ES2623166T3 - Crioconservación de células, tejidos y órganos - Google Patents
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Abstract
Un método de crioprotección de una muestra biológica que comprende la etapa de congelar dicha muestra biológica en presencia de un hidrogel, en el que dicho hidrogel se puede obtener mediante: a) la reticulación química de al menos un polisacárido seleccionado del grupo que consiste en pululano, dextrano, sulfato de dextrano, escleroglucano, carboximetildextrano, carboximetilpululano, agar, alginato, fucoidano, quitosano, ácido hialurónico, proteoglicanos de sulfato de heparán, heparina, miméticos de heparina o de sulfato de heparán y mezclas de los mismos con un agente reticulante seleccionado del grupo que consiste en trimetafosfato trisódico (STMP), oxicloruro de fósforo (POCl3), epiclorhidrina, formaldehídos, carbodiimidas hidrosolubles y glurataldehído en condiciones alcalinas a una temperatura comprendida entre 30 y 70 ºC; en el que dicha etapa de congelación se realiza a una temperatura por debajo de 0 ºC en condiciones de presión convencionales y dicha etapa de congelación se realiza sin dimetilsulfóxido (DMSO).
Description
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DESCRIPCION
Crioconservacion de celulas, tejidos y organos Sector de la tecnica
La presente divulgacion proporciona un metodo de crioconservacion de diversas celulas, organos y tejidos.
Estado de la tecnica
La crioconservacion y la vitrificacion son procesos mediante los cuales la muestra biologica se conserva a temperaturas bajo cero. Se sabe que las reacciones biologicas se ralentizan al reducir la temperatura. Sin embargo, dichas tecnicas deben realizarse con cuidado cuando se trata de celulas vivas. De hecho, al ser el agua el componente principal de las celulas vivas y su entorno de crecimiento, se debe controlar la formacion de cristal de hielo durante la congelacion de dichas celulas vivas con el fin de preservar su integridad.
Se ha informado de que la congelacion puede causar danos a la muestra biologica, en especial, a las celulas vivas. De hecho, durante la congelacion, se forman cristales de hielo, que tienen un grave efecto perjudicial sobre las celulas. Los cristales intracelulares pueden danar las paredes y la estructura de las celulas, mientras que la precipitacion extracelular del agua en forma de cristales de hielo aumenta las concentraciones de sal a niveles que pueden danar las celulas.
Por lo tanto, los compuestos que funcionan como estabilizadores qmmicos o ffsicos, en concreto, los agentes crioprotectores, se han usado ampliamente para proteger las celulas contra el estres al que se enfrentan durante la congelacion. La difusion de los agentes crioprotectores clasicos actuales tales como el dimetilsulfoxido (DMSO) en una celula producira un reemplazo parcial del agua intracelular y ayudara a prevenir la deshidratacion de la formacion de hielo durante la congelacion.
Sin embargo, se sabe que el DMSO induce la diferenciacion de algunas lmeas celulares tales como HT-60, ATCC CCL-240 (Collins et al., 1978). Ademas, se ha informado que el DMSO expone a las celulas, tales como las celulas reproductoras y los embriones, a una transformacion genetica, lo que es inaceptable para la crioconservacion.
Lo que es mas importante, la oxidacion con DMSO, que es muy rapida, induce la formacion de compuestos toxicos. Finalmente, se ha informado que el DMSO es responsable de la desestabilizacion de las membranas de fosfolfpidos (Anchordoguy et al., 2003).
Por lo tanto, en la actualidad, el DMSO no esta adaptado a su uso en la crioconservacion. De hecho, la toxicidad de los agentes crioprotectores es un factor limitante clave en la criobiologfa. El uso de estos agentes puede manifestarse asf en forma de danos criogenicos.
Existe, por tanto, la necesidad de una tecnica de crioconservacion que sea util para diversas muestras biologicas, incluyendo celulas tales como las celulas reproductoras y los embriones, y que no conduzca a danos relacionados con la toxicidad de los crioprotectores, danos criogenicos de la muestra biologica congelada ni/o la transformacion genetica de dicha muestra.
Objeto de la invencion
Los inventores han demostrado que el uso de un hidrogel muy espedfico permite la crioconservacion de diversas celulas y tejidos, sin o con una reduccion considerable de los crioprotectores clasicos tales como el DMSO.
Por lo tanto, el metodo de la invencion evita el uso de crioprotectores clasicos, limitando asf los riesgos de toxicidad aplicados a la muestra biologica que se va a crioproteger. Al evitar o limitar el uso de los crioprotectores y, por tanto, al limitar el riesgo de toxicidad o de transformacion genetica de las celulas congeladas, la presente invencion proporciona una estrategia prometedora de crioconservacion y vitrificacion.
La invencion palia asf los inconvenientes tecnicos de las tecnicas de crioconservacion comunmente usadas.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
Como se usan en el presente documento, los terminos "crioproteccion", "criopreservacion" o "crioconservacion" se refieren a un proceso que implica una etapa de congelacion mediante la cual se preserva una muestra biologica de la degradacion. Este termino engloba tecnicas convencionales de crioconservacion, asf como tecnicas de vitrificacion.
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Como se usa en el presente documento, 'vitrificacion" se refiere a una estrategia de crioconservacion en la que las celulas se convierten en un solido amorfo vftreo que esta exento de cualquier estructura cristalina. En general, dicho proceso se consigue mediante una combinacion de alta concentracion de crioprotector y una velocidad de enfriamiento extremadamente alta.
Como se usan en el presente documento, la expresion "agente crioprotector" o el termino "crioprotector" se refieren a un agente usado para proteger la muestra biologica de los danos inducidos por la congelacion. Mas concretamente, dicho agente es util para preservar la muestra biologica de los danos relacionados con la formacion de hielo dentro de las celulas sometidas a una etapa de congelacion. Los ejemplos no limitantes de crioprotectores clasicos actuales son dimetilsulfoxido (DMSO), etilenglicol, polietilenglicol (PEG), glicerol, 2-metil-2,4-pentanodiol (MPD), propanodiol, sacarosa, trehalosa. Otros ejemplos de crioprotectores son glucosa, lactosa, fructosa, rafinosa, propilenglicol, 1,2-2,3-butanodiol, acetamida, dextrano, alcohol polivimlico polimerico, polivinilpirrolidona, hidroxietilalmidon, propilenglicol, 1,2-propanodiol, butanodiol, formamida, ficoll, manitol y gluconato, carboximetilcelulosa y dextrano.
Como se usa en el presente documento, el termino 'polisacarido" se refiere a una molecula que comprende dos o mas unidades de monosacarido.
Como se usa en el presente documento, la expresion 'solucion alcalina" se refiere a una solucion acuosa que tiene un pH estrictamente superior a 7.
Como se usa en el presente documento, la expresion "solucion acuosa" se refiere a una solucion en la que el disolvente principal es el agua.
Como se usa en el presente documento, el termino 'reticulacion" se refiere a la union de una cadena de polisacarido a otra con enlaces covalentes.
Como se usan en el presente documento, los terminos "hidrogel" o "criobiogel" se refieren a las composiciones muy espedficas que se pueden obtener mediante el metodo desarrollado por los inventores. Dicho hidrogel se puede obtener mediante reticulacion qrnmica de un polisacarido tal como pululano, con un agente reticulante tal como trimetafosfato trisodico (STMP) en condiciones alcalinas a una temperatura de 50 °C. Dichas expresiones se pueden referir indistintamente al hidrogel que se puede obtener directamente reticulando un polisacarido con un agente reticulante, y al hidrogel que se puede obtener tras el hinchamiento de las partfculas de hidrogel secadas.
Como se usa en el presente documento, la expresion 'partfculas de hidrogel" se refiere a partfculas que tienen formas diferentes, como esferas, cilindros o cubos. Dichas partfculas de hidrogel son, por lo tanto, partfculas del hidrogel obtenido tras las etapas de molienda. A menos que se especifique lo contrario, las partfculas de expresion "partfculas de hidrogel" no estan secadas.
Como se usan en el presente documento, las expresiones 'partfcula de hidrogel secada", 'particula secada" y "criobiogel secado" se refieren a una partfcula de hidrogel secada que tiene un intervalo de tamanos inferior a 5 mm, preferentemente inferior a 1 nm, preferentemente inferior a 50 pm, preferentemente inferior a 25 pm. Dichas partfculas de hidrogel secadas se obtienen mediante el secado de las partfculas de hidrogel. Dichas partfculas de hidrogel secadas se hinchan en una solucion de hinchamiento apropiada con el fin de obtenerse un hidrogel.
