JP6088501B2 - プレプロバソプレッシンまたはそのフラグメントへの結合物を得る方法 - Google Patents
プレプロバソプレッシンまたはそのフラグメントへの結合物を得る方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、プレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含むそのフラグメントへの結合物を得るおよび／または確認する方法、結合物および生物学試料においてプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含むそのフラグメントを定性的または定量的に検出するための該結合物を含むキット、ならびにプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含むそのフラグメントへの結合物を作製するためのペプチドに関する。
プレプロバソプレッシンは、シグナルペプチドの切断によってプロバソプレッシンを生成することができ、プロバソプレッシンからさらにバソプレッシン、ニューロフィシン２およびコペプチンを生成することができる。コペプチンは前駆体ペプチドのＣ末端部分である。バソプレッシンは、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）としても知られ、水と電解質の平衡の重要な調節因子である。生物学的試料におけるバソプレッシンの測定は、循環からの速やかな消滅、血清中の血小板との相互作用および小さなサイズという大きな技術的障害のため、日常的な臨床業務においてはほとんど不可能である。［００３９］の「文献」、［１〜３］参照。バソプレッシンと共に化学量論的に形成されるコペプチンは、バソプレッシンの代理マーカーとして確立され、成功を収めている。この成功の主たる理由は、コペプチンが極めて高いエクスビボでの安定性を有し、日常的な使用に適するためであると考えられる［４〜６］。
臨床研究により明らかにされた数多くの適応症において、コペプチンの測定は、心臓病、肺疾患、感染症、腎臓病、水と電解質の平衡の病的障害その他を含む、極めて有用な診断情報を提供する［５］。コペプチンの検出のための公表されている方法は免疫検定法である［４、６］。
プレプロバソプレッシンおよびそのフラグメントはまた、ある種の癌においても異所的に発現され得、組織試料における発現を検出するために抗コペプチン抗体が使用できる（欧州特許出願公開第１５３９８１８号）。
臨床研究により明らかにされた数多くの適応症において、コペプチンの測定は、心臓病、肺疾患、感染症、腎臓病、水と電解質の平衡の病的障害その他を含む、極めて有用な診断情報を提供する［５］。コペプチンの検出のための公表されている方法は免疫検定法である［４、６］。
プレプロバソプレッシンおよびそのフラグメントはまた、ある種の癌においても異所的に発現され得、組織試料における発現を検出するために抗コペプチン抗体が使用できる（欧州特許出願公開第１５３９８１８号）。
段落［００４４］参照
抗コペプチン抗体の作製のための免疫原は記述されているが、これらの抗体の実際のエピトープについては、皆無ではないにせよ、わずかしか知られていない。記述されている抗ヒトコペプチン抗体を表１に列挙する。先行技術では、抗コペプチン抗体のエピトープ特異性が、そのような抗体を使用した、生物学的試料中のプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含むそのフラグメントの検出の精度および確実性に影響を及ぼし得るかどうかならびにどのように影響を及ぼし得るかに関する問題には注意が払われてこなかった。コペプチンはそれ自体が非常に安定であるとかなり一般的に信じられている。成熟コペプチンの検出のための抗体であって、そのエピトープが「コペプチンのＣ末端近傍」にマッピングされているとかなり非特異的に定義されるものは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって提供され、ＥＬＩＳＡおよび他の適用における使用のために推奨されている。
本発明は、請求項１に記載の方法、請求項１０に記載のペプチドおよび請求項１１に記載のその使用、請求項１２に記載の結合物、請求項１４に記載の前記結合物の使用、ならびに請求項１８に記載のキットに関する。好ましい実施形態をそれぞれの従属請求項で述べる。
詳細には、第一の態様において、本発明は、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）またはコペプチン（配列番号：２）を含む少なくとも６アミノ酸長のそのフラグメント、への結合物を得るおよび／または確認する方法であって、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１３８〜１６３に対応するがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれるエピトープに結合することができる結合物または結合物の混合物を得るために、
ａ）プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれる少なくとも６アミノ酸長のアミノ酸配列を含む開発物を使用して結合物を作製するステップ；
ｂ）前記結合物が、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれる少なくとも４アミノ酸長のアミノ酸配列に結合することができるかどうかを判定するステップ；
ｃ）複数の結合物から、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列に結合することができる前記結合物を選択し、場合により単離するステップ；
ｄ）生物学的試料中のプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含む、少なくとも６アミノ酸長のそのフラグメントのエクスビボでの安定性を判定するために前記結合物に関する結合アッセイを実施するステップ；
ｅ）生物学的試料中のプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含む、少なくとも６アミノ酸長のそのフラグメントの濃度を測定するために比較の目的で前記結合物と別の結合物に関する結合アッセイを実施するステップ；
の少なくとも１つを含み、ここでＣ末端部分がプレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１３８〜１６４から成る、方法に関する。
ａ）プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれる少なくとも６アミノ酸長のアミノ酸配列を含む開発物を使用して結合物を作製するステップ；
ｂ）前記結合物が、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれる少なくとも４アミノ酸長のアミノ酸配列に結合することができるかどうかを判定するステップ；
ｃ）複数の結合物から、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列に結合することができる前記結合物を選択し、場合により単離するステップ；
ｄ）生物学的試料中のプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含む、少なくとも６アミノ酸長のそのフラグメントのエクスビボでの安定性を判定するために前記結合物に関する結合アッセイを実施するステップ；
ｅ）生物学的試料中のプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含む、少なくとも６アミノ酸長のそのフラグメントの濃度を測定するために比較の目的で前記結合物と別の結合物に関する結合アッセイを実施するステップ；
の少なくとも１つを含み、ここでＣ末端部分がプレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１３８〜１６４から成る、方法に関する。
本発明の主たる態様は、生物学的試料中のプレプロバソプレッシンのフラグメント、特にコペプチンが、先行技術で示唆されるように、それ自体が極めて安定であるわけではなく、分析物の安定性および正確で信頼できる検出は、コペプチンなどのフラグメントを検出するアッセイで使用される抗体が対象とするエピトープに依存するという驚くべき所見である。特に、プレプロバソプレッシンまたはコペプチンなどのそのフラグメントへの結合物に対するエピトープの一部としてのプレプロバソプレッシンのＣ末端部分のアミノ酸１６４位を排除することが、正確な検出および分析物の安定性の両方に関して極めて重要であることが認められた。したがって、本発明の方法は、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するアミノ酸配列、すなわちアミノ酸１３８から始まる、それより下流のアミノ酸配列のエピトープ中にアミノ酸１６４の存在を必要としない結合物を確実に見出すステップを含む。本発明において認められ、確認されたように、結合のためにエピトープ中にアミノ酸１６４を必要としない結合物は、より正確で信頼できる分析結果をもたらし、したがって、結合のために前記アミノ酸１６４を必要とする結合物よりも、プレプロバソプレッシンまたはそのフラグメントを検出するためのアッセイにおいて使用されるのにより適している。
プレプロバソプレッシンまたはそのフラグメントへの結合物に対するエピトープの一部としてのプレプロバソプレッシンのＣ末端部分から、アミノ酸１６４が欠失していても良いのみならず、該アミノ酸より多くのアミノ酸が欠失している場合にも改善された結果が得られ得ることをさらに示すことができた。より詳細には、アミノ酸１６３および１６４、好ましくは１６２〜１６４、最も好ましくはアミノ酸１６１〜１６４が、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するアミノ酸配列から欠失していても良い。すなわち、本発明の方法によって入手できる結合物は、プレプロバソプレッシンまたはコペプチン（配列番号：２）を含むそのフラグメントへの結合のためにエピトープ中にこれらのアミノ酸の存在を必要としない。
本明細書で使用される「プレプロバソプレッシン」および「コペプチン」という用語は、例えばプレプロバソプレッシンおよびコペプチンにそれぞれ７５％だけの相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列も含む。同じことがコペプチン以外のプレプロバソプレッシンの他のフラグメントにも当てはまる。プレプロバソプレッシンの「フラグメント」は、少なくとも６アミノ酸長、好ましくは少なくとも８、特に好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１２アミノ酸残基長のフラグメントに関する。
本発明の方法は、上述したように結合のためにアミノ酸１６４を必要としない適切な結合物を得るおよび／または確認するいくつかの手段を説明するが、それらは単独でまたは互いに組み合わせて使用し得る。１番目の可能性はステップａ）において、所望結合物を選択的に得るための適切な開発物を使用することにり、結合物を合目的的かつ選択的に作製することである。具体的には、開発物は、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するアミノ酸配列に含まれるがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列を有する。すなわち、開発物は、プレプロバソプレッシンのアミノ酸１３８〜１６４のアミノ酸配列の少なくとも一部に対応するがアミノ酸１６４を有さない、少なくとも６アミノ酸長のアミノ酸配列を含む。アミノ酸１６４が欠失しているアミノ酸配列を有する開発物を使用することにより、結合のために前記アミノ酸１６４を必要としない単一結合物または結合物の混合物が得られる。（以下では、「結合物」（ｂｉｎｄｅｒ）という用語は、特に明記しない限り、単一種の結合物または種々の種類の結合物の混合物の両方を意味する。）基本的に、ステップａ）は、このように、所望結合物を選択的および直接的に導き、結合のために前記アミノ酸１６４を必要とする結合物を除去するための付加的なステップを必要としない。しかし、これは、ステップａ）の後に、特性づけ、精製、選択および単離ステップなどの付加的なステップを実施し得ることを排除しない。
