JP6085603B2 - 結腸直腸がん及び乳がん診断法におけるｄｎａメチル化 - Google Patents

Description

本発明は一般的には、そのＤＮＡメチル化レベルの変化が新生物の発症又は新生物の発症の素因を示す核酸分子に関する。より詳細には、本発明は、そのＤＮＡメチル化レベルの変化が腺腫又は腺癌などの大腸新生物又は***新生物の発症及び／又は進行を示す核酸分子を対象とする。本発明のＤＮＡメチル化状態は、結腸直腸腺癌又は***腺癌などの結腸直腸新生物又は***新生物の診断及び／又はモニタリングに関する適用を含む（但し、これらに限定されない）一定範囲の適用に有用である。したがって、関連する態様では、本発明は、１つ又は複数の核酸分子のＤＮＡメチル化の変調をスクリーニングすることにより新生物の発症、発症の素因及び／又は進行についてスクリーニングする方法を対象とする。

結腸直腸がんには、結腸、直腸及び虫垂における癌性成長が含まれる。年あたり世界中で６５５，０００人が死亡しており、結腸直腸がんは合衆国では４番目に一般的な種類のがんであり、西洋ではがん関連死の３番目の主因である。結腸直腸がんは結腸において腺腫性ポリープから生じる。このキノコ形状の成長は通常は良性であるが、一部は時間と供にがんに成長する。限局性結腸がんは結腸内視鏡検査により診断される。結腸の壁内に限定される浸潤がん（ＴＮＭ分類Ｉ及びＩＩ）は手術により治癒可能である。この浸潤がんは、処置されなければ、リンパ節領域まで広がり（分類ＩＩＩ）、この場合には７３％までが手術及び化学療法により治癒可能である。遠隔部位へ転移するがん（分類ＩＶ）は通常は治癒可能ではないが、化学療法は生存を延長することができ、ごくまれに、手術と化学療法を組み合わせると患者が治癒することがあった（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ、２００９年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６１（２５）：２４４９〜６０頁）。直腸がんには放射線が使用される。

乳がんは***組織、もっとも一般的には、乳管の内層又は乳管に乳を供給する小葉を起源とするがんの一種である。乳管を起源とするがんは乳管癌として知られ、小葉を起源とするがんは小葉癌として知られる。圧倒的多数の症例は女性に発生するが、男性の乳がんも起こることがある。

世界的に、乳がんは女性のすべてのがんの２２．９％を占め、女性での発症は男性の１００倍を超えるが、男性のほうが診断の遅れのせいで転帰不良になる傾向がある。乳がんの予後及び生存率は、患者のがんの種類、病期、処置、及び地理的位置に応じて大きく変わる。西洋では生存率は高く、たとえば、乳がんと診断された英国女性の１０人中８人を超える割合（８４％）が少なくとも５年間生存している。しかし、発展途上国では、生存率はずっと悪い。

多くのがんでは腺腫が先行する。腺腫は、腺組織に由来する又は明確に限定された腺構造を示す上皮起源の良性腫瘍又は新生物である。一部の腺腫は線維組織（線維腺腫）及び上皮構造などの認識可能な組織要素を示すが、気管支腺腫などの他の腺腫は、臨床症候群を生じることもある活性化合物を生成する。

腺腫は進行して浸潤新生物になることがあり、その場合は、腺癌と呼ばれる。したがって、腺癌は、身体の多くの器官の構成部分である線構造から生じる悪性上皮腫瘍と定義される。用語腺癌は、腺成長パターンを示す腫瘍にも適用される。これらの腫瘍は、前記腫瘍が生成する物質に従って、たとえば、粘液分泌及び漿液性腺癌と細分類されたり、又はその細胞の鏡検上の配列パターンに従って、たとえば、乳頭状及び濾胞腺癌と細分類され得る。これらの癌は、固形の場合もあれば嚢胞性（嚢胞腺癌）の場合もある。それぞれの器官は、様々な組織学的種類を示す腫瘍を生じることがあり、たとえば、卵巣は粘液性腺癌と嚢胞腺癌の両方を生じることがある。

腺腫は器官が異なれば振る舞いも異なる。一般に、癌(carcinoma)が腺腫内に存在する（すなわち、がんの病巣が良性病変内で発生している）全体的可能性はおよそ５％である。しかし、これは腺腫のサイズと関係がある。たとえば、大腸（具体的には結腸及び直腸）では、腺腫内でのがんの発生は、１センチメートル未満の腺腫ではまれである。大きさが４センチメートルを超えており、絨毛状変化又は高度異形成などのある種の組織学的変化を示す腺腫ではそのような発生は４０〜５０％と推定される。異形成の程度が高い腺腫ほど、癌(carcinoma)の発生率が高くなる。所与の結腸直腸腺腫では、この器官中の現在のがん腫(cancer)の存在又は将来のがん腫の発生の予測因子には、サイズ（特に９ｍｍを超える）、管状から絨毛状形態への変化の程度、高度異形成の存在及び「鋸歯状腺腫」として記載される形態学的変化が含まれる。所与の個体では、加齢、結腸直腸腺腫又はがん腫の家族内発症、雄性又は腺腫の多様性という追加の特徴が、その器官における将来のがんリスクの増加を予想する（いわゆるがん腫リスク因子である）。腺腫の存在及びそのサイズを除いて、これらの特徴はどれ１つとして客観的に定義されておらず、数とサイズ以外の特徴はすべて観察者の誤差及び問題の特徴の正確な定義に関する混乱を生じる可能性がある。そのような因子は評価し定義するのが困難になることがあるために、がんの現在又は将来のリスクの予測因子としてのその価値は不正確である。

散発性腺腫が発症してしまうと、新しい腺腫が発生する可能性は２６か月以内でおよそ３０％である。

結腸直腸がんの症状は、大腸における腫瘍の位置及び腫瘍が転移してしまったかどうかに依拠する。不運にも、症状の多くは他の疾患でも同様に起こり得るため、症状により結腸直腸がんを決定的に診断することができない場合がある。

局所症状は、腫瘍が肛門近くに位置している場合は可能性が高くなる。排便習慣の変化（別の原因の非存在下での便秘又は下痢の新たな発生）、不完全な排便感及び糞便径の減少が生じる場合がある。テネスムス及び糞便形状の変化は両方とも直腸がんの特徴である。粘液の存在の増加と同じように、糞便中の明赤色血液の***を含む下部消化管出血は、結腸直腸がんを示している場合がある。外見がタール様の黒色便を生じる下血は、通常は上部消化管出血において（たとえば、十二指腸潰瘍から）起こるが、疾患が大腸の起始部に位置する場合には結腸直腸がんにおいて遭遇することもある。

腸の全菅腔を満たすほど大きい腫瘍は、腸閉塞を引き起こし得る。このような状況は、便秘、腹痛、腹部膨満及び嘔吐により特徴付けられる。このために、閉塞し膨張した腸をもたらし穴を開けたり腹膜炎を引き起こすこともある。

疾患がさらに進行すると結腸直腸がんのある種の局所的影響が生じる。大きな腫瘍は腹部に触れた際に気付かれ易く、医師が身体検査で気付くことがある。疾患は他の器官を浸潤し得、尿又は膣***物中に血液又は空気を引き起こし得る。

腫瘍が慢性的潜血を引き起こした場合、鉄欠乏性貧血が起こり得る。これは、疲労、動悸として経験され、蒼白として気づかれ得る。結腸直腸がんは、一般には食欲減退のせいで体重が低下することもある。

さらに普通でない全身症状は未解明の熱及びいくつかの腫瘍随伴症候群のうちの１つである。もっとも一般的な腫瘍随伴症候群は、血栓症、通常は深部静脈血栓症である。

結腸直腸がんはもっとも一般的に肝臓まで広がる。これは気がつかれないまま進行することがあるが、肝臓中の大きな沈着物は黄疸及び腹痛を引き起こし得る（嚢の伸長に起因する）。腫瘍沈着物が胆管を遮断する場合、黄疸は蒼白色の糞便などの胆管閉塞という他の特徴を伴うことがある。

結腸直腸がんは発症するのに何年もかかることがあり、結腸直腸がんの初期検出は予後を大いに改善する。結腸直腸がんスクリーニング法を実行する小さな努力でさえ、がん死亡を低下させることが可能である。これにもかかわらず、結腸直腸がんスクリーニング率は依然として低い。したがって、リスクが増大している個体においてはこの疾患についてのスクリーニングが推奨される。現在、この目的のために利用可能であるいくつかの異なる検査が存在する。
直腸指診：医師は潤滑剤を付け手袋をした指を直腸に挿入し、指の感覚で異常な領域を探す。直腸指診は直腸の末端部分において感じ取れるほどの大きさの腫瘍を検出するのみであるが、最初のスクリーニング検査として有用である。
糞便潜血検査：糞便中の血液を調べる検査。糞便中の潜血を検出するためには２種類の検査、すなわち、グアヤクベース（化学的検査）の検査と免疫化学的検査を使用することが可能である。免疫化学的検査の感度は、特異性が容認できないほど減少することなく、化学的検査よりも優れている（Ｗｅｉｔｚｅｌ ＪＮ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９９年）。「遺伝的癌リスク評価 まとめ（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ． Ｐｕｔｔｉｎｇ ｉｔ ａｌｌ ｔｏｇｅｔｈｅｒ）」。Ｃａｎｃｅｒ ８６（１１ ｓｕｐｐｌ）：２４８３〜９２頁）。
内視鏡検査：
Ｓ字結腸鏡検査：照明付きプローブ（Ｓ字結腸鏡検査）が直腸及び結腸下部内に挿入されて、ポリープ及び他の異常について検査する。
結腸内視鏡検査：結腸内視鏡と呼ばれる照明付きプローブが直腸及び全結腸内に挿入されて、がんにより引き起こされることがあるポリープ及び他の異常を探す。結腸内視鏡検査には、その処置中にポリープが見つかった場合には、ポリープを直ちに除去することができるという利点がある。組織を生検のために採取することもできる。
二重造影注腸（ＤＣＢＥ）：先ず、一晩の準備時間を取って結腸を洗浄する。硫酸バリウムを含有する浣腸液を投与し、次に結腸に空気を吹き込み、膨張させる。その結果、結腸の内層全体にバリウムの薄層ができ、これはＸ線フィルム上で可視化できる。がん又は前がん性ポリープはこのようにして検出することが可能である。この技法では（より一般的ではない）平坦なポリープは見逃されることがある。
バーチャル結腸鏡検査は、二重造影注腸におけるＸ線フィルム（上記）を特殊なコンピュータ断層撮影スキャンで置き換えるものであり、放射線科医が解釈することができるように特殊なワークステーションソフトウェアを必要とする。この技法は、ポリープに対する感度では結腸内視鏡検査に近づいている。しかし、見つかったポリープは依然として標準の結腸内視鏡検査により除去しなければならない。
標準コンピュータＸ線体軸断層撮影は、がんの広がりの程度を決定するのに使用することができるＸ線法であるが、スクリーニングのために使用できるほどの感度はない。一部のがんは、他の理由で実施されるＣＡＴスキャンにおいて見つけられる。
血液検査：ある種のタンパク質レベルの上昇について患者の血液を測定することにより、腫瘍量の指標を得ることが可能になる。特に、血液中の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）レベルが高ければ腺癌の転移の指標と成り得る。この検査は偽陽性又は偽陰性であることが多く、スクリーニングには推奨されないが、疾患再発を評価するには有用になり得る。ＣＡ１９−９及びＣＡ２４２バイオマーカーは、ｅ−セレクチン関連転移リスクを示し、治療進展を追跡するのに役立ち、疾患再発を評価することができる。最近、セプチン９遺伝子のメチル化された配列の血漿中での検出のためのアッセイも利用できるようになって結腸直腸がんの診断に役立っている。
陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）は、３次元走査技術であり、放射性糖が患者に注入され、この糖は代謝活性が高い組織に集まり、糖からの放射線の放出を測定することにより画像が形成される。がん細胞は非常に高い代謝速度を有する場合が多いので、これを使用して良性と悪性腫瘍を区別することが可能である。ＰＥＴはスクリーニングには使用されず、結腸直腸がん症例の定常精密検査(routine workup)には（まだ）用いられない。
全身ＰＥＴ画像撮影は再発結腸直腸がんの検出のためのもっとも正確な診断検査であり、切除可能な疾患と切除不能疾患を区別するのに対費用効果の高い方法である。ＰＥＴスキャンは重要な取り扱いに関する決定が腫瘍存在及び程度の正確な評価にかかっている場合は必ず指示される。
糞便ＤＮＡ検査は、結腸直腸がんについてのスクリーニングする新しい技術である。前悪性腺腫及びがん腫はＤＮＡマーカーをそれらの細胞から放ち、このマーカーは消化過程中分解されず糞便中で安定なままである。捕獲とそれに続くＰＣＲにより、ＤＮＡをアッセイのための検出可能レベルにまで増幅させる。
リスクマーカーとしての高いＣ反応性タンパク質レベル
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄａｉｌｙ．ｃｏｍ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／２０１０／０４／１００４１９１５０８３１．ｈｔｍ）。

これらの検査法が存在するにも拘らず、診断は依然として問題がある。より感度の良い検査の大半は極めて侵襲的で高価であるため、患者による利用は少ない。したがって、腺腫又は癌(carcinoma)を発症している可能性の高い人に結腸内視鏡検査を受診するよう指示できるように、もっと簡便でもっと情報価値のある診断プロトコール又は診断補助を開発する必要性が現在も存在する。簡便で正確なスクリーニング検査があれば、はるかに広く適用可能なスクリーニングシステムを提供できるようになると考えられる。同様に、乳がんに関しては、がんが早期に診断される場合には、著しく予後が良好であるが、これを確実に達成するのは困難な場合が多い。なぜならば、侵襲性の強いサブグループのがんの予後指標として、ＢＲＣＡ遺伝子検査以外は、信頼できるのはまだ主にマンモグラム及び腫瘍を確認するための自己検診であるが、そのいずれの技法も初期がんを確実に検出できるほど感度はよくないからである。

本発明に至る研究で、ＬＯＣ１００５２６８２０、特にＬＯＣ１００５２６８２０の２つの特定の領域のメチル化の変化は、腺腫及び腺癌などの大腸の新生物の発生を示していることが判明している。さらに、高度メチル化される特定のゲノムＤＮＡシトシンヌクレオチドが同定されたことにより、診断で常用するのに非常に簡便で特異的な増幅反応の開発が可能になった。

本明細書及びこれに続く特許請求の範囲全体を通して、文脈が他の用法を要求していないかぎり、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変化は、述べられている個体（integer）若しくはステップ又は個体若しくはステップの群を含むが、他のいかなる個体若しくはステップ又は個体若しくはステップの群を排除しないことを意味すると解釈される。

本明細書で使用される際、用語「に由来する」は、特定の個体（integer）又は個体の群が明記されている種を起源とするが、必ずしも明記された供給源から直接入手されたわけではないことを示すと解釈される。さらに、本明細書で使用される際、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が他の方法で明白に指示していないかぎり、複数対象の指示を含む。

本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、他の方法で定義されていないかぎり、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。

本明細書は、参考文献一覧の後で本明細書に提示されるプログラムＰａｔｅｎｔＩｎバージョン３．５を使用して作成されたヌクレオチド配列情報を含む。それぞれのヌクレオチド配列は、数字指標＜２１０＞、続いて配列識別子（たとえば、＜２１０＞１、＜２１０＞２等）により配列表において特定される。配列（ＤＮＡ等）の長さ、種類、及び配列ごとの供給源生物は、それぞれ数字指標フィールド＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３＞に提供される情報により示される。明細書において言及されるヌクレオチド配列は、指標配列番号、続いて配列識別子（たとえば、配列番号１、配列番号２等）により特定される。明細書において言及される配列識別子は、配列識別子（たとえば、＜４００＞１、＜４００＞２等）が後に続く、配列表における数字指標フィールド＜４００＞に提供される情報と関連付けられる。すなわち、明細書において詳述される配列番号１は、配列表において＜４００＞１として示される配列と関連付けられる。

本発明の一態様は、個体における大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、前記個体由来の生体試料中のＨｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４０９７〜１６３８３４９８２により定義されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含み、対照レベルと比べた前記ＤＮＡ領域のより高いレベルのメチル化が新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因を有する細胞を示す方法を対象とする。

別の態様では、ヒトにおける大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、前記個体由来の生体試料中のＨｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４０９７〜１６３８３４９８２により定義されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含み、対照レベルと比べた前記ＤＮＡ領域のより高いレベルのメチル化が新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因を有する細胞を示す方法を対象とする。

本発明のさらに別の態様は、個体における大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、前記個体由来の生体試料中のＨｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４２９５〜１６３８３４５００又はＣｈｒ６：１６３８３４６２１〜１６３８３４９０６により定義される領域のうちの１つ又は両方から選択されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含み、これらＤＮＡ領域のうちの１つ又は両方のより高いレベルのメチル化が新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因を有する細胞を示す方法を対象とする。

さらに別の態様では、個体における大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、前記個体由来の生体試料中のＨｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４３９３〜１６３８３４５１９又はＣｈｒ６：１６３８３４３９３〜１６３８３４４５５により定義される領域のうちの１つ又は両方から選択されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含み、これらＤＮＡ領域のうちの１つ又は両方のより高いレベルのメチル化が新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因を有する細胞を示す方法が提供される。

さらに別の態様では、個体における大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、前記個体由来の生体試料中の

から選択される１つ若しくは複数のシトシン残基又は反対のＤＮＡ鎖上のｎ＋１位の対応するシトシンのメチル化を評価するステップを含み、対照試料における対応する残基のメチル化レベルと比べて前記残基のうちの１つ又は複数のより高いレベルのメチル化が新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因を有する細胞を示す方法が提供される。

追加の態様では、本発明のＤＮＡ領域における増大したメチル化は、
（ｉ）生体試料由来のＤＮＡを、変異誘発(mutagenesis)を引き起こすのに十分な条件下で非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる化合物で処置するステップと、
（ｉｉ）配列番号１、２、３又は４のうちの１つにより定義されるＤＮＡ領域を増幅するように設計されたプライマーを使用して、ステップ（ｉ）のＤＮＡを増幅するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の増幅産物の塩基配列を決定して、対照試料由来のＤＮＡ中の対応する変異残基と比べて、前記試験試料由来のＤＮＡ中での変異を受けていない１つ又は複数のシトシン残基の存在を同定するステップと
を含むプロセスを使用して決定される。

別の態様では、前記変異誘発は亜硫酸水素塩又は等価な物質を用いて誘導され、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換される。

本発明の別の態様は、個体における大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、前記個体由来の生体試料中のＨｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４２９５〜１６３８３４５００により定義されるＤＮＡ領域の発現レベルを評価するステップを含み、対照レベルと比べた前記ＤＮＡ領域のより低い発現レベルが新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因を有する細胞を示す方法を対象とする。

