JP6073461B2 - 標的大規模並列配列決定法を使用した対立遺伝子比分析による胎児トリソミーの非侵襲的出生前診断 - Google Patents
標的大規模並列配列決定法を使用した対立遺伝子比分析による胎児トリソミーの非侵襲的出生前診断 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2012年4月6日付で出願された、「標的大規模並列配列決定法を使用した対立遺伝子比分析による胎児トリソミーの非侵襲的出生前診断」と題された米国特許仮出願第61/621,454号の非仮出願であり、そして、その恩恵を主張するものである。かかる仮出願の全ての内容をあらゆる目的のために参照により本明細書中に援用する。
トリソミー21(T21)などの胎児異数性の出生前スクリーニング及び診断は、現代の産科ケアの定着した要素である。従来の出生前スクリーニングは、母親の年齢、超音波及び生化学的マーカーなどのパラメータにより構築されている[1]。これらのパラメータは表現型特性に主に基づいており、そしてそれは本来、中心となる分子病理に関連している付帯的徴候であるため、それらの診断能力は通例、次善的なものである。上記のスクリーニング方法により高いリスクに分類された妊娠では、絨毛膜標本採取(CVS)や羊水穿刺のような侵襲的手技によって得られた胎児遺伝物質の更なる調査を必要とする。これらの後者の手技には、わずかではあるが、しかし、一定の流産の危険性を伴う[2]。1997年に母親の血漿中の胎児DNAに関する証拠が、非侵襲的出生前診断(NIPD)の可能性を切り開いた[3]。
実施形態では、無細胞胎児DNAと母親DNAの混合物を含んでいる生物学的サンプルを分析することによって、胎児が第1の染色体に関係する異数性を有するか否かを非侵襲的に決定法するための方法、装置、及びシステムを提供する。例えば、第1の対立遺伝子比が第1の染色体について決定でき、第2の対立遺伝子比が1若しくは複数の基準染色体について決定できる。その比を決定するために、DNAは多形性遺伝子座に関係する標的領域が富化され、その後、配列決定される。胎児特異的対立遺伝子を伴う標的領域内の遺伝子座は、第1の染色体上、及び1若しくは複数の基準染色体上で同定される。これらの遺伝子座は、それぞれの対立遺伝子比を決定するのに使用できる。第1の対立遺伝子比と第2の対立遺伝子比から成る第3の比は、異数性が第1の染色体に存在しているか、及び異数性が母親由来又は父親由来であるか判断するために、カットオフと比較され得る。
本明細書で使われる用語の「生物学的サンプル」は、対象(例えば、妊婦などのヒト)から採取される任意のサンプルを意味し、1つ又は複数の目的の核酸分子を含む。例としては、血漿、唾液、胸水、汗、腹水、胆汁、尿、血清、膵液、糞便及び子宮頸部塗抹サンプルが挙げられる。
妊婦から得られた血漿DNAは、無細胞母親DNA及び無細胞胎児DNAの混合物を含んでいる。母親の血漿中の胎児DNA割合は、正倍数体の妊娠において様々な染色体にわたる多形性遺伝子マーカーを使用して決定される場合、比較的一貫している。例えば、第1の遺伝子座の第1の胎児特異的対立遺伝子数の割合は、その他の遺伝子座の第2の胎児特異的対立遺伝子数の割合と比較的一致している。胎児DNA割合は、ある母親サンプルと他のサンプルでは異なっている可能性があるが、(同じ染色体又は異なった染色体上の)異なった多形性遺伝子マーカーに関する胎児DNA割合は、サンプル内で比較的一貫している。
(T21などの)異数性のNIPDのためのアプローチは、母親の血漿サンプル中の第21染色体(chr21)由来のDNA分子の割合を計測することである。母親がT21の胎児を妊娠しているのであれば、胎児からのchr21の付加コピーが、母親の血漿のサンプルに対して付加量のchr21DNA分子に寄与し、そして、高い割合のchr21配列につながるであろう[11]。大規模並列配列決定法(MPS)は、DNA定量の精度を上げ、その上、異数性染色体由来の莫大な量の胎児DNAの検出を可能にした[11−14]。
図1Aは、母親と正倍数性胎児の遺伝子座における対立遺伝子、並びに本発明の実施形態による計算例に関する略図100を示す。遺伝子座103は基準染色体に関するものであり、遺伝子座106は第21染色体(しかし、それは任意の着目の染色体であってもよい)に関するものである。母親のゲノムは各遺伝子座においてホモ接合であり、そして、胎児は各遺伝子座においてヘテロ接合である。示されているように、2つの遺伝子座についての実際の配列とは異なるであろうが、母系対立遺伝子は各遺伝子座においてAと標識される。これにより、AとBは、同じ遺伝子座における2つの異なった対立遺伝子(すなわち、染色体の2つの異なったコピーからの対立遺伝子)、そしてこの場合、胎児のゲノム内の2つの対立遺伝子を目立たせる、分かりやすい標識である。
図1Bは、母親及び父親由来の異数性胎児遺伝子座における対立遺伝子、並びに本発明の実施形態による計算例の略図120を示す。遺伝子座123は基準染色体のためのものであり、そして、遺伝子座126は染色体21のためのものである。図1Aに関して、母親のゲノムは各遺伝子座においてホモ接合であり、そして、胎児は各遺伝子座においてヘテロ接合である。
図1Cは、母親及び父親由来の異数性胎児遺伝子座における対立遺伝子、並びに本発明の実施形態による計算例の略図140を示す。遺伝子座143は基準染色体のためのものであり、そして、遺伝子座146は染色体21のためのものである。図1Aに関して、母親のゲノムは各遺伝子座においてホモ接合であり、そして、胎児は各遺伝子座においてヘテロ接合である。
図2は、胎児が異数性を有しているか否か決定するために、胎児を妊娠している女性対象からの生物学的サンプルを分析する方法200を例示するフローチャートである。生物学的サンプルは、胎児及び女性対象からのDNA分子の混合物を含んでいる。方法200の一部は、コンピュータシステムによって実施されてもよい。
富化は、配列決定前にDNAサンプルから標的領域を選択的に増幅すること、及び/又は捕捉することによって行われる。富化は、ゲノム内の特定の位置にハイブリダイズするように設計されたプローブ及び/又はプライマーによって達成される。これらのプローブ/プライマーの多くが、ゲノム内の複数の領域を標的とするのに使用され得る。様々な領域が、着目の染色体上で標的とされ、そして、様々な領域が1つの基準染色体上で、又は複数の基準染色体にわたって標的とされる。
(例えば、アレイを使用した)捕捉の理論的根拠は、固定されたプローブにDNAライブラリがハイブリダイズすることである。例えば、標的領域に相当するプローブ、及びこれらの標的領域からのDNA分子が、固定されたプローブにハイブリダイズした。これにより、標的DNAは固定され、非標的DNAは固定されない。
増幅のために、プライマーは、ゲノムの標的領域を増幅するように設計されている。捕捉技術が非標的領域からDNAを取り除く一方で、増幅技術は、標的領域からDNA分子数を優先的に増強する。このように、同じように、配列読み取りが標的領域に相当する見込みがより高くなる。
上記のとおり、実施形態では、母親がホモ接合であり、そして、胎児がヘテロ接合である場合、情報提供遺伝子座を使用する。これらの遺伝子座は、いろいろな方法により同定される。例えば、情報提供遺伝子座(例えば、SNP)は、母親及び胎児の遺伝子型決定の情報に従って同定され得る。しかしながら、そのようなプロセスは、例えば、侵襲的技術によって、胎児細胞を得ることを伴うであろう。例えば、遺伝子型決定は、侵襲的に得られる母親の血球細胞及び胎児の組織サンプルに対して行われ得る。他の実施形態では、非侵襲的技術により情報提供遺伝子座を同定できる。しかし、この遺伝子型決定は、非侵襲的方法の妥当性を比較するためのゴールドスタンダードとして使用され得る。以下の非標的配列決定の結果について、読み取り深度は、配列決定だけに基づく、多くの情報提供遺伝子座の同定には不十分であり、これにより、情報提供遺伝子座に関する以前の遺伝子型決定情報が使用された。
DNAは、単胎胎児を妊娠している14人の妊婦から回収された血漿サンプルから抽出された。ハイブリダイゼーションベースの標的配列決定法を使用して、chr7、chrl3、crr18、及びchr21上の2,906の一塩基多型遺伝子座を富化した。標的富化した又はしていない血漿DNAライブラリが、大規模並列配列決定法で分析された。各ケースについて母親と胎児の両方のゲノムDNAのサンプルが、一塩基多型マイクロアレイ解析によって遺伝子型を決定された。
A.非標的配列決定データを使用したF−S比の計算
図4Bは、FSR21 Ref値が本発明の実施形態による非標的配列決定データによる正倍数性胎児と父親及び母親由来のT21とを識別するために計算されたことを示す。chr21上の1,437の標的SNP遺伝子座及び(chr7、chr13、及びcbr18を含めた)chrRef上の1,469のSNP遺伝子座の中で、各ケースについて、情報提供SNP(chr21=151〜273SNP、chrRef=145〜182SNP)が同定された。胎児特異的及び共有対立遺伝子を有する配列読み取り数が、表300中に示されているように、chr21(FC21=197〜761、SC21=3,610〜7,740)及びchrRef(FCRcf=154〜473、SCRef=2,786〜5,557)について決定された。
父親由来のT21ケースは、非標的配列決定データと標的配列決定データの両方で首尾よく検出された。母親由来のT21ケースについて、このアプローチは、有効でなくなった。平均FSR21 Ref値は母親由来のT21ケースで低かったが、正倍数性と母親由来のT21ケースの間でFSR21 Ref値の顕著な重複があった。父親由来のT2I検出と母親由来のT2I検出の間の能力の相違点は、主にFSR21 Refの変化の程度に起因し、そしてそれは、父親由来のT21について2倍に増強され、そして、母親由来のT21についてf/2倍に減少した(図1B及び1C)。これにより、父親の遺伝性異数体は、母親の遺伝性異数体より低い配列決定深度で非侵襲的に識別されることができた。
コンピュータシミュレーションは、T21検出のためのF−S比分析の精度を調査するために利用された。統計モデルは、父親及び母親由来のT21モデルの両方の分画胎児DNA濃度によれば、胎児特異的対立遺伝子の数及び共有対立遺伝子数の数が二項分布に従うはずであるという仮定に基づいている。例えば、基準染色体(chrRef)の分画胎児DNA濃度がfであると仮定すると、情報提供SNPの胎児特異的対立遺伝子を検出する確率は、胎児の異数性状態にかかわらずchrRefのf/2であろう。その一方で、母親が正倍数性胎児を妊娠している場合、chr21上に胎児特異的対立遺伝子を検出する確率はf/2であり、母親が父親由来のT21胎児を妊娠している場合、それは2f/(2+f)であり、母親が母親由来のT21胎児を妊娠している場合、それはf/(2+f)である(図1A〜1C)。
先に概説されているとおり、当業者が検出精度を改善できる様々な方法が存在する。1つのアプローチは、分画胎児DNA濃度を高めることであり、そしてそれは、母親由来のT21におけるFSR21 Refの変化の程度を拡大するであろう。初期の研究は、母親の血漿のホルムアルデヒド処理によって胎児DNA割合を富化することを試みたが[7]、この方法は、別のグループによって一貫して再現されなかったので、使用が容易ではなかった[8−10]。あるいは、母親由来のT21検出の精度が、情報提供対立遺伝子数を増やすことによって改善できる。我々のシミュレーション分析によると、付加情報提供対立遺伝子数は、ある程度、分画胎児DNA濃度の減少によって引き起こされた検出精度の喪失を補うであろう(図6)。2つのアプローチ、すなわち、より多くの情報提供SNPの動員及び各遺伝子座のより深い配列決定が、情報提供対立遺伝子数を増やすために使用できる。一実施形態において、両アプローチが使用される。
情報提供SNP数は、一般に、2つの要因:検出のための着目の染色体上のSNPの総数及び情報提供SNPの頻度、によって決定される。後者は、分析したSNP群の中の検出可能な情報提供SNPのパーセンテージである。調査するために、絨毛膜絨毛DNAのマイクロアレイベースの分析で決定される胎児の遺伝子型情報は、情報提供SNPの頻度を最大化するのに使用され、そしてそれの平均値は、この試験の全14ケースにおいて約12%である。しかしながら、胎児のゲノム材料は、実際のNIPDのためにあらかじめ入手可能ではないであろう。そのため、情報提供SNPは、例えば、親が共にホモ接合であるにもかかわらず、異なった対立遺伝子を伴う状況(例えば、母親がAAであり、そして、父親がBBである)でSNPを選択することによって間接的に推定される必要があろう。このシナリオでは、そういったアプローチは父親がヘテロ接合であるあらゆるSNPを除くであろうから、情報提供SNPの頻度は12%から6%に減少するであろう。
十分な数の対立遺伝子を得るために、代替アプローチは、比較的少数の情報提供SNPを用いてより深く各遺伝子座を配列決定することである。我々の以前の刊行物によると、我々は、1ミリリットルの血漿あたり約1,000ゲノム等量のDNAが含まれており、そしてそれが、各遺伝子座あたり2,000の対立遺伝子数をもたらすであろうことを実証した[4]。我々が5mLの血漿中の各遺伝子座について対立遺伝子のすべてを計数できた場合、我々は、各遺伝子座につき1万の対立遺伝子数を得るであろう。このシナリオでは、26の情報提供SNP(chr21上に13SNP、chrRef上に33SNP)が、15%の胎児DNAを含むサンプルにおける母親由来のT21検出に十分な情報提供対立遺伝子数を提供する可能性があり、そしてそれは、chr21及びchrRefのそれぞれに130,000の情報提供対立遺伝子数(10,000×13)を意味する。情報提供SNPの数は、5%の分画胎児DNA濃度を含むサンプルのために720(chr21上に360SNP、chrRef上に360SNP)まで増やされる必要がある。このストラテジーに必要とされる高い読み取り深度(すなわち、情報提供対立遺伝子あたり10,000の数)のため、標的富化のためのPCRベースのアプローチ(すなわち、増幅法)が、このタイプの適用のための代替法であるかもしれない[18、19]。
我々は、単胎胎児を妊娠している14人の妊婦(12週間〜13週間及び5日間の在胎月齢)を採用した。母親の末梢血サンプルは、CVSの前に回収された。CVSに続いて、胎児ゲノムDNAサンプルを絨毛膜絨毛から得た。異数性又は正倍数性状態は、完全な核型分析によって確認された。14ケースの中で、7ケースがT21胎児であり、残りが正倍数性であった。
A.血漿DNAライブラリの標的配列決定法
遺伝子型決定は、配列決定技術の精度を確認するために使用された。母親及び胎児のゲノムDNAサンプルが、Genome-Wide Human SNP Array 6.0(Asymetrix)を用いて遺伝子型決定された。7人のT21胎児のcbr3の付加コピーの親起源を、chr21上のSNPの対立遺伝子シグナル強度が分析される、絨毛膜絨毛サンプルのマイクロアレイ解析を使用して決定される。胎児が父親由来のT21を有する場合、胎児特異的対立遺伝子(B対立遺伝子)のシグナル強度は、胎児の遺伝子型がchr21上でABBになっおり、逆もまた同様であるから、共有対立遺伝子(A対立遺伝子)に比べて2倍高くなるはずである。このアプローチを使用すると、1の胎児が父親由来のT21と同定されるのに対して、6が母親由来のT21と同定される。
IX.コンピュータシステム
Claims (22)
- 胎児を妊娠している女性対象からの生物学的サンプルを、前記胎児が第1の染色体に関係する異数性を有しているか否かを決定するために分析する方法であって、前記生物学的サンプルが、前記胎児と女性対象からのDNA分子の混合物を含んでおり、以下のステップ:
複数の標的領域からDNA分子について生物学的サンプルを富化し;
前記生物学的サンプルからDNA分子を配列決定して、複数の配列読み取りを得;
複数の配列読み取りを分析するが、ここで、前記配列読み取りの分析が:
前記配列読み取りを基準ゲノムと整列させることによって、基準ゲノム内の配列読み取りの位置を同定し;そして
前記配列読み取りのそれぞれの対立遺伝子を決定すること、
を含み;
第1の染色体上の、標的領域の一部に相当する複数の第1の遺伝子座を同定し;
1若しくは複数の基準染色体上の、標的領域の一部に相当する複数の第2の遺伝子座を同定するが、ここで、前記妊婦は、第1及び第2の遺伝子座のそれぞれにおけるそれぞれの母系対立遺伝子についてホモ接合であり、且つ、ここで、前記胎児は、第1及び第2の遺伝子座のそれぞれにおけるそれぞれの母系対立遺伝子及びそれぞれの父系対立遺伝子についてヘテロ接合であって、それぞれの父系対立遺伝子がそれぞれの母系対立遺伝子と異なっており;
複数の第1の遺伝子座においてそれぞれの母系対立遺伝子の第1の母系の量を決定し;
複数の第1の遺伝子座においてそれぞれの父系対立遺伝子の第1の父系の量を決定し;
第1の母系の量と第1の父系の量に関して第1の比を計算し;
複数の第2の遺伝子座においてそれぞれの母系対立遺伝子の第2の母系の量を決定し;
複数の第2の遺伝子座においてそれぞれの父系対立遺伝子の第2の父系の量を決定し;
第2の母系の量と第2の父系の量に関して第2の比を計算し;
第1の比と第2の比に関して第3の比を計算し;そして
第3の比を1若しくは複数のカットオフ値と比較して、前記胎児が第1の染色体に関係する異数性を有しているか否か決定すること、
を含む、前記方法。 - 前記生物学的サンプルを富化することが、
複数の標的領域に相当する固定されたプローブを用いて、前記生物学的サンプル中のDNA分子を捕捉すること、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記生物学的サンプルを富化することが:
複数の標的領域に相当するプライマーを用いて、生物学的サンプル中のDNA分子を増幅すること、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第1の染色体上の複数の第1の遺伝子座のうちの第1の遺伝子座を同定することが、
複数の配列読み取りを第1の遺伝子座と整列させ;そして
第1の遺伝子座に整列させた複数の配列読み取りの中から2つの対立遺伝子を同定すること、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第1の遺伝子座の第1の対立遺伝子に相当する第1の配列読み取りの数を決定し;
前記第1の遺伝子座の第2の対立遺伝子に相当する第2の配列読み取りの数を決定し;
第1の数と第2の数に関して対立遺伝子比を計算し;
前記対立遺伝子比が第1の閾値を上回り、且つ、第2の閾値を下回るか否かを決定すること、
をさらに含む、請求項4に記載の方法。 - 第1の染色体上の複数の第1の遺伝子座のうちの第1の遺伝子座を同定することが、
前記胎児の父親が、第1の遺伝子座において第1の対立遺伝子に関してホモ接合であることを同定し;そして
妊婦が、第1の遺伝子座において第2の対立遺伝子に関してホモ接合であることを同定すること、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第1の比が、第1の母系の量と第1の父系の量から決定される、混合物中の胎児DNA分子の第1のパーセンテージに合致し;そして、前記第2の比が、第2の母系の量と第2の父系の量から決定される、混合物中の胎児核酸分子の第2のパーセンテージに合致する、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の比として、第1の父系の量と第1の母親の量の合計によって割られた第1の父親の量が挙げられる、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の比として、第1の母系の量によって割られた第1の父系の量が挙げられ、そして、前記第2の比として、第2の母系の量によって割られた第2の父系の量が挙げられる、請求項1に記載の方法。
- 第1のカットオフ値が、母親由来である異数性に対応し、そして、第2のカットオフ値が、父親由来である異数性に対応する、請求項1に記載の方法。
- 異数性が父親由来であるときに、前記第3の比が、2である、請求項10に記載の方法。
- 異数性が母親由来であるときに、前記第3の比が、1−f/2{式中、fが、混合物中の分画胎児DNA濃度である}である、請求項10に記載の方法。
- 前記第2の父系の量と第2の母系の量から、分画胎児DNA濃度fを決定すること、
をさらに含む、請求項12に記載の方法。 - 前記第1の染色体が、第21染色体、第13染色体、又は第18染色体である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の遺伝子座のうちの少なくとも1つが、SNPである、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の第2の遺伝子座が、複数の基準染色体上に位置している、請求項1に記載の方法。
- 胎児を妊娠している女性対象からの生物学的サンプルを、前記胎児が第1の染色体に関係する異数性を有しているか否か決定するための分析を行うためのプログラムであって、前記生物学的サンプルは、前記胎児と女性対象からのDNA分子の混合物を含んでおり、前記プログラムが、以下のプロセスを実行する:
複数の標的領域からDNA分子について富化された生物学的サンプルからのDNA分子の配列決定から得られた複数の配列読み取りを受信し;
複数の配列読み取りを分析するが、ここで、前記配列読み取りの分析が:
前記配列読み取りを基準ゲノムと整列させることによって、基準ゲノム内の配列読み取りの位置を同定し;そして
前記配列読み取りのそれぞれの対立遺伝子を決定すること、
を含み;
第1の染色体上の、標的領域の一部に相当する複数の第1の遺伝子座を同定し;
1若しくは複数の基準染色体上の、標的領域の一部に相当する複数の第2の遺伝子座を同定するが、ここで、前記妊婦は、第1及び第2の遺伝子座のそれぞれにおけるそれぞれの母系対立遺伝子についてホモ接合であり、且つ、ここで、前記胎児は、第1及び第2の遺伝子座のそれぞれにおけるそれぞれの母系対立遺伝子及びそれぞれの父系対立遺伝子についてヘテロ接合であって、それぞれの父系対立遺伝子がそれぞれの母系対立遺伝子と異なっており;
複数の第1の遺伝子座においてそれぞれの母系対立遺伝子の第1の母系の量を決定し;
複数の第1の遺伝子座においてそれぞれの父系対立遺伝子の第1の父系の量を決定し;
第1の母系の量と第1の父系の量に関して第1の比を計算し;
複数の第2の遺伝子座においてそれぞれの母系対立遺伝子の第2の母系の量を決定し;
複数の第2の遺伝子座においてそれぞれの父系対立遺伝子の第2の父系の量を決定し;
第2の母系の量と第2の父系の量に関して第2の比を計算し;
第1の比と第2の比に関して第3の比を計算し;そして
第3の比を1若しくは複数のカットオフ値と比較して、前記胎児が第1の染色体に関係する異数性を有しているか否か決定すること、
を含む、前記プログラム。 - 第1のカットオフ値が、母親由来である異数性に対応し、そして、第2のカットオフ値が、父親由来である異数性に対応している、請求項17に記載のプログラム。
- 異数性が父親由来であるときに、前記第3の比が、2である、請求項18に記載のプログラム。
- 異数性が母親由来であるときに、前記第3の比が、1−f/2{式中、fが、混合物中の分画胎児DNA濃度である}である、請求項18に記載のプログラム。
- 前記第1の比として、第1の母系の量によって割られた第1の父系の量が挙げられ、そして、前記第2の比として、第2の母系の量によって割られた第2の父系の量が挙げられる、請求項17に記載のプログラム。
- 胎児を妊娠している女性対象からの生物学的サンプルを、前記胎児が第1の染色体に関係する異数性を有しているか否か決定するための分析を行うための装置であって、前記生物学的サンプルは、前記胎児と女性対象からのDNA分子の混合物を含んでおり、
請求項17〜21のいずれか1項に記載のプログラムを保存するコンピュータ可読媒体;及び
該コンピュータ可読媒体に保存されたプログラムを実行ように構成された1又はそれ以上のプロセッサ
を含む、装置。
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