本発明に関連して、結合物を作製するために使用されるプレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列は、主として合成によって調製できるかまたは天然由来のアミノ酸配列であり得る。該アミノ酸配列は直鎖状であり得るかまたは折りたたまれていてもよい。前記アミノ酸配列は、主として所望結合物を作製するまたは結合物への効率的な結合を得るのに適した６またはそれ以上のアミノ酸の任意の長さであり得る。前記アミノ酸配列は、主としてプレプロバソプレッシンのアミノ酸１３８から１６３の間の任意のアミノ酸配列に対応し得る。好ましくは、アミノ酸配列は、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４０〜１６３、より好ましくは１４２〜１６３、特に好ましくは１４４〜１６３、最も好ましくは１４６〜１６３の配列に含まれる。適切には、アミノ酸配列は、少なくとも８、好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１２アミノ酸を有する。特に、前記アミノ酸配列は、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３に対応するアミノ酸配列に含まれる少なくとも６、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１２の連続するアミノ酸を含む。
本明細書で使用される場合、「結合物」（ｂｉｎｄｅｒ）という用語は、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するアミノ酸配列に含まれるエピトープに結合することができる任意の物質を指す。この結合物は一般に、空間的にならびに表面特徴に関して、例えば表面電荷、疎水性、親水性、ルイス供与体および／または受容体の存在または不在に関して、標的分子または関心対象の分子、すなわちプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含むそのフラグメントに特異的に結合するように適切に成形される。これにより、結合は、例えば、結合物と標的分子または関心対象の分子との間のイオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、π−π相互作用、σ−π相互作用、疎水性相互作用または水素結合相互作用、またはこれらの相互作用の２以上の組合せによって媒介され得る。そのような結合物は、抗体およびアプタマーから成る群より選択され得るが、これらに限定されない。
好ましくは、結合物は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清、濃縮または精製ポリクローナル抗体、組換え抗体、またはその機能的誘導体である。本明細書で使用される「抗体」という用語は、特に指示されない限り、抗体分子および様々な抗体由来分子の両方を指すために広義に使用される。そのような抗体由来分子は、少なくとも１つの可変領域（重鎖または軽鎖可変領域のいずれか）、ならびに個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖と他の分子との間のキメラ融合物等を含む。本発明による機能的免疫グロブリンフラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２であり得る。「抗体」という用語により、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体；キメラモノクローナル抗体；ヒト化抗体、遺伝子操作されたモノクローナル抗体も包含される。機能的誘導体は、類似の機能性／結合能力を有する抗体／抗血清の化学的および／または生化学的に修飾された変異体である。同様に、開発物は、本発明の結合物を作製するのに適した任意の物質であり得る。好ましくは、開発物は、免疫原、最も好ましくはプレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するアミノ酸配列に含まれる少なくとも６アミノ酸長のアミノ酸配列を含む、天然または合成ペプチドである。
本明細書で使用される「開発物」（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）という用語は、結合物、例えばアミノ酸配列の作製のための結合部位関連物質を指す。開発物は、上述したアミノ酸配列で構成されてもよく、このアミノ酸配列を化合物の機能的部分として含んでもよい。例えば、開発物は、他のアミノ酸配列などの連結部分を付加的に含み得る。好ましくは、開発物は、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３（配列番号：７）、１４６〜１６２（配列番号：８）、１４６〜１６１（配列番号：９）、１４６〜１６０（配列番号：１０）、１４６〜１５９（配列番号：１１）、１４６〜１５８（配列番号：１２）および１４６〜１５７（配列番号：１３）から成るペプチドを含む群より選択される。これらのペプチドおよび本発明の方法におけるそれらの使用も本発明の一部である。ペプチドを使用して結合物、特に抗体を惹起する方法は一般に当分野において公知であるので、本明細書で説明する必要はない。
本発明のステップｂ）では、結合物が、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列に結合することができるかどうかが判定される。ここで、およびステップｃ）では、アミノ酸配列およびＣ末端部分は、アミノ酸配列中の少なくとも４アミノ酸の長さが結合を判定するのに十分とみなされることを除き、上記ステップａ）におけるように定義される。好ましくは、アミノ酸配列は、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３に対応するアミノ酸配列に含まれる少なくとも６、より好ましくは少なくとも８、さらに一層好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１２の連続するアミノ酸を有し、好ましくは、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３（配列番号：７）、１４６〜１６２（配列番号：８）、１４６〜１６１（配列番号：９）、１４６〜１６０（配列番号：１０）、１４６〜１５９（配列番号：１１）、１４６〜１５８（配列番号：１２）および１４６〜１５７（配列番号：１３）から成る群より選択されるアミノ酸配列である。
ステップｂ）は、例えば、作製ステップで得られた結合物の適切性を確認するためにステップａ）に加えて実施され得る。しかし、より好ましくは、ステップｂ）は、結合物が、ステップａ）におけるように選択的開発物を使用して調製されたのではなく、また結合のために前記アミノ酸１６４を必要とするかどうかが明らかでない場合に、該結合物がプレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれる少なくとも４アミノ酸長のアミノ酸配列に実際に結合することができるかどうかを調べるために、実施され得る。これは、結合物の混合物が有効な結合のためにエピトープ中にアミノ酸１６４を必要とする結合物を含むかどうかを調べる必要があり得る場合に、結合物の混合物にも当てはまる。これが確認された場合、これらの望ましくない結合物はその後のステップで除去され得る。
ステップｂ）は、例えば、作製ステップで得られた結合物の適切性を確認するためにステップａ）に加えて実施され得る。しかし、より好ましくは、ステップｂ）は、結合物が、ステップａ）におけるように選択的開発物を使用して調製されたのではなく、また結合のために前記アミノ酸１６４を必要とするかどうかが明らかでない場合に、該結合物がプレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれる少なくとも４アミノ酸長のアミノ酸配列に実際に結合することができるかどうかを調べるために、実施され得る。これは、結合物の混合物が有効な結合のためにエピトープ中にアミノ酸１６４を必要とする結合物を含むかどうかを調べる必要があり得る場合に、結合物の混合物にも当てはまる。これが確認された場合、これらの望ましくない結合物はその後のステップで除去され得る。
ステップｂ）は、専門家に公知の任意の適切な判定方法を用いて実施できる。結合物がプレプロバソプレッシンのＣ末端部分のアミノ酸配列に対応する少なくとも４アミノ酸長のアミノ酸配列に結合することができるかどうかを判定する好ましい方法は、エピトープマッピングである。エピトープマッピングは当業者に公知の工程である。エピトープマッピングは、結合物の標的抗原上の、結合物の結合部位または「エピトープ」を同定する工程である。結合物が抗原に結合するために用いる２種類の一般構造があり、これらは線状配座および立体配座である。線状エピトープはタンパク質中のアミノ酸の連続的な配列によって形成され、一方立体配座エピトープは、タンパク質中の不連続なアミノ酸から成るが、三次元タンパク質折りたたみ後に集合する。標的抗原上の結合エピトープをマッピングするために使用できるいくつかの方法がある。代表的なアプローチはＸ線共結晶構造解析であり、これは抗原と結合物との間の相互作用の直接の視覚化を可能にする。しかし、このアプローチは技術的に難しく、大量の精製タンパク質を必要とし、時間と費用がかかり得る。エピトープマッピングのための代替的なアプローチはペプチドスキャニングである。この技術は、標的タンパク質のオーバーラップするセグメントからの短いペプチド配列のライブラリを使用し、関心対象の抗体に結合するそれらの能力を試験する。この方法はより迅速で比較的安価であるが、主として線状エピトープをマッピングするために使用され、立体配座エピトープのマッピングには使用されない。結合物がそれぞれのアミノ酸配列に結合することができるかどうかを試験するために、アミノ酸配列を直接または間接的に固相に結合することができる。間接的な結合のためには、アミノ酸配列は、このアミノ酸配列を化合物の機能的な部分として含み得る。例えば、アミノ酸配列はビオチンなどの連結部分を付加的に含み得る。ビオチン化アミノ酸配列を、固相上に直接結合されたストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジンを介して固定化することができる。ビオチンはストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジンに極めて高い親和性と特異性で結合するので、それぞれの結合物の結合に関して試験しなければならないアミノ酸配列は、その結果、ビオチン／ストレプトアビジン複合体を介して間接的に固相に結合される。エピトープマッピングのための別のアプローチは部位指定突然変異誘発である。このアプローチを使用して、アミノ酸の体系的な突然変異をタンパク質配列に導入し、それに続いてエピトープを含むアミノ酸を同定するために結合物の特異的結合を測定する。この技術は線状および立体配座エピトープの両方をマッピングするという利点を有するが、大きな労力を要しかつ時間がかかり、典型的には分析を少数のアミノ酸残基に限定する。これらの方法すべてが本発明のステップｂ）において使用できる。好ましくは、しかし、この工程では、結合領域の変異体に対する結合物の結合を評価する。そのような変異体は、典型的には化学合成によってまたは分子生物学的な方法による組換えペプチド／タンパク質として生成される、結合領域のトランケートされた、突然変異した、伸長したまたはさもなければ修飾された形態であり得る。実験的なエピトープマッピングデータの解釈は、適用される実験条件、例えば提供される結合標的の量、適用される結合物の濃度、適用される検出方法、適用されるインキュベーション条件等によって強く影響され得ることに留意しなければならない。これは、しかしながら、専門家に公知であり、したがって考慮され得る。