本発明の別の態様は、本発明のマーカーを検出するための１つ又は複数の物質及びこの物質による検出を容易にするのに有用な試薬を含む、生体試料をアッセイするための診断キットを提供する。たとえば、生体試料を受けるための追加の手段も含み得る。物質は、いかなる適切な検出分子でもよい。

一実施形態では、前記キットは、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１又は１２に一致する１つ若しくは複数の核酸分子又は実質的に類似する核酸分子を含む。上述したように、これらの配列は、試験試料から増幅された産物を評価する際の基準（対照）として有用である。

別の実施形態では、前記キットは、
（ｉ）配列番号１３及び１４又は実質的に類似する配列
（ｉｉ）配列番号１３、１４及び１５又は実質的に類似する配列
（ｉｉｉ）配列番号１８及び１９又は実質的に類似する配列
（ｉｖ）配列番号２０及び２１又は実質的に類似する配列
の配列に一致する１つ又は複数の増幅プライマーセットを含む。

メチル化位置が示されている配列番号１を示す。赤色線：１０件の結腸直腸がん検体において測定されたメチル化の割合。青色線：１０件の正常結腸検体において測定されたメチル化の割合。 メチル化位置が示されている配列番号２を示す。赤色線：１０件の結腸直腸がん検体において測定されたメチル化の割合。青色線：１０件の正常結腸検体において測定されたメチル化の割合。 配列番号１及び２の配列を、ＬＯＣ１００５２６８２０の染色***置番号と供に示す。

本発明は、一部は大腸新生物又は***新生物を特徴付けるＤＮＡメチル化状態の解明に基づいている。この知見により、対照レベルと比べたＬＯＣ１００５２６５２０ＤＮＡ領域のメチル化の増加に基づいて、大腸新生物若しくは***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする常用手段の開発が促進される。本発明により、問題の細胞が新生物であるか否かに応じて、メチル化のレベルの特異な変化の点でこのＤＮＡ領域が変調していることが判定された。問題のＤＮＡ領域は、その名称とその染色体座標を参照することの両方により本明細書では記載されることは理解されるべきである。ＤＮＡ領域に対応する染色体座標が収載されている限り、この染色体座標は２００９年２月に公表されたヒトゲノムデータベースバージョンＨｇ１９（本明細書では「Ｈｇ１９座標」と呼ばれる）と一致している。

したがって、本発明の一態様は、個体における大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、前記個体由来の生体試料中のＨｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４０９７〜１６３８３４９８２により定義されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含み、対照レベルと比べて前記ＤＮＡ領域のより高いレベルのメチル化が新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因を有する細胞を示す方法を対象とする。

「大腸」への言及は、大腸の８つの解剖学的領域であって、回腸の末端領域の後で始まり、これらの領域が
（ｉ）盲腸
（ｉｉ）上行結腸
（ｉｉｉ）横行結腸
（ｉｖ）下行結腸
（ｖ）Ｓ状結腸
（ｖｉ）直腸
（ｖｉｉ）脾彎曲部、及び
（ｖｉｉｉ）肝彎曲部
である領域のうちの１つに由来する細胞への言及として理解されるべきである。

本発明をいかなる１つの理論又は作用機序にも限定することなく、哺乳動物***は、年齢、月経周期及び生殖状態と共に変動する構造的に動的な器官である。哺乳動物***は、内部小葉で一つにまとめられ小葉内管へ排出し次に小葉間導管に排出する分泌腺房を提示する分岐状の管状胞状腺である。小葉は１５〜２０の葉に組織化され、葉のそれぞれが別々の乳管洞に注ぎ、そこから乳管に注ぐ。小葉内間質は、小葉上皮成分を取り囲んでいるホルモン感受性線維芽細胞帯を有する疎性結合組織からなる。これらは、形態形成及び分化中に上皮／基底膜／間質誘導性相互作用に関与すると考えられている。***は個体の様々な生活環段階で独自の分化及び増殖的発展を経る。したがって、***への言及は、思春期前、思春期、出生前、出生後／授乳中及び閉経後段階を含むその発生の任意の段階での***を含む細胞への言及であると理解するべきである。これに関して、乳汁分泌を促進する目的で妊娠中生成される細胞などの所与の細胞集団が***に一過性でのみ存在することがあることも理解されるべきである。

「新生物」への言及は、病変、腫瘍又は他の被包性若しくは非被包性腫瘤又は新生物細胞を含む他の形態の成長物(growth)への言及として理解されるべきである。「新生物細胞」は、異常な成長を示す細胞への言及として理解されるべきである。用語「成長(growth)」はその最も広い意味で理解されるべきであり、増殖(proliferation)への言及を含む。この点に関連して、異常な細胞成長の例は、細胞の制御されない増殖である。別の例は、細胞におけるアポトーシスの失敗であり、したがって細胞の通常の寿命の延長である。新生物細胞は良性細胞のこともあれば悪性細胞であることもある。好ましい実施形態では、対象の新生物は腺腫又は腺癌である。本発明をどれか１つの理論又は作用機序に限定するものではないが、腺腫は一般には、上皮組織由来である又は明確に限定された上皮構造を示す上皮起源の良性腫瘍である。これらの構造物は腺外見を帯びることもある。腺腫は、その内部に悪性細胞集団を含むことがあり、良性腺腫又は良性新生物病変の腺癌への進行を引き起こすことがある。

好ましくは、前記新生物細胞は腺腫又は腺癌であり、さらに好ましくは、結腸直腸又は***の腺腫又は腺癌である。

「ＤＮＡ領域」への言及は、ゲノムＤＮＡの特定のセクションへの言及として理解されるべきである。これらのＤＮＡ領域は、染色体座標のセットに言及することにより特定され、当業者には理解されている。上述のように、本明細書において特定されるＤＮＡ領域の染色体座標は、ゲノムのＨｇ１９バージョンに一致する。一般に、遺伝子は、それを介してその配列が定常的に得られる遺伝子の染色***置を参照することにより、定常的に同定することができる。ＤＮＡ領域Ｃｈｒ６：１６３８３４０９７〜１６３８３４９８２への言及は、名称ＬＯＣ１００５２６８２０により本明細書では互換的に言及されることも理解されるべきである。この遺伝子座の８８６のヌクレオチド逆鎖配列は配列番号１７に与えられている。

この遺伝子座に入る他のＤＮＡ領域は本明細書に開示されている。これらの領域は、以下の通りである。
（ｉ）ヌクレオチド配列が以下の配列であるＣｈｒ６：１６３８３４２９５〜１６３８３４５００

（ｉｉ）ヌクレオチド配列が以下の配列であるＣｈｒ６：１６３８３４６２１〜１６３８３４９０６

（ｉｉｉ）ヌクレオチド配列が以下の配列であるＣｈｒ６：１６３８３４３９３〜１６３８３４４５５

（ｉｖ）ヌクレオチド配列が以下の配列であるＣｈｒ６：１６３８３４３９３〜１６３８３４５１９

配列番号１及び２は、ＬＯＣ１００５２６８２０遺伝子座内の２つの別々の領域を表す。配列番号３及び４は配列番号１内の２つの領域を表し、配列番号３領域は実はさらに長い配列番号４の領域内に入る。これらの領域はすべてこの後さらに詳細に考察される。

上述の各ＤＮＡ領域への言及は、あらゆる形態の分子及びその断片又は変異体(variants)への言及として理解されるべきである。当業者に理解されているように、一部のＤＮＡ領域は、個体間での対立遺伝子変異又は一塩基多型を示すことが知られている。ＳＮＰは、サイズを変化させる挿入及び欠失、並びにジヌクレオチド及びトリヌクレオチド反復などの単純な配列反復を包含する。変異体は、本明細書に記載されるＤＮＡ領域に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％配列同一性を共有する、すなわち、１つ又は複数の欠失、付加、置換、反転配列(inverted sequence)等を有する同じ領域由来の核酸配列を含む。したがって、本発明は、現在の診断適用の点から、実際の核酸配列間の小さな遺伝子変異が個体間に存在し得るという事実にもかかわらず、同じ結果を達成するような変異体にまで及ぶと解釈されるべきである。したがって、本発明は、任意の他の突然変異、多型、又は対立遺伝子変異から生じるあらゆる形態のＤＮＡにまで及ぶと解釈されるべきである。

試験の対象である「個体」はヒトであっても、は非ヒト哺乳動物であってもよいことは理解されるべきである。非ヒト哺乳動物の例には、霊長類、家畜動物（たとえば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ、等）、実験室試験動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、ペット（たとえば、イヌ、ネコ）及び捕獲野生動物（たとえば、シカ、キツネ）が含まれる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

この実施形態によれば、ヒトにおける大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、前記個体由来の生体試料中のＨｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４０９７〜１６３８３４９８２により定義されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含み、対照レベルと比べて前記ＤＮＡ領域のより高いレベルのメチル化が新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因を有する細胞を示す方法が提供される。

本発明をいかなる１つの理論又は作用機序に限定するものではないが、ＬＯＣ１００５２６８２０全域でメチル化レベルを測定することは大腸新生物又は***状態の診断に役立つが、ＬＯＣ１００５２６８２０内の２つの別々の領域は、これに関して特に有用であることが判明した。というのは、これらの領域が結腸直腸がんなどの大腸新生物及び***新生物において頻繁に高メチル化されている高密度のＣｐＧジヌクレオチドを含有するからである。

したがって、本発明の一実施形態は、個体における大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、前記個体由来の生体試料中のＨｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４２９５〜１６３８３４５００又はＣｈｒ６：１６３８３４６２１〜１６３８３４９０６により定義される領域のうちの１つ又は両方から選択されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含み、これらＤＮＡ領域のうちの１つ又は両方のより高いレベルのメチル化が新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因を有する細胞を示す方法を対象とする。

さらに別の実施形態では、解析の対象であるＤＮＡ領域は、配列番号１領域内に入るＣｈｒ６：１６３８３４３９３〜１６３８３４５１９（配列番号４）又は配列番号４領域内に入るＣｈｒ６：１６３８３４３９３〜１６３８３４４５５（配列番号３）である。特定の一実施形態では、これら２つの小さいＤＮＡ領域に関してＰＣＲベースのアッセイが開発され適用された。これらは、以下でさらに詳細に言及される。

この実施形態によれば、個体における大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、前記個体由来の生体試料中のＨｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４３９３〜１６３８３４５１９又はＣｈｒ６：１６３８３４３９３〜１６３８３４４５５により定義される領域のうちの１つ又は両方から選択されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含み、これらＤＮＡ領域のうちの１つ又は両方のより高いレベルのメチル化が新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因を有する細胞を示す方法が提供される。

別の実施形態では、前記新生物細胞は腺腫又は腺癌であり、さらに好ましくは、結腸直腸又は***の腺腫又は腺癌である。

本発明をどれか１つの理論又は作用機序に限定するものではないが、ＤＮＡメチル化は細菌、植物、及び動物において普遍的である。ＤＮＡメチル化は、細胞***の周期に亘り安定しているＤＮＡの化学修飾の一種であるが、生物の基礎をなすＤＮＡ配列の変化を伴わない。クロマチン及びＤＮＡ修飾は、エピジェネティクスの２つの重要な特徴であり、細胞分化の過程に関与しており、細胞が同じゲノム物質を含有しているのにも拘らず異なる特徴を安定的に維持することを可能にする。真核生物では、ＤＮＡメチル化はシトシンピリミジン環の第５番の炭素でのみ起こる。哺乳動物では、ＤＮＡメチル化はＣｐＧジヌクレオチドのシトシンの第５番の炭素で大部分起こる。ＣｐＧジヌクレオチドはおよそ１％のヒトゲノムを構成する。

すべてのＣｐＧの７０〜８０％はメチル化されている。ＣｐＧは、多くの遺伝子の５’調節領域に存在しメチル化されていないことが多い「ＣｐＧアイランド」と呼ばれるクラスターにグループ化されていることがある。がんなどの多くの疾患過程では、遺伝子プロモーター及び／又はＣｐＧアイランドは、遺伝性の転写サイレンシングに関連する異常な高度メチル化を獲得する。ＤＮＡメチル化は遺伝子の転写に２つの方法で影響を与え得る。第一に、ＤＮＡのメチル化は、それ自体が転写タンパク質の遺伝子への結合を物理的に阻害し、それによって転写を遮断することがある。第二に、メチル化されたＤＮＡには、メチル−ＣｐＧ−結合ドメインタンパク質（ＭＢＤ）として知られるタンパク質が結合し得る。次いで、ＭＢＤタンパク質は、ヒストンデアセチラーゼ、及びヒストンを修飾しそれによりサイレントクロマチンと呼ばれる緻密で不活性なクロマチンを形成することができる他のクロマチン再構築タンパク質などの追加のタンパク質を遺伝子座に動員する。ＤＮＡメチル化とクロマチン構造間のこの連関は非常に重要である。特に、メチル−ＣｐＧ−結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の喪失はレット症候群に関与しており、メチル−ＣｐＧ−結合ドメインタンパク質２（ＭＢＤ２）はがんにおいて高度メチル化された遺伝子の転写サイレンシングを媒介する。

ヒトでは、ＤＮＡメチル化のプロセスは、３種の酵素、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１、３ａ及び３ｂ（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ）により実行される。ＤＮＭＴ３ａ及びＤＮＭＴ３ｂは、発生の初期にＤＮＡメチル化パターンを設定する新規のメチルトランスフェラーゼであると考えられている。ＤＮＭＴ１は、ＤＮＡ複製中ＤＮＡメチル化パターンを娘鎖にコピーすることに関与していると提唱されたメインテナンスメチルトランスフェラーゼである。ＤＮＭＴ３Ｌは、その他のＤＮＭＴ３に相同であるが触媒活性がないタンパク質である。代わりに、ＤＮＭＴ３Ｌは、ＤＮＡに結合する新規のメチルトランスフェラーゼの能力を増加させて、その活性を刺激することにより新規のメチルトランスフェラーゼを補助する。最後に、ＤＮＭＴ２は「謎の」ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ相同体として同定されており、すべてのＤＮＡメチルトランスフェラーゼに共通の１０個の配列モチーフすべてを含有するが、ＤＮＭＴ２はＤＮＡをメチル化しないことがあるが、代わりに、小型ＲＮＡをメチル化することが示されている。

したがって、「メチル化状態」は、ＤＮＡ領域内の特定のヌクレオチド（単数又は複数）でのメチル化の存在、非存在及び／又は量への言及として理解されるべきである。特定のＤＮＡ配列のメチル化状態（たとえば、本明細書に記載されるＤＮＡ領域）は、前記配列におけるすべての塩基のメチル化状態、又は前記配列内の塩基対のサブセットの（たとえば、シトシンの）メチル化状態又は１つ若しくは複数の特定の制限酵素認識配列のメチル化状態を示すことができる。或いは前記配列のどこでメチル化が起きているかについての正確な情報を与えることなく、前記配列内の領域でのメチル化密度に関する情報を示すことができる。メチル化状態は、任意選択で、「メチル化値」により表す又は示すことができる。メチル化値は、たとえば、メチル化依存性制限酵素での制限消化に続いて存在する無傷のＤＮＡの量を定量化することにより生成することができる。この例では、ＤＮＡ中の特定の配列が定量的ＰＣＲを使用して定量化される場合は、擬似(mock)処理をされた対照にほぼ等しい鋳型ＤＮＡの量は、前記配列が高度にメチル化されていないことを示し、擬似処理された試料において存在するよりも鋳型の量が実質的に少ないことは前記配列でのメチル化されたＤＮＡの存在を示している。したがって、たとえば、上記の例からの値、すなわち、メチル化値はメチル化状態を表し、したがって、メチル化状態の定量的指標として使用することができる。試料中の配列のメチル化状態を閾値と比較することが望ましい場合、このことは特に有用である。

本発明の方法は、生体試料の特定のＤＮＡ領域のメチル化レベルとこれらのＤＮＡ領域の対照メチル化レベルとの比較に基づいている。「対照レベル」とは「正常レベル」であり、新生物ではない又はアッセイのためにＤＮＡを単離し得る別の生体試料、たとえば血漿における対応する大腸又は***の細胞又は細胞集団のＤＮＡ領域のメチル化レベルである。

正常な（又は「非新生物の」）メチル化レベルは、検査の対象である同一個体由来の非新生物組織を使用して決定し得る。しかし、これは関係する個体に対して極めて侵襲的になり得ると考えられ、したがって、問題の患者以外の個体から得られる個々の又は集団の結果を反映する標準結果に対して検査結果を解析するほうが便宜な場合がある。この後者の形態の分析は、実際、好ましい分析方法である。なぜならば、この方法は単一の生体試料（対象の試験試料である）の収集及び分析を必要とするキットの設計を可能にするからである。正常なメチル化レベルを与える標準結果は、当業者には周知と考えられる任意の適切な手段により計算し得る。たとえば、正常組織の集団は、本発明の遺伝子のメチル化レベルの点から評価し、それにより将来の試験試料すべてを分析する際の基準となる標準値又は値の範囲を与えることができる。正常レベルは、特定の集団（cohort）の対象から及びその集団由来の試験試料に関して使用するために決定し得ることも理解されるべきである。したがって、年齢、性別、民族性又は健康状態などの特徴の点で異なる集団に対応するいくつかの標準値又は範囲を決定し得る。前記「正常レベル」は、別々のレベル又はある範囲のレベルでもよい。正常レベルと比べた対象遺伝子のメチル化レベルの増加は、組織が新生物であることを示している。

用語「メチル化」は、核酸、たとえば、ゲノムＤＮＡの領域においてＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の作用によりシトシン塩基（単数又は複数）に付加されたメチル基の存在を意味するものとする。本明細書に記載されるように、核酸のメチル化のレベル又は程度を決定するための当業者に公知の方法がいくつか存在する。

「より高いレベル」は、診断された対象中に、対照試料中よりも多くの数のメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドが存在する、すなわち、特定のＣｐＧ部位でメチル化されたＤＮＡ分子の割合がより高い又は対象中にメチル化された個別のＣｐＧ部位の数が多いことを意味する。用語「増強された」又は「増加された」は用語「より高い」と互換的に使用されると理解されるべきである。本発明は、対象における新生物の診断に役立つと見なされるメチル化された残基の正確な数により限定されるべきではない。なぜならば、患者試料間のある程度の変動が存在するだろうからである。本発明は、メチル化された残基の位置決めによって限定されることもない。にもかかわらず、大腸新生物、特に腺腫及び良性新生物病変との関連で高メチル化を受ける多くの特定のシトシン残基が同定された。これらの残基は、配列番号１及び２により定義されるＬＯＣ１００５２６８２０領域に位置付けられる。したがって、一実施形態では、これらの残基又は反対のＤＮＡ鎖上のｎ＋１位の対応するシトシンのうちの１つ又は複数のメチル化状態を評価することに特に向けられるスクリーニング法を用いることが可能である。

