍結細胞学において広範に使用されているこの技術(Boutronら、1979;Devireddy、1998;Bischof、2000)により、数ミリグラムの試料において動的条件下での相転移の観察が可能である。非晶質状態の対応するガラス形成傾向および安定性はこのように示差走査熱量測定から評価される。測定は、Setaram DSC131熱分析計で実施した。−10℃/分にて試料を20℃〜−150℃に冷やした。熱分析ソフトウェアSETSOFT2000を使用してサーモグラムを分析した。
実施に有用なヒドロゲル粒子を図1に表す。前記粒子の特定の性質を本明細書以下に記載する。
図2の左に示すように、膨張比は粒子が膨張する膨張溶液の性質に依存する。
熱機械分析
図2の右は、本発明の方法を実施するのに有用な凍結生物ゲルの特徴を示す。
凍結生物ゲルを1mlの膨張溶液で膨張させた。4種類の膨張溶液を使用した。
1)生理食塩水および5%グリセロールからなるSGLY;
2)生理食塩水および10%の濃縮したグルコール溶液からなるSGLU;
3)生理食塩水およびポリエチレングリコール(15g/L)からなるSPEG15。
DMEM、10%DMSOおよび10%FCSの溶液は対照として使用した。
細胞凍結
20mgの凍結生物ゲル(粒径<5mm)を、900μlの凍結保存溶液を含有する2mlのクライオバイアル(cryovial)中で膨張させた。105/mlのHuvec細胞(ヒト臍帯静脈内皮細胞)またはCD34+細胞を含有する100μLの凍結保存溶液を、膨張した凍結生物ゲルまたは対照培地を含有するクライオチューブに加えた。クライオチューブを自動フリーザ(Freezal、Air Liquide、フランス)に移した。冷却速度は−1℃/分で室温から−80℃または−196℃であった。クライオバイアルは−80℃のフリーザに即座に移したか、または液体窒素容器に入れた。
クライオバイアルを37℃にて2分間水浴中に浸漬した。細胞および凍結生物ゲルは、過剰な培地の存在下で40μmの細胞ストレーナ(Dutscher、フランス)で分離した。遠心分離工程はこの段階で必要とされなかった。対照のために、細胞を1000rpmにて5分間遠心分離した。次いで凍結培地を取り出した。細胞溶液を培養フラスコに移し、加湿5%CO2雰囲気下で37℃にてインキュベートした。培地は2日毎に変化させた。
解凍後にトリパンブルー染色を使用して細胞生存を評価した。この方法は壊死細胞とアポトーシス細胞とを見分けることができないので、レサズリンを蛍光分子、レゾルフィンに変換する生細胞の自然減少力を使用するレサズリン(almarBlue)指示染料を使用することによっても細胞生存を評価した。生存細胞はレサズリンをレゾルフィンに連続して変換するので、生存および細胞毒性の定量的尺度が生じる(Al−Nasiry、S.ら(2007)、The use of alamarBlue assay for quantitative analysis of viability,migration and invasion of choriocarcinoma cells.Hum Reprod 22:1304−1309)。
細胞増殖実験のために、HUVEC細胞(5×103個の細胞)を、37℃、95%湿度、5%CO2にて10%ウシ胎仔血清(FCS)および2mMのL−グルタミン(Sigma)を追加したダルベッコ最小必須培地(DMEM)中で24ウェルプレート中に播種した。培地は2日毎に変化させた。1、3および7日目に、トリプシン−EDTAにより細胞を収集し、Malassez血球計算器(hematocymeter)でカウントした。全ての実験は少なくとも2回および4連の試料で実施した。
組織採取
胸部大動脈を250gの体重のオスのラット(wistar、ws/ws)から採取した。全ての手順および動物処置は、National Society for Medical Research(フランス農林省からの承認番号006235)により発行されている実験動物ケアの指針に従った。一般的な麻酔の後、胸部壁を切開し、胸部大動脈を大動脈弓の下で採取し、実験前に0.9%NaCl溶液(CDM Lavoisier Laboratories)中に浸した。1cmのこれらの切片を各血管から得た。
60mgのヒドロゲル(粒径<0.1mm)を、1mlの凍結保存溶液または抗凍結剤としてジメチルスルホキシド(Me2SO)を有する対照培地(DMEM、10%FCS)を含有する2mlのクライオバイアル中で膨張させた。次いで1cmの大動脈をクライオバイアル中に入れた。クライオチューブを自動フリーザ(Freezal、Air Liquide、フランス)に移し、−1℃/分の冷却速度を適用して−80℃または−196℃に到達させた。クライオバイアルを即座に−80℃のフリーザまたは液体窒素容器に移した。
保存後、クライオバイアルを37℃にて水浴中に浸漬することによって迅速に解凍した。クライオバイアルを濾過により除去した。凍結した試料を含有するクライオバイアルを37℃にて2分間水浴中に浸漬した。組織を鉗子により除去して、生理食塩水中に浸漬し、ヒドロゲルを除去した。あるいは、過剰な培地を加え、大動脈を容易に採取した。
細胞生存
