JP6067701B2 - 改良されたラテラルフローアッセイ用の単一パッドストリップおよびそれを用いる試験デバイス - Google Patents
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Description
単一パッド;および
乾燥形態で沈着された基質
からなる、予め選択されたアナライトのための酵素駆動式のラテラルクロマトグラフィーフローアッセイ用のストリップを提供する。
(a) 以下からなるストリップを含む試験デバイスを用意するステップ:
(i) 単一パッド;および
(ii) 乾燥形態で沈着された基質;
(b) サンプルを、基質が沈着されている単一パッドに適用するステップ;
(c) 上記サンプルを、消化パッドを通して流し、上記基質に到達させるステップ;
(d) 上記サンプルを上記基質と反応させて応答を生成するステップ;および
(e) 上記応答を同定および解釈し、サンプル中のアナライトの存在または濃度を示すステップ
を含む、上記アッセイを提供する。
(a) 以下のものを含む単一パッドストリップを含む試験デバイスを用意するステップ:
(i) 溶解バッファーで前処理した消化単一パッド;
(ii) グルコース-6-リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、水素化物移動剤または電子移動剤、およびそれらの混合物を含むアッセイ混合物;および
(iii) テトラゾリウム塩;
(b) サンプルを上記消化単一パッドに適用するステップ;
(c) 上記サンプルを、上記消化パッドを通して流し、上記アッセイ混合物と接触させるステップ;
(d) 上記サンプルを、上記アッセイ混合物と反応させて応答を生成するステップ;ならびに
(e) 上記応答を同定および解釈し、上記サンプル中のアナライトの存在または濃度を示すステップ
を含む、上記アッセイを提供する。
本発明は、
単一パッド;および
乾燥形態で沈着された基質
からなる、予め選択されたアナライトのための酵素駆動式のラテラルクロマトグラフィーフローアッセイ用のストリップを提供する。
(a) 以下からなるストリップを含む試験デバイスを提供するステップ;
(i) 単一パッド;および
(ii) 乾燥形態で沈着された基質;
(b) サンプルを、基質が沈着されている単一パッドに適用するステップ;
(c) 上記サンプルを、消化パッドを通して流し、上記基質に到達させるステップ;
(d) サンプルを上記基質と反応させて応答を生成するステップ;および
(e) 上記応答を同定および解釈し、上記サンプル中のアナライトの存在または濃度を示すステップ
を含んでなる、上記アッセイを提供する。
G6PDの存在を検出するための酵素駆動式のラテラルクロマトグラフィーフローアッセイであって、以下:
(a) 以下のものを含む単一パッドストリップを含む試験デバイスを提供するステップ:
(i) 溶解バッファーで前処理した消化単一パッド;
(ii) グルコース-6-リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、水素化物移動剤、およびそれらの混合物を含むアッセイ混合物;および
(iii) テトラゾリウム塩;
(b) サンプルを上記消化単一パッドに適用するステップ;
(c) 上記サンプルを、上記消化パッドを通して流し、上記アッセイ混合物と接触させるステップ;
(d) 上記サンプルを、上記アッセイ混合物と反応させて応答を生成するステップ;ならびに
(e) 上記応答を同定および解釈し、上記サンプル中のアナライトの存在または濃度を示すステップ
を含む、上記アッセイを提供する。
本発明は、サンプル適用ゾーンと反応物-結果ゾーンが全て1パッド上にある、1パッドストリップデバイスを提供する。単一パッド中で実施されるアッセイは、アナライトの均一な移動を提供し、複数の層を通過するサンプルの不均一な移動を除去することによって一貫性のある結果を生成する。例えば、血液サンプルを、溶解バッファーで前処理した1パッドストリップに適用する場合、ヘモグロビンを結果物から簡単に分離することができる。
本発明のアナライトは、抗体-抗原間の反応の免疫学的反応、酵素-基質反応、タンパク質-基質結合、または基質-基質複合体形成などの様々な反応を用いて反応物と反応する。
本発明の1つの具体的実施形態は、色素を還元して特定の指標(例えば色)を表すことができる、酵素とその基質との反応から得られる代謝物の活性を利用した、サンプル中の酵素(例えば血液サンプル中のG6PD)の存在の直接検出などの酵素ベースのアッセイを提供する。テトラゾリウム化合物などの色素分子は、還元されて不溶性ホルマザンを形成することができる。不溶性ホルマザンは紫色を示し、任意の特定の装置を用いることなく、目視で簡単に同定することができる。