この実施形態に従えば、個体における大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、前記個体由来の生体試料において、

又は反対のＤＮＡ鎖上のｎ＋１位の対応するシトシンから選択される１つ又は複数のシトシン残基のメチル化を評価するステップを含み、
対照試料における対応する残基のメチル化レベルと比べて前記残基のうちの１つ若しくは複数のメチル化のより高いレベルは、新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因となる細胞を示す、方法が提供される。

これらの第６染色体の位置は、図３に描かれている配列番号１及び２配列を参照して番号付けがされている。

本発明をいかなる１つの理論又は作用機序に限定するものではないが、新生物の発生は、遺伝子変化（点変異、欠失、遺伝子増幅又は遺伝子配置）並びに特定の遺伝子座でのＤＮＡメチル化及びヒストン修飾の変化を含む、一定範囲のエピジェネティックな変化の両方を伴う。これらの変化のうちの最も広範に特徴付けられるものは、ＣｐＧアイランドの遺伝子プロモーターの高メチル化である。前述したように、そのような高メチル化は頻繁に遺伝子発現のサイレンシングを伴う。多くの場合、このメチル化に伴う遺伝子サイレンシングは、たとえば、ｐ１６若しくはＲｂなどの腫瘍抑制遺伝子の、又はＤＮＡ修復遺伝子（たとえば、ＭＬＨ１若しくはＭＧＭＴ）のサイレンシングを通じて新生物の発生において重要な役割を果たしていると理解されている。

ＤＮＡメチル化の解析のための全ゲノム技法(genome-wide techniques)は、異なる細胞型又はがんを含む疾患状態におけるＤＮＡメチル化の変化を同定するのに益々使用されつつあり、種々の生化学的及び情報科学的アプローチを用いてＤＮＡメチル化変化の重複セットを同定している（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ ２：５８７〜９８（２０１０））。亜硫酸水素塩タグ技術は、本発明との関連で、ＭｓｐＩ（ＣＣＧＧ）又はＴａｑ１（ＴＣＧＡ）制限酵素部位内のＣｐＧ部位でのそのメチル化状態に基づいてＤＮＡのメチル化フラクション及び非メチル化フラクションを別々に産生するのに使用される。

本発明の検出法は任意の適切な生体試料で実施することが可能である。このために、「生体試料」への言及は、細胞物質、生体液（たとえば、血液）、糞便、組織生検標本、外科的標本又は動物の身体に導入されその後取り出された液体（たとえば、浣腸液から回収された溶液など）などの（但し、これらに限定されない）動物由来の生体物質の任意の試料への言及として理解されるべきである。本発明の方法に従って試験される生体試料は、直接試験することもあれば、試験に先立ってある種の処理を必要とすることもある。たとえば、生検又は外科的試料は試験に先立って均質化を必要とすることもあれば、個々の遺伝子の質的発現レベルのインサイツ試験のために切開（sectioning）を必要とすることもある。また、細胞試料は試験に先立って透過処理を必要とすることもある。さらに、生体試料が液体形態ではない場合、（そのような形態が試験のために必要であれば）前記生体試料は、試料を流動化するためにバッファーなどの試薬の添加を必要とすることもある。

対象のＤＮＡ領域が生体試料中に存在する限り、生体試料は直接試験してもよいし、さもなければ生体試料中に存在する核酸のすべて若しくは一部を試験に先立って単離してもよい。さらに別の例では、分析に先立って、試料を部分的に精製したり、他の方法で濃縮してもよい。たとえば、生体試料が極めて多様な細胞集団を含む場合、特定の対象の亜集団を濃縮することが望ましいこともある。標的細胞集団又はそれに由来する分子を試験に先立って処理する、たとえば、生ウイルスを不活化することは本発明の範囲内である。生体試料は、新たに得てもよく、又は試験に先立って保存しておいたり（たとえば、凍結により）、他の方法で試験に先立って処理してもよい（培養に供するなど）ことも理解されるべきである。

本明細書に開示される方法に従って試験するためにはどのような種類の試料がもっとも適切なのかの選択は、状況の性質に依存することになる。好ましくは、試料は便（糞便）試料、浣腸水、外科的切除、組織生検又は血液試料（たとえば、全血、血清又は血漿）である。

さらに好ましくは、前記生体試料は血液試料、生検試料又は糞便試料である。

上述したように、本発明は大腸又は***に位置する新生物細胞又は細胞集団についてスクリーニングするように設計されている。したがって、「細胞又は細胞集団」への言及は、個々の細胞又は細胞の群への言及として理解されるべきである。細胞の群は、細胞の拡散集団、細胞懸濁液、細胞の被包性集団又は組織の形態をとる細胞の集団のこともある。

腺腫又は腺癌などの新生物の「発症」への言及は、異形成を示す個体の１つ又は複数の細胞への言及として理解されるべきである。この点に関して、腺腫又は腺癌は、多量の異形成細胞が発生している点でよく発達していることがある。或いは、腺腫又は腺癌は、診断時には比較的少数の異常な細胞***のみが起きている点でごく初期段階であることもある。本発明は、腺腫又は腺癌などの新生物の発生の個体の素因の評価までにも及ぶ。本発明をいかなる点でも限定するものではないが、メチル化レベルの変化は、腺腫若しくは腺癌又は別の腺腫若しくは腺癌の将来の発生などの、新生物を発症する個体の素因を示すことがある。

好ましい方法は、新生物発生又はその素因を診断する目的でメチル化レベルを評価することであるが、このメチル化レベルの逆の変化の検出は、ある状況において、たとえば、腺腫又は腺癌の発生などの新生物状態を制御することに向けられる治療又は予防処置の有効性をモニターするためには望ましいこともある。たとえば、メチル化レベルの上昇が、個体が腺腫又は腺癌の発生により特徴付けられる状態を発症したことを示す場合、治療的処置レジメの開始に続くメチル化レベルの減少についてのスクリーニングは、新生物細胞の排除に成功したことを示すのに利用し得る。別の例では、この方法を使用して腫瘍の充分な外周部(full margin of the tumor)が取り除かれたかどうかを確定するために腫瘍切除部分の周囲の組織(the tissue at the margins of tumor resection)を試験することができる。

したがって、本方法は、診断、予後、分類、疾病リスクの予測、疾病の再発の検出、及びいくつかの種類の新生物の治療の選択に使用することが可能である。原発、転移性及び再発がんなどのいかなる進行段階のがんも検出することが可能である。

本発明は、哺乳動物（たとえば、ヒト）が大腸の新生物又は***の新生物を有するかどうか、哺乳動物から採取した生体試料が新生物細胞又は新生物細胞由来のＤＮＡを含有するかどうかを確定する、哺乳動物が新生物を発症するリスク又は可能性を推定する、抗がん治療の効力をモニターする、又はがんを有する哺乳動物における適切な抗がん治療を選択するための方法を提供する。そのような方法は、本明細書に記載されるＤＮＡ領域において新生物細胞が正常細胞とは異なるメチル化状態を有することの決定に基づいている。したがって、細胞が本明細書に記載されるＤＮＡ領域において差異的にメチル化された配列を含有するかどうかを確定することにより、細胞が新生物であるかどうかを決定することが可能である。

本発明の方法は、新生物を有することが知られている若しくは疑われる個体を評価するために、又は定常的な臨床試験として、すなわち、必ずしも新生物を有すると疑われるわけではない個体において使用することが可能である。追加の診断アッセイを実施して、個体における新生物の状態を確認し新生物の種類を確かめることができる。たとえば、血液検査結果が新生物の存在を示している場合、追加のスクリーニングを行って、その新生物が***起源なのか大腸起源なのかをはっきりさせる必要がある場合もある。

さらに、本方法を使用して処置経過の効力を評価し得る。たとえば、抗がん治療の効力は、がんに罹っている哺乳動物において本明細書に記載される配列のＤＮＡメチル化を時間をかけてモニターすることにより、評価することができる。たとえば、治療前に又は治療の早期に哺乳動物から採取した試料中のレベルと比べて、治療に続いて哺乳動物から採取した生体試料における本発明の診断配列のいずれかでのメチル化の減少又は非存在は、有効な治療であることを示している。

したがって、本発明の方法は、１回限りの検査として、又は新生物発生の危険があると考えられる個体の継続的モニターとして、又は新生物発生を阻害する、さもなければ遅延することに向けられる治療的若しくは予防的処置レジメの有効性のモニターとして有用である。これらの状況では、いずれか１つ又は複数の種類の生体試料におけるメチル化レベルの変調をマッピングすることは、個体の状態又は現在使用されている治療的若しくは予防的レジメの有効性についての価値ある指標である。したがって、本発明の方法は、その正常レベル（上記で定義されている）と比べて、又は個体の生体試料から確定された１つ若しくは複数の以前のメチル化レベルと比べて、個体におけるメチル化レベルの増加又は減少についてモニターすることにまで及ぶと理解されるべきである。

新生物を検出するための方法は、１つ又は複数の他のがん関連ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の検出を含むことができる。したがって、本発明の方法によるメチル化の検出は、単独で又は新生物の診断若しくは予後のための他のスクリーニング法と組み合わせて使用することが可能である。

ＤＮＡメチル化を検出するためのいかなる方法も、本発明の方法において使用することができる。いくつかの方法が、原発組織試料における又は血液、尿、糞便若しくは唾液などの患者試料における特定の遺伝子座での差異的にメチル化されたＤＮＡの検出に利用することが可能である（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｈａｎｓｅｎ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．５５：１４７１〜８３頁、２００９年；Ａｍｍｅｒｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１７９０：８４７〜６２頁、２００９年；Ｓｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２５１：１８７〜９８頁、２００７年；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．１：２３５３〜６４頁、２００６年に概説されている）。標的遺伝子のＤＮＡメチル化の割合又は程度の分析では、ＤＮＡは通常、亜硫酸水素ナトリウムで処理され、対象の領域は、ＤＮＡのメチル化状態とは無関係に増幅するプライマー及びＰＣＲ条件を使用して増幅される。次に、全体のアンプリコン又は個々のＣｐＧ部位のメチル化は、パイロシーケンス、制限酵素消化（ＣＯＢＲＡ）を含む塩基配列決定により又は融解曲線解析により評価することが可能である。代わりに、特定のＣｐＧ部位でのメチル化の分析のための連結反応による方法を使用し得る。腫瘍から体液中に放出された異常にメチル化されたＤＮＡの検出はがん診断の手段として開発中である。ここでは、高度メチル化された配列の場合、メチル化されていない正常細胞ＤＮＡの背景からのメチル化されたＤＮＡ配列の選択的増幅を可能にする感度の良い方法を使用する必要がある。亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡに基づくそのような方法には、たとえば、メチル化選択ＰＣＲ（ＭＳＰ）、Ｈｅａｖｙｍｅｔｈｙｌ ＰＣＲ、ヘッドループ（Ｈｅａｄｌｏｏｐ）ＰＣＲ及びヘルパー依存性（Ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）連鎖反応（ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１４７５）が含まれる。

手短に言えば、いくつかの実施形態では、メチル化を検出するための方法は、ゲノムＤＮＡを無作為に剪断する又は無作為に断片化し、メチル化依存性又はメチル化感受性制限酵素でＤＮＡを切断し、それに続いて切断された又は切断されていないＤＮＡを選択的に同定する及び／又は分析することを含む。選択的同定には、たとえば、切断されたＤＮＡと切断されていないＤＮＡを分離し（たとえば、サイズにより）、切断された又は切断されていない対象の配列を定量化することを含むことができる。たとえば、米国特許第７，１８６，５１２号を参照されたい。また、この方法は、制限酵素消化後無傷のＤＮＡを増幅し、それによって増幅された領域において制限酵素により切断されなかったＤＮＡのみを増幅することを包含することができる。たとえば、米国特許出願第１０／９７１，９８６号、米国特許出願第１１／０７１，０１３号及び米国特許出願第１０／９７１，３３９号を参照されたい。いくつかの実施形態では、増幅は、遺伝子特異的であるプライマーを使用して実施することができる。代わりに、アダプターを無作為に断片化されたＤＮＡの端部に付加することができ、このＤＮＡはメチル化依存性又はメチル化感受性制限酵素で消化することができ、無傷のＤＮＡは前記アダプター配列にハイブリダイズするプライマーを使用して増幅することができる。この場合、ＤＮＡの増幅されたプールにおいて特定の遺伝子の存在、非存在又は量を決定する第２のステップを実施することができる。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡはリアルタイム定量的ＰＣＲを使用して増幅される。

いくつかの実施形態では、前記方法は、ゲノムＤＮＡの集団内の標的配列における平均メチル化密度を定量化することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、遺伝子座における潜在的制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されないままであることを可能にする条件下で、ゲノムＤＮＡをメチル化依存性制限酵素又はメチル化感受性制限酵素に接触させ、前記遺伝子座の無傷のコピーを定量化し、増幅された産物の量を対照ＤＮＡのメチル化の量を表す対照値と比較し、それによって前記対照ＤＮＡのメチル化密度と比べた前記遺伝子座における平均メチル化密度を定量化することを含む。

ＤＮＡの遺伝子座のメチル化の量は、前記遺伝子座を含むゲノムＤＮＡの試料を提供し、前記ＤＮＡをメチル化感受性又はメチル化依存性である制限酵素で切断し、次に無傷のＤＮＡの量を定量化する又は対象のＤＮＡ遺伝子座で切断されたＤＮＡの量を定量化することにより決定することができる。無傷の又は切断されたＤＮＡの量は、前記遺伝子座を含有するゲノムＤＮＡの最初の量、前記遺伝子座におけるメチル化の量、及び前記ゲノムＤＮＡにおいてメチル化されている遺伝子座におけるヌクレオチドの数（すなわち、割合）に依存することになる。ＤＮＡ遺伝子座におけるメチル化の量は、無傷のＤＮＡ又は切断されたＤＮＡの量を同様な処理を受けたＤＮＡ試料における無傷のＤＮＡ又は切断されたＤＮＡの量を表す対照値と比較することにより決定することができる。対照値は、メチル化されたヌクレオチドの既知の又は予想される数を表すことができる。代わりに、対照値は、別の（たとえば、正常な、非疾患）細胞における同じ遺伝子座又は第二の遺伝子座由来の無傷の又は切断されたＤＮＡの量を表すことができる。

遺伝子座における潜在的制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されないままであることを可能にする条件下で、少なくとも１つのメチル化感受性又はメチル化依存性制限酵素を使用し、それに続いて残っている無傷のコピーを定量化し、その量を対照と比較することにより、遺伝子座の平均メチル化密度を決定することができる。メチル化感受性酵素は、その認識配列がメチル化されていなければＤＮＡを切断する酵素であり、メチル化依存性酵素は、その認識配列がメチル化されているとＤＮＡを切断する。メチル化感受性制限酵素を、遺伝子座における潜在的制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されないままであることを可能にする条件下で、ＤＮＡ遺伝子座のコピーに接触させるならば、残っている無傷のＤＮＡはメチル化密度に正比例することになり、したがって、対照と比較して、試料中の遺伝子座の相対的メチル化密度を決定し得る。同様に、メチル化依存性制限酵素を、遺伝子座における潜在的制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されないままであることを可能にする条件下で、ＤＮＡ遺伝子座のコピーに接触させるならば、残っている無傷のＤＮＡはメチル化密度に反比例することになり、したがって、対照と比較して、試料中の遺伝子座の相対的メチル化密度を決定し得る。そのようなアッセイは、たとえば、米国特許出願第１０／９７１，９８６号に開示されている。

上記方法のためのキットは、たとえば、メチル化依存性制限酵素、メチル化感受性制限酵素、増幅（たとえば、ＰＣＲ）試薬、プローブ及び／又はプライマーのうちの１つ又は複数を含むことができる。

定量的増幅法（たとえば、定量的ＰＣＲ又は定量的線形増幅）を使用して、制限消化に続いて、増幅プライマーが隣接する遺伝子座内の無傷のＤＮＡの量を定量化することができる。定量的増幅の方法は、たとえば、米国特許第６，１８０，３４９号、米国特許第６，０３３，８５４号及び米国特許第５，９７２，６０２号、並びにたとえば、Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５〜１００１頁（１９９６）；ＤｅＧｒａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３４（１）：１０６〜１０頁、１１２〜５頁（２００３）；Ｄｅｉｍａｎ Ｂ、ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（２）：１６３〜７９頁（２００２）に開示されている。増幅は「リアルタイム」でモニターし得る。

ＤＮＡメチル化を検出するための追加の方法は、ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する前及び後のゲノム配列決定を含むことができる。たとえば、Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７〜１８３１頁（１９９２）を参照されたい。亜硫酸水素ナトリウムをＤＮＡに接触させると、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、メチル化されたシトシンは改変されない。

いくつかの実施形態では、亜硫酸水素塩変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化を使用して、ＤＮＡメチル化を検出する。たとえば、Ｓａｄｒｉ＆Ｈｏｒｎｓｂｙ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０５８〜５０５９頁（１９９６）；Ｘｉｏｎｇ＆Ｌａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２〜２５３４頁（１９９７）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」）反応は、単独で又はＤＮＡメチル化を検出する他の方法と組み合わせて使用される。ＭＳＰアッセイは、亜硫酸水素ナトリウムによるＤＮＡの最初の改変、すべての非メチル化であるがメチル化されないシトシンのウラシルへの変換、及びメチル化対非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを用いたそれに続く増幅を必要とする。Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１〜９８２６頁、（１９９６）；米国特許第５，７８６，１４６号を参照されたい。

いくつかの実施形態では、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイは、単独で又はＤＮＡメチル化を検出する他の方法と組み合わせて使用される（Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２〜２３０６頁（１９９９）参照）。手短に言えば、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔプロセスでは、ゲノムＤＮＡは亜硫酸水素ナトリウム反応において変換される（亜硫酸水素塩プロセスは非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する）。次に、対象のＤＮＡ配列の増幅は、ＣｐＧジヌクレオチドにハイブリダイズするＰＣＲプライマーを使用して実施される。メチル化されたＤＮＡの亜硫酸水素塩変換から生じる配列（又は代わりに非メチル化配列）のみにハイブリダイズするプライマーを使用することにより、増幅は前記プライマーがハイブリダイズする配列のメチル化状態を示すことができる。さらに、増幅産物は、メチル化（又は非メチル化）ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理から生じる配列に特異的に結合するプローブを用いて検出することができる。必要であれば、プライマーとプローブの両方を使用してメチル化状態を検出することが可能である。したがって、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔで使用するためにキットは、亜硫酸水素ナトリウム及び、亜硫酸水素塩で処理されているメチル化されたＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを区別するプライマー又は検出可能的に標識されたプローブ（Ｔａｑｍａｎ又は分子ビーコンプローブを含むがこれらに限定されない）を含むことができる。他のキット成分は、たとえば、ＰＣＲバッファー、デオキシヌクレオチド及び熱安定ポリメラーゼを含むがこれらに限定されない、ＤＮＡの増幅に必要な試薬を含むことができる。