解凍後にトリパンブルー染色により細胞生存を評価した。この方法は壊死細胞とアポトーシス細胞とを見分けることができないので、レサズリンを蛍光分子、レゾルフィンに変換する生細胞の自然減少力を使用するレサズリン(almarBlue)指示染料を使用することによっても細胞生存を評価した。生存細胞はレサズリンをレゾルフィンに連続して変換するので、生存および細胞毒性の定量的尺度が生じる(Al−Nasiry、S.ら(2007)、The use of alamar Blue assay for quantitative analysis of viability,migration and invasion of choriocarcinoma cells.Hum Reprod 22:1304−1309)。
細胞生存のパーセンテージ(%)=[(解凍後の細胞の吸光度)/(解凍前の細胞の吸光度)]×100
対照培地は、HUVEC細胞についてDMEM、10%DMSO、10%FCSまたはCD34+細胞についてDMEM、10%DMSO、5%アルブミンであった。
細胞増殖実験のために、HUVEC細胞(5×103個の細胞)を、37℃、95%湿度、5%CO2にて10%ウシ胎仔血清(FCS)および2mMのL−グルタミン(Sigma)を追加した24ウェルプレート中のダルベッコ最小必須培地(DMEM)中で播種した。培地は2日毎に変化させた。1、3および7日目に、トリプシン−EDTAによって細胞を収集し、Malassez血球計算器でカウントした。全ての実験は少なくとも2回および4連の試料で実施した。
MTTアッセイを使用して組織細胞生存を測定した。MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾール)を生細胞のミトコンドリア中で紫色のホルマザンに還元し、この還元はミトコンドリア還元酵素が活性化される場合にのみ行われる。手短に述べると、大動脈切片(1cm)を1mlのMTT溶液(5mg/ml、Sigma、フランス)中に入れ、RTにて3時間インキュベートした。得られたホルマザン結晶を、300μlのイソプロパノールを19時間添加することによって可溶化した。570nmにおける光学密度を測定し、細胞生存のパーセンテージを以下の式を使用して計算した:
細胞生存のパーセンテージ(%)=[(実験大動脈切片の吸光度)/(新鮮な大動脈切片の吸光度)]×100
以前に開示されたプロトコルを使用して、本発明者らは種々の培地中のHUVEC細胞の生存を比較した(図4)。凍結生物ゲルSGlyおよびRGlyは、従来の培地(DMSOおよびSVFからなる)と比較してDMSOおよびFCSの非存在下でさえ、より良い結果を与えた。
動脈試料を凍結保存のために、抗凍結剤として凍結生物ゲルおよび凍結保存培地を含有するまたは抗凍結剤としてジメチルスルホキシド(Me2SO)を含む対照培地(DMEM、10%FCS)を含有する2mlの液体窒素保存バイアル(Nuclon−Intermed、Nunc A/S、Roskildo、Denmark)に入れた。次に、動脈切片を、−80℃に到達する1℃/分の段階的な温度減少速度にて自動化制御凍結に供し、切片をこの温度で1日間、フリーザに保存した。この保存期間の後、切片を37℃にて水浴に浸漬することによって迅速に解凍した。過剰な培地を加え、大動脈を容易に回収した。凍結生物ゲルを濾過により除去した。図7は以下の細胞生存率を示す
a)新鮮な大動脈血管;
b)DMSOの存在下での大動脈血管;
c)凍結生物ゲルおよび生理食塩水の存在下での大動脈血管。
本発明者らは、本発明に関して使用したヒドロゲル粒子が、凍結保存プロセスに使用できる非常に特定の特性を与える唯一のものであることを示した。
材料および方法
性的に成熟したニュージーランドホワイト雌ウサギを使用した(n=14)。動物を平坦なデッキケージ内に収容し、標準的なペレット食餌を自由に与え、自由に水を取らせた。16時間の明および8時間の暗の交互周期を使用した。単独または組換えヒトLH(rhLH;Luveris75;Serono Europe Ltd.、London、United Kingdom)と共にrhFSH(Gonal−F75;Serono Europe Ltd.、London、United Kingdom)を使用して***を誘導し、雌を受精させた。胚を以前に記載したぎっしり詰まった桑実胚期にて人工授精の72時間後に採取した。手短に述べると、動物を、0.4mLのキシラジン2%(Rompun;Bayer AG、Leverkusen、ドイツ)の筋肉内注射および1.2mL/kg体重のケタミン(Imalgene;Merial S.A.、Lyon、フランス)の静脈注射により麻酔した。次いで、腹部を剃り、消毒し、動物を安楽死させる前に卵巣および子宮角を注意深く取り除いた。卵巣の肉眼検査を***率を決定するために実施した。各々の子宮角を、0.2%のウシ血清アルブミン(BSA;Sigma−Aldrich Quimica S.A.、Madrid、スペイン)を含有する50mLのダルベッコリン酸緩衝食塩水(DPBS;Sigma、St Louis、MO、USA)でフラッシュした。回収したフラッシュ培地を立体顕微鏡下での実験のために滅菌ペトリ皿に移した。胚を、International Embryo Transfer Society分類に従う形態学的基準によってスコア付けした。均質の割球ならびに通常のムチンコートおよび透明帯の両方を有する桑実胚期における胚のみを正常な胚とみなした。全部で534個の胚を凍結した。
胚のインビトロでの生存率に関する結果を以下の表1に示す:
種々の濃度で使用したヒドロゲルを、最初にUVにより30分間浄化し、次いで4ウェルプレート中で700μLの完全DMEM培地(10%SVFおよび1%PSA)の存在下で膨張させた。ヒドロゲルの膨張後、卵母細胞を各ウェルに加えた。
材料および方法
種々の濃度で使用したヒドロゲル粒子を、最初にUVにより30分間浄化し、次いで4ウェルプレート中で700μLの完全DMEM培地(10%SVFおよび1%PSA)の存在下で膨張させた。ゲルの膨張後、ラットの皮膚(6mm直径)を各ウェルに加え、吸引を使用してストローを充填した。DMEM、10%のジメチルスルホキシドを参照(対照)として使用した。次に、凍結(ゆっくりとした凍結またはガラス化)を、Nicool Freezal(登録商標)(AIR LIQUIDE)を使用して実施した。次いで試料を液体窒素タンクに入れた。液体窒素保存の1ヶ月後、皮膚を解凍し、以前に記載されているMTT法によって組織生存を研究した。
結果を以下の表2にまとめる:
この実験において、本発明者らは、細胞分解に対する、凍結生物ゲルを用いたHUVEC凍結保存の効果を調べた。これは、マトリゲル上でのインビトロ管形成(特異的マーカーCD31を識別するための免疫蛍光染色に起因する)により、ならびに至適基準法として本明細書において指定した、DMEM、10%DMSOおよび10%FCSの溶液に関する方法との比較により試験した。
1.組織構成に対する効果
大動脈ラット血管構造および内皮細胞層保存を、凍結生物ゲルを含む液体窒素中の1ヶ月の凍結保存後に評価した。結果を至適基準法(10%DMSO、10%FCS)と比較した。
本発明者らはさらに、液体窒素中で1ヶ月後、凍結生物ゲルの存在下で凍結保存した大動脈の機械的性質を調べた。大動脈の機械的性質に対する凍結生物ゲルの存在下での凍結保存の影響を長手方向において引張試験によって評価し、新鮮な大動脈および至適基準法(10%DMSO、10%FCS)で保存した大動脈と比較した。
実験溶液(SGly、0%DMSO)、および
2つの臨床的市販溶液(SCOT 15(登録商標)およびSCOT 30(登録商標)、0%DMSO、MacoPharma、フランス)。
本発明者らは、以下のように1,2−プロパンジオール(PROH)を使用して3つの異なる実験においてラットの卵母細胞の生存率を比較した:
I群:PROH1.5mol/L、スクロース0.3%(臨床的至適基準);
II群(対照):PROH0.5mol/L、アルブミン10%;および
III群:PROH0.5mol/L、凍結生物ゲル、アルブミン10%。
結果は以下の通りである。
本出願全体を通して、種々の参考文献が本発明に関する技術状況を記載している。これらの参考文献の開示は参照により本開示内に組み込まれる。
Claims (11)
- ヒドロゲルの存在下で生物試料を凍結する工程を含む、該生物試料を凍結保存する方法であって、
前記ヒドロゲルは、
a)30〜70℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム(STMP)、オキシ塩化リン(POCl 3 )、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの多糖を化学的に架橋する工程
によって得られ、
前記凍結する工程は標準圧力条件にて0℃以下の温度で実施され、
前記凍結する工程はジメチルスルホキシド(DMSO)を用いずに実施される、方法。 - ヒドロゲルの存在下で生物試料を凍結する工程を含む、該生物試料を凍結保存する方法であって、
前記ヒドロゲルは、
a)30〜70℃の温度にてアルカリ性条件下で、トリメタリン酸三ナトリウム(STMP)、オキシ塩化リン(POCl 3 )、エピクロルヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される網状化剤を用いて、プルラン、デキストラン、硫酸デキストラン、スクレログルカン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、寒天、アルギン酸塩、フコイダン、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、ヘパリン硫酸模倣剤またはヘパラン硫酸模倣剤およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの多糖を化学的に架橋する工程、
b)ヒドロゲル粒子を得るためにa)において得られたヒドロゲルを研磨する工程、
c)工程b)において得られた前記ヒドロゲル粒子を洗浄する工程、
d)工程b)または工程c)において得られた前記ヒドロゲル粒子を篩にかける工程、
e)工程b)または工程d)において得られた前記ヒドロゲル粒子を洗浄する工程、
f)工程b)または工程e)において得られた前記ヒドロゲル粒子を脱水する工程、
g)乾燥ヒドロゲル粒子を得るために、工程f)において得られた前記ヒドロゲル粒子を乾燥する工程、
h)工程g)において得られた乾燥粒子を篩にかける工程、および
i)ヒドロゲルを得るために、工程h)において得られた乾燥ヒドロゲル粒子を、膨張溶液中で膨張させる工程
によって得られ、
前記凍結する工程は標準圧力条件にて0℃以下の温度で実施され、