1つの実施形態において、本発明は、ポイントオブケア試験のための、1パッドストリップ上のドライフォーマットアッセイにおける迅速診断試験(RDT)を提供する。ドライフォーマットラテラルクロマトグラフィーは、安定した試験デバイス、簡単な方法および迅速な試験結果を提供する。G6PD欠損症は最も一般的なヒト酵素欠損症であり、400万人に影響を及ぼし、マラリアが風土病である地域で高度に蔓延している。この欠損は、マラリア感染からのある程度の防御を与えると考えられる。しかしまた、この欠損は、プリマキン(PRIMAQUINE)などの特定のマラリア薬を投与すると溶血を引き起こす可能性もある。従って、スクリーニングに属する分野に適した迅速診断試験(RDT)が早急に必要とされている。
多くの一般的に使用されるポイントオブケア試験は、微多孔膜の毛細管作用を利用する膜ベースの免疫クロマトグラフィーに基づくラテラルフローアッセイを用いる。ラテラルフロークロマトグラフィーアッセイにおいて、移動相試料溶液中のアナライトは、分子を固定固相に捕捉する親和性結合によって他の成分から分離される。ニトロセルロースまたはナイロンで作製される膜は、アフィニティークロマトグラフィーの固体固定相としての、また毛細管作用によって免疫複合体粒子を動かして他の液体溶質から分離させる分離クロマトグラフィーの液相としてのマトリックスを提供する。
1. 本発明の1パッドストリップは、ニトロセルロース膜、グラスファイバー、セルロースまたはポリエステル等から選択される多孔マトリックスを含む。
ラテラルクロマトグラフィーアッセイにおいてシグナル強度を制御する重量なパラメーターは、膜の毛細管流速およびタンパク質結合能である。毛細管流速と結合能は、孔のサイズ、多孔性、および膜の厚さによって決定される。膜のタンパク質結合能は、その孔のサイズおよび表面特性によって決まる。
本発明のパッドを溶解バッファーで前処理し、室温で乾燥させた。1パッドストリップおよび2パッドストリップの構造を図1に示す。前処理したパッドをプラスチック支持体に取り付け、吸収パッドとして、吸湿紙をプラスチック支持体の頭部においてパッドに重ねた。グルコース-6-リン酸、NADP、テトラゾリウム、および水素化物移動剤または電子移動剤を含むアッセイ混合物を調製し、これを多孔パッドに含浸させた。アッセイ混合物含浸パッドを室温で一晩乾燥させた。
本発明のパッドを、塩化マグネシウムを含む溶解バッファーで前処理し、室温で一晩乾燥させた。前処理したパッドをプラスチック支持体に取り付け、吸収パッドとして、吸湿紙をプラスチック支持体の頭部においてパッドに重ねた。乳酸、NADP、テトラゾリウム、およびTris-HCl バッファー(pH8.0)水素化物移動剤を含むアッセイ混合物を調製し、これを多孔パッドに含浸させた。アッセイ混合物含浸パッドを室温で一晩乾燥させた。
本発明のパッドを、洗浄剤を含むバッファーで前処理し、室温で一晩乾燥させた。前処理したパッドをプラスチック支持体に取り付け、吸収パッドとして、吸湿紙をプラスチック支持体の頭部においてパッドに重ねた。アルコール、NAD、テトラゾリウム、およびTris-HClバッファー(pH8.0)水素化物移動剤を含むアッセイ混合物を調製し、これを多孔パッドに含浸させた。アッセイ混合物含浸パッドを室温で一晩乾燥させた。
本発明のパッドを、洗浄剤を含むバッファーで前処理し、室温で一晩乾燥させた。前処理したパッドをプラスチック支持体に取り付け、吸収パッドとして、吸湿紙をプラスチック支持体の頭部においてパッドに重ねた。乳酸、NADP、テトラゾリウム、およびTris-HCl バッファー(pH8.0)水素化物移動剤を含むアッセイ混合物を調製し、これを多孔パッドに含浸させた。アッセイ混合物含浸パッドを室温で一晩乾燥させた。
Claims (18)
- 予め選択された血液サンプル中のアナライトのためのラテラルクロマトグラフィーフロー酵素アッセイ用のストリップであって、
単一パッド;および
乾燥形態で沈着された基質からなり、
前記アナライトが酵素を含み、
前記単一パッドがイオン性または非イオン性界面活性剤を含む溶解バッファーで前処理され、かつ
血液サンプル中のヘモグロビンがストリップ中でアナライトより速く移動する、
前記ストリップ。 - 前記アナライトが、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PD)、および乳酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択されるものである、請求項1に記載のストリップ。
- 前記単一パッドが、前記溶解バッファーでコーティングされている、請求項1に記載のストリップ。
- 前記基質が、グルコース-6-リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、電子移動剤、およびそれらの混合物を含むアッセイ混合物である、請求項1に記載のストリップ。
- 前記基質が指示薬を含む、請求項1に記載のストリップ。
- 前記指示薬が色素である、請求項5に記載のストリップ。
- 前記色素が、テトラゾリウム塩である、請求項6に記載のストリップ。
- 前記テトラゾリウム塩が、TTC (2,3,5-トリフェニル-2H-テトラゾリウムクロリド)、INT (2-(4-インドフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H-テトラゾリウムクロリド)、MTT (3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド)、XTT (2,3-ビス-(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキシアニリド)、NBT (ニトロブルーテトラゾリウム)、MTS (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)、およびDCPIP (2,6-ジクロロフェノールインドフェノール)からなる群から選択される、請求項7に記載のストリップ。
- 予め選択されたアナライトのためのラテラルクロマトグラフィーフロー酵素アッセイであって、以下のステップ:
(a) 以下からなるストリップを含む試験デバイスを用意するステップ:
(i) 単一パッド;および
(ii) 乾燥形態で沈着された基質;
(b) 血液サンプルを、基質が沈着されている単一パッドに適用するステップ;
(c) 該サンプルを、消化パッドを通して流し、該基質に到達させるステップ;
(d) 該サンプルを該基質と反応させて応答を生成するステップ;および
(e) 該応答を利用して、該サンプル中のアナライトの存在または濃度を同定するステップを含み、
前記アナライトが酵素を含み、
前記単一パッドがイオン性または非イオン性界面活性剤を含む溶解バッファーで前処理され、かつ
血液サンプル中のヘモグロビンがストリップ中でアナライトより速く移動する、
前記アッセイ。 - 前記アナライトが、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PD)、および乳酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項9に記載のアッセイ。
- 前記単一パッドが、前記溶解バッファーでコーティングされている、請求項9に記載のアッセイ。
- 前記基質が、グルコース-6-リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、電子移動剤、およびそれらの混合物を含むアッセイ混合物である、請求項9に記載のアッセイ。
- 前記基質が指示薬を含む、請求項9に記載のアッセイ。
- 前記指示薬が色素である、請求項13に記載のアッセイ。
- 前記色素が、テトラゾリウム塩である、請求項14に記載のアッセイ。
- 前記テトラゾリウム塩が、TTC (2,3,5-トリフェニル-2H-テトラゾリウムクロリド)、INT (2-(4-インドフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H-テトラゾリウムクロリド)、MTT (3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド)、XTT (2,3-ビス-(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキシアニリド)、NBT (ニトロブルーテトラゾリウム)、MTS (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)、およびDCPIP (2,6-ジクロロフェノールインドフェノール)からなる群から選択される、請求項15に記載のアッセイ。
- 前記溶解バッファーが塩化マグネシウムを含む、請求項11に記載のアッセイ。
- G6PDの存在を検出するためのラテラルクロマトグラフィーフロー酵素アッセイであって、以下のステップ:
(a) 次の(i)〜(iii)のものを含む単一パッドストリップを含む試験デバイスを用意するステップ:
(i) イオン性または非イオン性界面活性剤を含む溶解バッファーで前処理した消化単一パッド;
(ii) グルコース-6-リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、電子移動剤およびそれらの混合物を含むアッセイ混合物;および
(iii) テトラゾリウム塩;
(b) 血液サンプルを該消化単一パッドに適用するステップ;
(c) 該サンプルを該消化パッドを通して流し、該アッセイ混合物と接触させるステップ;
(d) 該サンプルを、該アッセイ混合物と反応させて応答を生成するステップ;および
(e) 該応答を利用して、該サンプル中のG6PDの存在または濃度を同定するステップ
を含み、
血液サンプル中のヘモグロビンがストリップ中でG6PDより速く移動する、前記アッセイ。
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