いくつかの実施形態では、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性一塩基プライマー伸長）反応は、単独で又はＤＮＡメチル化を検出する他の方法と組み合わせて使用される（Ｇｏｎｚａｌｇｏ＆Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９〜２５３１頁（１９９７）参照）。Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理、続いて一塩基プライマー伸長に基づいて特定のＣｐＧ部位でのメチル化の差を評価するための定量的方法である（Ｇｏｎｚａｌｇｏ＆Ｊｏｎｅｓ、上記参照）。手短に言えば、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムと反応させて、５−メチルシトシンは不変のままにして、非メチル化シトシンをウラシルに変換する。次に、目的の標的配列の増幅は、亜硫酸水素塩変換ＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使用して実施され、得られた産物は単離されて対象のＣｐＧ部位（単数又は複数）でのメチル化分析のための鋳型として使用される。

Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ分析のための典型的な試薬（たとえば、典型的なＭｓ−ＳＮｕＰＥベースのキットに見られるような）は、特定の遺伝子（又はメチル化変更されたＤＮＡ配列又はＣｐＧアイランド）のためのＰＣＲプライマー；最適化されたＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；正の対照プライマー；特定の遺伝子のためのＭｓ−ＳＮｕＰＥプライマー；反応バッファー（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応のための）；並びに検出可能的に標識されたヌクレオチドを含むことができるが、これらに限定されない。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬は、ＤＮＡ変性バッファー；スルホン化バッファー；ＤＮＡ回収試薬又はキット（たとえば、沈殿、限外濾過、親和性カラム）；脱スルホン化バッファー；及びＤＮＡ回収成分を含み得る。

追加のメチル化検出法には、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７〜１２（１９９９）参照）、たとえば、米国特許出願公開第２００５／００６９８７９号；Ｒｅｉｎ、ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６（１０）：２２５５〜６４（１９９８）；Ｏｌｅｋ、ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７（３）：２７５〜６（１９９７）；及びＰＣＴ出願公開ＷＯ ００／７００９０に記載されている方法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ ＰＣＴ並びにヘルパー依存性連鎖反応が含まれるが、これらに限定されない。

これらの一般的に記載されている方法のいくつかに関するさらに詳細な情報は以下に提供される、
（ａ）プローブ又はプライマー設計及び／又は生成
新生物の診断のための本明細書に記載されるいくつかの方法は、１つ又は複数のプローブ及び／又はプライマーを使用する。たとえば、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションにおいて使用するためのプローブ及び／又はプライマーを設計するための方法は当技術分野では公知であり、たとえば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（Ｅｄｓ）（Ｉｎ：ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＮＹ．１９９５）に記載されている。さらに、種々のアッセイのための最適プローブ及び／又はプライマーを設計するいくつかのソフトウェアパッケージ、たとえば、ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡから入手可能なＰｒｉｍｅｒ３が公開されている。

明らかに、プローブ又はプライマーの潜在的使用はその設計中に検討するほうがよい。たとえば、プローブ又はプライマーがメチル化特異的ＰＣＲ又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）アッセイにおいて使用するために生成されるとすれば、３’端部（又はＬＣＲの場合は５’端部）のヌクレオチドは好ましくは核酸中のメチル化されたヌクレオチドに一致するほうがよい。

新生物に関連する配列の検出に有用なプローブ及び／又はプライマーは評価されて、ヘアピンを形成することも、セルフプライムすることも、（たとえば、検出アッセイにおいて使用される別のプローブ又はプライマーと）プライマーダイマーを形成することもないプローブ及び／又はプライマーを決定する。さらに、プローブ又はプライマー（又はその配列）は評価されて、それが標的核酸から変性する温度（すなわち、プローブ若しくはプライマーの融解温度又はＴｍ）を決定する場合が多い。Ｔｍを推定するための方法は当技術分野では公知であり、たとえば、Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１４６０〜１４６５頁、１９９５年又はＢｒｅｓｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：３７４６〜３７５０頁、１９８６年に記載されている。

本発明のプローブ又はプライマーを生成する／合成するための方法は当技術分野では公知である。たとえば、オリゴヌクレオチド合成は、Ｇａｉｔ（Ｅｄ）（Ｉｎ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４年）に記載されている。たとえば、プローブ又はプライマーは、生物学的合成により（たとえば、制限エンドヌクレアーゼを用いた核酸の消化により）又は化学合成により得られる。短い配列では（約１００ヌクレオチドまで）、化学合成が好ましい。

もっと長い配列では、たとえば、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１０１，２０〜７８頁、１９８３年により記載される一本鎖ＤＮＡのためのＭ１３の使用などの、分子生物学で用いられる標準複製法が有用である。オリゴヌクレオチド合成のための他の方法には、たとえば、リン酸トリエステル及びリン酸ジエステル法（Ｎａｒａｎｇ、ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ ６８：９０頁、１９７９年）及び支持体上での合成（Ｂｅａｕｃａｇｅ、ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９〜１８６２頁、１９８１年）並びにホスホロアミド酸法、Ｃａｒｕｔｈｅｒ，Ｍ．Ｈ．、ｅｔ ａｌ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌ．１５４、２８７〜３１４頁（１９８８）、並びに「ＤＮＡとＲＮＡの合成と適用（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ）」、Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ ｅｄｉｔｏｒ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年及びそこに引用される参考文献に記載される他の方法が含まれる。ロックド核酸（ＬＮＡ）を含むプローブは、たとえば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．、１：３４２３頁、１９９７年；Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ、Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．１２４７頁、１９９８年に記載される通りに合成される。その上、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むプローブは、たとえば、Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：１８９５頁、１９９２年；Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６頁、１９９３年；及びＯｒｕｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：５３３２頁、１９９３年に記載される通りに合成される。

（ｂ）ＤＮＡのメチル化感受性エンドヌクレアーゼ消化
一例では、試料中のメチル化の増加は、核酸が消化されるのに十分な条件下で一定量のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ酵素で核酸を処理し、次に生成された断片を検出することを含むプロセスを使用して決定される。例となるメチル化感受性エンドヌクレアーゼには、たとえば、ＨｈａＩ又はＨｐａＩＩが含まれる。好ましくは、アッセイは、用いられるメチル化感受性酵素と同じ特異性を有するメチル化非感受性酵素で消化される内部標準を含む。たとえば、メチル化非感受性酵素ＭｓｐＩは、メチル化感受性酵素ＨｐａＩＩのイソ制限酵素である。

ハイブリダイゼーションアッセイフォーマット
一例では、核酸の消化は未消化核酸へのプローブ又はプライマーの選択的ハイブリダイゼーションにより検出される。代わりに、プローブは消化された核酸と未消化核酸の両方に選択的にハイブリダイズするが、たとえば、電気泳動により両方の形態の区別を促進する。ハイブリダイゼーションプローブへの選択的ハイブリダイゼーションを達成するのに適切な検出法には、たとえば、サザン又は他の核酸ハイブリダイゼーションが含まれる（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４、７４２１〜７４２７頁、１９９４年；Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７、５９４〜５９９頁、１９９７年）。

適切なハイブリダイゼーション条件は、プローブを含む核酸二重鎖の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定される。いくつかの一般論を適用することは可能であるが、最適ハイブリダイゼーション反応条件はプローブごとに経験的に決定するほうがよいことは当業者であれば知っている。好ましくは、短いオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションは、低いから中程度の厳密性で実施される。ＧＣリッチプローブ若しくはプライマー又はもっと長いプローブ若しくはプライマーの場合には、高厳密性ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄が好ましい。高厳密性は本明細書では、約０．１×ＳＳＣバッファー及び／若しくは約０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ若しくはさらに低い塩濃度において、並びに／又は少なくとも６５℃の温度若しくは同等の条件で実施されるハイブリダイゼーション及び／又は洗浄であると定義される。特定レベルの厳密性への本明細書での言及は、当業者には公知のＳＳＣ以外の洗浄／ハイブリダイゼーション溶液を使用する同等の条件を包含する。

本例に従えば、試験試料及び負の対照試料のために生成される断片の差異は対象が新生物を有することを示している。同様に、対照試料が、腫瘍、がん組織又はがん細胞若しくは前がん細胞のデータを含む場合、試験試料と対照試料間の類似性は、必ずしも絶対的同一性ではないとしても、陽性診断（すなわち、がん）を示している。

増幅アッセイフォーマット
別の例では、制限酵素により生成される断片は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、逆ポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）、インサイツＰＣＲ（Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６８７頁、１９９０年）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）又はサイクリングプローブ技術などの増幅システムを使用して検出される。

ＰＣＲの方法は当技術分野では公知であり、たとえば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．（ｓｅｒｉｅｓ ｅｄｓ、Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｏｘｆｏｒｄ．１〜２５３頁、１９９１年により、及びＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（ｅｄ） ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（ｅｄ）（Ｉｎ：ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＮＹ、１９９５年）により記載されており、前記内容はそれぞれが参照によりその全体を組み込まれている。一般に、ＰＣＲでは、少なくとも約１８ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも２０〜３０ヌクレオチド長を含む２つの非相補的核酸プライマー分子は、核酸鋳型分子の異なる鎖にそのそれぞれのアニーリング部位でハイブリダイズされ、アニーリング部位に介在する鋳型の特定の核酸分子コピーは酵素的に増幅される。増幅産物は、たとえば、電気泳動及び核酸に結合する検出可能マーカーを用いる検出を使用して検出し得る。代わりに、オリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数は検出可能なマーカー（たとえば、フルオロフォア）で標識され、増幅産物は、たとえば、ライトサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を使用して検出される。

鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼを利用して標的配列を増幅する。オリゴヌクレオチドは標的核酸にハイブリダイズされ、ポリメラーゼを使用してプライマーアニーリング部位に介在する領域のコピーを生成する。次に、コピーされた核酸と標的核酸の二重鎖は、コピーされた核酸の始まりの配列を特異的に認識するエンドヌクレアーゼで切れ目が入れられる。ＤＮＡポリメラーゼは切れ目を入れられたＤＮＡを認識し、同時に標的領域の別のコピーを生成して、すでに生成されている核酸を置換する。ＳＤＡの利点は、それが等温フォーマットで起こり、それによってハイスループット自動分析を促進することである。

サイクリングプローブ技術は、標的配列にハイブリダイズすることができるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡを含むキメラ合成プライマーを使用する。標的配列にハイブリダイズすると、形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖はリボヌクレアーゼＨの標的となり、それによってプライマーを切断する。次に、切断されたプライマーは、たとえば、質量分析又は電気泳動により検出される。

メチル化感受性エンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する又は近接しているプライマーでは、そのようなプライマーは新生物において高度メチル化されている部位のみに隣接して確実に診断増幅産物が生成されるようにすることが好ましい。この点に関して、増幅産物は制限部位が切断されない場合、すなわち、制限部位がメチル化される場合のみ生成されることになる。したがって、増幅産物の検出は対象のＣｐＧジヌクレオチド（単数又は複数）がメチル化されていることを示している。

当業者には公知であるように、増幅産物の正確な長さは、プライマー間の距離に応じて変動する。明らかに、それぞれのジヌクレオチドがメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ部位の中に存在すれば、この形式の分析を使用して複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を確定し得る。これらの方法では、プライマーのうちの１つ又は複数を検出可能なマーカー、たとえば、蛍光標識（たとえば、Ｃｙ５又はＣｙ３）又は放射性同位元素（たとえば、^３２Ｐ）で標識して、増幅された核酸の急速検出を促進し得る。

増幅された核酸は、一般に、たとえば、未変性アガロースゲル電気泳動、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析、液体クロマトグラフィー（たとえば、ＨＰＬＣ又はｄＨＰＬＣ）又はキャピラリー電気泳動（たとえば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を使用して分析される。たとえば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、質量分析（タンデム質量分析、たとえば、ＬＣ ＭＳ／ＭＳを含む）、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバーオプティックス技術又はＤＮＡチップ技術（たとえば、国際公開第９８／４９５５７号パンフレット；国際公開第９６／１７９５８号パンフレット；Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ７６７〜７７３頁、１９９１年；米国特許第５，１４３，８５４号及び米国特許第５，８３７，８３２号、これら文献の内容はすべてが参照により本明細書に組み込まれる）などのハイスループット検出法は、本明細書に記載されるすべてのアッセイフォーマットのために特に好ましい。代わりに、核酸の増幅は、本明細書及び／又はたとえば、米国特許第６，１７４，６７０号に記載される融解曲線分析法を使用して絶えずモニターし得る（前記特許文献は参照により本明細書に組み込まれる）。

（ｃ）他のアッセイフォーマット
別の例では、試料におけるメチル化の増加は、核酸が消化されるのに十分な条件下で核酸を含有するクロマチンを一定量のデオキシリボヌクレアーゼＩで処理し、次に生成された断片を検出することを含むプロセスを実施することにより決定される。このアッセイフォーマットは、メチル化されたＤＮＡ、たとえば、高度メチル化されたＤＮＡを含有するクロマチンは、非高度メチル化ＤＮＡよりも密に閉ざされた立体構造を有し、結果として、デオキシリボヌクレアーゼＩによるエンドヌクレアーゼ消化に感受性が低いという理解に基づいている。

この方法に従えば、長さの異なるＤＮＡ断片は、非メチル化ＤＮＡと比べたメチル化されたＤＮＡのデオキシリボヌクレアーゼＩ消化により生成される。そのような異なったＤＮＡ断片は、たとえば、以前記載されたアッセイを使用して検出される。代わりに、ＤＮＡ断片は、基本的には、たとえば、Ｇｒｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｆｅｉｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７、ｅ３２ｉ〜ｅ３２ｉｖ、１９９９年に記載されているＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用して検出される。ＰＣＲ−ＳＳＣＰを本発明に適応させる際、新生物試料ではデオキシリボヌクレアーゼＩ消化に抵抗性であるが健康な／正常な対照又は健康な／正常な試験試料ではデオキシリボヌクレアーゼＩ消化に抵抗性ではない核酸中の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接する又は含む増幅プライマーを使用して、デオキシリボヌクレアーゼＩ生成される断片を増幅する。この場合、デオキシリボヌクレアーゼＩを使用した特定の核酸断片の生成は新生物の診断に役立つ。なぜならば、ＤＮＡは効率的には分解されないからである。これとは対照的に、健康な／正常な対象試料由来の鋳型ＤＮＡはデオキシリボヌクレアーゼＩの作用により分解され、結果として、増幅は別々の増幅産物を生成することができない。たとえば、ＰＣＲ−ｄＨＰＬＣなどのＰＣＲ−ＳＳＣＰに代わる方法も当技術分野では公知であり、本発明により企図されている。

（ｄ）非メチル化ＤＮＡの選択的変異誘発
別の方法では、試料中のメチル化の増加は、変異誘発を誘導するのに十分な条件下でＣｐＧジヌクレオチド内の非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理することを含むプロセスを使用して決定される。

たとえば、亜硫酸水素の塩、たとえば、亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸水素カリウムなどの好ましい化合物はシトシンをウラシル又はチミジンに変異させる（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、１８２７〜１８３１頁、１９９２年）。ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理は、ＣｐＧジヌクレオチド内にはない又はメチル化を受けないＣｐＧジヌクレオチド内に位置するシトシン残基を含む、メチル化により保護されないシトシン残基を変異させることにより、メチル化されたシトシン残基を非メチル化シトシン残基と区別することが知られている。

配列ベースの検出
一例では、１つ若しくは複数の変異ヌクレオチドの存在又は変異配列の数は変異ＤＮＡの塩基配列決定により決定される。一形態の分析は、本明細書に記載される増幅反応、たとえば、ＰＣＲを使用して変異核酸を増幅することを含む。次に、増幅された産物は直接塩基配列決定される又はクローニングされ、クローニングされた産物は塩基配列決定される。ＤＮＡを塩基配列決定するための方法は当技術分野では公知であり、たとえば、ジデオキシ連鎖終止法又はマクサムギルバート法が含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．、ＣＳＨＰ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９年）又はＺｙｓｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、１９８８年）参照）。

たとえば、亜硫酸水素塩などの化合物で核酸を処理することにより非メチル化シトシンがウラシル（したがって、増幅過程後にチミジン）に変異されるので、配列の分析によりメチル化されたヌクレオチドの存在又は非存在が決定される。たとえば、対照試料若しくは亜硫酸水素塩で処理されていない試料を使用して得られる配列又は対象の領域の既知のヌクレオチド配列を処理された試料と比較することにより、ヌクレオチド配列の差異の検出が促進される。対照又は未処理の試料と比べられた処理された試料におけるシトシンの部位で検出されたどんなチミン残基も、亜硫酸水素塩処理の結果としての変異により引き起こされると見なし得る。亜硫酸水素塩処理された核酸の塩基配列決定を使用するメチル化の検出に適した方法は、たとえば、Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、１８２７〜１８３１頁、１９９２年又はＣｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２９９０〜２９９７頁、１９９４年に記載されている。

別の方法では、亜硫酸水素塩処理された試料における変異した又は非変異ヌクレオチドの存在は、たとえば、Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３：４０７２〜４０７９頁、２００２年に記載されているなどのピロシーケンスを使用して検出される。基本的に、この方法は、メチル化されているシトシンの部位に隣接する又は近い部位にハイブリダイズするプライマーを使用するリアルタイム塩基配列決定の一種である。ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのプライマーと鋳型のハイブリダイゼーションに続いて、４種の改変されたデオキシヌクレオチド三リン酸のそれぞれがあらかじめ決められた分配順に従って別々に付加される。亜硫酸水素塩処理された試料に相補的である付加されるヌクレオチドのみが組み込まれ、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）が遊離される。次に、ＰＰｉは反応を推進し、検出可能レベルの光を発生する。そのような方法により、プライマーのハイブリダイゼーション部位に隣接する特定のヌクレオチドの種類を決定することができる。

固相ピロシーケンスの方法は当技術分野では公知であり、たとえば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、８（８）：７６９〜７７６頁、１９９８年に概説されている。そのような方法により、いくつかのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化のハイスループット検出が可能になる。

亜硫酸水素塩処理されたヌクレオチドの配列を決定するための関連する方法は、メチル化感受性一塩基プライマー伸長（Ｍｅ−ＳｎｕＰＥ）又はＳＮａＰｍｅｔｈである。適切な方法は、たとえば、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：２５２９〜２５３１頁又はＵｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３：４０７２〜４０７９頁、２００２年に記載されている。メチル化されているシトシンの部位に隣接する核酸の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが使用される。次に、このオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ及び亜硫酸水素塩処理に続いてこの部位に存在する考えられる塩基（すなわち、チミン又はシトシン）のうちのどちらか又はいずれにでも一致する遊離のヌクレオチド二リン酸又はジデオキシヌクレオチド三リン酸を用いるプライマー伸長プロトコールにおいて使用される。好ましくは、ヌクレオチド−二リン酸は検出可能なマーカー（たとえば、フルオロフォア）で標識される。プライマー伸長に続いて、非結合の標識されたヌクレオチド二リン酸は、たとえば、サイズ排除クロマトグラフィー若しくは電気泳動を使用して取り除かれる、又はたとえば、アルカリホスファターゼを使用して加水分解され、標識されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの取り込みが検出され、前記部位に存在する塩基が示される。