前記凍結する工程はジメチルスルホキシド(DMSO)を用いずに実施される、方法。 - 前記凍結する工程は−30℃以下の温度で実施される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記凍結する工程は、−70℃以下の温度での機械的冷凍工程である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記凍結する工程は、−196℃の温度にて液体窒素中で行われる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記凍結する工程は、エチレングリコール、およびポリエチレングリコール(PEG)から選択される抗凍結剤を用いずに実施される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 膨張液が、
i)生理食塩水およびグリセロールを含む、溶液SGly;
ii)生理的血清およびグルコースを含む、溶液SGLU;および
iii)生理食塩水およびポリエチレングリコールを含む、溶液SPEG15
からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記生物試料は、哺乳動物細胞、植物細胞、血液細胞、卵母細胞もしくは精細胞などの生殖細胞、胚細胞、幹細胞、臍帯由来の細胞、卵巣皮質の細胞、造血系幹細胞または膵島などの細胞である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物試料は、ヒトの胚または非ヒトの胚を含む動物胚である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物試料は、心臓、肺、皮膚、血管、角膜、卵巣、肝臓、腎臓、膵臓、腸、眼または脾臓などの器官または組織である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物試料は、DNAまたはRNAなどの核酸である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP12305065 | 2012-01-17 | ||
EP12305065.0 | 2012-01-17 | ||
PCT/EP2013/050795 WO2013107797A1 (en) | 2012-01-17 | 2013-01-17 | Cryopreservation of cells, tissues and organs |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015503927A JP2015503927A (ja) | 2015-02-05 |
JP6095689B2 true JP6095689B2 (ja) | 2017-03-15 |
Family
ID=47559514
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014551650A Expired - Fee Related JP6095689B2 (ja) | 2012-01-17 | 2013-01-17 | 細胞、組織および器官の凍結保存 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9521839B2 (ja) |
EP (1) | EP2804475B1 (ja) |
JP (1) | JP6095689B2 (ja) |
CA (1) | CA2860580A1 (ja) |
DK (1) | DK2804475T3 (ja) |
ES (1) | ES2623166T3 (ja) |
HU (1) | HUE033833T2 (ja) |
PT (1) | PT2804475T (ja) |
WO (1) | WO2013107797A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR112015012161B1 (pt) | 2012-11-30 | 2020-05-05 | Pharmacosmos As | agente de crioproteção e seu uso, composições de crioproteção e método para criopreservar amostra". |
WO2015150394A1 (en) * | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Pharmacosmos A/S | Cryoprotective agent, cryoprotective and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation |
JP6699044B2 (ja) * | 2016-03-15 | 2020-05-27 | 国立大学法人山梨大学 | 染色方法および観察方法 |
CN106047812B (zh) * | 2016-05-25 | 2018-08-03 | 上海赛立维生物科技有限公司 | 肿瘤组织冻存、复苏试剂盒及其处理方法 |
CN106818708B (zh) * | 2017-01-19 | 2020-11-06 | 中山大学 | 棕点石斑鱼***超低温冷冻保护剂及其保存方法 |
WO2018165327A1 (en) | 2017-03-08 | 2018-09-13 | Alafair Biosciences, Inc. | Hydrogel medium for the storage and preservation of tissue |