例えば上述した判定ステップｂ）において、結合物の混合物が得られることが判明するか、または調製方法が結合物の混合物を導くことが明らかであり、混合物が、有効な結合のためにエピトープ中にアミノ酸１６４を必要とする望ましくない結合物を含む場合には、これらの望ましくない結合物を除去するかまたは少なくとも激減させるべきである。このために、本発明の方法は、結合のためにエピトープ中にプレプロバソプレッシンのアミノ酸１６４を必要とせず、したがって改善された分析結果を導く所望結合物を、望ましくない結合物から分離し得るように選択するステップｃ）を含む。この選択ステップは、望ましくない結合物と比較して所望結合物を濃縮するために所望結合物を選択的に入手するのに適した任意の工程であり得る。これを行うための好ましい方法はアフィニティ分離である。この方法は、分離すべき分子の異なる結合特性を利用する。最も一般的な工程は、標的分子の結合部位に特異的なリガンドを不活性なクロマトグラフィマトリックスに結合させる、アフィニティクロマトグラフィである。結合条件下でクロマトグラフィマトリックス上のこの特異的なリガンドは、その特異性だけに従って分子に結合する。他のすべての試料成分は結合せずにクロマトグラフィ媒質を通過する。洗浄ステップ後、結合分子を、解離するように条件を変更することによってまたは標的分子をアフィニティリガンドから移動させる過剰の物質を添加することによって（競合的溶出）放出させ、溶出し得る。したがって結合物を精製形態で単離することができる。本発明は、しかし、上記の選択、精製および単離ステップに限定されず、任意の他の適切な方法も使用できる。
結合物が、結合のためにエピトープ中にプレプロバソプレッシンのアミノ酸１６４を必要とするかどうかを調べることは、本発明のステップｄ）およびｅ）に従って結合アッセイを実施することによっても達成され得る。どちらのステップも結合物のエピトープ特異性を間接的に特性づけ、したがって結合物の適切性を確認するステップである。
本明細書で言及される場合、「アッセイ」は、診断の分野において適用される任意の種類であり得る。そのようなアッセイは、検出すべき分析物の、１またはそれ以上の捕捉プローブへの一定の親和性での結合に基づき得る。捕捉分子と標的分子または関心対象の分子との間の相互作用に関して、親和定数は、好ましくは１０８Ｍ−１より大きい。「捕捉分子」は、標的分子または関心対象の分子に結合させるために使用し得る分子である。捕捉分子は、したがって、空間的にならびに表面特徴に関して、例えば表面電荷、疎水性、親水性、ルイス供与体および／または受容体の存在または不在に関して、標的分子または関心対象の分子に特異的に結合するように適切に成形されていなければならない。先に述べたように、結合は、例えば、捕捉分子と標的分子または関心対象の分子との間のイオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、π−π相互作用、σ−π相互作用、疎水性相互作用または水素結合相互作用または上記相互作用の２もしくはそれ以上の組合せによって媒介され得る。
本明細書で言及される場合、「アッセイ」は、診断の分野において適用される任意の種類であり得る。そのようなアッセイは、検出すべき分析物の、１またはそれ以上の捕捉プローブへの一定の親和性での結合に基づき得る。捕捉分子と標的分子または関心対象の分子との間の相互作用に関して、親和定数は、好ましくは１０８Ｍ−１より大きい。「捕捉分子」は、標的分子または関心対象の分子に結合させるために使用し得る分子である。捕捉分子は、したがって、空間的にならびに表面特徴に関して、例えば表面電荷、疎水性、親水性、ルイス供与体および／または受容体の存在または不在に関して、標的分子または関心対象の分子に特異的に結合するように適切に成形されていなければならない。先に述べたように、結合は、例えば、捕捉分子と標的分子または関心対象の分子との間のイオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、π−π相互作用、σ−π相互作用、疎水性相互作用または水素結合相互作用または上記相互作用の２もしくはそれ以上の組合せによって媒介され得る。
アッセイは様々な形式、例えば放射免疫検定法（ＲＩＡ）、化学発光および蛍光免疫検定法、固相酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ルミネックスに基づくビーズアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、および例えば免疫クロマトグラフィストリップ試験などの迅速な試験形式を有し得る。
アッセイは、均一または不均一アッセイ、競合的および非競合的アッセイであり得る。特に好ましい実施形態では、アッセイは、非競合的免疫検定法であるサンドイッチアッセイの形態であり、このアッセイでは検出すべきおよび／または定量化すべき分子を第一抗体および第二抗体に結合させる。第一抗体は、固相、例えばビーズ、ウェルまたは他の容器の表面、チップまたはストリップに結合させ得、第二抗体は、例えば染料、放射性同位体、または反応性もしくは触媒的に活性な成分で標識された抗体である。次に分析物に結合した標識抗体の量を適切な方法によって測定する。「サンドイッチアッセイ」に関わる一般的な組成物および手順は広く確立されており、当業者に公知である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｅｄ．Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＬＴＤ，Ｏｘｆｏｒｄ；３ｒｄ ｅｄ．（Ｍａｙ ２００５），ＩＳＢＮ−１３：９７８−００８０４４５２６７；Ｈｕｌｔｓｃｈｉｇ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００６ Ｆｅｂ；１０（１）：４−１０．ＰＭＩＤ：１６３７６１３４）。特に好ましい実施形態では、アッセイは２つの捕捉分子、好ましくはどちらも液体反応混合物中に分散として存在する抗体を含み、ここで、両方の捕捉分子の分析物への結合後に、試料を含む溶液中で形成されたサンドイッチ複合体の検出を可能にする測定可能なシグナルが生成されるように、蛍光もしくは化学発光クエンチングまたは増幅に基づく標識系の一部である、第一標識成分を第一捕捉分子に結合させ、前記標識系の第二標識成分を第二捕捉分子に結合させる。
さらに一層好ましくは、前記標識系は、蛍光染料または化学発光染料、特にシアニン型の染料と組み合わせて希土類クリプテートまたは希土類キレートを含む。
アッセイは、均一または不均一アッセイ、競合的および非競合的アッセイであり得る。特に好ましい実施形態では、アッセイは、非競合的免疫検定法であるサンドイッチアッセイの形態であり、このアッセイでは検出すべきおよび／または定量化すべき分子を第一抗体および第二抗体に結合させる。第一抗体は、固相、例えばビーズ、ウェルまたは他の容器の表面、チップまたはストリップに結合させ得、第二抗体は、例えば染料、放射性同位体、または反応性もしくは触媒的に活性な成分で標識された抗体である。次に分析物に結合した標識抗体の量を適切な方法によって測定する。「サンドイッチアッセイ」に関わる一般的な組成物および手順は広く確立されており、当業者に公知である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｅｄ．Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＬＴＤ，Ｏｘｆｏｒｄ；３ｒｄ ｅｄ．（Ｍａｙ ２００５），ＩＳＢＮ−１３：９７８−００８０４４５２６７；Ｈｕｌｔｓｃｈｉｇ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００６ Ｆｅｂ；１０（１）：４−１０．ＰＭＩＤ：１６３７６１３４）。特に好ましい実施形態では、アッセイは２つの捕捉分子、好ましくはどちらも液体反応混合物中に分散として存在する抗体を含み、ここで、両方の捕捉分子の分析物への結合後に、試料を含む溶液中で形成されたサンドイッチ複合体の検出を可能にする測定可能なシグナルが生成されるように、蛍光もしくは化学発光クエンチングまたは増幅に基づく標識系の一部である、第一標識成分を第一捕捉分子に結合させ、前記標識系の第二標識成分を第二捕捉分子に結合させる。
さらに一層好ましくは、前記標識系は、蛍光染料または化学発光染料、特にシアニン型の染料と組み合わせて希土類クリプテートまたは希土類キレートを含む。
ステップｄ）において、結合アッセイは、生物学的試料中のプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含むそのフラグメントのエクスビボでの安定性を判定するために結合物を用いて実施される。本発明において示されたように、結合のためにプレプロバソプレッシンまたはそのフラグメントのアミノ酸１６４を必要とする結合物を使用した場合は、結合のために前記アミノ酸１６４を必要としない結合物を使用した場合に比較して、分析物の安定性はより高い。その結果として、分析物の安定性は、結合物の種類を判断するために使用できる。最も高い安定性を有する分析物は、結合のためにアミノ酸１６４を必要としないものであり、したがって本発明における好ましい結合物である。結合のためにアミノ酸１６４を必要としないことが分かっている結合物を比較のために使用できる。すなわち、該比較結合物に関する分析物安定性を、新しい結合物についての分析物安定性評価における比較基準として使用することができる。
ステップｄ）に代わるものとしてまたはステップｄ）に加えて実施し得るステップｅ）においても、比較目的で別の結合物を使用し、生物学的試料中のプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含むそのフラグメントの濃度を測定するために、比較目的のこの結合物と新しい結合物に関して結合アッセイを実施する。比較目的の結合物は、適切には、前記エピトープへの結合のためにプレプロバソプレッシンの前記アミノ酸１６４を必要としないことが分かっている結合物である。同じく結合のためにエピトープ中にプレプロバソプレッシンの前記アミノ酸１６４を必要としない新しい結合物は、生物学的試料において比較目的の結合物と類似のまたはより高いプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含むそのフラグメントの濃度を示す結果を示すと予想され、一方前記アミノ酸１６４を必要とする結合物はより低い濃度を生じると予想される。
既に上述したように、本発明の方法はステップａ）〜ｅ）の１つだけで構成され得る。例えば、ステップａ）、ステップｂ）、ステップｃ）、ステップｄ）またはステップｅ）だけから成り得る。本発明の方法は、しかし、任意の適切な順序でステップａ）〜ｅ）の２またはそれ以上の組合せも包含する。例えば、所望結合物と望ましくない結合物の両方を含む混合物を生じさせると考えられる調製ステップは、その後にステップｂ）、ｄ）またはｅ）などの分析ステップを実施してもよく、続いて場合によりステップｃ）に従って所望結合物を選択してもよく、次に、所望する場合は、濃縮された所望結合物（これは、上述したように、所望結合物の混合物であってもよい）を生じさせる単離ステップを実施し得る。
本発明の方法により、方法ステップａ）〜ｅ）の少なくとも１つを用いて、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１３８〜１６３に対応するがアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれるエピトープに効率的に結合することができる結合物を得ることが可能であり、それらは、本発明が意外にも示したように、有効な結合のためにプレプロバソプレッシンのＣ末端部分に対応するアミノ酸配列のエピトープ中にアミノ酸１６４の存在を必要としない結合物である。結果として、本発明の方法によって入手できる結合物、または生物学的試料中のプレプロバソプレッシンもしくはコペプチンを含むそのフラグメントを定性的もしくは定量的に検出するための前記結合物を含むキットを使用した場合、より信頼できる分析結果を得ることができる。
生物学的試料は任意の種類の体液であってよく、好ましくは血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液および唾液を含む群から選択される。好ましくは、試料は血液試料であり、最も好ましくは血清試料または血漿試料である。適切な場合は、液体試料を得るために本発明における使用の前に試料を均質化するまたは溶媒で抽出する必要があり得る。これにより液体試料は溶液または懸濁液であり得る。液体試料は、本発明における使用の前に１またはそれ以上の前処理に供し得る。そのような前処理は、希釈、ろ過、遠心分離、濃縮、沈降、沈殿、透析を含むが、これらに限定されない。前処理はまた、酸、塩基、緩衝液、塩、溶媒、反応性染料、界面活性剤、乳化剤、キレート化剤などの化学物質または生化学物質の溶液への添加も含み得る。
本発明に関連して「血漿」は、遠心分離後に得られる抗凝固剤を含む血液の実質的に無細胞の上清である。例示的な抗凝固剤は、ＥＤＴＡまたはクエン酸などのカルシウムイオン結合化合物およびヘパリネートまたはヒルジンなどのトロンビン阻害剤を含む。無細胞血漿は、抗凝固処理した血液（例えばクエン酸、ＥＤＴＡまたはヘパリン添加血液）の２０００〜３０００ｇで少なくとも１５分間の遠心分離によって入手できる。それゆえ、本発明に関連して使用される血漿試料は、１５００ｇ以上で３０分間、好ましくは少なくとも２０００ｇで少なくとも３０分間、より好ましくは少なくとも３０００ｇで少なくとも２０分間、最も好ましくは少なくとも３０００ｇで少なくとも３０分間遠心分離に供されていることが好ましい。
本発明に関連して「血清」は、十分な凝固が完了した後の血液の希釈されていない細胞外部分である。凝固は通常３０分後に完了する。血清は、最低速度１５００ｇで少なくとも１０分間の凝固試料の遠心分離によって入手できる。それゆえ、本発明に関連して使用される血清試料は、少なくとも１５００ｇで少なくとも１０分間、好ましくは少なくとも１５分間、より好ましくは少なくとも２０分間遠心分離に供されていることが好ましい。最も好ましくは、血清試料は少なくとも３０００ｇで少なくとも２０分間遠心分離に供されている。
本発明に関連して「血漿」は、遠心分離後に得られる抗凝固剤を含む血液の実質的に無細胞の上清である。例示的な抗凝固剤は、ＥＤＴＡまたはクエン酸などのカルシウムイオン結合化合物およびヘパリネートまたはヒルジンなどのトロンビン阻害剤を含む。無細胞血漿は、抗凝固処理した血液（例えばクエン酸、ＥＤＴＡまたはヘパリン添加血液）の２０００〜３０００ｇで少なくとも１５分間の遠心分離によって入手できる。それゆえ、本発明に関連して使用される血漿試料は、１５００ｇ以上で３０分間、好ましくは少なくとも２０００ｇで少なくとも３０分間、より好ましくは少なくとも３０００ｇで少なくとも２０分間、最も好ましくは少なくとも３０００ｇで少なくとも３０分間遠心分離に供されていることが好ましい。
本発明に関連して「血清」は、十分な凝固が完了した後の血液の希釈されていない細胞外部分である。凝固は通常３０分後に完了する。血清は、最低速度１５００ｇで少なくとも１０分間の凝固試料の遠心分離によって入手できる。それゆえ、本発明に関連して使用される血清試料は、少なくとも１５００ｇで少なくとも１０分間、好ましくは少なくとも１５分間、より好ましくは少なくとも２０分間遠心分離に供されていることが好ましい。最も好ましくは、血清試料は少なくとも３０００ｇで少なくとも２０分間遠心分離に供されている。
プレプロバソプレッシンまたはそのフラグメントを測定する場合の結果の信頼性は、本発明の結合物に加えて少なくとも１つの他の結合物を使用することによってさらに一層改善され得る。この他の結合物は、適切には、本発明の結合物以外のプレプロバソプレッシンまたはそのフラグメントの別のエピトープに結合する。結合のために他の結合物によって使用されるエピトープは、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１２６〜１６４に対応するアミノ酸配列内に完全にまたは部分的に含まれるエピトープである。特に好ましくは、エピトープは、プレプロバソプレッシンのアミノ酸１２６〜１４６、最も好ましくはアミノ酸１２６〜１３７に対応するアミノ酸配列内に完全にまたは部分的に含まれる。これに関連して「部分的に含まれる」とは、エピトープの一部だけがプレプロバソプレッシンのアミノ酸１２６〜１６４に対応するアミノ酸配列内に存在し、その他の部分はアミノ酸配列の上流、Ｎ末端側に位置することを意味する。すなわち、エピトープの一部はプレプロバソプレッシンの前記アミノ酸配列とオーバーラップし、エピトープの残りの部分はその上流に位置する。オーバーラップは、好ましくは少なくとも６アミノ酸である。付加的な結合物とは、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１２６〜１６４に対応するアミノ酸配列内に完全にまたは部分的に含まれるエピトープに結合することができる任意の物質を指す。好ましくは、付加的な結合物は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清、濃縮または精製ポリクローナル抗体、組換え抗体、またはその機能的誘導体である。
付属の図面および実施例を参照して本発明をさらに説明する、図面および実施例は本発明の好ましい実施形態に関するが、本発明はこれらの実施形態に限定されず、特許請求の範囲に包含されるすべての他の実施形態を含む。
ペプチド
以下のコペプチン関連ペプチドを、標準的な手順を用いて化学合成し、精製して、品質管理した：
以下のコペプチン関連ペプチドを、標準的な手順を用いて化学合成し、精製して、品質管理した：
抗体
ペプチドＰＡＹ１６およびＰＡＹ１４に対するモノクローナル抗体を標準的な手順によって作製した（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ，Ｌａｎｅ Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ｌａｎｅ ＲＤ．Ａ ｓｈｏｒｔ−ｄｕｒａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８５；８１：２２３−８）。
簡単に述べると、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を使用することによってペプチドをＢＳＡに結合した。これらの複合体を用いてＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、ブーストして、脾細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞株を作製した。細胞株を、ポリスチレン固相に被覆された、免疫原性ペプチドに結合する抗体を分泌するそれらの能力に関してスクリーニングした。
このアプローチを用いて、モノクローナル抗体４２９／Ｆ４（ＰＡＹ１６に対する）および４２３／Ｆ１０（ＰＡＹ１４に対する）を分泌する細胞株を作製した。さらなる実験のために、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィによってモノクローナル抗体を培養上清から精製した。
記述されているように［４，７］コペプチン（ＣＴプロＡＶＰ）を検出する化学発光／被覆チューブアッセイにおいて使用した、ペプチドＰＬＡＹ１７に対して開発されたヒツジ抗血清および対応するアフィニティ精製されたポリクローナルヒツジ抗体（「ｐｃ抗ＰＬＡＹ」）は、ＢＲＡＨＭＳ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。
ペプチドＰＡＹ１６およびＰＡＹ１４に対するモノクローナル抗体を標準的な手順によって作製した（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ，Ｌａｎｅ Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ｌａｎｅ ＲＤ．Ａ ｓｈｏｒｔ−ｄｕｒａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８５；８１：２２３−８）。
簡単に述べると、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を使用することによってペプチドをＢＳＡに結合した。これらの複合体を用いてＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、ブーストして、脾細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞株を作製した。細胞株を、ポリスチレン固相に被覆された、免疫原性ペプチドに結合する抗体を分泌するそれらの能力に関してスクリーニングした。
このアプローチを用いて、モノクローナル抗体４２９／Ｆ４（ＰＡＹ１６に対する）および４２３／Ｆ１０（ＰＡＹ１４に対する）を分泌する細胞株を作製した。さらなる実験のために、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィによってモノクローナル抗体を培養上清から精製した。
記述されているように［４，７］コペプチン（ＣＴプロＡＶＰ）を検出する化学発光／被覆チューブアッセイにおいて使用した、ペプチドＰＬＡＹ１７に対して開発されたヒツジ抗血清および対応するアフィニティ精製されたポリクローナルヒツジ抗体（「ｐｃ抗ＰＬＡＹ」）は、ＢＲＡＨＭＳ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。
エピトープマッピング
抗体のエピトープを以下のようにマッピングした：
抗体のエピトープを以下のようにマッピングした：
ａ）ペプチドの被覆
標準的な手順（欧州特許出願公開第１４８８２０９号、欧州特許出願公開第１７３８１７８号）によって被覆を行った：ポリスチレンスターチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、ペプチドＰ１４６〜１６４、Ｐ１４６〜１６３、Ｐ１４６〜１６２、Ｐ１４６〜１６１、Ｐ１４６〜１５９、Ｐ１４６〜１５８およびＰ１４６〜１５７（チューブ当たり、ＰＢＳ、ｐＨ７．８ ３００μＬ中ペプチド１．５μｇ）を用いて２２℃で一晩被覆した。次に、３％Ｋａｒｉｏｎ ＦＰ（Ｍｅｒｃｋ）、０．５％プロテアーゼ不含ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）でチューブをブロックし、凍結乾燥した。
標準的な手順（欧州特許出願公開第１４８８２０９号、欧州特許出願公開第１７３８１７８号）によって被覆を行った：ポリスチレンスターチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、ペプチドＰ１４６〜１６４、Ｐ１４６〜１６３、Ｐ１４６〜１６２、Ｐ１４６〜１６１、Ｐ１４６〜１５９、Ｐ１４６〜１５８およびＰ１４６〜１５７（チューブ当たり、ＰＢＳ、ｐＨ７．８ ３００μＬ中ペプチド１．５μｇ）を用いて２２℃で一晩被覆した。次に、３％Ｋａｒｉｏｎ ＦＰ（Ｍｅｒｃｋ）、０．５％プロテアーゼ不含ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）でチューブをブロックし、凍結乾燥した。
ｂ）ロバ抗ヒツジＩｇＧおよびヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の標識化
標準的な手順（欧州特許出願公開第１４８８２０９号、欧州特許出願公開第１７３８１７８号）によって標識化を行った：ロバ抗ヒツジ抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）およびヤギ抗マウス抗体（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，ＵＳＡ）の濃度を１ｇ／Ｌに調整し、抗体を、化学発光標識ＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳ−エステル（１ｇ／Ｌ；ＩｎＶｅｎｔ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に１：４のモル比で室温にて２０分間インキュベートすることによって標識した。１／１０容の１ｍｏｌ／Ｌトリスを室温で１０分間添加することによって反応を停止させた。標識抗体を、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴｈｅｒｍｏ ＢｉｏＢａｓｉｃ ３００ ５μｍ ＨＰＬＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でのサイズ排除クロマトグラフィによって遊離標識体から分離した。
標準的な手順（欧州特許出願公開第１４８８２０９号、欧州特許出願公開第１７３８１７８号）によって標識化を行った：ロバ抗ヒツジ抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）およびヤギ抗マウス抗体（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，ＵＳＡ）の濃度を１ｇ／Ｌに調整し、抗体を、化学発光標識ＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳ−エステル（１ｇ／Ｌ；ＩｎＶｅｎｔ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に１：４のモル比で室温にて２０分間インキュベートすることによって標識した。１／１０容の１ｍｏｌ／Ｌトリスを室温で１０分間添加することによって反応を停止させた。標識抗体を、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴｈｅｒｍｏ ＢｉｏＢａｓｉｃ ３００ ５μｍ ＨＰＬＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でのサイズ排除クロマトグラフィによって遊離標識体から分離した。
ｃ）ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７抗血清／アフィニティ精製抗体
標識ロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体を、２００μｌ当たり１０６相対光単位（ＲＬＵ）のＭＡＣＮ標識抗体を含むアッセイ緩衝液、ＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）に希釈することによってトレーサを生成した。ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７ヒツジ抗血清（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＰＢＳ、０．５％ウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）を用いて１：１０００、１：３０００、１：９０００、１：２７０００および１：８１０００の割合で希釈した。アフィニティ精製したｐｃ抗ＰＬＡＹ１７ヒツジ抗体をＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミンで以下の濃度に希釈した：９７２、３２４、１０８、３６および１２ｎｇ／２００μｌ。最初のインキュベーションステップでは、ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７ヒツジ抗血清／精製抗体の希釈物５０μｌおよびＰＢＳ、０．５％ウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）２００μｌをチューブにピペットで分注し、ペプチドＰ１４６〜１６４、Ｐ１４６〜１６３、Ｐ１４６〜１６２、Ｐ１４６〜１６１、Ｐ１４６〜１５９、Ｐ１４６〜１５８およびＰ１４６〜１５７で被覆した。非特異的結合（ＮＳＢ）の計算のために、０．５％ウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）とＰＢＳ２５０μｌだけをチューブにピペットで分注し、ペプチドＰ１４６〜１６４、Ｐ１４６〜１６３、Ｐ１４６〜１６２、Ｐ１４６〜１６１、Ｐ１４６〜１５９、Ｐ１４６〜１５８およびＰ１４６〜１５７で被覆した。チューブを撹拌しながら２２℃で一晩インキュベートした。次に、チューブをＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ洗浄液（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ）１ｍＬで５回洗浄した。２番目のインキュベーションステップでは、ロバ抗ヒツジＩｇＧトレーサ２００μｌを添加し、チューブを撹拌しながら２２℃で２時間インキュベートした。次に、チューブをＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ洗浄液１ｍＬで５回洗浄し、結合化学発光をＬＢ ９５２Ｔルミノメータ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）でチューブにつき１秒間測定した。
標識ロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体を、２００μｌ当たり１０６相対光単位（ＲＬＵ）のＭＡＣＮ標識抗体を含むアッセイ緩衝液、ＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）に希釈することによってトレーサを生成した。ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７ヒツジ抗血清（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＰＢＳ、０．５％ウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）を用いて１：１０００、１：３０００、１：９０００、１：２７０００および１：８１０００の割合で希釈した。アフィニティ精製したｐｃ抗ＰＬＡＹ１７ヒツジ抗体をＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミンで以下の濃度に希釈した：９７２、３２４、１０８、３６および１２ｎｇ／２００μｌ。最初のインキュベーションステップでは、ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７ヒツジ抗血清／精製抗体の希釈物５０μｌおよびＰＢＳ、０．５％ウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）２００μｌをチューブにピペットで分注し、ペプチドＰ１４６〜１６４、Ｐ１４６〜１６３、Ｐ１４６〜１６２、Ｐ１４６〜１６１、Ｐ１４６〜１５９、Ｐ１４６〜１５８およびＰ１４６〜１５７で被覆した。非特異的結合（ＮＳＢ）の計算のために、０．５％ウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）とＰＢＳ２５０μｌだけをチューブにピペットで分注し、ペプチドＰ１４６〜１６４、Ｐ１４６〜１６３、Ｐ１４６〜１６２、Ｐ１４６〜１６１、Ｐ１４６〜１５９、Ｐ１４６〜１５８およびＰ１４６〜１５７で被覆した。チューブを撹拌しながら２２℃で一晩インキュベートした。次に、チューブをＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ洗浄液（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ）１ｍＬで５回洗浄した。２番目のインキュベーションステップでは、ロバ抗ヒツジＩｇＧトレーサ２００μｌを添加し、チューブを撹拌しながら２２℃で２時間インキュベートした。次に、チューブをＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ洗浄液１ｍＬで５回洗浄し、結合化学発光をＬＢ ９５２Ｔルミノメータ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）でチューブにつき１秒間測定した。
ｄ）ｍＡｂ ４２９／Ｆ４およびｍＡｂ ４２３／Ｆ１０
標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を、２００μｌ当たり１０６相対光単位（ＲＬＵ）のＭＡＣＮ標識抗体を含むアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン）に希釈することによってトレーサを生成した。モノクローナル抗体４２９／Ｆ４および４２３／Ｆ１０をＰＢＳ、０．５％ウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）で以下の濃度に希釈した：９７２、３２４、１０８、３６および１２ｎｇ／２００μｌ。
最初のインキュベーションステップでは、ｍＡｂ ４２９／Ｆ４／ｍＡｂ ４２３／Ｆ１０の希釈物５０μｌおよびＰＢＳ、０．５％ウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）２００μｌをチューブにピペットで分注し、これらをペプチドＰ１４６〜１６４、Ｐ１４６〜１６３、Ｐ１４６〜１６２、Ｐ１４６〜１６１、Ｐ１４６〜１５９、Ｐ１４６〜１５８およびＰ１４６〜１５７で被覆した。ＮＳＢの計算のために、ＰＢＳ、０．５％ウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）２５０μｌだけをチューブにピペットで分注し、ペプチドＰ１４６〜１６４、Ｐ１４６〜１６３、Ｐ１４６〜１６２、Ｐ１４６〜１６１、Ｐ１４６〜１５９、Ｐ１４６〜１５８およびＰ１４６〜１５７で被覆した。チューブを撹拌しながら２２℃で一晩インキュベートした。次に、チューブをＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ洗浄液（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）１ｍＬで５回洗浄した。２番目のインキュベーションステップでは、ヤギ抗マウストレーサ２００μｌを添加し、チューブを撹拌しながら２２℃で２時間インキュベートした。次に、チューブをＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ洗浄液１ｍＬで５回洗浄し、結合化学発光をＬＢ ９５２Ｔルミノメータ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）でチューブにつき１秒間測定した。
標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を、２００μｌ当たり１０６相対光単位（ＲＬＵ）のＭＡＣＮ標識抗体を含むアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン）に希釈することによってトレーサを生成した。モノクローナル抗体４２９／Ｆ４および４２３／Ｆ１０をＰＢＳ、０．５％ウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）で以下の濃度に希釈した：９７２、３２４、１０８、３６および１２ｎｇ／２００μｌ。
最初のインキュベーションステップでは、ｍＡｂ ４２９／Ｆ４／ｍＡｂ ４２３／Ｆ１０の希釈物５０μｌおよびＰＢＳ、０．５％ウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）２００μｌをチューブにピペットで分注し、これらをペプチドＰ１４６〜１６４、Ｐ１４６〜１６３、Ｐ１４６〜１６２、Ｐ１４６〜１６１、Ｐ１４６〜１５９、Ｐ１４６〜１５８およびＰ１４６〜１５７で被覆した。ＮＳＢの計算のために、ＰＢＳ、０．５％ウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）２５０μｌだけをチューブにピペットで分注し、ペプチドＰ１４６〜１６４、Ｐ１４６〜１６３、Ｐ１４６〜１６２、Ｐ１４６〜１６１、Ｐ１４６〜１５９、Ｐ１４６〜１５８およびＰ１４６〜１５７で被覆した。チューブを撹拌しながら２２℃で一晩インキュベートした。次に、チューブをＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ洗浄液（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）１ｍＬで５回洗浄した。２番目のインキュベーションステップでは、ヤギ抗マウストレーサ２００μｌを添加し、チューブを撹拌しながら２２℃で２時間インキュベートした。次に、チューブをＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ洗浄液１ｍＬで５回洗浄し、結合化学発光をＬＢ ９５２Ｔルミノメータ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）でチューブにつき１秒間測定した。
図１（Ａ）〜１（Ｄ）において、コペプチンのＣ末端全長およびＣ末端部分のトランケート変異体であるペプチドへの抗血清および抗体の認められた結合を示す。抗ＰＬＡＹ１７ヒツジ抗血清、アフィニティ精製したヒツジポリクローナル抗ＰＬＡＹ１７抗体およびｍＡｂ ４２９／Ｆ４は、プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１６４、１４６〜１６３、１４６〜１６２、１４６〜１６１に対応するペプチドへの同等の結合を示した。Ｃ末端がより大きくトランケートされたペプチド変異体に関しては、結合が低減した。低減の量は、適用された抗体の濃度に依存した。試験した抗血清／抗体に関して、それらのエピトープはプレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１６１〜１６４を含まないと結論される。これに対し、ｍＡｂ ４２３／Ｆ１０の結合は、プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１６４に対応するペプチドに対してのみ効率的であり、Ｃ末端がトランケートされたペプチド変異体に対しては大きく低減した。したがって、ｍＡｂ ４２３／Ｆ１０のエピトープにはプレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１６４が含まれる。
免疫検定法
モノクローナル抗体の標識化
標準的な手順によって（欧州特許出願公開第１４８８２０９号、欧州特許出願公開第１７３８１７８号）標識化を行った：精製抗体４２９／Ｆ４および４２３／Ｆ１０の濃度を１ｇ／Ｌに調整し、抗体を、化学発光標識ＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳ−エステル（１ｇ／Ｌ；ＩｎＶｅｎｔ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に１：５のモル比で室温にて２０分間インキュベートすることによって標識した。１／１０容の１ｍｏｌ／Ｌトリスを室温で１０分間添加することによって反応を停止させた。標識抗体を、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴｈｅｒｍｏ ＢｉｏＢａｓｉｃ ３００ ５μｍ ＨＰＬＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でのサイズ排除クロマトグラフィによって遊離標識体から分離した。
モノクローナル抗体の標識化
標準的な手順によって（欧州特許出願公開第１４８８２０９号、欧州特許出願公開第１７３８１７８号）標識化を行った：精製抗体４２９／Ｆ４および４２３／Ｆ１０の濃度を１ｇ／Ｌに調整し、抗体を、化学発光標識ＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳ−エステル（１ｇ／Ｌ；ＩｎＶｅｎｔ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に１：５のモル比で室温にて２０分間インキュベートすることによって標識した。１／１０容の１ｍｏｌ／Ｌトリスを室温で１０分間添加することによって反応を停止させた。標識抗体を、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴｈｅｒｍｏ ＢｉｏＢａｓｉｃ ３００ ５μｍ ＨＰＬＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でのサイズ排除クロマトグラフィによって遊離標識体から分離した。
３つのサンドイッチ免疫検定法を以下のように利用または開発した：
Ａ．Ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７
［７］に記載されているＣＴプロＡＶＰ ＬＩＡ（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
Ｂ．ｍＡｂ ４２９／Ｆ４／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７
標識抗体４２９／Ｆ４を、２００μｌ当たり１０６相対光単位（ＲＬＵ）のＭＡＣＮ標識抗体を含むアッセイ緩衝液（３００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡナトリウム、５ｇ／Ｌプロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、１ｇ／Ｌ非特異的ヒツジＩｇＧ、１ｇ／Ｌ非特異的ウシＩｇＧ、１ｇ／Ｌ非特異的マウスＩｇＧ、０．９ｇ／Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ７．０）に希釈することによってトレーサを生成した。ＣＴプロＡＶＰ標準品（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）５０μｌ／試料およびトレーサ２００μｌをＣＴプロＡＶＰ被覆チューブ（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ）にピペットで分注した。チューブを撹拌しながら２２℃で２時間インキュベートした。次に、チューブを洗浄液（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ）１ｍＬで５回洗浄し、結合化学発光をＬＢ ９５２Ｔルミノメータ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）でチューブにつき１秒間測定した。
Ｃ．ｍＡｂ ４２３／Ｆ１０／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７
標識抗体４２３／Ｆ１０を、２００μｌ当たり１０６相対光単位（ＲＬＵ）のＭＡＣＮ標識抗体を含むアッセイ緩衝液（３００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡナトリウム、５ｇ／Ｌプロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、１ｇ／Ｌ非特異的ヒツジＩｇＧ、１ｇ／Ｌ非特異的ウシＩｇＧ、１ｇ／Ｌ非特異的マウスＩｇＧ、０．９ｇ／Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ７．０）に希釈することによってトレーサを生成した。ＣＴプロＡＶＰ標準品（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）５０μｌ／試料およびトレーサ２００μｌをＣＴプロＡＶＰ被覆チューブ（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ）にピペットで分注した。チューブを撹拌しながら２２℃で２時間インキュベートした。次に、チューブを洗浄液（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ）１ｍＬで５回洗浄し、結合化学発光をＬＢ ９５２Ｔルミノメータ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）でチューブにつき１秒間測定した。３つのアッセイについての典型的な用量反応曲線を図２に示す。
Ａ．Ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７
［７］に記載されているＣＴプロＡＶＰ ＬＩＡ（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
Ｂ．ｍＡｂ ４２９／Ｆ４／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７
標識抗体４２９／Ｆ４を、２００μｌ当たり１０６相対光単位（ＲＬＵ）のＭＡＣＮ標識抗体を含むアッセイ緩衝液（３００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡナトリウム、５ｇ／Ｌプロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、１ｇ／Ｌ非特異的ヒツジＩｇＧ、１ｇ／Ｌ非特異的ウシＩｇＧ、１ｇ／Ｌ非特異的マウスＩｇＧ、０．９ｇ／Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ７．０）に希釈することによってトレーサを生成した。ＣＴプロＡＶＰ標準品（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）５０μｌ／試料およびトレーサ２００μｌをＣＴプロＡＶＰ被覆チューブ（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ）にピペットで分注した。チューブを撹拌しながら２２℃で２時間インキュベートした。次に、チューブを洗浄液（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ）１ｍＬで５回洗浄し、結合化学発光をＬＢ ９５２Ｔルミノメータ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）でチューブにつき１秒間測定した。
Ｃ．ｍＡｂ ４２３／Ｆ１０／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７
標識抗体４２３／Ｆ１０を、２００μｌ当たり１０６相対光単位（ＲＬＵ）のＭＡＣＮ標識抗体を含むアッセイ緩衝液（３００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡナトリウム、５ｇ／Ｌプロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、１ｇ／Ｌ非特異的ヒツジＩｇＧ、１ｇ／Ｌ非特異的ウシＩｇＧ、１ｇ／Ｌ非特異的マウスＩｇＧ、０．９ｇ／Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ７．０）に希釈することによってトレーサを生成した。ＣＴプロＡＶＰ標準品（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）５０μｌ／試料およびトレーサ２００μｌをＣＴプロＡＶＰ被覆チューブ（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ）にピペットで分注した。チューブを撹拌しながら２２℃で２時間インキュベートした。次に、チューブを洗浄液（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ）１ｍＬで５回洗浄し、結合化学発光をＬＢ ９５２Ｔルミノメータ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）でチューブにつき１秒間測定した。３つのアッセイについての典型的な用量反応曲線を図２に示す。
方法の比較
上述した３つのアッセイを用いて、健常個人、心臓病を有する患者およびＩＣＵからの患者由来の試料を含む様々な臨床試料を測定した。グラフでの方法比較を図３（血清）および図４（ＥＤＴＡ−血漿試料）に示す。アッセイｐｃ抗ＰＬＡＹ１７／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７をアッセイｍＡｂ ４２９／Ｆ４／ｍＡｂ ＰＡＴＶ１７と比較した場合、理想的なスピアマンの相関係数が認められ、一方アッセイｍＡｂ ４２３／Ｆ１０／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７をｐｃ抗ＰＬＡＹ１７／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７またはアッセイｍＡｂ ４２９／Ｆ４／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７と比較した場合には、明らかな差異が認められた。差異は、ＥＤＴＡ−血漿試料よりも血清に関してより顕著であった。認められた差異は明らかに抗体のエピトープに関連する：ｍＡｂ ４２３／Ｆ１０のエピトープはプレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１６４を含むが、ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７およびｍＡｂ ４２９／Ｆ４のエピトープはプレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１６１〜１６４を含まない。見かけ上、完全長コペプチンに加えて血清および血漿の両方に存在するＣ末端トランケート変異体もある。方法比較に使用した試料は採取直後に凍結しており、測定の直前に解凍したので、部分的なＣ末端トランケーションは、見かけ上エクスビボでの保存の結果としては起こっていたのではなく、インビボで既に生じていた。
上述した３つのアッセイを用いて、健常個人、心臓病を有する患者およびＩＣＵからの患者由来の試料を含む様々な臨床試料を測定した。グラフでの方法比較を図３（血清）および図４（ＥＤＴＡ−血漿試料）に示す。アッセイｐｃ抗ＰＬＡＹ１７／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７をアッセイｍＡｂ ４２９／Ｆ４／ｍＡｂ ＰＡＴＶ１７と比較した場合、理想的なスピアマンの相関係数が認められ、一方アッセイｍＡｂ ４２３／Ｆ１０／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７をｐｃ抗ＰＬＡＹ１７／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７またはアッセイｍＡｂ ４２９／Ｆ４／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７と比較した場合には、明らかな差異が認められた。差異は、ＥＤＴＡ−血漿試料よりも血清に関してより顕著であった。認められた差異は明らかに抗体のエピトープに関連する：ｍＡｂ ４２３／Ｆ１０のエピトープはプレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１６４を含むが、ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７およびｍＡｂ ４２９／Ｆ４のエピトープはプレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１６１〜１６４を含まない。見かけ上、完全長コペプチンに加えて血清および血漿の両方に存在するＣ末端トランケート変異体もある。方法比較に使用した試料は採取直後に凍結しており、測定の直前に解凍したので、部分的なＣ末端トランケーションは、見かけ上エクスビボでの保存の結果としては起こっていたのではなく、インビボで既に生じていた。
分析物の安定性
方法比較において使用した血清試料のサブセットを２２℃で種々の期間保存し、その後３つのアッセイで測定した。ｍＡｂ ４２３／Ｆ１０／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７アッセイを使用することにより、２２℃で１日の保存後既に、回収率が大幅に低下した。ｍＡｂ ４２３／Ｆ１０のエピトープはプレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１６４を含む。これに対し、ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７またはｍＡｂ ４２９／Ｆ４／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７アッセイのいずれかを使用した場合、分析物ははるかに安定であると思われた。ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７およびｍＡｂ ４２９／Ｆ４のエピトープはプレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１６１〜１６４を含まない。
方法比較において使用した血清試料のサブセットを２２℃で種々の期間保存し、その後３つのアッセイで測定した。ｍＡｂ ４２３／Ｆ１０／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７アッセイを使用することにより、２２℃で１日の保存後既に、回収率が大幅に低下した。ｍＡｂ ４２３／Ｆ１０のエピトープはプレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１６４を含む。これに対し、ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７またはｍＡｂ ４２９／Ｆ４／ｍｃ抗ＰＡＴＶ１７アッセイのいずれかを使用した場合、分析物ははるかに安定であると思われた。ｐｃ抗ＰＬＡＹ１７およびｍＡｂ ４２９／Ｆ４のエピトープはプレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１６１〜１６４を含まない。
配列
配列番号：１（プレプロバソプレッシン）
１０ ２０ ３０
ＭＰＤＴＭＬＰＡＣＦ ＬＣＬＬＡＦＳＳＡＣ ＹＦＱＮＣＰＲＧＣＫ
４０ ５０ ６０
ＲＡＭＳＤＬＥＬＲＱ ＣＬＰＣＧＰＧＧＫＧ ＲＣＦＣＰＳＩＣＣＡ
７０ ８０ ９０
ＤＥＬＣＣＦＶＧＴＡ ＥＡＬＲＣＱＥＥＮＹ ＬＰＳＰＣＱＳＧＱＫ
１００ １１０ １２０
ＡＣＧＳＧＧＲＣＡＡ ＦＧＶＣＣＮＤＥＳＣ ＶＴＥＰＥＣＲＥＧＦ
１３０ １４０ １５０
ＨＲＲＡＲＡＳＤＲＳ ＮＡＴＱＬＤＧＰＡＧ ＡＬＬＬＲＬＶＱＬＡ
１６０
ＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱ ＰＤＡＹ
配列番号：２（コペプチン）
ＡＳＤＲＳＮＡＴＱＬＤＧＰＡＣＡＬＬＬＲＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡＹ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１２６〜１６４を示す）
配列番号：３（ペプチドＰＡＹ１４）
ＣＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡＹ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１５２〜１６４プラスＮ末端システインを示す）
配列番号：４（ペプチドＰＡＹ１６）
ＣＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡＹ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１５０〜１６４プラスＮ末端システインを示す）
配列番号：５（ペプチドＰＡＹ３３）
ＡＴＱＬＤＧＰＡＧＡＬＬＬＲＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡＹ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１３２〜１６４を示す）
配列番号：６（ペプチドＰ１４６〜１６４）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡＹ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１６４を示す）
配列番号：７（ペプチドＰ１４６〜１６３）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１６３を示す）
配列番号：８（ペプチドＰ１４６〜１６２）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１６２を示す）
配列番号：９（ペプチドＰ１４６〜１６１）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１６１を示す）
配列番号：１０（ペプチドＰ１４６〜１６０）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１６０を示す）
配列番号：１１（ペプチドＰ１４６〜１５９）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１５９を示す）
配列番号：１２（ペプチドＰ１４６〜１５８）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１５８を示す）
配列番号：１３（ペプチドＰ１４６〜１５７）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１５７を示す）
配列番号：１（プレプロバソプレッシン）
１０ ２０ ３０
ＭＰＤＴＭＬＰＡＣＦ ＬＣＬＬＡＦＳＳＡＣ ＹＦＱＮＣＰＲＧＣＫ
４０ ５０ ６０
ＲＡＭＳＤＬＥＬＲＱ ＣＬＰＣＧＰＧＧＫＧ ＲＣＦＣＰＳＩＣＣＡ
７０ ８０ ９０
ＤＥＬＣＣＦＶＧＴＡ ＥＡＬＲＣＱＥＥＮＹ ＬＰＳＰＣＱＳＧＱＫ
１００ １１０ １２０
ＡＣＧＳＧＧＲＣＡＡ ＦＧＶＣＣＮＤＥＳＣ ＶＴＥＰＥＣＲＥＧＦ
１３０ １４０ １５０
ＨＲＲＡＲＡＳＤＲＳ ＮＡＴＱＬＤＧＰＡＧ ＡＬＬＬＲＬＶＱＬＡ
１６０
ＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱ ＰＤＡＹ
配列番号：２（コペプチン）
ＡＳＤＲＳＮＡＴＱＬＤＧＰＡＣＡＬＬＬＲＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡＹ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１２６〜１６４を示す）
配列番号：３（ペプチドＰＡＹ１４）
ＣＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡＹ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１５２〜１６４プラスＮ末端システインを示す）
配列番号：４（ペプチドＰＡＹ１６）
ＣＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡＹ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１５０〜１６４プラスＮ末端システインを示す）
配列番号：５（ペプチドＰＡＹ３３）
ＡＴＱＬＤＧＰＡＧＡＬＬＬＲＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡＹ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１３２〜１６４を示す）
配列番号：６（ペプチドＰ１４６〜１６４）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡＹ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１６４を示す）
配列番号：７（ペプチドＰ１４６〜１６３）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１６３を示す）
配列番号：８（ペプチドＰ１４６〜１６２）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１６２を示す）
配列番号：９（ペプチドＰ１４６〜１６１）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１６１を示す）
配列番号：１０（ペプチドＰ１４６〜１６０）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１６０を示す）
配列番号：１１（ペプチドＰ１４６〜１５９）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１５９を示す）
配列番号：１２（ペプチドＰ１４６〜１５８）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１５８を示す）
配列番号：１３（ペプチドＰ１４６〜１５７）
ＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥ
（プレプロバソプレッシンのアミノ酸位置１４６〜１５７を示す）
文献
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７．Ｆｅｎｓｋｅ Ｗ，Ｓｔｏｒｋ Ｓ，Ｂｌｅｃｈｓｃｈｍｉｄｔ Ａ，Ｍａｉｅｒ ＳＧ，Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ ＮＧ，Ａｌｌｏｌｉｏ Ｂ．Ｃｏｐｅｐｔｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｙｐｏｎａｔｒｅｍｉａ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００９；９４：１２３−９．
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２．Ｐｒｅｉｂｉｓｚ ＪＪ，Ｓｅａｌｅｙ ＪＥ，Ｌａｒａｇｈ ＪＨ，Ｃｏｄｙ ＲＪ，Ｗｅｋｓｌｅｒ ＢＢ．Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ ｉｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １９８３；５：１１ ２９−３８．
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５．Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ ＮＣ，Ｓｔｒｕｃｋ Ｊ，Ｊｏｃｈｂｅｒｇｅｒ Ｓ，Ｄｕｎｓｅｒ ＭＷ．Ｃｏｐｅｐｔｉｎ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｂｉｏ−ｍａｒｋｅｒ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００８；１９：４３−９．
６．Ｓｔｒｕｃｋ Ｊ，Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ ＮＧ，Ｂｅｒｇｍａｎｎ Ａ．Ｃｏｐｅｐｔｉｎ，ａ ｓｔａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ｉｓ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｓｅｐｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００５；２６：２５００−４．
７．Ｆｅｎｓｋｅ Ｗ，Ｓｔｏｒｋ Ｓ，Ｂｌｅｃｈｓｃｈｍｉｄｔ Ａ，Ｍａｉｅｒ ＳＧ，Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ ＮＧ，Ａｌｌｏｌｉｏ Ｂ．Ｃｏｐｅｐｔｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｙｐｏｎａｔｒｅｍｉａ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００９；９４：１２３−９．
Claims (9)
- プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のＣ末端部分に対応するアミノ酸配列であって、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３からなりアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列からなるアミノ酸配列に含まれるエピトープに結合することができる結合物または結合物の混合物を得るおよび／または確認する方法であって、
ａ）プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３からなりアミノ酸１６４を欠く前記アミノ酸配列に含まれる少なくとも１２アミノ酸長のアミノ酸配列を含む開発物を使用して結合物を作製するステップ；
ｂ）前記結合物が、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３からなりアミノ酸１６４を欠く前記アミノ酸配列に含まれる少なくとも１２アミノ酸長のアミノ酸配列に結合することができるかどうかを判定するステップ；
ｃ）プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３からなりアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれる前記アミノ酸配列に結合することができる複数の結合物から、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３からなりアミノ酸１６４を欠くアミノ酸配列に含まれる少なくとも１２アミノ酸長のアミノ酸配列に結合することができる前記結合物を選択し、場合により単離するステップ；
ｄ）生物学的試料中のプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含む、少なくとも６アミノ酸長のそのフラグメントのエクスビボでの安定性を判定するために前記結合物に関する結合アッセイを実施するステップであって、前記エピトープへの結合物の結合の特異性が、前記エピトープへの結合のためにプレプロバソプレッシン（配列番号：１）の前記アミノ酸１６４を必要としないことが分かっている結合物のエピトープ特異性との比較により判定される、ステップ；
ｅ）生物学的試料中のプレプロバソプレッシンまたはコペプチンを含む、少なくとも６アミノ酸長のそのフラグメントの濃度を測定するために結合アッセイを実施するステップであって、前記エピトープへの結合物の結合の特異性が、前記エピトープへの結合のためにプレプロバソプレッシン（配列番号：１）の前記アミノ酸１６４を必要としないことが分かっている結合物のエピトープ特異性との比較により判定される、ステップ
の少なくとも１つを含む、方法。 - アミノ酸１６３、アミノ酸１６２〜１６３またはアミノ酸１６１〜１６３が、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３からなりアミノ酸１６４を欠く前記アミノ酸配列から欠失している、請求項１に記載の方法。
- 前記開発物に含まれるアミノ酸配列および／またはプレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３からなりアミノ酸１６４を欠く前記アミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列が、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６２（配列番号：８）、１４６〜１６１（配列番号：９）、１４６〜１６０（配列番号：１０）、１４６〜１５９（配列番号：１１）、１４６〜１５８（配列番号：１２）および１４６〜１５７（配列番号：１３）から成るペプチドを含む群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
- 前記結合物が、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３に対応するアミノ酸配列に含まれる少なくとも１２の連続するアミノ酸のアミノ酸配列に結合することができる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合物が、プレプロバソプレッシン（配列番号：１）のアミノ酸１４６〜１６３（配列番号：７）、１４６〜１６２（配列番号：８）、１４６〜１６１（配列番号：９）、１４６〜１６０（配列番号：１０）、１４６〜１５９（配列番号：１１）、１４６〜１５８（配列番号：１２）および１４６〜１５７（配列番号：１３）から成る群より選択されるアミノ酸配列に結合することができる、請求項４に記載の方法。
- 判定ステップｂ）がエピトープマッピングを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エピトープへの結合物の結合の特異性を、結合物のエピトープ特異性との比較により判定する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
- 選択ステップがアフィニティ分離を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
- −ステップａ）を含むがステップｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）を含まない、または
−ステップｂ）を含むがステップａ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）を含まない、または
−ステップｃ）を含むがステップａ）、ｂ）、ｄ）およびｅ）を含まない、または
−ステップｄ）を含むがステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｅ）を含まない、または
−ステップｅ）を含むがステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）を含まない、または
−ステップｂ）およびｃ）を含むがステップａ）、ｄ）およびｅ）を含まない、
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
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|---|---|---|---|
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