明らかに、他のハイスループット塩基配列決定法は本発明に包含されている。そのような方法には、たとえば、固相ミニシークエンシング（たとえば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３：１００８〜１０１７頁、１９９２年に記載されている）、又はＦＲＥＴを用いるミニシークエンシング（たとえば、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｋｗｏｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３４７〜３５３頁、１９９７年に記載されている）が含まれる。

制限エンドヌクレアーゼベースのアッセイフォーマット
一方法では、非変異配列の存在は、基本的にＸｉｏｎｇ ａｎｄ Ｌａｉｒｄ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：２５３２〜２５３４頁、２００１年に記載されている組合せ亜硫酸水素塩制限分析（ＣＯＢＲＡ）を使用して検出される。この方法は、非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる化合物、たとえば、亜硫酸水素塩を用いた処理後メチル化された核酸と非メチル化核酸間の制限酵素認識部位の差異を利用する。

亜硫酸水素塩処理に続いて、メチル化され制限エンドヌクレアーゼ認識配列に含まれる１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む対象の領域は、本明細書に記載される増幅反応、たとえば、ＰＣＲを使用して増幅される。次に、増幅産物を、切断が起こるのに十分な時間及び条件下で、ＣｐＧジヌクレオチドの部位で切断する制限酵素に接触させる。制限部位はメチル化の存在又は非存在を示すように選択され得る。たとえば、制限エンドヌクレアーゼＴａｑＩは配列ＴＣＧＡを切断するが、非メチル化核酸の亜硫酸水素塩処理に続いて、配列はＴＴＧＡになり、結果として、切断されなくなる。次に、消化及び／又は未消化核酸は、たとえば、電気泳動及び／又は質量分析などの、当技術分野で公知の検出手段を使用して検出される。核酸の切断又は非切断は対象におけるがんを示している。明らかに、この方法は、がんの診断のための陽性読出し又は陰性読出しシステムにおいて用い得る。

陽性読出しアッセイフォーマット
一実施形態では、本発明のアッセイフォーマットは、たとえば、亜硫酸水素塩で処理された試料由来のＤＮＡが陽性シグナルとして検出される陽性読出しシステムを含む。好ましくは、健康な又は正常な対照対象由来の非高度メチル化ＤＮＡは検出されない又は微弱にしか検出されない。

好ましい実施形態では、対象試料におけるメチル化の増加は、
（ｉ）変異誘発を誘導するのに十分な条件下で非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理し、それによって変異核酸を生成するステップ、
（ｉｉ）非変異核酸への選択的ハイブリダイゼーションが起こるような条件下でメチル化されたシトシン残基を含む配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブ又はプライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、及び
（ｉｉｉ）選択的ハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含むプロセスを使用して決定される。

この状況では、用語「選択的ハイブリダイゼーション」は、非変異核酸へのプローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションが、対応する変異配列への同じプローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションよりも高い頻度若しくは速度で起こる、又は高い最大反応速度を有することを意味する。好ましくは、プローブ又はプライマーは、使用される反応条件下では変異（単数又は複数）を担持する非メチル化配列にはハイブリダイズしない。

ハイブリダイゼーションベースのアッセイフォーマット
一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、サザン、ドットブロット、スロットブロット又は他の核酸ハイブリダイゼーション手段を使用して検出される（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７４２１〜７４２７頁、１９９４年；Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７、５９４〜５９９頁、１９９７年）。適切なプローブ選択を条件として、そのようなアッセイフォーマットは、本明細書において上に一般的に記載されており、現在記載されている選択的変異誘発アプローチを準用する。

好ましくは、リガーゼ連鎖反応フォーマットを用いて、変異と非変異核酸の区別をする。リガーゼ連鎖反応（ＥＰ３２０，３０８及び米国特許第４，８８３，７５０号に記載されている）は、標的核酸に並置されるように標的核酸にアニールする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブを使用する。リガーゼ連鎖反応アッセイでは、標的核酸は、診断プローブが実質的に標的核酸のみに結合したままである条件下で、標的配列、たとえば、１つ又は複数のメチル化されたＣｐＧジヌクレオチド（単数又は複数）を含む核酸の診断部分に相補的である第一のプローブ（診断プローブ）、及び診断部分に近接しているヌクレオチド配列に相補的である第二のプローブ（近接プローブ）にハイブリダイズされる。診断及び近接プローブは、ハイブリダイゼーションの厳密性を調整して標的へのその選択的ハイブリダイゼーションが可能になるように、長さが異なり及び／又は異なる融解温度を有することができ、融解温度が高いほうのプローブはより高い厳密性でハイブリダイズされ、未結合及び／又は非選択的に結合したプローブを洗浄して取り除くことに続いて融解温度が低いほうのもう一方のプローブはより低い厳密性でハイブリダイズされる。次に、診断プローブと近接プローブは、たとえば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してなどの共有結合的にライゲートされて、それによって標的配列に相補的であるより大きな標的プローブを生成し、ライゲートされないプローブはハイブリダイゼーション厳密性を変更することにより取り除かれる。この点に関して、ライゲートされなかったプローブは、ライゲートされたプローブよりも低い厳密性ハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズすることになる。したがって、長いほうのプローブを、好ましくは、ライゲーションに続いて短いほうのプローブにより与えられる増加した長さに起因するより高い厳密性でハイブリダイズさせるのに使用される厳密性と少なくとも同じくらいの高さの厳密性までハイブリダイゼーションの厳密性を高めることが可能である。

別の例では、標的−プローブ二重鎖を溶解し、解離したプローブを溶出し、標識（単数又は複数）について試験することにより、標的配列の存在又は非存在を試験することができるように、プローブのうちの１つ又は両方は標識される。両方のプローブが標識される場合、異なるリガンドを使用してライゲートされたプローブと非ライゲートプローブの区別を可能にし、その場合、同じ溶出画分中に両方のプローブが存在すればライゲーション事象が確認される。標的核酸が、たとえば、サザンハイブリダイゼーション、スロットブロット、ドットブロット、又はマイクロチップアッセイフォーマットにおいて固体マトリックスに結合しているならば、診断と近接プローブの両方の存在は直接決定することが可能である。

メチル化特異的マイクロアレイ（ＭＳＯ）も変異と非変異配列を区別するのに有用である。適切な方法は、たとえば、Ａｄｏｒｊａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３０：ｅ２１、２００２年に記載されている。ＭＳＯでは、変異と非変異核酸の両方を増幅させる増幅反応のための鋳型として、非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる化合物（たとえば、亜硫酸水素塩）で処理されている核酸が使用される。増幅は、たとえば、フルオロフォア、たとえば、Ｃｙ３又はＣｙ５などの検出可能標識を含む少なくとも１つのプライマーを用いて実施される。

変異核酸の検出のためのマイクロアレイを生成するために、オリゴヌクレオチドは、たとえば、グラススライド上に、好ましくはある程度重複してスポットされる（たとえば、Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６：５３１〜５３７頁、１９９９年に記載されている）。好ましくは、分析されるＣｐＧジヌクレオチドごとに、２つの異なるオリゴヌクレオチドが使用される。それぞれのオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化又は非メチル化状態を反映する配列Ｎ_２−_１６ＣＧＮ_２−_１６又はＮ_２−_１６ＴＧＮ_２−_１６（Ｎは対象のＣｐＧジヌクレオチドに隣接している又は並置しているヌクレオチドの数である）を含む。

次に、標識された増幅産物は一塩基差異の検出を可能にする条件下、マイクロアレイ上でオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。洗浄して未結合増幅産物を取り除くことに続いて、ハイブリダイゼーションは、たとえば、マイクロアレイスキャナーを使用して検出される。この方法は、多数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定することを可能にするだけではなく、半定量的でもあり、分析されるそれぞれのＣｐＧジヌクレオチドでメチル化の程度を決定することが可能である。１つの試料においてメチル化のある程度の不均一性が存在し得るので、そのような定量化はがんの診断に役立ち得る。

増幅ベースのアッセイフォーマット
別の例では、ハイブリダイゼーションは、増幅システムを使用して検出される。メチル化特異的ＰＣＲフォーマットでは（ＭＳＰ；Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１〜９８２６頁、１９９２年）、ハイブリダイゼーションは亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡを増幅することを含むプロセスを使用して検出される。したがって、中程度及び／又は高厳密性条件下で非変異配列に特異的にアニールする１つ又は複数のプローブ又はプライマーを使用することにより、増幅産物はメチル化されたヌクレオチドを含む試料のみを使用して生成される。亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡの混合物からのメチル化された又は非メチル化成分の選択的増幅のために提供される別のアッセイは、Ｃｏｔｔｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：ｅ１０、２００４年（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ ＰＣＲ）、Ｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ１２７、２００５年（Ｈｅａｄｌｏｏｐ ＰＣＲ）、Ｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ １：９４〜１００頁、２００６年（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ＰＣＲ）及びＰＣＴ／ＡＵ０７／０００３８９（Ｅｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）により提供される。

たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、逆ポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）、インサイツＰＣＲ（Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６８７頁、１９９０年）、鎖置換増幅又はサイクリングプローブ技術などの、本明細書に記載されるいずれの増幅アッセイフォーマットも使用することが可能である。ＰＣＲ技法は、遺伝子変異の検出（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１４３〜１１４７頁、１９９１年）及び対立遺伝子特異的発現の定量化（Ｓｚａｂｏ ａｎｄ Ｍａｎｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：３０９７〜３１０８頁、１９９５年；及びＳｉｎｇｅｒ−Ｓａｍ ｅｔ ａｌ．、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．１：１６０〜１６３頁、１９９２年）のために開発された。そのような技法は、ＰＣＲ生成された鋳型にアニールし、アッセイされる単一ヌクレオチドの５’で直ちに終結する内部プライマーを使用する。そのようなフォーマットは本明細書の上に記載されるリガーゼ連鎖反応と容易に組み合わされる。リアルタイム定量的アッセイフォーマットの使用も有用である。適切なプライマーを選択することを条件として、そのようなアッセイフォーマットは本明細書の上に一般的に記載されており、現在記載されている選択的変異誘発アプローチを準用する。

メチル化特異的融解曲線分析（基本的に、Ｗｏｒｍ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４７：１１８３〜１１８９頁、２００１年に記載されている）も本発明により企図されている。このプロセスは、亜硫酸水素塩処理されたメチル化された又は非メチル化核酸を使用して生成される増幅産物における融解温度の差異を利用する。基本的に、亜硫酸水素塩処理された試料の非差別的増幅が、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する蛍光色素（たとえば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）の存在下で実施される。蛍光をモニターしながら増幅産物の温度を増加することにより、融解特性及びしたがって増幅産物の配列が決定される。蛍光の減少は、増幅産物における少なくともドメインの融解を反映する。蛍光が減少する温度は、増幅された核酸のヌクレオチド配列を示しており、それによって１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドの部位のヌクレオチドを、本発明を使用して増幅される核酸の配列として決定することができる。

本発明は、この実施例を実施するために、たとえば、ＴａｑＭａｎ（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８、７２７６〜７２８０頁、１９９１年；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１、３７６１〜３７６６頁、１９９３年）などのリアルタイム定量型のＰＣＲの使用も包含している。たとえば、Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：Ｅ３２、２０００年のＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ法では、修正されたＴａｑＭａｎアッセイを使用して、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化を検出する。基本的に、この方法は、核酸試料を亜硫酸水素塩で処理し、増幅反応、たとえば、ＰＣＲを使用して、新生物細胞ではメチル化されているが対照試料ではメチル化されていない１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸を増幅させるステップを含む。増幅反応は、３つのオリゴヌクレオチド、対象の領域に隣接するフォワード及びリバースプライマー並びに前記２つのプライマー間で１つ又は複数のメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドの部位にハイブリダイズするプローブの存在下で実施される。プローブは、５’蛍光レポーター及び３’クエンチャー（又は逆にして）で二重に標識される。プローブが無傷の場合、クエンチャー色素はその近接のせいでレポーターの蛍光を吸収する。ＰＣＲ産物へのアニーリングに続いて、プローブは、たとえば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’までのエキソヌクレアーゼ活性により切断される。この切断により、レポーターはクエンチャーから放出され、それによって最初の鋳型メチル化レベルを推定するのに使用することができる増大した蛍光シグナルを生じる。非変異核酸（すなわち、メチル化された核酸）に選択的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを使用することにより、たとえば、標準曲線を使用してメチル化のレベルが決定される。

代わりに、切断を必要とする標識されたプローブを使用するのではなく、たとえば、分子ビーコン．ＴＭ．などのプローブが使用される（たとえば、Ｍｈｌａｎｇａ ａｎｄ Ｍａｌｍｂｅｒｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４６３〜４７１頁、２００１年参照）。分子ビーコンは、ステムループ構造を有する一本鎖核酸分子である。ループ構造は、新生物試料ではメチル化されているが対照試料ではメチル化されていない１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドを囲む領域に相補的である。ステム構造は、プローブ（ループ）のどちら側にもある、互いに相補的な２本の「アーム」をアニールすることにより形成される。蛍光部分は一方のアームに結合しており、分子ビーコンが標的配列に結合していないときにはいかなる検出可能な蛍光も抑制する消光部分はもう一方のアームに結合している。ループ領域がその標的核酸に結合すると、アームは分離され蛍光が検出可能になる。しかし、単一の塩基ミスマッチでさえ、試料において検出される蛍光のレベルを著しく変える。したがって、特定の塩基の存在又は非存在は、検出される蛍光のレベルにより決定される。そのようなアッセイは、核酸における１つ又は複数の非変異部位（すなわち、メチル化されたヌクレオチド）の検出を促進する。

蛍光的に標識されたロックド核酸（ＬＮＡ）分子又は蛍光的に標識されたタンパク質−核酸（ＰＮＡ）分子は、ヌクレオチド差異の検出に有用である（たとえば、Ｓｉｍｅｏｎｏｖ ａｎｄ Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０（１７）：１〜５頁、２００２年）。ＬＮＡ及びＰＮＡ分子は、核酸、特にＤＮＡに高親和性で結合する。ＬＮＡ又はＰＮＡプローブにコンジュゲートしたフルオロフォア（特に、ローダミン又はヘキサクロロフルオレセイン）は、標的核酸に前記プローブがハイブリダイズすると著しく大きなレベルで蛍光を発する。しかし、一つのヌクレオチドミスマッチでも存在すると、蛍光の増加レベルは同一レベルにまで増強されなくなる。したがって、試料において検出される蛍光の程度は、メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドにおける変異シトシンの存在下などのＬＮＡ又はＰＮＡプローブと標的核酸間のミスマッチの存在を示している。好ましくは、蛍光的に標識されたＬＮＡ又はＰＮＡ技術を使用して、たとえば、当技術分野で公知の及び／又は本明細書に記載される増幅法を使用してすでに増幅されている核酸における少なくとも一塩基変化を検出する。

当業者には明らかになるように、ＬＮＡ又はＰＮＡ検出技術は、Ｏｒｕｍ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１８９８〜１９０５頁、１９９９年に記載されるように、ＬＮＡ又はＰＮＡプローブを固体支持体に固定化することにより、１つ又は複数のマーカーのハイスループット検出を受け入れることができる。

代わりに、たとえば、いわゆるＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌアッセイ（Ｃｏｔｔｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：ｅ１０、２００４年）などのリアルタイムアッセイを使用して、試験試料における核酸のメチル化の存在又はレベルを決定する。基本的に、この方法では、メチル化特異的な形で亜硫酸水素塩処理された核酸に結合する１つ又は複数の非伸長可能核酸（たとえば、オリゴヌクレオチド）ブロッカーが使用される（すなわち、ブロッカー（単数又は複数）は中程度から高厳密性条件下で未変異ＤＮＡに特異的に結合する）。増幅反応は、任意選択でメチル化特異的であってもよいが１つ又は複数のブロッカーに隣接する１つ又は複数のプライマーを使用して実施される。非メチル化核酸（すなわち、非変異ＤＮＡ）の存在下で、ブロッカー（単数又は複数）は結合し、ＰＣＲ産物は生成されない。基本的に上に記載される通りにＴａｑＭａｎアッセイを使用して、試料における核酸のメチル化レベルが決定される。

非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる化合物を用いた処理に続いてメチル化された核酸を検出するための他の増幅ベースの方法には、たとえば、メチル化特異的一本鎖立体構造分析（ＭＳ−ＳＳＣＡ）（Ｂｉａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．、１４：２８９〜２９３頁、１９９９年）、メチル化特異的変性勾配ゲル電気泳動（ＭＳ−ＤＧＧＥ）（Ａｂｒａｍｓ ａｎｄ Ｓｔａｎｔｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１２：７１〜７４頁、１９９２年）及びメチル化特異的変性高速液体クロマトグラフィー（ＭＳ−ＤＨＰＬＣ）（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ、Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１２：１７１〜１９１頁、２０００年）が含まれる。これらの方法のそれぞれで、ヌクレオチド配列及び／又は二次構造における差異に基づいて増幅産物における核酸差異を検出するための異なった技法が使用される。そのような方法は、明らかに本発明により企図されている。

他の増幅ベースのアッセイフォーマットの場合と同じように、増幅産物は、ゲル電気泳動、ゲル濾過、質量分析を含む様々な手法を使用して、標識されたプライマーの場合には、増幅産物における標識を同定することにより、分析される、別の実施形態では、亜硫酸水素塩変換されたＤＮＡから増幅されるＰＣＲ産物の制限酵素消化は、基本的に、Ｓａｄｒｉ ａｎｄ Ｈｏｒｎｓｂｙ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０５８〜５０５９頁、１９９６年；及びＸｉｏｎｇ ａｎｄ Ｌａｉｒｄ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、２５３２〜２５３４頁、１９９７年により記載される通りに実施されて、形成される産物を分析する。

たとえば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、質量分析（タンデム質量分析、たとえば、ＬＣ ＭＳ／ＭＳを含む）、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバーオプティクス技術又はＤＮＡチップ技術などのハイスループット検出法を用いることも可能である。

ハイブリダイゼーション及び／又は増幅検出システムを利用する本明細書に記載されるその他のアッセイフォーマットの場合と同じように、本明細書において上に記載されるようなプロセスの組合せは、選択的変異誘発ベースのアッセイにより特に企図されている。一例では、
（ｉ）変異誘発を誘導するのに十分な条件下で非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理し、それによって変異された核酸を生成するステップ、
（ｉｉ）非変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、メチル化されたシトシン残基を含むＤＮＡにおける配列に相補的であるヌクレオチド配列をそれぞれが含む２つの非重複及び非相補的プライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、
（ｉｉｉ）ハイブリダイズされたプライマーに介在する核酸を増幅させ、それによってプライマー配列を含む配列からなるＤＮＡ断片を生成するステップ、
（ｉｖ）非変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下でメチル化されたシトシン残基を含む配列に一致する又は相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブに増幅されたＤＮＡ断片をハイブリダイズさせるステップ、
（ｖ）前記ハイブリダイゼーションを検出するステップ、
を含むプロセスを実施することによりメチル化の増加が検出される。

陰性読出しアッセイ
別の例では、アッセイフォーマットは、健康な／正常な対照試料由来のＤＮＡのメチル化の減少が陽性シグナルとして検出され、好ましくは、新生物試料由来のメチル化されたＤＮＡが検出されない又は微弱にしか検出されない陰性読出しシステムを含む。

好ましい実施形態では、
（ｉ）変異誘発を誘導するのに十分な条件下で非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理し、それによって変異された核酸を生成するステップ、
（ｉｉ）変異核酸への選択的ハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、変異シトシン残基を含む配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブ又はプライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、及び
（ｉｉｉ）前記選択的ハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含むプロセスを使用して、メチル化の減少は決定される。

これらの例の一実施形態では、前記シトシン残基はＣｐＧジヌクレオチド内に又はＣｐＧアイランド内にある。

この状況では、用語「選択的ハイブリダイゼーション」は、変異核酸へのプローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションが、対応する非変異配列への同一プローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションよりも高い頻度で若しくは速度で起こる、又は高い最高反応速度を有することを意味する。好ましくは、前記プローブ又はプライマーは、使用される反応条件下ではメチル化された配列（又は非変異配列）にはハイブリダイズしない。

ハイブリダイゼーションベースのアッセイフォーマット
一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、サザン、ドットブロット、スロットブロット又は他の核酸ハイブリダイゼーション手段を使用して検出される（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４、７４２１〜７４２７頁、１９９４年；Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７、５９４〜５９９頁、１９９７年）。適切なプローブ選択を条件として、そのようなアッセイフォーマットは、本明細書において上に一般的に記載されており、現在記載されている選択的変異誘発アプローチを準用する。好ましくは、リガーゼ連鎖反応フォーマットを用いて、非変異と変異核酸の区別をする。この点に関して、アッセイ要件及び条件は陽性読出しアッセイについて本明細書において上に記載されている通りであり、現在のフォーマットを準用する。しかし、プローブの選択は異なることになる。陰性読出しアッセイでは、非変異配列ではなく変異配列に選択的にハイブリダイズする１つ又は複数のプローブが選択される。

好ましくは、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンがチミジンに変異される場合、たとえば、非メチル化シトシン残基の場合にのみ、診断プローブ及び近接プローブがライゲートされることができるように、リガーゼ連鎖反応プローブ（単数又は複数）は、健康な対照試料ではメチル化されていないが、癌では高度メチル化されているＣｐＧジヌクレオチドを含む３’端部及び／又は５’端部配列を有する。

当業者には明らかになるように、上に記載されるＭＳＯ法は陽性及び／又は陰性読出しアッセイのどちらか又は両方を受け入れられる。これは、記載されるアッセイが変異と非変異配列の両方を検出し、それによってメチル化のレベルを決定することを促進するからである。しかし、メチル化された又は非メチル化配列のみを検出するアッセイは本発明により企図されている。

増幅ベースのアッセイフォーマット
別の例では、ハイブリダイゼーションは、変異核酸に選択的にハイブリダイズするプライマー（及び適用可能な場合はプローブ）を使用しているのもかかわらず、陽性読出しアッセイのために本明細書において上に記載される任意の増幅アッセイフォーマットを使用する増幅システムを使用して検出される。

上に記載されるＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌアッセイを陰性読出しフォーマットに適応する際に、亜硫酸水素塩処理された核酸にメチル化特異的な形で結合するブロッカーは、中程度から高厳密性条件下で変異ＤＮＡに特異的に結合する。増幅反応は、任意選択でメチル化特異的であってもよい（すなわち、変異核酸のみに結合する）が１つ又は複数のブロッカーに隣接する１つ又は複数のプライマーを使用して実施される。メチル化された核酸（すなわち、変異ＤＮＡ）の存在下で、ブロッカー（単数／複数）は結合し、ＰＣＲ産物は生成されない。

一例では、
（ｉ）変異誘発を誘導するのに十分な条件下で非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理して、それによって変異核酸を生成するステップ、
（ｉｉ）変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、変異シトシン残基を含むＤＮＡ中の配列に相補的であるヌクレオチド配列をそれぞれが含む２つの非重複及び非相補的プライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、
（ｉｉｉ）ハイブリダイズしたプライマーに介在する核酸を増幅させそれによってプライマー配列を含む配列からなるＤＮＡ断片を生成するステップ、
（ｉｖ）変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、変異シトシン残基を含む配列に一致する又は相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブに増幅されたＤＮＡ断片をハイブリダイズさせるステップ、並びに
（ｖ）前記ハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含むプロセスを実施することにより正常な／健康な対照対象におけるメチル化の減少が検出される。

当業者には明らかになるように、陰性読出しアッセイは好ましくは、確実に陰性結果が反応の失敗ではなくメチル化された核酸により引き起こされるように適切な対照試料を含む。

一特定の実施形態では、
（ｉ）変異誘発を誘導するのに十分な条件下で非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる化合物で生体試料由来のＤＮＡを処置するステップ、
（ｉｉ）配列番号１、２、３又は４のうちの１つにより定義されるＤＮＡ領域を増幅するように設計されたプライマーを使用して、ステップ（ｉ）のＤＮＡを増幅するステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の増幅産物を塩基配列決定して、対照試料由来のＤＮＡ中の対応する変異残基と比べて、前記試験試料由来のＤＮＡ中での変異を受けていない１つ又は複数のシトシン残基の存在を同定するステップ
を含むプロセスを使用して本発明のＤＮＡ領域における増大したメチル化が決定される。

別の実施形態では、前記変異誘発は亜硫酸水素ナトリウム又は等価な薬剤を用いて誘導され、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換される。これらのウラシル残基は増幅ステップ中にチミンに変換される。

上文に記載された検出方法に従って、解析されるＤＮＡ領域が配列番号１領域又は実質的に類似の領域である一実施形態では、亜硫酸水素ナトリウム変異誘発ステップを受けた非新生物対照から単離された対応する領域の配列は配列番号５に実質的に一致すると考えられ、大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因を示す対象から単離された対応する領域の配列は配列番号６に実質的に一致すると考えられる。

この特定の実施形態に従えば、利用されるプライマーは配列番号１８及び１９に一致する又は実質的に類似する。

解析されるＤＮＡ領域が配列番号２領域又は実質的に類似の領域であるさらに別の実施形態では、亜硫酸水素ナトリウム変異誘発ステップを受けた非新生物対照から単離された対応する領域の配列は配列番号７に実質的に一致すると考えられ、大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因を示す対象から単離された対応する領域の配列は配列番号８に実質的に一致すると考えられる。

この特定の実施形態に従えば、利用されるプライマーは配列番号２０及び２１に一致する又は実質的に類似する。

解析されるＤＮＡ領域が配列番号３領域又は実質的に類似の領域であるさらに別の実施形態では、亜硫酸水素ナトリウム変異誘発ステップを受けた非新生物対照から単離された対応する領域の配列は配列番号９に実質的に一致すると考えられ、大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因を示す対象から単離された対応する領域の配列は配列番号１０に実質的に一致すると考えられる。

この特定の実施形態に従えば、利用されるプライマーは配列番号１３及び１４に一致する又は実質的に類似する。プライマーがメチル化特異的プライマーである場合、前記プライマーは変異されていない配列番号１０分子を効率的に増幅することになるが、非メチル化シトシンの変異を受けている配列番号９分子は極めて非効率的にしか増幅しないことは、当業者であれば認識するべきである。同じ問題は、下で考察されるそれぞれ配列番号１１及び１２に関連している。

解析されるＤＮＡ領域が配列番号４領域又は実質的に類似の領域であるさらに別の実施形態では、亜硫酸水素ナトリウム変異誘発ステップを受けた非新生物対照から単離された対応する領域の配列は配列番号１１に実質的に一致すると考えられ、大腸新生物の発症又は発症の素因を示す対象から単離された対応する領域の配列は配列番号１２に実質的に一致すると考えられる。

この特定の実施形態に従えば、利用されるプライマーは配列番号１３、１４及び１５に一致する。

上文で詳述されたように、患者試料間の変動はメチル化されているシトシン残基の数に関して起こり得ることは当業者であれば認識されるであろう。したがって、上文で列挙された実施形態との関連では、得られ続いて増幅される配列は、高メチル化を受けているシトシン残基の実数の対立遺伝子／多型変動又は差異のせいで本明細書に提供される配列とはわずかに変化し得ることは理解されるべきである。したがって、これらの実施形態は、そのような変動を示す配列まで広がると理解されるべきである。ＤＮＡ配列を評価して、それが本発明のＤＮＡ領域の天然に存在する変動であるのかどうかを決定するのは、十分に当業者の能力内にある。

本発明は、本明細書に記載される方法を使用する、本発明の診断配列又はその発現若しくはメチル化の検出及び／又は定量化のためのキットも提供する。

メチル化の検出のためのキットでは、本発明のキットは、本発明の診断配列のうちの少なくとも１つにハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチド及び遺伝子メチル化の検出のための少なくとも１つの試薬を含むことができる。メチル化の検出のための試薬には、たとえば、亜硫酸水素ナトリウム、バイオマーカー配列がメチル化されていなければ（たとえば、少なくとも１つのＣ→Ｕ変換を含有する）、本発明のバイオマーカー配列の産物である配列にハイブリダイズするよう設計されたポリヌクレオチド及び／又はメチル化感受性若しくはメチル化依存性制限酵素が含まれる。キットは、上記の配列番号５〜１２に開示されている配列などの、配列のメチル化又は非メチル化形態を表す対照の天然又は合成ＤＮＡ配列も含み得る。キットは、アッセイにおいて使用するように構成されるアッセイ器具の形態で固体支持体を提供することができる。キットは、キットにおいて任意選択でポリヌクレオチド（たとえば、プローブ）に連結されている検出可能な標識をさらに含み得る。試験管、移動ピペット、及び同種のものを含む、アッセイの実施に有用な他の材料もキットに含めることが可能である。キットは、本明細書に記載されるアッセイのいずれにおいてもこれらの試薬のうちの１つ又は複数の使用のための書面による使用説明書も含むことが可能である。

上文で詳述されているように、高度メチル化は転写サイレンシングに関連している。したがって、大腸新生物若しくは***新生物の素因又は発症についてスクリーニングする基礎を提供するこれら遺伝子のメチル化レベルの増加に加えて、これら遺伝子の発現レベルの下方調節も診断的に価値がある。本発明のこの態様に従えば、遺伝子「発現産物」又は「遺伝子の発現」への言及は、転写産物（たとえば、一次ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）又はタンパク質などの翻訳産物への言及である。この点に関して、生成される発現産物（すなわち、ＲＮＡ又はタンパク質）のレベルの変化、遺伝子に会合しているクロマチンタンパク質の変化、たとえば、アミノ酸位番号９若しくは２７のリシン上でのメチル化されたヒストンＨ３の存在（抑制的修飾）又はＤＮＡのメチル化の変化などの、発現を下方調節するよう作用するＤＮＡそれ自体の変化についてスクリーニングすることにより遺伝子の発現レベルの変化を評価することが可能である。

したがって、本発明の別の態様は、個体における大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、前記個体由来の生体試料中のＨｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４２９５〜１６３８３４５００により定義されるＤＮＡ領域の発現レベルを評価するステップを含み、対照のレベルと比べて前記ＤＮＡ領域のより低い発現レベルが新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因となる細胞を示す方法を対象とする。

本発明のこの態様の方法は、この新生物マーカーのレベルとこのマーカーの対照レベルとの比較に基づいている。「対照レベル」は、新生物ではない対応する大腸細胞又は細胞集団により発現されるマーカーのレベルである「正常レベル」でもよい。

上文で詳述されるように、正常（又は「非新生物」）レベルは、試験対象である同じ個体由来の組織を使用して決定し得る。しかし、これは関係する個体には極めて侵襲的になることがあり、したがって、問題の患者以外の個体から得られる個々の又は集団の結果を反映する標準結果と比べて試験結果を分析するほうが都合がよい可能性があることは認識されるであろう。

好ましくは、前記対照レベルは非新生物レベルである。

上文で詳述されるように、本発明は、大腸又は***に位置している新生物細胞又は細胞集団についてスクリーニングするように設計されている。したがって、「細胞又は細胞集団」への言及は、個々の細胞又は細胞の群への言及として理解されるべきである。前記細胞の群は拡散した細胞集団、細胞懸濁液、被包性細胞集団又は組織の形態をとる細胞集団であってもよい。

「発現」への言及は、核酸分子の転写及び／又は翻訳への言及として理解されるべきである。「ＲＮＡ」への言及は、一次ＲＮＡ又はｍＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡ（たとえば、ｍｉＲＮＡ、等）などの任意の形態のＲＮＡへの言及を包含すると理解されるべきである。いかなる点でも本発明を限定することなく、増加した又は減少したＲＮＡ合成をもたらす遺伝子転写のモジュレーションは、タンパク質産物を生成するこのＲＮＡ転写物（たとえば、ｍＲＮＡ）の翻訳とも相関していることがある。したがって、本発明は、細胞又は細胞集団の新生物状態の指標としてのマーカータンパク質産物のモジュレートしたレベル又はパターンについてスクリーニングすることを対象とする検出方法論までにも及ぶ。一方法は、ｍＲＮＡ転写物及び／又は対応するタンパク質産物についてスクリーニングすることであるが、本発明はこの点に関して限定されることはなく、たとえば、一次ＲＮＡ転写物などの他の任意の形態の発現産物についてスクリーニングすることにまで及ぶことは理解されるべきである。

ＤＮＡ領域の発現の下方調節についてスクリーニングする点に関して、ＤＮＡレベルで検出可能である変化は遺伝子発現活性の変化、したがって、発現産物レベルの変化を示していることも当業者には周知であろう。そのような変化には、ＤＮＡメチル化の変化が含まれるが、これに限定されない。したがって、「発現レベルをスクリーニングする」及びこれらの「発現レベル」と対照「発現レベル」の比較への本明細書での言及は、遺伝子／ＤＮＡメチル化パターンなどの、転写に関係しているＤＮＡ因子を評価することへの言及として理解されるべきである。これらのことは、ある程度上文に詳細に説明されている。

クロマチン構造の変化は遺伝子発現の変化を示していることも当業者には公知であろう。遺伝子発現のサイレンシングは、クロマチンタンパク質の修飾に関連する場合が多く、ヒストンＨ３の９位及び２７位のどちらか又は両方でのリシンのメチル化はよく研究されている例であり、活性なクロマチンはヒストンＨ３のリシン９のアセチル化を特徴とする。したがって、遺伝子配列と抑制的又は活性な修飾を担持しているクロマチンの会合を使用して、遺伝子の発現レベルの評価をすることが可能である。

「核酸分子」への言及は、デオキシリボ核酸分子とリボ核酸分子の両方及びその断片への言及として理解されるべきである。したがって、本発明は、生体試料においてｍＲＮＡレベルについて直接スクリーニングすること又は対象のｍＲＮＡ集団から逆転写されている相補的ｃＤＮＡについてスクリーニングすることの両方に及ぶ。ＤＮＡ又はＲＮＡのどちらかについてスクリーニングすることを対象とする方法論を設計することは十分に当業者の能力の範囲内である。上で詳述されたように、本発明の方法は対象ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡそれ自体から翻訳されたタンパク質産物についてスクリーニングすることにも及ぶ。

好ましい方法は、新生物発生又はその素因を診断する目的で新生物マーカーの発現産物又はＤＮＡ変化を検出することであるが、前記マーカーのレベルの逆の変化の検出は、ある種の状況下では、たとえば、腺腫又は腺癌の発生などの新生物状態を調節することを対象とする治療的又は予防的処置の有効性をモニターするためには望ましいことがある。たとえば、対象マーカーの発現の減少が、個体が腺腫又は腺癌発生により特徴付けられる状態を発症していることを示す場合、たとえば、治療レジメの開始に続いてこのマーカーのレベルの増加についてスクリーニングすることを利用して、対象個体の状態の回復又は他の形の改善を示し得る。したがって、本発明の方法は、１度限りの検査として又は新生物発生のリスクがあると考えられる個体の進行中のモニターとして又は新生物発生を阻害する若しくは他の方法で遅延させることを対象とする治療的若しくは予防的処置レジメの有効性のモニターとして有用である。

生体試料において対象の発現された新生物マーカーを評価する手段は、当業者には周知であると考えられる任意の適切な方法により達成することができる。このために、均一な細胞集団（たとえば、腫瘍生検又は不均一な出発集団から濃縮された細胞集団）又は組織切片を調べている限り、インサイツハイブリダイゼーション、マイクロアッセイによる発現プロファイルの評価、免疫アッセイ及び同類のもの（下文にさらに詳細に記載されている）などの多種多様な技法を利用して、対象のマーカーの発現レベルの非存在又は下方調節を検出し得ることは認識されるであろう。しかし、不均一な細胞集団又は血液試料などの不均一な細胞集団が見出される体液をスクリーニングしている限り、マーカーの発現レベルの非存在又は減少は、試料中に存在する非新生物細胞によるマーカーの固有の発現のせいで検出不可能であることもある。すなわち、細胞の亜集団の発現レベルの減少は検出可能ではないことがある。この状況では、本発明のマーカーの発現レベルの新生物の亜集団における減少を検出するさらに適切な機構は、エピジェネティック変化の検出などの間接的手段を介してである。