CN108552158A (zh) * | 2018-04-09 | 2018-09-21 | 广东省中医院(广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院) | 一种贴壁细胞冻存液、冻存方法和解冻方法 |
CN108478594B (zh) * | 2018-04-13 | 2020-07-24 | 桂林医学院 | 岩藻多糖在制备防治有机磷农药所致胚胎毒性的药物中的应用 |
US11116206B2 (en) | 2018-10-01 | 2021-09-14 | Cook Medical Technologies Llc | Cryocontainer |
JP7339761B2 (ja) * | 2019-02-15 | 2023-09-06 | イビデン株式会社 | 凍結保存液 |
WO2022099456A1 (zh) * | 2020-11-10 | 2022-05-19 | 南通市台盈新材料科技有限公司 | 一种含有普鲁兰糖包被层的羊水间充质干细胞冻存管 |
CN114404394B (zh) * | 2022-01-20 | 2024-01-02 | 西安交通大学 | 一种干细胞水凝胶及制备方法、冷冻保存方法和复苏方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1992008347A1 (en) | 1988-04-18 | 1992-05-29 | Cryolife, Inc. | Cryoprotective agent |
IT1256621B (it) * | 1992-12-04 | 1995-12-12 | Soluzioni crioprotettrici | |
FR2862980B1 (fr) * | 2003-11-28 | 2006-03-03 | Biopredic Internat | Moyens pour le transport et la conservation de cellules ou tissus vivants |
EP2222159B1 (en) * | 2007-11-20 | 2018-02-21 | Pioneer Surgical Orthobiologics, Inc. | Cryopreservation of cells using cross-linked bioactive hydrogel matrix particles |
WO2009070842A1 (en) * | 2007-12-04 | 2009-06-11 | Proteobioactives Pty Ltd | Protection of progenitor cells and regulation of their differentiation |
-
2013
- 2013-01-17 ES ES13700326.5T patent/ES2623166T3/es active Active
- 2013-01-17 DK DK13700326.5T patent/DK2804475T3/en active
- 2013-01-17 CA CA2860580A patent/CA2860580A1/en not_active Abandoned
- 2013-01-17 US US14/372,971 patent/US9521839B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2013-01-17 EP EP13700326.5A patent/EP2804475B1/en not_active Not-in-force
- 2013-01-17 HU HUE13700326A patent/HUE033833T2/en unknown
- 2013-01-17 JP JP2014551650A patent/JP6095689B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-01-17 PT PT137003265T patent/PT2804475T/pt unknown
- 2013-01-17 WO PCT/EP2013/050795 patent/WO2013107797A1/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK2804475T3 (en) | 2017-07-03 |
US20150087056A1 (en) | 2015-03-26 |
ES2623166T3 (es) | 2017-07-10 |
JP2015503927A (ja) | 2015-02-05 |
US9521839B2 (en) | 2016-12-20 |
PT2804475T (pt) | 2017-05-08 |
WO2013107797A1 (en) | 2013-07-25 |
EP2804475A1 (en) | 2014-11-26 |
EP2804475B1 (en) | 2017-02-01 |
CA2860580A1 (en) | 2013-07-25 |
HUE033833T2 (en) | 2018-01-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6095689B2 (ja) | 細胞、組織および器官の凍結保存 | |