Como se usa en el presente documento, la expresion "hidrogel hinchado" se refiere a un hidrogel resultante del hinchamiento de partfculas de hidrogel secadas. El hidrogel obtenido directamente reticulando un polisacarido con un agente reticulante, y el hidrogel que se puede obtener tras hinchar las partfculas de hidrogel secadas comparten las mismas caractensticas tecnicas y funcionales.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "perla de hidrogel secada" y "esfera de hidrogel secada" se usan indistintamente, y se refieren a una partfcula de hidrogel que tiene una forma esencialmente esferica u ovoide.
La invencion se refiere a un metodo de crioproteccion de una muestra biologica que comprende la etapa de congelar dicha muestra biologica en presencia de un hidrogel, en el que dicho hidrogel se puede obtener mediante:
a) la reticulacion qrnmica de al menos un polisacarido seleccionado del grupo que consiste en pululano, dextrano, sulfato de dextrano, escleroglucano, carboximetildextrano, carboximetilpululano, agar, alginato, fucoidano, quitosano, acido hialuronico, proteoglicanos de sulfato de heparan, heparina, mimeticos de heparina o de sulfato de heparan y mezclas de los mismos con un agente reticulante seleccionado del grupo que consiste en trimetafosfato trisodico (STMP), oxicloruro de fosforo (POCb), epiclorhidrina, formaldetndos, carbodiimidas hidrosolubles y glurataldehfdo en condiciones alcalinas a una temperatura comprendida entre 30 y 70 °C, preferentemente entre 40 y 50 °C, lo mas preferentemente de 50 °C.
Preferentemente, dicho agente reticulante es trimetafosfato trisodico (STMP). Es muy ventajoso usar partfculas del
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hidrogel mencionado anteriormente, en especial, pardculas de hidrogel secadas que se puedan hinchar posteriormente para restituir un hidrogel. Por lo tanto, las partfculas proporcionan un uso mas facil debido al tamano de las partfculas que pueden adaptarse al tipo y al tamano de las celulas, del/de los tejido/s o del/de los organo/s que se van a crioconservar. Por lo tanto, en el presente documento, tambien se desvela un metodo de crioproteccion de una muestra biologica, que comprende la etapa de congelar dicha muestra biologica en presencia de un hidrogel, en el que dicho hidrogel se puede obtener mediante:
a) la reticulacion qmmica de al menos un polisacarido seleccionado del grupo que consiste en pululano, dextrano, sulfato de dextrano, escleroglucano, carboximetildextrano, carboximetilpululano, agar, alginato, fucoidano, quitosano, acido hialuronico, proteoglicanos de sulfato de heparan, heparina, mimeticos de heparina o de sulfato de heparan y mezclas de los mismos con un agente reticulante seleccionado del grupo que consiste en trimetafosfato trisodico (STMP), oxicloruro de fosforo (POCb), epiclorhidrina, formaldelddos, carbodiimidas hidrosolubles y glurataldehfdo en condiciones alcalinas a una temperatura comprendida entre 30 y 70 °C;.
b) la molienda del hidrogel obtenido en a) para obtener partfculas de hidrogel;
c) opcionalmente, el lavado de dichas partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b);
d) opcionalmente, el tamizado de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b) o en la etapa c);
e) opcionalmente, el lavado de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b) o en la etapa d), preferentemente con una solucion salina, preferentemente una solucion salina tamponada con fosfato bien enjuagada en agua destilada;
f) la deshidratacion de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b) o en etapa e), preferentemente en banos de etanol/agua;
g) el secado de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa f), preferentemente a 50 °C con el fin de obtener partfculas de hidrogel secadas;
h) opcionalmente, el tamizado de las partfculas secadas obtenidas en la etapa g); y
i) el hinchamiento de la partfcula de hidrogel secada obtenida en la etapa h) en una solucion de hinchamiento para obtener un hidrogel.
Por lo tanto, la invencion se refiere a un metodo de crioproteccion de una muestra biologica que comprende la etapa de congelar dicha muestra biologica en presencia de un hidrogel, en el que dicho hidrogel se puede obtener mediante:
a) la reticulacion qmmica de al menos un polisacarido seleccionado del grupo que consiste en pululano, dextrano, sulfato de dextrano, escleroglucano, carboximetildextrano, carboximetilpululano, agar, alginato, fucoidano, quitosano, acido hialuronico, proteoglicanos de sulfato de heparan, heparina, mimeticos de heparina o de sulfato de heparan y mezclas de los mismos con un agente reticulante seleccionado del grupo que consiste en trimetafosfato trisodico (STMP), oxicloruro de fosforo (POCb), epiclorhidrina, formaldelddos, carbodiimidas hidrosolubles y glurataldehfdo en condiciones alcalinas a una temperatura comprendida entre 30 y 70 °C;.
b) la molienda del hidrogel obtenido en a) para obtener partfculas de hidrogel;
c) el lavado de dichas partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b);
d) el tamizado de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b) o la etapa c);
e) el lavado de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b) o la etapa d);
f) la deshidratacion de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b) o en etapa e);
g) el secado de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa f);
h) el tamizado de las partfculas secadas obtenidas en la etapa g); e
i) el hinchamiento de la partfcula de hidrogel secada obtenida en la etapa h) en una solucion de hinchamiento para obtener un hidrogel.
Como se usan en el presente documento, la expresion "partfculas de hidrogel" o el termino "particulas" se refieren al producto obtenido moliendo el hidrogel de acuerdo con la invencion. Por lo general, dicha etapa de molienda se realiza usando un molino de cuchillas Grindoxmix GM 200 con una velocidad variable de 2.000 a 10.000 rotaciones por minuto.
Preferentemente, las partfculas de hidrogel secadas obtenidas en la etapa g) son perlas de hidrogel secadas.
Dicha etapa de congelacion se realiza esencialmente exenta de o sin dimetilsulfoxido (DMSO). Preferentemente, dicha etapa de congelacion se realiza sin dimetilsulfoxido (DMSO).
Como se usa en el presente documento, "esencialmente exento/a" significa presente a una concentracion que es inferior al aproximadamente 1 %, preferentemente inferior al aproximadamente 0,5 %, mas preferentemente inferior al aproximadamente 0,1 %, lo mas preferentemente completamente ausente. Por lo general, "esencialmente exento de crioprotector" puede corresponder a una cantidad tres veces inferior a la cantidad de crioprotector usada en los metodos convencionales.
En una realizacion espedfica, dicha etapa de congelacion se realiza esencialmente exenta de 1,2-propanodiol, preferentemente con una cantidad de 1,2-propanodiol tres veces inferior a la cantidad usada en los metodos convencionales. Como alternativa, dicha etapa de congelacion se realiza sin 1,2-propanodiol.
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Como se usa en el presente documento, "sin" un crioprotector dado se refiere a la ausencia completa (0 %) de dicho crioprotector mientras se lleva a cabo la invencion.
Preferentemente, dicha etapa de congelacion se realiza sin un crioprotector seleccionado entre dimetilsulfoxido (DMSO), etilenglicol, propanodiol y polietilenglicol (PEG).
Preferentemente, dicha etapa de congelacion se realiza sin un crioprotector seleccionado entre dimetilsulfoxido (DMSO), etilenglicol, polietilenglicol (PEG), glicerol, 2-metil-2,4-pentanodiol (MDP), sacarosa y trehalosa.
Mas preferentemente, dicha etapa de congelacion se realiza sin un crioprotector seleccionado entre dimetilsulfoxido (DMSO), etilenglicol, polietilenglicol (PEG), glicerol, 2-metil-2,4-pentanodiol (MDP), propanodiol, sacarosa y trehalosa.
Mas preferentemente, dicha etapa de congelacion se realiza sin un crioprotector seleccionado entre dimetilsulfoxido (DMSO), etilenglicol, polietilenglicol (PEG), glicerol, 2-metil-2,4-pentanodiol (MPD), propanodiol, sacarosa, trehalosa, glucosa, lactosa, fructosa, rafinosa, propilenglicol, 1,2-2,3-butanodiol, acetamida, dextrano, alcohol polivimlico polimerico, polivinilpirrolidona, hidroxietilalmidon, propilenglicol, 1,2-propanodiol, butanodiol, formamida, ficoll, manitol, gluconato, carboximetilcelulosa y dextrano.
Mas preferentemente, dicha etapa de congelacion se realiza esencialmente exenta de crioprotector.
Por lo general, la etapa de congelacion se realiza de acuerdo con tecnicas convencionales.
Preferentemente, dicha etapa de congelacion se realiza a una temperatura por debajo de 0 °C en condiciones de presion convencionales.
Preferentemente, dicha etapa de congelacion se realiza a una temperatura comprendida por debajo de -10 °C, -20 °C, -30 °C, -40 °C, -50 °C, -60 °C preferentemente por debajo de -70 °C. Mas preferentemente, dicha etapa de congelacion se realiza a una temperatura comprendida entre -70 °C y -156 °C. Mas preferentemente, dicha etapa de congelacion se realiza a una temperatura comprendida entre -196 °C.
Preferentemente, dicha etapa es una etapa de refrigeracion mecanica, a una temperatura comprendida por debajo de -70 °C, preferentemente a una velocidad de enfriamiento controlada apropiada a una temperatura comprendida entre -70 °C y -156 °C. Como alternativa, dicha etapa de congelacion se produce en nitrogeno lfquido a una temperatura de -196 °C. En otra realizacion, dicha etapa de congelacion se produce usando tecnologfa de vitrificacion. Los detalles de dicha tecnologfa caen dentro del conocimiento general del experto en la materia.
Preferentemente, la etapa de congelacion de la muestra biologica se produce en presencia de una cantidad de hidrogel suficiente para criopreservar dicho tejido biologico. El experto en la materia se encargana de proporcionar una cantidad suficiente de dicho hidrogel para llevar a cabo de manera eficaz el proceso de la invencion. El experto en la materia tambien se encargana de proporcionar una cantidad de dicho hidrogel, que no provocara danos a la muestra biologica.
El experto en la materia adaptana facilmente la cantidad de hidrogel a la solucion de crioconservacion correcta y para la crioconservacion de una cantidad espedfica y definida de muestra biologica. Por lo general, cuando el metodo de la invencion implica el uso de partfculas de hidrogel secadas, dicha cantidad depende del tamano de las partfculas de hidrogel, es decir, de la granulometna de dichas partfculas de hidrogel.
Por lo general, para la crioconservacion de una solucion que contiene celulas 104 a 106, se pueden usar de 20 a 60 mg, preferentemente de 15 a 25 mg de hidrogel o de partfculas de hidrogel.
Por lo general, la etapa de lavado e) se puede realizar con una solucion salina, preferentemente solucion salina de tampon fosfato (PBS) a un pH de 7,4. Se puede proceder a varios lavados con PBS. Por ejemplo, se puede lavar el hidrogel:
> 3 veces con PBS a una concentracion de 1,5 M;
^ 2 veces con PBS a una concentracion de 0,15 M;
> 3 veces con PBS a una concentracion de 0,015 M.
Cada vez, el hidrogel se lava bien durante aproximadamente 20 minutos. El hidrogel se enjuaga a fondo en agua
destilada durante un tiempo suficiente para obtener un hidrogel con un pH comprendido entre 6 y 8, preferentemente de aproximadamente 7, mas preferentemente un pH de 7,4. Como alternativa, el hidrogel se puede enjuagar con un flujo continuo de agua destilada, seguida de solucion salina tamponada (PBS) a concentraciones gradualmente decrecientes, y deshidratar luego usando banos de etanol de concentraciones variables.
Por lo general, la etapa de deshidratacion f) se realiza en banos de etanol/agua. El experto en la materia conoce la
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naturaleza y el numero apropiado de dichos banos. Para esta etapa de deshidratacion, puede haber varios banos de etanol/agua. Por ejemplo, se pueden usar:
^ 2 banos con etanol/PBS 0,015 M a una concentracion de etanol del 70 %;
^ 2 banos con etanol/PBS 0,015 M a una concentracion de etanol del 50 %;
^ 1 bano con etanol absoluto.
Por lo general, la etapa de secado g) se puede realizar a 50 °C. Por lo general, dicha etapa se realiza por medio de un vado. El metodo de la invencion puede comprender una etapa adicional g') posterior a la etapa g) y previa a la etapa h) de molienda de las partfculas de hidrogel para obtener un polvo.
La etapa de tamizado h) conduce a la formacion de partfculas calibradas con un diametro deseado. Esta etapa proporciona una amplia seleccion de distribucion del tamano de pardcula. Por lo general, el diametro de dichas partfculas esta comprendido entre 5 pm y 2 mm, preferentemente entre 20 pm y 1,5 mm. Por lo general, dicha etapa de tamizado se puede realizar con ayuda de un agitador de tamiz vibratorio. Se pueden ajustar dos parametros en este instrumento: la aceleracion del fondo del tamiz, que se puede ajustar de 1,0 a 4 m/s2, y la amplitud de oscilacion variable, que va de 0,20 a 3 mm.
La etapa de hinchamiento i) se puede realizar con diferente solucion de hinchamiento. Dicha solucion de hinchamiento puede ser cualquier medio adecuado conocido por el experto en la materia. Sin embargo, los inventores han demostrado que algunos medios muy espedficos proporcionan mejores resultados cuando se usan para hinchar las partfculas de hidrogel secadas.
Preferentemente, dicha solucion de hinchamiento es una solucion salina.
Como alternativa, dicha solucion de hinchamiento puede ser una solucion comercial tal como SCOT30, SCOT15, Perfadex, Stem, soluciones alfa, Viapsan, solucion celsior, solucion UW, solucion VS4, solucion Bioxell, medio Eagle, solucion de Hanks o medio de Dubelcco modificado por Eagle.
Como se usa en el presente documento, la expresion "solucion salina" o “solucion fisiologica” se refiere a una solucion de cloruro de sodio en agua. Por lo general, dicha solucion comprende 0,9 % de cloruro de sodio. Por lo general, dicha solucion es esteril y es isotonica, es decir, tiene la misma presion osmotica que la sangre. Por lo tanto, dicha solucion salina es fisiologica.
Preferentemente, dicha solucion de hinchamiento se selecciona del grupo que consiste en:
i) una solucion SGly, solucion que comprende solucion salina y glicerol, preferentemente a una concentracion comprendida entre el 1 y 10 % de glicerol, lo mas preferentemente del aproximadamente 5 %;
ii) una solucion SGLU, solucion que comprende solucion salina y glucosa, preferentemente a una concentracion comprendida entre el 5 y 20 % de glucosa, lo mas preferentemente del aproximadamente 10 %; e
iii) una solucion SPEG15, solucion que esta compuesta de solucion salina y polietilenglicol, preferentemente a una concentracion de 15 g de polietilenglicol por litro de solucion salina.
Como se usa en el presente documento, la expresion “SGly” se refiere a una solucion de hinchamiento que comprende solucion salina y glicerol, preferentemente a una concentracion comprendida entre el 1 y 10 % de glicerol, lo mas preferentemente del aproximadamente 5 %.
Como se usa en el presente documento, la expresion “SGLU” se refiere a una solucion de hinchamiento que comprende solucion salina y glucosa, preferentemente a una concentracion comprendida entre el 5 y 20 % de glucosa, lo mas preferentemente del aproximadamente 10 %.
Como se usa en el presente documento, la expresion “SPEG15” se refiere a una solucion de hinchamiento que comprende solucion salina y polietilenglicol, preferentemente a una concentracion de 15 g de polietilenglicol por litro de solucion salina.
La cantidad de la solucion de hinchamiento depende de la cantidad de partfculas de hidrogel y de la naturaleza de la muestra biologica que se vaya a criopreservar. Asf pues, el experto en la materia determinara facilmente la cantidad espedfica de solucion de hinchamiento en la que se hincharan las partfculas de hidrogel secadas.
El metodo de la invencion proporciona mayores tasas de supervivencia tras la congelacion de la muestra biologica.
En una realizacion, dicha muestra biologica son celulas tales como celulas de mamffero, celulas vegetales, celulas sangumeas, celulas reproductoras tales como ovocitos o celulas espermaticas, celulas embrionarias, celulas madre,
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celulas del cordon umbilical, celulas de la corteza ovarica, progenitores hematopoyeticos o islotes pancreaticos. Dicha muestra biologica tambien puede ser un embrion tal como un embrion animal, humano o no humano.
Los inventores han demostrado que, gracias al hidrogel tan espedfico de la invencion, la tasa de supervivencia de los ovocitos crioconservados es mucho mayor que la supervivencia obtenida con el metodo convencional que implica el uso de 1,2-propanodiol (PROH), usando una cantidad tres veces inferior de PROH.
Con el fin de evitar cualquier riesgo de choque osmotico cuando se crioconservan celulas o embriones, se prefiere inyectar las celulas dentro del hidrogel. La inyeccion de dichas celulas dentro de dicho hidrogel puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier tecnica convencional. Por lo general, el hidrogel se coloca dentro de un criotubo, o en una pajita de alta seguridad en una cantidad suficiente para criopreservar las celulas diana. La eleccion del dispositivo dependera de la naturaleza de las celulas que se vayan a criopreservar. A continuacion, las celulas se inyectan dentro del hidrogel. Entonces, se puede producir la etapa de congelacion.
En otra realizacion, dicha muestra biologica es un organo tal como un corazon, un pulmon, piel, un vaso, una cornea, un ovario, un tugado, un rinon, un pancreas, un intestino, un ojo o un bazo. En esta realizacion particular, se prefiere colocar primero el organo dentro de solo una parte del hidrogel antes de proporcionar la cantidad restante del hidrogel. Por lo general, antes de implementar el proceso, el experto en la materia determina la cantidad suficiente de hidrogel para criopreservar el organo diana. A continuacion, se coloca del 10 al 60 %, preferentemente del 20 al 40 % de este hidrogel dentro de un criotubo adaptado, pajita o bolsa. Una vez que se coloca el organo dentro del hidrogel, se coloca del 40 al 90 %, preferentemente del 60 al 80 % del hidrogel restante dentro de dicho criotubo, pajita o bolsa. Entonces, se puede producir la etapa de congelacion.
En otra realizacion mas, dicha muestra biologica son acidos nucleicos tales como ADN o ARN. Por lo general, dichos acidos nucleicos se obtienen mediante un procedimiento rutinario para extraccion de ADN o ARN.
Por lo general, el polvo de hidrogel secado util para llevar a cabo la presente invencion tiene una relacion de hinchamiento comprendida entre el 1 y el 3.000 %. La relacion de hinchamiento de las partfculas de hidrogel secadas se determina en solucion salina. Por lo general, se registra el peso del criobiogel secado (Wd) antes de la inmersion en una solucion salina, preferentemente solucion salina de tampon fosfato (PBS). Tras 1 h de incubacion, se elimina el exceso de agua y se pesa el criobiogel hinchado (Ws). La relacion de hinchamiento se calcula de acuerdo con la formula:
SR = [(W5 - Wd) / Wd] x 100,
El hidrogel secado de la invencion proporciona propiedades de hinchamiento superiores a las de los hidrogeles disponibles en el mercado tales como Agar® o Agargel®. El hidrogel secado util para llevar a cabo la presente invencion muestra resultados inesperados en comparacion con cualquier otro hidrogel comercial. Dichos resultados estan justificados por la naturaleza muy espedfica del hidrogel de la invencion. Por lo tanto, claramente parece que el metodo desarrollado por los inventores proporciona caractensticas muy espedficas a dicho hidrogel.
Cuando se desea, la muestra biologica se descongela. Por lo general, la etapa de descongelacion se realiza colocando la muestra biologica congelada o vitrificada en una solucion de descongelacion.
Como se usa en el presente documento, la expresion “solucion de descongelacion” se refiere a una solucion que permite que la muestra biologica se descongele mientras se preserva su viabilidad. Dicho medio puede ser cualquier medio conocido en la tecnica que sea apropiado como medio base para la muestra biologica en particular.
La invencion se refiere a un metodo de congelacion de celulas reproductoras y/o embriones de animales. Cuando los tratamientos de fertilizacion in vitro se realizan con menos embriones con el fin de evitar embarazos multiples, existe la necesidad de un metodo eficaz para la crioconservacion de los ovocitos, espermatozoides y embriones. Por lo tanto, la presente invencion es muy util para la crioconservacion de celulas reproductoras y embriones de animales (humanos y no humanos).
Por lo general, los embriones se pueden someter a crioconservacion en diversas fases del desarrollo, preferentemente fases tempranas tales como la fase de morula y de blastula.
La presente invencion se refiere ademas al uso de un hidrogel como crioprotector, en el que dicho hidrogel se puede obtener mediante:
a) la reticulacion qmmica de al menos un polisacarido seleccionado del grupo que consiste en pululano, dextrano, sulfato de dextrano, escleroglucano, carboximetildextrano, carboximetilpululano, agar, alginato, fucoidano, quitosano, acido hialuronico, proteoglicanos de sulfato de heparan, heparina, mimeticos de heparina o de sulfato de heparan y mezclas de los mismos con un agente reticulante seleccionado del grupo que consiste en trimetafosfato trisodico (STMP), oxicloruro de fosforo (POCb), epiclorhidrina, formaldetudos, carbodiimidas
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hidrosolubles y glurataldehudo en condiciones alcalinas a una temperature comprendida entre 30 y 70 °C.
La presente invencion se refiere ademas al uso de un hidrogel como crioprotector, en el que dicho hidrogel se puede obtener mediante:
a) la reticulacion qmmica de al menos un polisacarido seleccionado del grupo que consiste en pululano, dextrano, sulfato de dextrano, escleroglucano, carboximetildextrano, carboximetilpululano, agar, alginato, fucoidano, quitosano, acido hialuronico, proteoglicanos de sulfato de heparan, heparina, mimeticos de heparina o de sulfato de heparan y mezclas de los mismos con un agente reticulante seleccionado del grupo que consiste en trimetafosfato trisodico (STMP), oxicloruro de fosforo (POCb), epiclorhidrina, formaldehudos, carbodiimidas hidrosolubles y glurataldehudo en condiciones alcalinas a una temperatura comprendida entre 30 y 70 °C;
b) la molienda del hidrogel obtenido en a) para obtener partfculas de hidrogel;
c) opcionalmente, el lavado de dichas partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b);
d) opcionalmente, el tamizado de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b) o la etapa c);
e) opcionalmente, el lavado de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b) o en la etapa d), preferentemente con una solucion salina, preferentemente una solucion salina tamponada con fosfato bien enjuagada en agua destilada;
f) la deshidratacion de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b) o en etapa e), preferentemente en banos de etanol/agua;
g) el secado de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa f), preferentemente a 50 °C con el fin de obtener partfculas de hidrogel secadas;
h) opcionalmente, el tamizado de las partfculas secadas obtenidas en la etapa g); y
i) el hinchamiento de la partfcula de hidrogel secada obtenida en la etapa h) en una solucion de hinchamiento para obtener un hidrogel.
Todas las caractensticas tecnicas mencionadas anteriormente son aplicables.
A continuacion, se ilustrara la invencion por medio de los siguientes ejemplos asf como de las figuras.
Descripcion de las figuras
Figura 1: Vistas macroscopicas del criobiogel de diverso tamano desarrollado por los inventores.
Figura 2.
a) Propiedades termicas del hidrogel a base de pululano. Los espectros revelan una variacion de Tg (145 °C para el hidrogel de pululano y 152 °C para el hidrogel polimerizado), lo que permite la caracterizacion del hidrogel producido.
b) Velocidad de hinchamiento de las partfculas de hidrogel secadas utiles en el contexto de la invencion. La velocidad de hinchamiento de los geles de hidrogel secado es util en el contexto de la invencion. A temperatura ambiente durante una hora, se dejaron hinchar 10 mg de hidrogel en una solucion de PBS, DMEM, DMEM, FCS al 10 %. Se elimino el exceso de lfquido y se peso el hidrogel.
Figura 3: Temperatura de cristalizacion y % de solucion cristalizada en hielo para el criobiogel y DMSO. La Figura muestra la reduccion de la formacion de hielo cristalino cuando se usaron geles.
Figura 4: Viabilidad de celulas HUVEC (celulas endoteliales de vena umbilical humana) en diversos medios. Las celulas se congelaron en presencia de geles y sin geles. Se comparo el resultado con la referencia - una mezcla de DMEM, SVF al 10 %, DMSO al 10 %. La Figura muestra que el uso del hidrogel de acuerdo con la invencion proporciona un mayor porcentaje de viabilidad celular en comparacion con la referencia.
Figura 5: Borde de crecimiento de las celulas tras la descongelacion. Las celulas se congelaron con y sin criobiogel y sin DMSO o FCS (x 103/cm2) en diversos medios: la referencia, SGly y SGly. El crecimiento celular fue identico al crecimiento de la referencia en presencia de hidrogel, a pesar de la ausencia de DMSO.
Figura 6: Viabilidad de celulas HUVEC en diversos medios y comparacion con el patron de referencia para la congelacion (+ DMSO + SVF). La viabilidad celular fue identica a la de la referencia.
Figura 7: Crioconservacion de la aorta en diferentes medios de la siguiente manera: DMSO al 10 %; y criobiogel desarrollado por los inventores. Los resultados se compararon con la aorta recien preparada. Los mismos resultados se obtuvieron con el criobiogel en ausencia de DMSO.
Figura 8: Comparacion visual del hidrogel desarrollado por los inventores y diversos hidrogeles disponibles en el mercado. Durante una hora a temperatura ambiente, se dejaron hinchar 10 mg de cada hidrogel se en suero fisiologico.
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Figura 9: Comparacion visual de la viscosidad del hidrogel desarrollado por los inventores y Angargel®. Tras el hinchamiento, el hidrogel permanecio unido al fondo del tubo al darle la vuelta, lo que no fue el caso de los geles comerciales vendidos, tales como Agargel, por ejemplo, que tambien se usa para estas aplicaciones.
Figura 10: Observacion mediante tincion con inmunofluorescencia de las formaciones de tubo en celulas HUVEC crioconservadas con Criobiogel o con la principal tecnica convencional (DMSO al 10 %, FSO al 10 %).
Figura 11: Evaluacion de la estructura de los vasos aorticos de rata y la capa de celulas endoteliales tras un mes de crioconservacion en nitrogeno lfquido con Criobiogel, y en comparacion con el principal metodo convencional (DMSO al 10 %, FCS al 10 %).
Figura 12: Evaluacion de las propiedades mecanicas (modulo de Young) de la aorta crioconservada. Se usaron tres soluciones de hinchamiento:
- una solucion experimental (SGly, DMSO al 0 %); y
- dos soluciones comerciales clmicas (SCOT 15® y SCOT 30®, DMSO al 0 %, MacoPharma, Francia).
Ejemplos
Ejemplo 1: Conservacion de celulas y tejidos
Se obtuvo un banco de partfculas de hidrogel a base de polisacaridos (Criobiogel) mediante reticulacion qmmica de pululano (PM de 200.000, Hayashibara, Okayama, Japon) con agente reticulante de trimetafosfato trisodico (STMP, 10 % (p/p, Sigma)) en condiciones alcalinas a 50 °C.
Se tamizo el hidrogel resultante en un colador (5 mm de diametro), se lavo con una solucion salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) enjuagando bien en agua destilada. A continuacion, se deshidrato el hidrogel en banos de etanol/agua (uno al 70 %, dos al 50 % y tres en etanol absoluto sucesivamente). Tras secar al vacfo a 50 °C, se trituraron las partfculas de gran tamano y se tamizaron, obteniendose partfculas de hidrogel calibradas (de 0,1 a 1,5 mm de diametro).
A) Caracterizacion del criobiogel
a) Protocolos Analisis de hinchamiento
Para definir el comportamiento de las partfculas de hidrogel en un entorno fisiologico, se determinaron las relaciones de hinchamiento de estos hidrogeles en suero fisiologico. Se registraron los pesos del Criobiogel secado (Wd) antes de la inmersion en PBS. Tras 1 h de incubacion, se elimino el exceso de agua y se peso el criobiogel hinchado (Ws). La relacion de hinchamiento se calculo de acuerdo con la formula:
Contenido de fosfatos
Se cuantifico el contenido de fosfatos unidos en el Criobiogel usando un ensayo de fosfatos. En resumen, se incubaron 50 mg de partfculas de hidrogel en HNO3 al 10 % a 105 °C hasta la degradacion completa del hidrogel. A continuacion, a la solucion de hidrogel degradada, se anadio una solucion de metavanadato de amonio (NH4VO3, 11 mmol/l) y una solucion de heptamolibdato de amonio ((NH4)6MozO24, 43 mol/l). Se realizo un intervalo de calibracion usando una solucion de H3PO4 a 0,4 mmol/l. Los espectros de muestra se registraron a 405 nm usando un espectrofotometro.
Analisis termomecanico
Para definir como usar hidrogeles de manera eficiente, primero es necesario estudiar sus propiedades termicas de acuerdo con su composicion. En realidad, esta caracterizacion termica sistematica de los hidrogeles sintetizados sera un factor determinante para su uso en criobiologfa.
Calorimetria diferencial de barrido
Esta tecnica, ampliamente usada en criobiologfa (Boutron et al., 1979, Devireddy, 1998, Bischof, 2000), permite observar transiciones de fase en condiciones dinamicas en muestras de unos cuantos miligramos. La correspondiente tendencia a la formacion de vidrio y la estabilidad del estado amorfo se evaluaran de este modo a partir de las mediciones de calorimetna diferencial de barrido. Las mediciones se llevaron a cabo en un analizador termico Setaram DSC131. La muestra se enfrio de 20 °C a -150 °C a -10 °C/min. Los termogramas se analizaron usando el software de analisis termico SETSOFT 2000.
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b) Resultados
Las partfculas de hidrogel utiles para llevarlo a cabo se representan en la Figura 1. A continuacion, se describen las caractensticas espedficas de dichas partfculas.
Velocidad de hinchamiento
Como se muestra en la Figura 2 de la derecha, la velocidad de hinchamiento depende de la naturaleza de la solucion de hinchamiento en la que se hinchan las partfculas.
Analisis termomecanico
La Figura 2 de la derecha muestra las caractensticas del criobiogel util para llevar a cabo el metodo de la invencion.
B) Preparacion del criobiogel
Se hincho el criobiogel con 1 ml de solucion de hinchamiento. Se usaron cuatro tipos de solucion de hinchamiento.
1) SGLY compuesta de solucion salina y glicerol al 5 %;
2) SGLU compuesta de solucion salina y solucion concentrada de glucosa al 10 %;
3) SPEG15 compuesta de solucion salina y polietilenglicol (15 g/l).
Como control, se uso una solucion de DMEM, DMSO al 10 % y FCS al 10 %.
C) Congelacion y descongelacion de las celulas
Congelacion de las celulas
Se dejaron hinchar 20 mg de criobiogel (tamano de partfcula < 5 mm) en un criovial de 2 ml que contema 900 |jl de solucion de crioconservacion. Se anadieron 100 jl de solucion de crioconservacion que contema 105\ml de celulas Huvec (celulas endoteliales de venas umbilicales humanas) o celulas CD 34+ al criotubo que contema el criobiogel hinchado o medio de control. Se transfirieron los criotubos a un congelador automatico (Freezal, Air Liquide, Francia). La velocidad de enfriamiento fue de -1 °C/min desde la temperatura ambiente a -80 °C o -196 °C. Se transfirieron los crioviales de inmediato a un congelador de -80 °C o se dispusieron en un recipiente de nitrogeno lfquido.
Descongelacion de las celulas
Se sumergieron los crioviales en un bano de agua a 37 °C durante 2 min. Se separaron las celulas y los criobiogeles con un filtro de celulas de 40 jl (Dutscher, Francia) en presencia de un exceso de medio. No se requirio ninguna etapa de centrifugacion en esta etapa. Para el control, las celulas se centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos. A continuacion, se retiro el medio de congelacion. Se transfirieron las soluciones celulares a un matraz de cultivo y se incubaron a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % humidificada. El medio se cambio cada dos dfas.
Viabilidad celular
Se evaluo la viabilidad celular tras la descongelacion usando tincion con azul de tripano. Debido a que este metodo no puede distinguir entre celulas necroticas y apoptoticas, la viabilidad celular tambien se evaluo usando el colorante indicador resaruzina (almarBlue), que usa el poder reductor natural de las celulas vivas para convertir la resazurina en la molecula fluorescente, la resorufina. Las celulas viables convierten de manera continua la resazurina en resorufina, generando asf una medida cuantitativa de la viabilidad y la citotoxicidad (Al-Nasiry, S. et al. (2007). “The use of alamarBlue assay for quantitative analysis of viability, migration and invasion of choriocarcinoma cells”. Hum Reprod 22:1304-1309).
Cultivo celular
Para el experimento de crecimiento celular, se sembraron celulas HUVEC (5 x 103 celulas) en placas de 24 pocillos en Medio Mmimo Esencial de Dubelcco (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal (FCS) al 10 % y L- glutamina 2 mM (Sigma) a 37 °C, humedad del 95 %, CO2 al 5 %. El medio se cambio cada dos dfas. El dfa 1, 3 y 7, las celulas se recogieron con tripsina-EDTA y se contaron con un hematodmetro Malassez. Todos los experimentos se realizaron al menos dos veces y en muestras cuadruplicadas.
D) Recogida, congelacion y descongelacion de tejido
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Se recogieron muestras de aorta toracica de ratas macho (Wistar, ws/ws) con un peso de 250 g. Todos los procedimientos y tratamientos con animales cumplieron con los Principios de Cuidado de Animales de Laboratorio emitidos por la Sociedad Nacional de Investigacion Medica (autorizacion n.° 006235 del Ministerio de Agricultura frances). Tras la anestesia general, se realizo una incision en la pared del torax y se recogio la aorta toracica por debajo del arco aortico, y se sumergio en solucion de NaCl al 0,9 % (CDM Lavoisier Laboratories) antes del experimented Se obtuvieron tres segmentos de 1 cm de cada recipiente.
Congelation de tejidos
Se hincharon 60 mg de hidrogel (tamano de partteula < 0,1 mm) en un criovial de 2 ml que contema 1 ml de solucion de crioconservacion o medio de control (DMEM, FCS al 10 %) con dimetilsulfoxido (Me2SO) como crioprotector. A continuacion, se dispuso 1 cm de aorta en el criovial. Se transfirieron los criotubos a un congelador automatico (Freezal, Air Liquide, Francia) y se aplico una velocidad de enfriamiento de -1 °C/min hasta alcanzar -80 °C o -196 °C. Se transfirieron los crioviales de inmediato a un congelador de -80 °C o en un recipiente de nitrogeno lfquido.
Descongelacion de tejidos
Tras el almacenamiento, se descongelaron rapidamente los crioviales por inmersion en un bano de agua a 37 °C. Se retiro el criobiogel por filtracion. Se sumergieron los crioviales que conteman las muestras congeladas en un bano de agua a 37 °C durante 2 min. Se retiro el tejido con un forceps y se sumergio en solucion salina para retirar el hidrogel. Como alternativa, se anadio un exceso de medio y se recupero la aorta con facilidad.
E) Evaluaciones de las viabilidades de celulas y tejidos
Viabilidad celular
Se evaluo la viabilidad celular tras la descongelacion mediante tincion con azul de tripano. Debido a que este metodo no puede distinguir entre celulas necroticas y apoptoticas, la viabilidad celular tambien se evaluo usando el colorante indicador resaruzina (almarBlue), que usa el poder reductor natural de las celulas vivas para convertir la resazurina en la molecula fluorescente, la resorufina. Las celulas viables convierten de manera continua la resazurina en resorufina, generando asf una medida cuantitativa de la viabilidad y la citotoxicidad (Al-Nasiry, S. et al. (2007). “The use of alamar Blue assay for quantitative analysis of viability, migration and invasion of choriocarcinoma cells”. Hum Reprod 22:1304-1309).
Se transfirieron 500 pl de solucion de celulas (2 x 104 celulas/ml) en un pocillo de placas de 24 pocillos con 50 pl de solucion azul de resazurina y se incubaron a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % humidificada. 4 h mas tarde, se midio la reduccion de resazurina usando el fluorometro FluoStar Optima y se comparo con la reduccion de celulas antes de la crioconservacion a la misma concentracion. El porcentaje de viabilidad celular se calculo usando la siguiente formula:
Porcentaje de viabilidad celular (%) = [(absorbancia de las celulas tras la descongelacion)/(absorbancia de las
celulas antes de la congelacion)] x 100
El medio de control fue DMEM, DMSO al 10 %, FCS al 10 % para celulas HUVEC o DMEM, DMSO al 10 %, albumina al 5 % para celulas CD34+.
Crecimiento celular
Para el experimento de crecimiento celular, se sembraron celulas HUVEC (5 x 103 celulas) en placas de 24 pocillos en Medio Mmimo Esencial de Dubelcco (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal (FCS) al 10 % y L- glutamina 2 mM (Sigma) a 37 °C, humedad del 95 %, CO2 al 5 %. El medio se cambio cada dos dfas. El dfa 1, 3 y 7, las celulas se recogieron con tripsina-EDTA y se contaron con un hematodmetro Malassez. Todos los experimentos se realizaron al menos dos veces y en muestras cuadruplicadas.
Viabilidad tisular
La viabilidad de las celulas tisulares se midio usando el ensayo MTT. El MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5-difeniltetrazolio, un tetrazol) se reduce al formazan purpura en las mitocondrias de las celulas vivas, y esta reduccion solo tiene lugar cuando las enzimas reductasas mitocondriales estan activas. En resumen, se introdujo segmento de aorta (1 cm) en 1 ml de solucion de MTT (5 mg/ml, Sigma, Francia) y se incubo durante 3 h a TA. Se disolvieron los cristales de formazan resultantes mediante la adicion de 300 pl de isopropanol durante 19 h. Se midio la densidad optica a 570 nm y se calculo el porcentaje de viabilidad celular usando la siguiente formula:
Porcentaje de viabilidad celular (%) = [(absorbancia del segmento de aorta experimental)/(del segmento de aorta
recien preparado)] x 100.
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Resultados
Usando el protocolo previamente descrito, los inventores compararon la viabilidad de las celulas HUVEC en diversos medios (Figura 4). El criobiogel SGly y RGly proporcionaron mejores resultados incluso en ausencia de DMSO y FCS en comparacion con los medios convencionales (que consisten en DMSO y SVF).
La Figura 5 tambien muestra que el crecimiento celular tras la descongelacion se mejora en un medio de criobiogel en comparacion con un medio de SGly convencional. Los inventores tambien demostraron que el criobiogel SGly proporciona resultados asf como el medio de referencia.
La Figura 6 muestra que el criobiogel SGlu proporciona excelentes resultados para la crioconservacion de las celulas HUVEC. Tras la congelacion mecanica lenta, los resultados tras la descongelacion revelaron identica viabilidad celular en presencia del hidrogel en comparacion con el control y el medio de referencia.
Ejemplo 2: Crioconservacion de los vasos aorticos
Se dispusieron muestras arteriales en viales de almacenamiento de nitrogeno lfquido de 2 ml para la crioconservacion (Nuclon-Intermed, Nunc A/S, Roskildo, Dinamarca) que conteman el criobiogel como medio crioprotector y crioconservador o que conteman el medio de control (DMEM, FCS al 10 %) con sulfoxido de dimetilo Me2SO) como crioprotector. A continuacion, se sometieron los segmentos arteriales a congelacion controlada automatizada a una velocidad de reduccion gradual de la temperatura de 1° C/min para alcanzar -80 °C, y se almacenaron los segmentos en el congelador a esta temperatura durante un dfa. Tras este penodo de almacenamiento, se descongelaron rapidamente los segmentos por inmersion en un bano de agua a 37 °C. Se anadio un exceso de medio y se recupero la aorta con facilidad. Se retiro el criobiogel por filtracion.
La Figura 7 muestra la viabilidad celular de
a) vaso aortico recien preparado;
b) vaso aortico en presencia de DMSO;
c) vaso aortico en presencia de criobiogel; y solucion salina.
Los inventores mostraron que el proceso desarrollado por la invencion es tan eficiente como la tecnica convencional que usa DMSO. Los ensayos de MTT proporcionan evidencia de viabilidad celular y funcion mitocondrial adecuada, demostrando que esta funcion se conserva con el hidrogel y, ademas, que los hallazgos son comparables a los observados con DMSO. Los resultados obtenidos fueron similares a los encontrados usando una aorta recien preparada.
Ejemplo 3: Comparacion de las propiedades de hinchamiento entre el hidrogel de acuerdo con la invencion y los hidrogeles disponibles en el mercado tales como Agar® o Agargel®
Los inventores mostraron que la partfcula de hidrogel usada en el contexto de la presente invencion es la unica que ofrece caractensticas muy espedficas que permiten su uso en un proceso de crioconservacion.
Como se muestra en la Figura 8, los inventores compararon las caractensticas del Agar®, Agargel® y Phytogel® disponibles en el mercado y las partfculas de hidrogel usadas en el contexto de la invencion. Tras el hinchamiento, parece que la viscosidad del hidrogel de la invencion es superior, como se muestra en la Figura 9.
Ejemplo 4. Congelacion de embriones de conejo
Materiales y metodos
Se usaron conejos macho de Nueva Zelanda sexualmente maduros (n = 14). Los animales fueron alojados en jaulas de cubierta plana, alimentados con una dieta convencional de microgranulos a discrecion y con acceso libre al agua. Se uso un ciclo alterno de 16 h de luz y 8 h de oscuridad.
Se indujo la ovulacion usando rhFSH (Gonal-F 75, Serono Europe Ltd., Londres, Reino Unido), solo o en combinacion con LH humano recombinante (rhLH, Luveris, Serono Europe Ltd., Londres, Reino Unido) y se inseminaron. Se extrajeron los embriones 72 h despues de la inseminacion artificial en la fase de morula compactada como se ha descrito anteriormente. En resumen, los animales se anestesiaron con una inyeccion intramuscular de 0,4 ml de xilazina al 2 % (Rompun, Bayer AG, Leverkusen, Alemania) y una inyeccion intravenosa de 1,2 ml/kg de peso corporal de ketamina (Imalgene, Merial S. A., Lyon, Francia). A continuacion, se afeito y se desinfecto la region abdominal, y se extirparon cuidadosamente los ovarios y los cuernos uterinos antes de someter al animal a eutanasia. Se realizo el examen macroscopico de los ovarios para determinar la tasa de ovulacion. Se lavo abundantemente cada cuerno uterino con 50 ml de solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) que contema albumina de suero bovino al 0,2 % (BSA, Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Espana). Se transfirio el medio de lavado abundante recuperado a placas de Petri esteriles para su examen
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bajo un estereomicroscopio. Se clasificaron los embriones de acuerdo con criterios morfologicos segun la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones. Solo se consideraron embriones normales los embriones en fase de morula con blastomeros homogeneos y tanto capa de mucina regular como zona pelucida. Se congelo un total de 534 embriones.
Se dispusieron los embriones sucesivamente durante 5 minutos en diferentes medios de crioconservacion que consistfan en medio de retencion de embriones ART 019449 (Imv Technology), BSA a 4 g/l y DMSO al 10 % (referencia) o DMSO al 5 % (como control) o DMSO al 5 % y partfculas de hidrogel (granulometna < 0,5 mm, concentraciones que vanan de 80 mg a < 20 mg). A continuacion, se cargaron los embriones suspendidos en el medio de crioconservacion en pajitas de plastico esteriles de 0,25 ml (IMV, L'Aigle, Francia) entre dos gotas de DPBS separadas por burbujas de aire y cerradas hermeticamente con un tapon esteril. A continuacion, se colocaron las pajitas directamente en un congelador programable (Cryologic Pty Ltd, Mulgrave, Australia) y se congelaron siguiendo el protocolo de congelacion lenta de dos etapas de Menezo. En resumen, se equilibraron los embriones 10 min a -7 °C; tras un penodo de equilibrio de 5 minutos, se realizo una siembra manual. A continuacion, se enfriaron los embriones a -35 °C a una velocidad de congelacion de 0,5 °C/min antes de sumergir las pajitas directamente en nitrogeno lfquido. Tras 3 dfas, se realizo la descongelacion colocando las pajitas a temperatura ambiente durante 10 a 15 segundos antes de sumergirlas en un bano de agua a 20 °C durante 1 minuto. Tras la descongelacion, se retiro el medio de crioconservacion.
Se cultivo un total de 534 embriones congelados-descongelados. Los embriones se cultivaron durante 48 h en medio TCM-199 + suero bovino fetal al 20 % (Sigma-Aldrich Quimica S.A., Madrid, Espana) a 38,5 °C, CO2 al 5 % y humedad saturada. Se evaluaron la viabilidad de los embriones y las etapas de desarrollo de los embriones descongelados.
Resultados
Los resultados relacionados con la viabilidad in vitro de los embriones se muestran en la siguiente Tabla 1: Tabla 1: Determinacion de la viabilidad in vitro de los embriones
- MEDIO
- DESARROLLO DE BLASTOCITOS (%)
- Medio + DMSO al 10 % (referencia)
- 33,9
- Medio + DMSO al 5 % (control)
- 24,9
- Medio + DMSO al 5 % + GPS _ 20
- 22,22
- Medio + DMSO al 5 % + GP5 _ 60
- 20,63
- Medio + DMSO al 5 % + GP5 _ 80
- 17,65
- Medio + DMSO al 5 % + GP1 _ 30
- 39,66*
- Medio + DMSO al 5 % + GP1 _ 60
- 31,75*
- Medio + DMSO al 5 % + GP1 _ 80
- 32,51*
El potencial de desarrollo de los embriones congelados-descongelados obtenidos de los grupos de partfculas GP1 fue similar al grupo de referencia (medio + DMSO al 10 %) y significativamente superior al grupo de control (medio + DMSO al 5 %). La adicion de partfculas GP al medio permite una reduccion significativa de la concentracion de DMSO, que es interesante en la utilizacion clmica.
No se observaron diferencias entre el grupo GP5 y el grupo de control. Los resultados se correlacionaron con el tamano de partfcula y la concentracion de hidrogel.
Ejemplo 5: Congelacion de ovocitos humanos
El hidrogel, que se uso a diversas concentraciones, se descontamino primero con UV durante 30 minutos, y luego se hincho en presencia de 700 pl de medio de cultivo DMEM completo (SVF al 10 % y PSA al 1 %) en una placa de 4 pocillos. Tras el hinchamiento del hidrogel, se anadieron los ovocitos a cada pocillo.
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Estos ovocitos humanos fueron proporcionados por el Laboratorio de Procreacion Medicamente Asistida (MAP) del Hospital Bichat. El ovocito se debe cargar en una pajita de plastico esteril de alta seguridad para la congelacion. Las pajitas se cargaron usando aspiracion con una jeringa de 1 ml que tema una punta especial en la que encajaba la pajita de plastico. Todo el aparato es esteril y desechable (de un solo uso). A continuacion, se llevo a cabo la congelacion usando Nicool FreezalR (AIR LIQUIDE). Se trata de un congelador criogenico programable disenado para todo tipo de muestras biologicas sensibles: pajitas, tubos, bolsas, etc. Se selecciono el siguiente programa de congelacion: 2 °C/min hasta -7 °C (siembra manual), luego -0,3 °C/min de -7 °C a -25 °C, luego -25 °C/min hasta alcanzar -150 °C. La siembra produce la cristalizacion. Tras la estabilizacion a -7 °C, es necesario realizar la siembra con una "barra de siembra" (que se ha sumergido en nitrogeno lfquido) sobre el sembrado en el lado opuesto a los ovocitos con el fin de iniciar la congelacion. Al final del ciclo de congelacion, es decir, cuando la temperatura ha alcanzado -150 °C, se retiran las pajitas del Freezal usando pinzas. Se ponen en cajas y se colocan en nitrogeno lfquido.
Para evaluar el aspecto morfologico de los ovocitos tras la congelacion, se observaron usando un microscopio optico y se fotografiaron en diferentes fases: antes de la congelacion, los ovocitos solos, luego los ovocitos en contacto con un medio de cultivo que contema el hidrogel (en C1, C2 y C3), y tras la congelacion.
La morfologfa de los ovocitos se evaluo de la manera habitual cada vez que se trataban. La primera etapa consistio en colocar los ovocitos en hidrogel durante 20 minutos para asegurarse de que no habfan sufrido choque osmotico y que permanedan intactos. Para este fin, se uso una placa de 4 pocillos, en la que el hidrogel sufrio hinchamiento en DMEM a diversas concentraciones (C1, C2 y C3). Tras 20 minutos, se recuperaron los ovocitos y se aislaron en una placa de Petri.
Ejemplo 6: Congelacion de la piel Materiales y metodos
El hidrogel en partfculas, que se uso a diversas concentraciones, se descontamino primero con UV durante 30 minutos, y luego se hincho en presencia de 700 |jl de medio de cultivo DMEM completo (SVF al 10 % y PSA al 1 %) en una placa de 4 pocillos. Tras el hinchamiento del hidrogel, se anadio piel de rata (6 mm de diametro) a cada pocillo y se cargaron las pajitas usando aspiracion. Se uso DMEM, 10 % de dimetilsulfoxido como referencia (control). A continuacion, se llevo a cabo la congelacion (congelacion lenta o vitrificacion) usando Nicool Freezal® (AIR LIQUIDE). Despues, se colocaron las muestras en un tanque de nitrogeno lfquido. Tras un mes en almacenamiento en nitrogeno lfquido, la piel se descongelo y se estudio la viabilidad del tejido mediante el metodo de MTT como se ha descrito anteriormente.
Resultados
Los resultados se resumen en la siguiente Tabla 2:
Tabla 2: Determinacion de la viabilidad de la piel tras la congelacion mediante un ensayo de MTT en presencia de
Criobiogel o en DMSO
- MEDIO
- DO/MG DE PIEL
- + DMSO al 10 %
- 102,31 ± 2,2
- + Criobiogel, sin DMSO
- 90,91 ± 3,98
La adicion de criobiogel al medio de crioconservacion (DMEM, FCS al 10 %) preserva la viabilidad del tejido celular sin la adicion de DMSO y en una misma proporcion que la piel congelada en DMSO al 10 %.
Ejemplo 7: Inmunotincion de CD31 tras la crioconservacion de celulas HUVEC con Criobiogel
En este experimento, los inventores investigaron los efectos de la crioconservacion de HUVEC con Criobiogel sobre la diferenciacion celular. Esto se examino mediante la formacion de tubos in vitro (gracias a la tincion de inmunofluorescencia para identificar el marcador espedfico CD31) sobre Matrigel y mediante la comparacion con el metodo que implicaba una solucion de DMEM, DMSO al 10 % y FCS al 10 %, designada en el presente documento principal metodo convencional.
Se descongelo el Matrigel a 4 °C durante la noche, se extendio uniformemente sobre cada pocillo (240 jl, 10 mg de protema/ml) de una placa de 24 pocillos y se polimerizo durante mas de 30 minutos a 37 °C. Las celulas se descongelaron y luego se incubaron en DMEm y FBS al 10 % durante 6 h y se sembraron sobre la capa de Matrigel a una densidad de 5 x 104 celulas/pocillo.
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Tras 24 h de incubacion, se observo la formacion de los tubos (Figura 10). Se observo una formacion de tubos similar en las celulas HUVEC crioconservadas con Criobiogel o con la principal tecnica convencional (DMSO al 10 %, FCS al 10 %).
Por lo tanto, los inventores demostraron que el Criobiogel de la invencion proporciona los mismos resultados que el principal metodo convencional de la tecnica anterior con respecto a la capacidad de los tejidos para diferenciarse.
Ejemplo 8: Crioconservacion de vaso aortico de rata en nitrogeno liquido
1. Efecto sobre la organizacion tisular
Se evaluaron la conservacion de la estructura de los vasos aorticos y de la capa de celulas endoteliales de la rata tras un mes de crioconservacion en nitrogeno lfquido con Criobiogel. Los resultados se compararon con el principal metodo convencional (DMSO al 10 %, FCS al 10 %).
Como se muestra en la Figura 11, no se observo ninguna diferencia en la organizacion de los tejidos entre la principal tecnica convencional y el criobiogel.
Las laminas elasticas eran paralelas y se preservo una capa de celulas endoteliales (inmunotincion de RECA1). Por el contrario, en las condiciones de control (es decir, sin adicion de criobiogel), se observo una fragmentacion de la lamina elastica y un gran espacio entre dos laminas elasticas (tincion de orcema, flechas amarillas). Ademas, la capa de celulas endoteliales estaba ausente en las condiciones de control.
Por lo tanto, el criobiogel de la invencion no tiene ningun impacto negativo sobre la organizacion tisular de la celula criopreservada.
2. Efecto sobre las propiedades mecanicas
Los inventores investigaron ademas las propiedades mecanicas de la aorta crioconservada en presencia de criobiogel tras un mes en nitrogeno lfquido.
Se evaluo la influencia de la crioconservacion en presencia de criobiogel sobre las propiedades mecanicas de la aorta mediante ensayos de traccion en direccion longitudinal, y se comparo con aorta recien preparada y aorta preservada con el principal metodo convencional (DMSO al 10 %, FCS al 10 %).
Se usaron tres soluciones de crioconservacion:
- una solucion experimental (SGly, DMSO al 0 %); y
- dos soluciones comerciales clmicas (SCOT 15® y SCOT 30®, DMSO al 0 %, MacoPharma, Francia).
Como se muestra en la Figura 12, los modulos de Young calculados fueron mejores con la crioconservacion en presencia del criobiogel en comparacion con las condiciones de control, y similares al principal metodo convencional para las soluciones SCOT. La solucion SGly mostro resultados similares a la aorta recien preparada.
Por lo tanto, el criobiogel de la invencion no tiene ningun impacto negativo sobre las propiedades mecanicas de la celula crioconservada. Por el contrario, el metodo de la invencion proporciona aorta crioconservada que presenta un modulo de Young mejorado, es decir, mejores propiedades mecanicas.
Ejemplo 9: Supervivencia de crioconservacion de ovocitos de raton
Los inventores compararon la tasa de supervivencia de los ovocitos en tres experiencias diferentes usando 1,2- propanodiol (PROH) de la siguiente manera:
- Grupo I: PROH a 1,5 mol/l, Sacarosa al 0,3 % (principal patron clmico);
- Grupo II (control): PROH a 0,5 mol/l, Albumina al 10 %; y
- Grupo III: PROH a 0,5 mol/l, Criobiogel, Albumina al 10 %.
Los resultados son los siguientes:
Supervivencia de los ovocitos (%)
Grupo I 45,7
Grupo II 0
Grupo III 59,1________________
Los inventores han demostrado que gracias al criobiogel muy especifico de la invencion, obtuvieron una mayor tasa de supervivencia de los ovocitos crioconservados, aunque se usaron tres veces menos de PROH
que en los metodos convencionales.
Referencias
5 A lo largo de la presente solicitud, diversas referencias describen el estado de la tecnica al que pertenece la presente invencion.
Claims (10)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Un metodo de crioproteccion de una muestra biologica que comprende la etapa de congelar dicha muestra biologica en presencia de un hidrogel,en el que dicho hidrogel se puede obtener mediante:a) la reticulacion qmmica de al menos un polisacarido seleccionado del grupo que consiste en pululano, dextrano, sulfato de dextrano, escleroglucano, carboximetildextrano, carboximetilpululano, agar, alginato, fucoidano, quitosano, acido hialuronico, proteoglicanos de sulfato de heparan, heparina, mimeticos de heparina o de sulfato de heparan y mezclas de los mismos con un agente reticulante seleccionado del grupo que consiste en trimetafosfato trisodico (STMP), oxicloruro de fosforo (POCb), epiclorhidrina, formaldehndos, carbodiimidas hidrosolubles y glurataldehfdo en condiciones alcalinas a una temperatura comprendida entre 30 y 70 °C;en el quedicha etapa de congelacion se realiza a una temperatura por debajo de 0 °C en condiciones de presion convencionales ydicha etapa de congelacion se realiza sin dimetilsulfoxido (DMSO).
- 2. Un metodo de crioproteccion de una muestra biologica que comprende la etapa de congelar dicha muestra biologica en presencia de un hidrogel, en el que dicho hidrogel se puede obtener mediante:a) la reticulacion qmmica de al menos un polisacarido seleccionado del grupo que consiste en pululano, dextrano, sulfato de dextrano, escleroglucano, carboximetildextrano, carboximetilpululano, agar, alginato, fucoidano, quitosano, acido hialuronico, proteoglicanos de sulfato de heparan, heparina, mimeticos de heparina o de sulfato de heparan y mezclas de los mismos con un agente reticulante seleccionado del grupo que consiste en trimetafosfato trisodico (STMP), oxicloruro de fosforo (POCb), epiclorhidrina, formaldelmdos, carbodiimidas hidrosolubles y glurataldehfdo en condiciones alcalinas a una temperatura comprendida entre 30 y 70 °C;b) la trituracion del hidrogel obtenido en a) para obtener partfculas de hidrogel;c) el lavado de dichas partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b);d) el tamizado de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b) o la etapa c);e) el lavado de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b) o la etapa d);f) la deshidratacion de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa b) o en etapa e), preferentemente en banos de etanol/agua;g) el secado de las partfculas de hidrogel obtenidas en la etapa f), preferentemente a 50 °C con el fin de obtener partfculas de hidrogel secadas;h) el tamizado de las partfculas secadas obtenidas en la etapa g); yi) el hinchamiento de la partfcula de hidrogel secada obtenida en la etapa h) en una solucion de hinchamiento para obtener un hidrogel;en el quedicha etapa de congelacion se realiza a una temperatura por debajo de 0 °C en condiciones de presion convencionales, ydicha etapa de congelacion se realiza sin dimetilsulfoxido (DMSO).
- 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha etapa de congelacion se realiza a una temperatura comprendida por debajo de -30 °C.
- 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha etapa de congelacion es una etapa de refrigeracion mecanica, a una temperatura comprendida por debajo de -70 °C.
- 5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha etapa de congelacion se realiza en nitrogeno lfquido a una temperatura de -196 °C.
- 6. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha etapa de congelacion se realiza sin un crioprotector seleccionado entre dimetilsulfoxido (DMSO), etilenglicol y polietilenglicol (PEG).
- 7. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 a 6, en el que dicha solucion de hinchamiento se selecciona del grupo que consiste en:i) una solucion que comprende solucion salina y glicerol;ii) una solucion que comprende suero fisiologico y glucosa; yiii) una solucion que esta compuesta de solucion salina fisiologica y polietilenglicol.
- 8. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha muestra biologica son celulas tales como celulas de mairnfero, una celula vegetal, celulas sangurneas, celulas reproductoras, tales como ovocitos o celulas espermaticas, celulas embrionarias, celulas madre, celulas del cordon umbilical, celulas de lacorteza ovarica, progenitores hematopoyeticos o islotes pancreaticos.
- 9. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha muestra biologica es un embrion animal, humano o no humano.5
- 10. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha muestra biologica es un organo o un tejido tal como un corazon, un pulmon, piel, un vaso, una cornea, un ovario, un hngado, un rinon, un pancreas, un intestino, un ojo o un bazo.10 11. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha muestra biologica esacido nucleico tal como ADN o ARN.
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