遺伝子発現レベルの変化を検出する方法（上文で詳細に記載されているメチル化分析に加えて）は、特に対象生体試料が多数の非新生物細胞で汚染されていない場合には、
（ｉ）インビボ検出
分子イメージング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ）は、腸組織におけるマーカーの変更された発現を明らかにすることができるイメージングプローブ又は試薬の投与に続いて使用し得る。
分子イメージング（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．、ＢＢＡ、１４０２：２３９〜２４９頁、１９８８年；Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：３５１〜３５５頁、２０００年）は、Ｘ線、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ＭＲＩ、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）又は内視鏡検査などの「古典的」画像診断法を使用して現在視覚化されているマクロ特徴と相関している分子発現のインビボイメージングである。
（ｉｉ）細胞における蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による、又は細胞由来の抽出物における定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴＰＣＲ）若しくは競合的ＲＴ−ＰＣＲ産物のフローサイトメトリー定量化などの技術による、ＲＮＡ発現の下方調節の検出（Ｗｅｄｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：９ １３９８〜１４０５頁、２００２年）。
（ｉｉｉ）たとえば、アレイ技術によるＲＮＡの発現プロファイルの評価（Ａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：９６、６７４５〜６７５０頁、１９９９年６月）。
が含まれるが、これらに限定されない。
（ｉｖ）たとえば、免疫アッセイによる細胞抽出物における変更されたタンパク質レベルの測定。
生体試料におけるタンパク質性新生物マーカー発現産物についての試験は、当業者に周知であるいくつかの適切な方法のうちのいずれか１つにより実施することが可能である。適切な方法の例には、組織切片、生検標本又は体液試料の抗体スクリーニングが含まれるが、これに限定されない。抗体ベースの診断法が使用される限り、マーカータンパク質の存在は、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリー法によるなどのいくつかの方法で決定し得る。当然、これらには、非競合的種類の並びに従来の競合的結合アッセイにおける単一部位と二部位の両方又は「サンドイッチ」アッセイが含まれる。これらのアッセイは、標的への標識された抗体の直接結合も含まれる。
（ｖ）たとえば、免疫組織化学による細胞表面でのタンパク質新生物マーカーの変更された発現の決定。
（ｖｉ）上記のポイント（ｉｖ）及び（ｖ）において詳述された試験に加えて、任意の適切な機能試験、酵素試験又は免疫学的試験に基づいた変更されたタンパク質発現の決定、
が含まれるが、これらに限定されない。

当業者であれば、常用手順の問題として、特定種の生体試料への所与の方法の適用の妥当性を決定することができる。

本発明のさらに別の態様は、
（ｉ）配列番号５〜１２のうちのいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列、又は前記配列の長さにわたり少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％、若しくはそれよりも多い同一性を有するヌクレオチド配列、又は低厳密性条件下で核酸分子若しくはその相補型にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列のうちの１つ又は複数を含む単離された核酸分子又はそれに相補的な分子又はその断片若しくは誘導体、或いは
（ｉｉ）実質的に配列番号５〜１２のうちのいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列、又は前記分子の断片のうちの１つ又は複数を含む単離された核酸分子又はその誘導体若しくは断片
からなる一覧表から選択される単離された核酸分子を対象とする。

上文で詳述されたように、配列番号５〜１２は、配列番号１〜４により定義されるＤＮＡ領域の亜硫酸水素塩処理及び増幅に続いて得られると予想されるＤＮＡ分子の配列を表す。具体的には、大腸新生物由来のＤＮＡの亜硫酸水素塩処理では、非メチル化シトシン残基のみが変異を受けるので、シトシンからウラシルへの変異誘発事象を生じる可能性はないと考えられる。大腸新生物において高メチル化を受ける特定のシトシン残基のいくつかは、配列番号１〜４との関連で同定されている。したがって、配列番号１、２、３及び４により定義されるＤＮＡ領域の増幅は、関連するシトシン残基はすべて高メチル化されると仮定すれば、それぞれ配列番号６、８、１０及び１２に実質的に一致する配列を有するＤＮＡ産物を生じると予想されるであろう。非新生物細胞、すなわち対照ＤＮＡから単離されたＤＮＡに関係して、関連するシトシン残基の変異誘発は、残基がメチル化されていないので亜硫酸水素塩処理に続いて起こると予想されるであろう。したがって、この状況において配列番号１、２、３及び４により定義されるＤＮＡ領域の増幅は、それぞれ配列番号５、７、９及び１１に実質的に一致する配列を有するＤＮＡ産物を生じると予想されるであろう。その程度と高メチル化されているシトシン残基の数の両方に関して、高メチル化の程度の変動は、異なる患者間で起こり得ることは、当業者であれば認識されるであろうし、上文に詳述されている通りである。にもかかわらず、それぞれの新生物試料が正確に同定可能な高メチル化パターンを示さないことがあるという事実があるが、新生物試料は非新生物試料と比べて配列番号１〜４により定義される領域における検出可能な高メチル化を示すことになるという事実は残る。

シトシンからウラシルへの変異誘発法を介して明確に選択して高メチル化を評価し、続いて問題のＤＮＡ領域を増幅するという観点から、配列番号５〜１２により定義されるメチル化及び非メチル化配列は、この診断法からの患者結果を評価することが可能になる際の基準を提供する。試験試料が配列番号６、８、１０及び１２により表される完全な程度にまで高メチル化を示すかどうかは無関係である。むしろ、試料が配列番号５、７、９及び１１により表されるレベルにまでより高いレベルで高メチル化を示すならば、その結果は、前記試料が採取された患者が大腸新生物を有することを示していることになる。したがって、配列番号５、７、９、１１及び配列番号６、８、１０、１２は、試験結果を解析することが可能になる際の標準になる。メチル化のいかなる増加も配列番号５、７、９及び１１に対して極めて明白になり、新生物を示す。高メチル化の程度及びパターンを配列番号６、８、１０及び１２により定義される配列と比較すれば、高メチル化パターンに関して個々の患者又はコホート間に存在し得る可変性に関する有益な情報が提供される。したがって、診断キットにこれら標準配列を１つ又は複数含むことが企図されている。

本明細書で使用される語句「核酸」又は「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、若しくはこれらのうちのいずれかの断片、一本鎖若しくは二本鎖のこともある及びセンス鎖若しくはアンチセンス鎖のこともあるゲノム若しくは合成起源のＤＮＡ若しくはＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）、ペプチド核酸、又は、たとえば、ｉＲＮＡ、リボヌクレオタンパク質（たとえば、ｉＲＮＰ）を含む、起源が天然であれ合成であれ、任意のＤＮＡ様若しくはＲＮＡ様物質のことである。前記用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを包含する。前記用語は、合成骨格を有する核酸様構造体も包含する。たとえば、Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９〜１９７；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：８６９２〜８６９８；Ｓａｍｓｔａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ６：１５３〜１５６を参照されたい。

この目的のために、本発明は、上文で定義された核酸分子に向けられるアンチセンス核酸分子、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡにまで広がることは理解されるべきである。

本発明は、上文で定義された核酸分子に向けられるプローブ及びプライマーまで広がることも理解されるべきである。

アンチセンス核酸及びプローブ及びプライマーの設計は、本明細書に提供される詳述された教唆に照らせば当業者には通常手順の問題であることは認識される。前記アンチセンス分子、プローブ及びプライマーは好ましくはその標的分子に特異的であるが、アンチセンス分子、プローブ又はプライマーの配列及び長さに応じて同じ交差反応性が生じ得ることは認識されるであろう。交差反応性／***雑のレベルが許容可能かどうかは当業者が下すべき判断であり、状況の詳細な点に依存することになる。一般に、増加した特異性はプローブ又はプライマーの長さを増すことによりもたらすことが可能である。好ましくは、前記プローブ又はプライマーは少なくとも１０、２０、３０、４０又は５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むが、上文で定義されるヌクレオチド配列由来の又はに向けられるさらに大きな分子の使用も企図されている。この配列は、同定可能なシグナルを発することができるレポーター分子で標識してもよい。

本発明の核酸分子は好ましくは、単離形態である又は発現ベクターなどのベクターにライゲートされている。「単離された」は、少なくとも１回の精製ステップを受けた核酸分子のことであり、これは、たとえば、分子量、配列又は他の簡便な手段により決定される場合、他の成分と比べて少なくとも約１０％の主題の核酸、好ましくは少なくとも約２０％、さらに好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも約４０〜５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは８０〜９０％又はさらに多い主題の核酸分子を含む組成物により都合よく定義される。本発明の核酸分子は、好ましい実施形態では、生物学的に純粋であると見なしてもよい。

本発明の核酸は、たとえば、ｃＤＮＡライブラリーのクローニング及び発現、ＰＣＲ等によるｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの増幅によって作製する、単離する及び／又は操作することができる。

本発明の核酸は、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルス又はそのハイブリッドであれ、遺伝的に操作された、増幅された及び／若しくは発現された又は組換え的に産生された、種々の供給源から単離することができる。

代わりに、これらの核酸は、たとえば、Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている周知の化学合成法によりインビトロで合成することができる。

たとえば、サブクローニング、標識化プローブ（たとえば、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を使用するランダムプライマー標識化）、塩基配列決定、ハイブリダイゼーション、等などの核酸の操作のための技法は、科学文献及び特許文献にかなり記載されている。

核酸、ベクター、ポリペプチド等は当業者に周知の多くの一般的な手段のいずれによっても解析し定量することができる。これらの手段には、たとえば、ＮＭＲ、分光光度、Ｘ線撮影、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及びハイパー拡散クロマトグラフィーなどの分析的生化学的方法、様々な免疫学的方法、たとえば、液体又はゲル沈降反応、免疫拡散、免疫電気泳動、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、サザン解析、ノーザン解析、ドットブロット解析、ゲル電気泳動（たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、核酸又は標的又はシグナル増幅法、放射標識化、シンチレーション計測、及びアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。

本発明は、本発明の核酸を含むクローニング媒体を提供する。本発明のクローニング媒体は、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリア人工染色体、ウイルスＤＮＡ（たとえば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病及びＳＶ４０の誘導体）、Ｐ１−ベースの人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、及び対象の特定の宿主に特異的な他の任意のベクター（たとえば、バチルス、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及び酵母）を含むことができる。本発明のベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列を含むことができる。多数の適切なベクターが当業者には公知であり、市販されている。

本発明の核酸は、必要ならば、通常の分子生物学的方法を使用して種々のベクターのいずれにもクローニングすることができる。増幅された核酸をインビトロでクローニングするための方法は、たとえば、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。増幅された配列のクローニングを促進するために、制限酵素部位をＰＣＲプライマー対中に「組み込む」ことができる。

本明細書で使用される用語「類似性」及び「同一性」は、比較される配列間の正確な同一性をヌクレオチドレベルで含む。ヌクレオチドレベルで同一性が存在しない場合、「類似性」は、異なるアミノ酸をコードしている可能性があるが、にもかかわらず、構造的、機能的、生化学的及び／又は立体構造的レベルで互いに関係がある配列間の「同一性」差を含む。特に好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列比較は、類似性よりもむしろ同一性のレベルで行われる。

２つ又はそれよりも多いポリヌクレオチド間の配列関係を記述するのに使用される用語には、「基準配列」、「比較窓」、「配列類似性」、「配列同一性」、「配列類似性の百分率」、「配列同一性の百分率」、「実質的に類似する」及び「実質的同一性」が含まれる。「基準配列」は、少なくとも１２しかし頻繁に１５から１８、多くの場合少なくとも２５又は長さが３０モノマーユニットなどのそれよりも上である。２つのポリヌクレオチドはそれぞれが、（１）前記２つのポリヌクレオチド間で類似している配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、及び（２）前記２つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含むことがあるために、２つ（又はそれよりも多い）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には「比較窓」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較し配列類似性の局所的領域を同定し比較することにより、実施される。「比較窓」とは、基準配列と比較される典型的には１２の連続する残基の概念的なセグメントのことである。比較窓は、前記２つの配列の最適アライメントのための基準配列（付加も欠失も含まない）と比べた場合、約２０％又はそれよりも少ない付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある。比較窓を整列させるための配列の最適アライメントは、アルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ ｉｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）のコンピュータ化された実行により、又は検査及び選択された様々な方法のうちのいずれかによって作成される最良アライメント（すなわち、比較窓にわたって最高百分率相同性を生じる）により行ってもよい。たとえば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９、１９９７）により開示されたプログラムのＢＬＡＳＴファミリーを参考にしてもよい。配列解析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．Ｃｈａｐｔｅｒ １５、１９９４〜１９９８）のユニット１９．３に見ることができる。ＰＩＬＥＵＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ又はＶｅｃｔｏｒＮＴ１などのしかしこれらに限定されない広範な他のアルゴリズムを使用して、ヌクレオチド配列を比較してもよい。

本明細書で使用される用語「配列類似性」及び「配列同一性」とは、比較の窓にわたりヌクレオチド対ヌクレオチドに基づいて配列が同一である又は機能的に若しくは構造的に類似している程度のことである。したがって、たとえば、「配列同一性の百分率」は比較の窓にわたり２つの最適に整列された配列を比較し、同じ核酸塩基（たとえば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）が両方の配列に存在する位置の数を決定し一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較の窓における全位置数（すなわち、窓サイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることにより計算される。

２つの核酸の関連で語句「実質的に同一の」又は「実質的に類似する」は、比較し最大一致になるよう整列させた場合、たとえば、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも多い配列同一性を有する２つ又はそれよりも多い配列のことを指すことができる。

本発明は、低厳密性条件下で本発明の例示的な配列にハイブリダイズする単離された又は組換え核酸を提供する。別の態様では、厳密性条件は、当技術分野で公知の及び本明細書に記載される高厳密性条件又は中程度厳密性条件である。これらの方法を使用して、本発明の核酸を単離し得る。

「ハイブリダイゼーション」とは、核酸鎖が塩基対合を通じて相補的鎖に結合するプロセスのことである。ハイブリダイゼーション反応は、対象の特定の配列を、その配列が低濃度で存在する試料中でも同定することができるように、感受性であり選択性であることが可能である。厳密な条件は、たとえば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション溶液中の塩若しくはホルムアミドの濃度により、又はハイブリダイゼーション温度により定義することができ、当技術分野では周知である。たとえば、厳密性は、下に詳細に記載されるように、塩の濃度を減少する、ホルムアミドの濃度を増加する、又はハイブリダイゼーション温度を上げる、ハイブリダイゼーションの時間を変更することにより増加させることができる。別の態様では、本発明の核酸は、本明細書に記載されるように、様々な厳密性条件（たとえば、高、中程度、及び低）下でハイブリダイズするその能力により定義される。

低厳密性への本明細書での言及は、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約０〜少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミド及び少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩、並びに洗浄条件のための少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩を含み包含する。一般に、低厳密性は、約２５〜３０℃から約４２℃までである。温度は変更して、もっと高い温度を使用し、ホルムアミドを交換する及び／又は別の厳密性条件を与えてもよい。必要な場合は、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアルデヒド及び少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩、並びに洗浄条件のための少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩を含み包含する中程度の厳密性、又はハイブリダイゼーションのための少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミド及び少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩、並びに洗浄条件のための少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩を含み包含する高厳密性などの、別の厳密性条件を適用し得る。一般に、洗浄は、Ｔ_ｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％で実施される（Ｍａｒｍｕｒ ａｎｄ Ｄｏｔｙ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０９頁、１９６２年）。しかし、二重鎖ＤＮＡのＴ_ｍは、ミスマッチ塩基対の数が１％増加するごとに１℃低下する（Ｂｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｌａｓｋｅｙ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：８３頁、１９７４年）。ホルムアミドはこれらのハイブリダイゼーション条件では任意選択である。したがって、厳密性の特に好ましいレベルは以下の通りに定義され：低厳密性は、２５〜４２℃で、６×ＳＳＣバッファー、０．１％ｗ／ｖ ＳＤＳ；中程度の厳密性は、２０℃〜６５℃の範囲の温度で、２×ＳＳＣバッファー、０．１％ｗ／ｖ ＳＤＳ；高厳密性は、少なくとも６５℃の温度で、０．１×ＳＳＣバッファー、０．１％ｗ／ｖ ＳＤＳである。

本発明の核酸が高厳密性下でハイブリダイズするその能力により定義される場合、これらの条件は約３７℃〜４２℃の温度で約５０％のホルムアミドを含む。一態様では、本発明の核酸は、約３０℃〜３５℃で約３５％〜２５％のホルムアミドでの条件を含む低下した厳密性下でハイブリダイズするその能力により定義される。代わりに、本発明の核酸は、４２℃で５０％のホルムアルデヒド、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、及びｃｏｔ−１又はサーモン***ＤＮＡ（たとえば、２００ｎ／ｍｌの剪断され変性されたサーモン***ＤＮＡ）などの反復配列ブロッキング核酸の条件を含む高厳密性下でハイブリダイズするその能力により定義される。一態様では、本発明の核酸は、３５℃の下げられた温度で３５％のホルムアミドを含む低下した厳密性条件下でハイブリダイズするその能力により定義される。

本発明の別の態様は、本発明のマーカーを検出するための１つ又は複数の作用物質を含む生体試料をアッセイするための診断キット及び前記作用物質による検出を促進するのに有用な試薬を提供する。たとえば、生体試料を受け取るための追加の手段も含むことができる。前記作用物質は任意の適切な検出分子でもよい。

一実施形態では、前記キットは、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２に一致する１つ若しくは複数の核酸分子、又は実質的に類似する核酸分子を含む。上文で詳述したように、これらの配列は、試験試料から増幅された産物を評価する際の基準（対照）として有用である。

別の実施形態では、前記キットは、以下の
（ｉ）配列番号１３及び１４又は実質的に類似する配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１４及び１５又は実質的に類似する配列、
（ｉｉｉ）配列番号１８及び１９又は実質的に類似する配列、
（ｉｖ）配列番号２０及び２１又は実質的に類似する配列
の配列に一致する１つ又は複数の増幅プライマーセットを含む。

本発明は、以下の非限定的実施例を参照することによりさらに説明される。

（例１）
差異的ＤＮＡメチル化の推定領域の同定
国際特許出願第ＷＯ２０１１／０１７７６０号に記載される亜硫酸水素塩タグ法を使用するＤＮＡメチル化の全ゲノム解析は、末梢血由来のＤＮＡと比較して３つの結腸直腸がん細胞系、ＨＣＴＩ１６、ＳＷ４８０及びＬＩＭに適用された。この技法は、ＴａｑＩ（ＴＣＧＡ）及びＭｓｐ１（ＣＣＧＧ）制限部位でＤＮＡメチル化のレベルを特徴付ける。同定された差異的にメチル化された部位の中には、第６染色体、１６３、８３４、４０６位上に位置するＴａｑＩ制限部位内のＣｐＧ部位があった。この部位は、８つの結腸直腸がんＤＮＡの試料とその８つの対応する正常組織ＤＮＡを比べて差異的メチル化も示した。この部位は、以前は特徴付けられていなかった遺伝子Ｒｅｆｓｅｑ ＬＯＣ１００５２６８２０内にあることが同定され、この配列及び周辺の配列におけるＤＮＡメチル化はこの後記載される通りに調査された。前記遺伝子はそれに続いてＣＡＨＭ（高メチル化された結腸直腸腺癌）と名付けられてきた。

（例２）
１０の正常組織検体及び１０の結腸直腸がん検体由来の結腸直組織検体における配列番号１中のシトシンのメチル化
プライマーは、亜硫酸水素ナトリウムでの化学変換後ＬＯＣ１００５２６８２０遺伝子の２つの領域を増幅するよう設計された。亜硫酸水素ナトリウムと反応すると、シトシンは、５−メチルシトシンは未変換のままでウラシルに変換される（その後チミンとして増幅される）、プライマーはメチル化されたＤＮＡ配列とメチル化されていないＤＮＡ配列を等しく増幅するよう設計された。
フォワードプライマー：５’ＡＴＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＡＴ（配列番号１８）
リバースプライマー：５’ＴＣＴＴＡＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＲＴＴＡＴＴＣＴＡ（配列番号１９）

前記プライマーは、１０の結腸直腸がん標本、その対応正常組織及び正常血液ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡからのＰＣＲのために使用された。増幅は、Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｏＴａｑ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎなし）、３ｍＭのＭｇＣｌ_２を使用し、２００ｎＭのプライマー及び１０ｎｇのインプットＤＮＡを用いて行われた。サイクリング条件は、９５℃で２分間（１サイクル、続いて９５℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒を５０サイクルである。ＤＮＡの増幅されたバンドはゲル精製され、Ｒｏｃｈｅ ４５４ Ｔｉｔａｎｉｕｍ ＦＬＸシステム上での塩基配列決定のためのリンカーとライゲートされた。個々の患者由来の試料及び血液ＤＮＡ試料は、配列整列化及びスコア化のために配列リードを個々の試料の割り当てることができるように、バーコード化された「ＭＩＤ」リンカー（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０５６１９２１１００１）と個別にライゲートされた。この、配列番号２、下の例３、及び他の遺伝子由来のアンプリコンのライブラリーは、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｂｒａｒｙ調製キット及び試薬と共に提供されたプロトコールに従って調製され、フローセルの両半分で塩基配列決定され、２分の１はすべてのがん試料を含有し、１つは等しくバーコード化された正常試料を含有していた。亜硫酸水素塩塩基配列決定リードは、バーコード配列を使用して個々の試料に分離され、亜硫酸水素塩変換配列、配列番号６と一緒に整列された。最良のアライメント後、それぞれの潜在的ＣｐＧメチル化部位（アンプリコンにおけるヌクレオチド位を参照して、図１で３６、３８、６３、等と標識された部位）でのシトシンの割合が試料ごとに決定された。

図１（ｂ）は、アンプリコン内のＣｐＧ部位のそれぞれでのメチル化のプロファイルを示している。赤線はがん試料を表し、対応する青線は対応する正常組織ＤＮＡのメチル化状態を示している。がん試料のうちの７つが大半のＣｐＧ部位で高レベルのメチル化（約８０％）を示し、２つが中間レベル、１つが最小メチル化を示していることは明白である。これとは対照的に、１０の正常ＤＮＡ試料のうちの８つはメチル化を示し、一般にはアンプリコン全体で１０％未満であり、１つは低レベルで、１０〜２０％、１つは中間レベルで、約３０％であった。この部分的にメチル化された正常試料に対応するがん試料は、高レベルメチル化を示している試料の１つである。意義深いことに、末梢血由来のＤＮＡの解析により、アンプリコン全体ですべてのＣｐＧ部位で最小メチル化が示された（３％未満）。したがって、配列番号１内のＣｐＧ部位でのメチル化のレベルにより、結腸直腸がんＤＮＡと対応正常結腸組織ＤＮＡ及び血液由来の対照ＤＮＡは区別される。

（例３）
１０の正常組織検体及び１０の結腸直腸がん検体由来の結腸直組織検体における配列番号２中のシトシンのメチル化
図２（ａ）に示される隣接する領域、配列番号２は、プライマー対
フォワードプライマー：５’ＧＴＹＧＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＡＧＴＡＡＡＴＴ（配列番号２０）
リバースプライマー：５’ＣＡＣＲＡＴＡＣＲＡＡＡＡＡＣＴＡＡＴＡＡＡＣＴＴＴＣＣＴＴＡ（配列番号２１）
を使用して、配列番号１についてと同じように解析された。

図２（ｂ）は、アンプリコン内のＣｐＧ部位のそれぞれでのメチル化のプロファイルを示している。赤線はがん試料を表し、対応する青線は対応正常組織ＤＮＡのメチル化状態を示している。アンプリコンの中央領域の配列特徴は、Ｒｏｃｈｅ ４５４塩基配列決定システムにおいてはリードを制限し、したがって、配列リードの開始末端の近位のＣｐＧ部位のみを評価することができた。にもかかわらず、がん特異的高メチル化はアンプリコン左末端の最初の６つのＣｐＧ部位（塩基６１まで、染色体座標１６３、８３４、６５３〜１６３、８３４、６６８１）を含み、広がって塩基１９５から２５２（染色体座標１６３、８３４、８１５〜１６３、８３４、８７２）までの最後の１０のＣｐＧ部位を含むことは明らかである。さらに、１０のがん試料のうち９つが中間又は高レベルのメチル化を示し、１つの対応正常試料しか重要なメチル化を示していない。さらに、このアンプリコン内のＣｐＧ部位メチル化も末梢血ＤＮＡでは極めて低かった（３％未満）。総合データでは、前記２つの塩基配列決定されたアンプリコンにより包含される領域、すなわち、第６染色体（ｈｇ１９配列）の塩基１６３８３４２９５から１６３８３４９０６が結腸直腸がん特異的高メチル化を示し、結腸直腸がんの検出のためのアッセイの開発に適していることが示されている。

（例４）
増幅のためにメチル化特異的ｑＰＣＲアッセイを使用する結腸組織検体におけるＣＡＨＭ遺伝子（ＬＯＣ１００５２６８２０）でのメチル化レベルの測定
ＤＮＡは、１０の腺腫、１５の分類１、１８の分類Ｂ、２８の分類Ｃ、７つの分類ＩＶ、６つの対応正常結腸標本及び７つの他の正常結腸組織を含む結腸組織標本から抽出された。単離されたＤＮＡは、Ｚｙｍｏ ＥＺ Ｇｏｌｄ亜硫酸水素塩変換キットを製造業者が推奨する通りに使用して亜硫酸水素塩変換された。

ＰＣＲアッセイは、最終濃度１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００ｎＭのオリゴヌクレオチド配列番号１３及び１４、２００μＭのｄＮＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｂｕｆｆｅｒ並びに１対１２０，０００希釈度のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１５μＬの反応混合物である。サイクル条件は９５℃で２分間、続いて９２℃、１５秒；６２℃、１５秒；及び７２℃、２０秒の３サイクル。これに続いて、８２℃、１５秒；６３℃、１５秒及び７２℃、２０秒を５０サイクルであった。ＰＣＲ増幅は、３８４ウェルプレートを使用してＲｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲ機器で実施された。

メチル化のレベルは、４０ｐｇから５ｎｇを末梢血白血球ＤＮＡと混合し、総投入量５ｎｇを与える完全メチル化ＤＮＡの標準曲線を使用して定量された。表１は、ＬＯＣ１００５２６８２０ 配列番号３のメチル化の頻度をまとめている。ＰＣＲ標的された配列番号１０は、腺腫から抽出した組織ＤＮＡの７０％で陽性、集合がん組織検体で７４％陽性であるが、試験された正常結腸直腸組織検体の２５％（ここでは低レベルで）がメチル化されているだけであることが分かった。

（例５）
２５の結腸内視鏡検査陰性健康組織、結腸直腸腺腫に罹った２５患者及び結腸直腸がんに罹った２５患者由来の遊離循環血漿ＤＮＡにおけるＣＡＨＭ遺伝子（ＬＯＣ１００５２６８２０）でのメチル化レベルを測定することによる結腸直腸新生物の検出
ＤＮＡは結腸直腸腺腫に罹った２５患者、結腸直腸がんに罹った２５患者及び２５の結腸内視鏡検査陰性健康患者由来のヒト血漿４ｍＬから抽出された。抽出は、血清／血漿由来の遊離循環核酸のＱＩＡｍｐ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して実施された。単離されたＤＮＡは、Ｚｙｍｏ亜硫酸水素塩変換キットを製造業者の推奨する通りに使用して亜硫酸水素塩変換された。合計で３６μＬの亜硫酸水素塩変換ＤＮＡが４ｍＬの血漿から回収された。それぞれの患者由来の合計で２．５μＬの亜硫酸水素塩変換ＤＮＡは、最終濃度１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３．３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００ｎＭのオリゴヌクレオチド配列番号１３及び１５、２００μＭのｄＮＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）並びに１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｂｕｆｆｅｒからなる３０μＬの第１ラウンドＰＣＲ反応で使用された。サイクル条件は９５℃で２分間、続いて９２℃、１５秒；６０℃、３０秒；及び７２℃、３０秒の１１サイクルであった。ＰＣＲ増幅は。９６ウェルプレートを使用してＰＡＬＭエンドポイントＰＣＲサイクラーで実施された。第２ＰＣＲは、最終濃度１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００ｎＭのオリゴヌクレオチド配列番号１３及び１４、２００μＭのｄＮＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｂｕｆｆｅｒ並びに１対１２０，０００希釈度のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる１５μＬの総ＰＣＲ反応において、ＰＣＲラウンド１由来の１μＬの材料で実施された。サイクル条件は９５℃で２分間、続いて９２℃、１５秒；６２℃、１５秒；及び７２℃、２０秒の３サイクル。これに続いて、８２℃、１５秒；６２℃、１５秒及び７２℃、２０秒を４７サイクルであった。融解曲線解析は、９５℃で５秒、６５℃で１分及び１１℃／秒のランプ速度を使用して９７℃まで連続増加で実施された。ＰＣＲ増幅は、３８４ウェルプレートを使用してＲｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲ機器で実施された。７７．４℃＋／−０．５℃で産物融解曲線を有する患者試料は陽性であると呼ばれた。メチル化レベルは、４０ｐｇから５ｎｇを末梢血白血球ＤＮＡと混合し、総投入量５ｎｇを与える完全メチル化ＤＮＡの標準曲線を使用して定量された。表２は、遊離循環血漿ＤＮＡにおけるＣＡＨＭ遺伝子（ＬＯＣ１００５２６８２０）のメチル化の頻度をまとめている。

検出感度は、がんの段階が増大するのに合わせて増加すると見られている。これらのデータは、結腸直腸新生物の検出のために血漿から単離されるＤＮＡにおけるＬＯＣ１００５２６８２０のメチル化についての特異的アッセイの潜在的有用性を実証している。

（例６）
増幅のためのメチル化特異的ｑＰＣＲアッセイを使用する結腸、***、前立腺及び肺組織検体におけるＣＡＨＭ（ＬＯＣ１００５２６８２０）のメチル化レベルの測定
ＤＮＡは、１０の乳がん及び１０の対応正常***組織検体、１０の肺がん及び１０の対応正常肺組織検体、並びに５つの前立腺がん及び５つの対応正常前立腺組織検体を含む組織検体から抽出された。さらに、１０の結腸直腸がん組織検体及び１０の対応正常結腸組織検体の以前未試験コホートが対照として含まれていた。単離されたＤＮＡの濃度は、０．０５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｂｕｆｆｅｒ、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭのｄＮＴＰ及び２００ｎＭのＴａｑＭａｎプローブ（５’−６ＦＡＭ−ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＡＧＴ−ＢＨＱ−１）（配列番号２２）を含む改変された１５μＬのＰＣＲ混合物において、２００ｎＭのＣＦＦ１プライマー及びＤｅｖｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００９；５５：１３３７〜１３４６に記載されているサイクル条件を使用して決定された。

１μｇのＤＮＡは、Ｅｐｉｔｅｃｔ Ｐｌｕｓ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅキットを、製造業者（ＱＩＡＧＥＮ）の推奨する通りに使用して亜硫酸水素塩変換された。精製された亜硫酸水素塩変換ＤＮＡの濃度は、亜硫酸水素塩変換特異的ＡＣＴＢプライマー（フォワードプライマー：５’−ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＴＴ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＴ（配列番号２３）；リバースプライマー：５’−ＡＡＴ ＴＡＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＣＡＣ ＡＡＣ ＣＴＡ ＡＴＡ ＡＡ）（配列番号２４）を、０．０５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｂｕｆｆｅｒ、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭのｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００ｎＭのＴａｑＭａｎプローブ（５’−６ＦＡＭ−ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＣＡＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＡＴＡ ＡＣＡ ＡＡＣ ＡＣＡ−ＢＨＱ−１）（配列番号２５）を含む１５μＬのＰＣＲにおいてプライマーごとに最終濃度９００ｎＭで使用して決定された。ＰＣＲサイクル条件は、９５℃、２分；［９５℃、１０秒；６０℃、５０秒］を６０サイクル、４℃、１０秒であった。

５ｎｇの亜硫酸水素塩変換組織ＤＮＡにおけるＣＡＨＭメチル化のレベル（３通り）は、最終濃度１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００ｎＭのオリゴヌクレオチド配列番号１３及び１４、２００μＭのｄＮＴＰ、１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｂｕｆｆｅｒ並びに１対１２０，０００希釈度のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する２５μＬの反応混合物において、ＣＡＨＭ ＰＣＲアッセイを使用して決定された。ＰＣＲサイクル条件は、９５℃、２分；［９２℃、１５秒；６２℃、１５秒；７２℃、２０秒］を３サイクル、続いて［８２℃、１５秒；６３℃、１５秒；７２℃、２０秒］を５０サイクルであり、融解曲線解析が、９５℃、５秒；６５℃、１分；０．１１℃／秒の継続取得（５／秒）で９７℃まで傾斜をつけ、続いて１０秒で４０℃まで冷却する設定で実施された。ＰＣＲ増幅は、９６ウェルプレートを使用してＲｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲ機器で実施された。

メチル化のレベルは、２０ｐｇから５ｎｇまでの完全メチル化ＤＮＡの標準曲線を使用して定量された。表３はＣＡＨＭ遺伝子（ＬＯＣ１００５２６８２０）配列番号３のメチル化の頻度をまとめている。

ＰＣＲ標的された配列番号１０は、１０の結腸直腸がん検体のうちの９つ及び１０の正常検体のうちの１つにおいて２％を超えてメチル化されていた。これとは対照的に、ＣＡＨＭは、１０の対になった前立腺検体のうちのいずれにおいてもメチル化を示さなかった。２０の対応肺検体のうちの３つ（２つは正常及び１つのがん）及び対応***検体のうちの１８において、低レベルメチル化（０．３％未満）が測定された。２つの乳がん検体のみが２％を超えるＣＡＨＭメチル化を有していた。これらのデータにより、他のがんと比べて結腸がんの検出のためのＣＡＨＭ遺伝子座における高感度のメチル化が実証されたが、ＣＡＨＭメチル化は乳がんのサブグループを検出し得ることも実証された。

当業者であれば、本明細書に記載される発明は、具体的に記載された変動及び修正以外の変動及び修正を受け入れる余地があることは認識するであろう。本発明はそのような変動及び修正すべてを含むと理解されるべきである。本発明は、本明細書において言及される又は示されるステップ、特長、組成物及び化合物のすべてを個別に又は合わせて、並びに前記ステップ又は特長のうちの任意の２つ又はそれよりも多くのありとあらゆる組合せも含む。



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Claims (20)

1. 個体における大腸新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、
   該個体由来の生体試料中のＨｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４０９７〜１６３８３４９８２により定義されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含み、
   対照レベルと比べて該ＤＮＡ領域のより高いレベルのメチル化が新生物大腸細胞若しくは***細胞又は新生物状態の発症の素因を有する細胞を示す、方法。
2. Ｈｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４２９５〜１６３８３４５００又はＣｈｒ６：１６３８３４６２１〜１６３８３４９０６により定義される領域のうちの１つ又は両方から選択されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含む、請求項１に記載の方法。
3. Ｈｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４３９３〜１６３８３４５１９又はＣｈｒ６：１６３８３４３９３〜１６３８３４４５５により定義される領域のうちの１つ又は両方から選択されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含む、請求項２に記載の方法。
4. 
   から選択される１つ若しくは複数のシトシン残基又は反対のＤＮＡ鎖上のｎ＋１位の対応するシトシンのメチル化を評価するステップを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＤＮＡメチル化が、
   （ｉ）メチル化特異的ＰＣＲ、
   （ｉｉ）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイ、
   （ｉｉｉ）メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長、
   （ｉｖ）メチル化されたＣｐＧアイランド増幅、
   （ｖ）ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌアッセイ、
   （ｖｉ）Ｈｅａｄｌｏｏｐ ＰＣＲ、又は
   （ｖｉｉ）ヘルパー依存性連鎖反応
   を使用して検出される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
6. 解析されるＤＮＡ領域が配列番号１領域であり、亜硫酸水素ナトリウム変異誘発ステップを受けた非新生物対照から単離された対応する領域の配列が配列番号５に少なくとも９０％の配列同一性を有し、大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因を示す対象から単離された対応する領域の配列が配列番号６に少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
7. 利用されるプライマーが配列番号１８及び１９に少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項６に記載の方法。
8. 解析されるＤＮＡ領域が配列番号２領域であり、亜硫酸水素ナトリウム変異誘発ステップを受けた非新生物対照から単離された対応する領域の配列が配列番号７に少なくとも９０％の配列同一性を有し、大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因を示す対象から単離された対応する領域の配列が配列番号８に少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
9. 利用されるプライマーが配列番号２０及び２１に少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項８に記載の方法。
10. 解析されるＤＮＡ領域が配列番号３領域であり、亜硫酸水素ナトリウム変異誘発ステップを受けた非新生物対照から単離された対応する領域の配列が配列番号９に少なくとも９０％の配列同一性を有し、大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因を示す対象から単離された対応する領域の配列が配列番号１０に少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
11. 利用されるプライマーが配列番号１３及び１４に少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１０に記載の方法。
12. 解析されるＤＮＡ領域が配列番号４領域であり、亜硫酸水素ナトリウム変異誘発ステップを受けた非新生物対照から単離された対応する領域の配列が配列番号１１に少なくとも９０％の配列同一性を有し、大腸新生物又は***新生物の発症又は発症の素因を示す対象から単離された対応する領域の配列が配列番号１２に少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
13. 利用されるプライマーが配列番号１３、１４及び１５に一致する、請求項１２に記載の方法。
14. 個体における大腸新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする方法であって、
    該個体由来の生体試料中のＨｇ１９座標Ｃｈｒ６：１６３８３４２９５〜１６３８３４５００により定義されるＤＮＡ領域の発現レベルを評価するステップを含み、対照のレベルと比べて該ＤＮＡ領域のより低い発現レベルが新生物大腸細胞又は新生物状態の発症の素因を有する細胞を示す、方法。
15. 前記発現レベルがＲＮＡ発現である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記新生物細胞が腺腫又は腺癌である、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
17. 前記対照レベルが非新生物レベルである、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
18. 前記新生物が結腸直腸新生物である、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
19. 前記生体試料が糞便試料、浣腸洗浄水、外科切除、組織生検又は血液試料である、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
20. 前記個体がヒトである、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。