CA2753291C (en) | Method for ice-free cryopreservation of tissue | |
US5071741A (en) | Cryoprotective agent and its use in cryopreservation of cellular matter | |
Mazur | Freezing of living cells: mechanisms and implications | |
Dou et al. | Natural cryoprotectants combinations of l-proline and trehalose for red blood cells cryopreservation | |
US5897987A (en) | Use of arabinogalactan in cell cryopreservation media | |
CN109843052A (zh) | 用于细胞冷冻保存的组合物和方法 | |
CN110050782A (zh) | 一种干细胞冻存液及其制备方法和冻存方法 | |
Ma et al. | Advanced biomaterials in cell preservation: Hypothermic preservation and cryopreservation | |
KR100361357B1 (ko) | 배양된 조직등가물의 동결보존법 | |
EA028147B1 (ru) | Криозащитный агент, содержащая его композиция и способ криоконсервирования | |
EP1430067A2 (en) | Eukaryotic cells and method for preserving cells | |
Diaz-Dussan et al. | Trehalose-based polyethers for cryopreservation and three-dimensional cell scaffolds | |
CN108271770B (zh) | 微米颗粒在低温冻存中的应用 | |
JP7038369B2 (ja) | ウシ生殖細胞の凍結保存用組成物及び凍結保存方法 | |
JP2019527050A (ja) | 生物学的物質の凍結保存および安定化のための氷核形成調合物 | |
CN107771785A (zh) | 提高低温冻存烟草花粉生活力的方法 | |
CN109832261A (zh) | 一种细胞冻存液及其应用 | |
JP2019033707A (ja) | ガラス化凍結保存液およびガラス化凍結保存方法 | |
Choudhary et al. | Development of an efficient cryoconservation protocol for Himalyan mulberry (Morus laevigata Wall. ex Brandis) using dormant axillary buds as explants | |
Suzuki et al. | Cryoprotection in plant tissues related to reduced volume expansion of cryoprotectant solution | |
Neronov et al. | Cryoprotection of porcine cornea: a scanning electron microscopy study | |
WO2005095586A1 (ja) | 不凍糖タンパク質誘導体を含有する細胞凍結保存用組成物 | |
CN117243219A (zh) | 基于液态金属和有机材料的冷冻保护组合物及其制法与应用 | |
Choudhary et al. | Scanning electron microscopic study on freezing behaviour of tissue cells in dormant bud of mulberry (Morus sp.) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150320 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20151124 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20160914 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160920 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161214 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170207 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170214 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6095689 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |