CN114377133A - 靶向肾脏cd8+trm形成与活化在肾小球损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供靶向肾脏CD8⁺T_RM形成与活化在肾小球损伤中的应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明通过研究发现，肾脏中存在T_RM，在小鼠肾小球损伤疾病模型以及人中CD8⁺并非CD4⁺T_RM的比例数量升高。病理条件下，肾脏CD8⁺T_RM来源于外周血浸润。其中肾皮质的IL‑15水平的升高是促进肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的关键因素，进而加重肾小球硬化和足细胞损伤。针对IL‑15信号通路使用IL‑15及其受体CD122的封闭抗体显著改善小鼠模型中的肾小球硬化症状，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

靶向肾脏CD8+TRM形成与活化在肾小球损伤中的应用

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及靶向肾脏CD8⁺T_RM形成与活化在肾小球损伤中的应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

足细胞即肾小球脏层上皮细胞，与肾小球内皮细胞，肾小球基底膜，共同构成了肾小球滤过屏障。足细胞是高度分化的上皮细胞，附着于基底膜外侧。由于足细胞裂孔膜是血浆蛋白滤过的最后一道屏障，并在滤过屏障中孔径最小，是肾小球结构中最易受损的部位。

尽管有强有力的证据表明足细胞损伤是肾小球疾病如局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、微小病变(MCD)、糖尿病肾病(DN)和狼疮性肾炎(LN)发病机制的关键媒介，但针对足细胞的有效治疗仍是一个巨大的挑战。但发明人发现，目前尚无有效治疗或预防肾小球硬化和足细胞损伤的药物，仅限于对症治疗，对肾功能的改善有限。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供靶向肾脏CD8⁺T_RM形成与活化在肾小球损伤中的应用。本发明通过研究意外发现，肾脏中存在T_RM，在小鼠肾小球损伤疾病模型以及人中CD8⁺并非CD4⁺T_RM的比例数量升高。病理条件下，肾脏CD8⁺T_RM来源于外周血浸润。进一步研究发现，肾皮质的IL-15水平的升高是促进肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的关键因素，进而加重肾小球硬化和足细胞损伤。而针对IL-15信号通路使用IL-15及其受体CD122的封闭抗体显著改善小鼠模型中的肾小球硬化症状。基于上述研究成果，从而完成本发明。

本发明的第一个方面，提供靶向抑制肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的物质在如下a1)-a5)至少一种中的应用：

a1)减轻蛋白尿症状和/或制备减轻蛋白尿症状的产品；

a2)抑制肾小球系膜增生和/或制备抑制肾小球系膜增生的产品；

a3)减轻足细胞损伤和/或制备减轻足细胞损伤的产品；

a4)减轻肾小球硬化和/或制备减轻肾小球硬化的产品；

a5)治疗肾小球损伤相关疾病和/或制备治疗肾小球损伤相关疾病的产品。

本发明的第二个方面，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少包括靶向抑制肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的物质。

所述靶向抑制肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的物质可以为IL-15信号阻断剂；所述IL-15信号阻断剂可以为小分子化合物或抗体，优选为抗体，在本发明的一个具体实施方式中，所述IL-15信号阻断剂可以为IL-15信号阻断抗体，包括Anti-IL-15/CD122。

本发明的第三个方面，提供上述组合物在如下任意一种或多种中的应用：

a1)减轻蛋白尿症状和/或制备减轻蛋白尿症状的产品；

a2)抑制肾小球系膜增生和/或制备抑制肾小球系膜增生的产品；

a3)减轻足细胞损伤和/或制备减轻足细胞损伤的产品；

a4)减轻肾小球硬化和/或制备减轻肾小球硬化的产品；

a5)治疗肾小球损伤相关疾病和/或制备治疗肾小球损伤相关疾病的产品。

本发明的第四个方面，提供一种肾小球损伤相关疾病的治疗方法，所述治疗方法包括向受试者施用治疗有效剂量的IL-15信号阻断剂或上述组合物。

需要说明的是，肾小球损伤相关疾病的治疗至少包括改善肾小球硬化和足细胞损伤。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

1、上述技术方案利用动物模型在生化功能和组织细胞水平上科学地评价并证明了IL-15信号阻断抗体(Anti-IL-15/CD122)对慢性肾小球疾病的确切的改善和治疗作用。

2、上述技术方案所涉及的Anti-IL-15/CD122对正常对照组小鼠的相关病理指标无显著影响，具有很好的安全性。

3、上述技术方案利用Transwell实验科学的评价并证明了IL-15信号阻断抗体(Anti-IL-15/CD122)改善活化的CD8⁺T_RM引起的足细胞损伤，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中质谱流式检测人和小鼠生理水平的肾脏区域免疫微环境组成结果图。

其中，图1A为质谱流式检测正常人的肾脏CD45⁺细胞的组成成员降维图。

图1B为质谱流式检测正常小鼠的肾脏CD45⁺细胞的组成成员降维图。

图1C为正常人和小鼠肾脏CD45⁺细胞的热图分析。

图1D为正常人肾脏CD3,CD69,CD45RA,CCR7的降维图。

图1E为正常小鼠肾脏CD3,CD69,CD44的降维分析图。

图2为本发明实施例中流式细胞术检测肾脏CD69⁺记忆T细胞与CD69^-记忆T细胞的趋化性，活性比较统计图。

其中，图2A为流式细胞术检测肾脏CD69⁺记忆T细胞与CD69^-记忆T细胞CXCR3和CD62L的表达统计图。

图2B为流式细胞术检测肾脏IFN-γ和perforin的表达统计图。

图3为本发明实施例中阿霉素肾病以及db/db小鼠模型中肾脏CD8⁺T_RM比例活性结果图。

其中，图3A为流式细胞术检测阿霉素肾病小鼠肾脏CD8⁺T_RM的示意图及统计图。

图3B为流式细胞术检测阿霉素肾病小鼠肾脏CD4⁺T_RM的统计图。

图3C为流式细胞术检测db/db小鼠肾脏CD8⁺T_RM的示意图及统计图。

图3D为流式细胞术检测CD4⁺T_RM的统计图。

图3E为流式细胞术检测阿霉素肾病小鼠肾脏CD8⁺T_RM表达IFN-γ和Granzyme B的统计图。

图3F为流式细胞术检测db/db小鼠肾脏CD8⁺T_RM表达IFN-γ和Perforin的统计图。

图4为本发明实施例中FSGS和DKD患者肾脏病理切片染色统计肾小球周围的CD8⁺，CD4⁺T_RM数量结果图。

其中图4A为正常人，FSGS，DN患者肾脏CD8⁺T_RM细胞免疫荧光染色结果图。

图4B为正常人，FSGS，DN患者肾脏CD4⁺T_RM免疫荧光染色结果图。

图5为本发明实施例中阿霉素肾病小鼠使用FTY720后证明病理条件下肾脏CD8⁺T_RM的形成来源于外周浸润而不是自身增殖结果图。

其中图5A为阿霉素肾病模型小鼠给予FTY720的模式图。

图5B为流式细胞术检测肾脏CD8⁺T_RM表达Ki-67的模式图与统计图。

图6为本发明实施例中阿霉素肾病的裸鼠回输CD8⁺CD69^-CD44⁺T细胞后检测肾脏CD8⁺T细胞的表型结果图。

其中图6A为向阿霉素肾病的裸鼠回输CD8⁺CD69^-CD44⁺T细胞的模式图。

图6B为流式检测肾脏CD8⁺T细胞表达CD69的比例统计图。

图6C为流式检测肾脏CD8⁺T细胞表达CXCR3的比例统计图。

图7为本发明实施例中小鼠阿霉素肾病模型中肾皮质IL-15的水平明显升高结果图。

其中，图7A为Elisa检测con组，ADR组小鼠肾皮质IL-15的水平统计图。

图7B为阿霉素肾病小鼠肾皮质IL-15和UACR的相关性分析统计图。

图8为本发明实施例中IL-15并非IL-2可以体外诱导CD8⁺T_RM的形成与活化结果图。

其中，图8A为流式细胞术检测脾脏CD8⁺CD44⁺细胞的CD69^-向CD69⁺转化的比例统计图。

图8B为流式细胞术检测脾脏CD8⁺CD69⁺CD44⁺细胞表达IFN-γ的比例统计图。

图9为本发明实施例中Anti-CD122封闭抗体抑制IL-15体外诱导CD8⁺T_RM的形成与活化结果图。

其中，图9A为CD122在肾脏CD8⁺T_RM的表达示意图。

图9B为Anti-CD122封闭抗体抑制CD8⁺T_RM的形成与活化的统计图。

图10为本发明实施例中Anti-IL-15/CD122抗体的使用通过抑制阿霉素肾病小鼠肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化进而改善肾小球硬化与足细胞损伤的实验结果图。

其中，图10A为向阿霉素肾病的裸鼠回输CD8⁺CD69^-CD44⁺T细胞，同时给予Anti-IL-15/CD122抗体治疗的模式图。

图10B为流式细胞术检测小鼠肾脏CD8⁺T_RM细胞的统计图。

图10C为流式细胞术检测小鼠肾脏CD8⁺T_RM细胞表达IFN-γ的统计图。

图10D为小鼠尿液的尿肌酐与尿素氮的比值(UACR)统计图。

图10E为小鼠肾脏病理切片的PAS染色与透射电镜示意图。

图10F为小鼠肾脏病理切片nephrin，podocin免疫染色示意图。

图11为本发明实施例中db/db小鼠肾皮质IL-15水平明显升高结果图。

其中，图11A为流式细胞术检测db/db小鼠肾皮质IL-15水平统计图。

图11B为db/db小鼠肾皮质IL-15和UACR的相关性分析统计图。

图12为本发明实施例中Anti-IL-15/CD122抗体的使用通过抑制db/db小鼠肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化进而改善肾小球硬化与足细胞损伤的实验结果图。

其中，图12A为db/db小鼠给予Anti-IL-15/CD122治疗的模式图。

图12B为流式细胞术检测小鼠肾脏CD8⁺T_RM细胞的统计图。

图12C为流式细胞术检测小鼠肾脏CD8⁺T_RM细胞表达IFN-γ的统计图。

图12D为小鼠UACR统计图。

图12E为小鼠肾脏病理切片的PAS染色与透射电镜示意图。

图12F为小鼠肾脏病理切片nephrin，podocin免疫染色示意图。

图13为本发明实施例中体外使用Anti-IL-15/CD122抗体明显减少活化的肾脏CD8⁺T_RM引起的足细胞损伤结果图。

其中，图13A为流式细胞术检测小鼠足细胞凋亡比例的示意图及统计图。

图13B为qPCR检测小鼠足细胞podocin的表达统计图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

术语解释：

局灶节段性肾小球硬化(focal glomerular sclerosis,FSGS)是一种在儿童和青少年中常发作的肾病综合症，也是造成成年人肾功能衰竭的重要原因。

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)由糖尿病引起的肾脏疾病，属于糖尿病最常见的微血管并发症。目前认为与多种因素有关，在一定的遗传背景、危险因素共同作用下发病。可导致蛋白尿、水肿、高血压等，严重者可引起肾衰竭，危及生命。

如前所述，目前尚无有效治疗或预防肾小球硬化和足细胞损伤的药物，仅限于对症治疗，对肾功能的改善有限。

组织定居记忆性T细胞(T_RM)是近年来新发现的一类记忆性T细胞。与循环T细胞相比，T_RM不存在于外周血，并且在表型、功能和代谢方面与循环T细胞群显著不同。在抗原刺激T细胞分化为效应性T细胞后迁移到许多非淋巴器官中，并在原位分化成记忆性T细胞而定居下来。当在该组织中遇到相同抗原刺激时会迅速发生应答。T_RM在病原体感染，肿瘤免疫，自身免疫病中发挥重要作用。最近的研究表明，足细胞损伤与免疫稳态的破坏有关。多种免疫细胞尤其是T淋巴细胞参与了慢性肾脏疾病的发生发展。基于以上背景，发明人认为，肾脏T_RM可能参与了足细胞损伤，同时也为肾小球疾病潜在治疗靶点的寻找提供理论基础。

经一系列试验研究，发明人获得如下研究成果：

具体的，本发明通过质谱流式分析技术证明无论是正常人还是小鼠肾脏，T淋巴细胞所占的比例较大。同时存在以CD69⁺为标记的T_RM细胞。

本发明通过流式细胞术比较了小鼠肾脏非定居的记忆T细胞和定居的记忆T细胞的趋化性以及活性特征。

本发明构建了阿霉素肾病与db/db(30周)二型糖尿病小鼠模型，通过流式细胞术检测发现模型组肾脏CD8⁺并非CD4⁺T_RM的比例升高，活性增强。

本发明通过FSGS和DN患者肾组织切片染色发现CD8⁺并非CD4⁺T_RM在肾小球周围增多。

本发明证明了病理条件下肾脏的CD8⁺T_RM来源于外周血而并非自身增殖。

本发明通过检测阿霉素肾病和db/db小鼠模型肾皮质组织的IL-15水平，发现了模型组肾皮质分泌的IL-15水平升高。同时IL-15促进CD8⁺T_RM的分化与活化。

本发明使用了IL-15信号通路阻抗体Anti-IL-15/CD122，检测到两种抗体明显改善阿霉素肾病模型，db/db模型的蛋白尿症状，肾小球硬化以及足细胞损伤。

本发明构建了Transwell模拟肾脏微环境，发现只有活化的CD8⁺T_RM明显促进足细胞损伤。同时使用了IL-15信号阻断抗体Anti-IL-15/CD122，检测到两种抗体的使用明显改善足细胞损伤。

基于上述研究成果，本发明的一个典型具体实施方式中，提供靶向抑制肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的物质在如下a1)-a5)至少一种中的应用：

a1)减轻蛋白尿症状和/或制备减轻蛋白尿症状的产品；

a2)抑制肾小球系膜增生和/或制备抑制肾小球系膜增生的产品；

a3)减轻足细胞损伤和/或制备减轻足细胞损伤的产品；

a4)减轻肾小球硬化和/或制备减轻肾小球硬化的产品；

a5)治疗肾小球损伤相关疾病和和/或制备治疗肾小球损伤相关疾病的产品。

在本发明中，肾小球损伤相关疾病包括肾小球硬化和足细胞损伤。

本发明的又一具体实施方式中，所述靶向抑制肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的物质包括IL-15信号阻断剂，所述IL-15信号阻断剂可以为小分子化合物或抗体，优选为抗体，在本发明的一个具体实施方式中，所述IL-15信号阻断剂可以为IL-15信号阻断抗体，包括Anti-IL-15/CD122。

本发明的又一具体实施方式中，a1)-a5)中，所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用，比如在本申请中，通过构建阿霉素肾病模型小鼠和db/db小鼠模型进而对其施加IL-15/CD122封闭抗体，观察其生理和病理变化，从而可以对相关疾病机制等进行基础研究。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少包括靶向抑制肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的物质。

本发明的又一具体实施方式中，所述靶向抑制肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的物质可以为IL-15信号阻断剂；所述IL-15信号阻断剂可以为小分子化合物或抗体，优选为抗体，在本发明的一个具体实施方式中，所述IL-15信号阻断剂可以为IL-15信号阻断抗体，包括Anti-IL-15/CD122。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述组合物在如下任意一种或多种中的应用：

a1)减轻蛋白尿症状和/或制备减轻蛋白尿症状的产品；

a2)抑制肾小球系膜增生和/或制备抑制肾小球系膜增生的产品；

a3)减轻足细胞损伤和/或制备减轻足细胞损伤的产品；

a4)减轻肾小球硬化和/或制备减轻肾小球硬化的产品；

a5)治疗肾小球损伤相关疾病和和/或制备治疗肾小球损伤相关疾病的产品。

在本发明中，肾小球损伤相关疾病包括肾小球硬化和足细胞损伤。

所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验实际可以供基础研究使用。

根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。

所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、***胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种肾小球损伤相关疾病的治疗方法，所述治疗方法包括向受试者施用治疗有效剂量的IL-15信号阻断剂或上述组合物。

需要说明的是，肾小球损伤相关疾病的治疗至少包括改善肾小球硬化和足细胞损伤。

如上所述，所述IL-15信号阻断剂可以为小分子化合物或抗体，优选为抗体，在本发明的一个具体实施方式中，所述IL-15信号阻断剂可以为IL-15信号阻断抗体，包括Anti-IL-15/CD122。

所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。

所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织***、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例

一、实验步骤

1.肾脏组织区域免疫微环境组成分析

1.1肾脏区域免疫微环境组成(图1A，C左)

1.1.1人肾脏区域免疫微环境组成

选用临床上肾癌患者的癌旁组织，研磨组织并消化，提取肾脏单个核细胞。用上机缓冲液配制好染色抗体进行质谱流式上机。使用降维算法t-SNE将高维数据在两个维度上可视化，显示每个聚类的分布和标记的表达，以及各组之间的差异。

1.1.2小鼠肾脏区域免疫微环境组成(图1B，C右)

选用正常的WT Balb/c小鼠肾脏组织，研磨组织并消化，提取肾脏单个核细胞。用上机缓冲液配制好染色抗体进行质谱流式上机。使用降维算法t-SNE将高维数据在两个维度上可视化，显示每个聚类的分布的表达，以及各组之间的差异。

1.2肾脏中T淋巴细胞标记在肾脏区域免疫微环境中的分布

1.2.1 CD3，CD69，CD45RA和CCR7在人的肾脏区域免疫微环境中的分布(图1D)

按照1.1.1的步骤进行操作，使用降维算法t-SNE将高维数据在两个维度上可视化，显示每个标记的分布与表达，以及各组之间的差异。

1.2.2 CD3，CD69，CD44在小鼠肾脏区域免疫微环境中的分布(图1E)

按照1.1.2的步骤进行操作，使用降维算法t-SNE将高维数据在两个维度上可视化，显示每个标记的分布与表达，以及各组之间的差异。

2.肾脏T_RM的表型特征分析

2.1正常小鼠肾脏T_RM的趋化，归巢特性的表征(图2A)

选用正常的WT Balb/c小鼠肾脏，充分研磨并用胶原酶进行消化，通过percoll密度梯度离心得到肾脏的单个核细胞。利用流式染色技术对单个核细胞进行胞膜染色。流式上机检测肾脏T_RM(CD3⁺CD69⁺CD44⁺)与肾脏记忆性非定居T细胞(CD3⁺CD69^-CD44⁺)的CXCR3和CD62L的表达丰度。

2.2正常小鼠肾脏T_RM的细胞活性的表征(图2B)

选用正常的WT Balb/c小鼠肾脏，充分研磨并用胶原酶进行消化，通过percoll密度梯度离心得到肾脏的单个核细胞。利用流式染色技术对单个核细胞进行胞膜染色。随后破膜处理进行胞内染色，流式上机检测肾脏T_RM(CD3⁺CD69⁺CD44⁺)与肾脏记忆性非定居T细胞(CD3⁺CD69^-CD44⁺)的IFN-γ和perforin的表达丰度。

3.小鼠和人的肾小球损伤中T_RM的比例活性表征(图3)

3.1小鼠肾小球损伤中T_RM的比例活性表征

构建阿霉素肾病模型与db/db二型糖尿病小鼠模型(30周龄)取出小鼠肾脏，充分研磨并用胶原酶消化，通过percoll密度梯度离心得到肾脏的单个核细胞，利用流式染色技术对单个核细胞进行胞膜染色。流式上机检测肾脏CD4⁺和CD8⁺T_RM的比例，同时进行胞内染色，检测肾脏CD8⁺T_RM的活性。

3.2 FSGS和DN患者肾脏T_RM的分布

免疫荧光检测FSGS与DN患者肾脏中肾小球周围T_RM的分布，同时与癌旁肾脏比较T_RM的数量变化。

4病理条件下肾脏CD8⁺T_RM主要来源于外周血浸润的CD69^-T细胞

4.1体内证明病理条件下肾脏CD8⁺T_RM来自外周浸润的T细胞(图5)

向阿霉素肾病模型小鼠注射FTY720，6周后取出小鼠肾脏，充分研磨并用胶原酶消化，通过percoll密度梯度离心得到肾脏的单个核细胞，利用流式染色技术对单个核细胞进行胞膜染色，随后破核处理，进行核内Ki-67染色，检测肾脏CD8⁺T_RM的增殖水平。

4.2体内证明肾脏CD8⁺T_RM来自浸润的CD69^-T细胞(图6)

购买无胸腺小鼠nude mice(Balb/c种系)构建阿霉素肾病模型，静脉回输CD8⁺CD69^-CD44⁺T淋巴细胞，6周后取出小鼠肾脏，充分研磨并用胶原酶消化，通过percoll密度梯度离心得到肾脏的单个核细胞，流式细胞术检测小鼠肾脏T淋巴细胞的表型。

5 IL-15促进CD8⁺T_RM的形成与活化

5.1阿霉素肾病模型小鼠肾皮质IL-15检测(图7)

通过Elisa检测小鼠肾皮质组织IL-15的含量。同时用全自动生化仪分析小鼠尿微量白蛋白与尿肌酐的比值(UACR)，GraphpadPrism软件进行相关性分析。

5.2 IL-15促进CD8⁺T_RM的形成与活化(图8)

5.2.1 IL-15促进CD8⁺T_RM的形成

提取脾脏单个核细胞，加入重组小鼠IL-15(50ng/mL)连续刺激3天。流式细胞仪检测其中CD8⁺CD44⁺T淋巴细胞CD69⁺的比例。

5.2.2 IL-15促进CD8⁺T_RM的活化

提取脾脏单个核细胞，加入重组小鼠IL-15(50ng/mL)连续刺激3天。流式细胞仪检测其中CD8⁺CD69⁺CD44⁺T细胞产生IFN-γ的比例。

5.3 Anti-CD122对CD8⁺T_RM的形成与活化的影响(图9)

5.3.1 CD122的表达

提取肾脏单个核细胞，流式胞膜染色CD122，检测其在肾脏的CD8⁺T_RM以及肾脏CD8⁺非T_RM的表达。

5.3.2 Anti-CD122对CD8⁺T_RM的形成与活化的影响

提取脾脏单个核细胞，加入重组小鼠IL-15(50ng/mL)连续刺激3天。同时加入Anti-CD122，流式细胞仪检测CD8⁺CD69⁺CD44⁺T细胞的比例以及其产生IFN-γ的比例。

6 IL-15/CD122封闭抗体对CD8⁺T_RM的形成与活化的影响，以及对肾小球硬化与足细胞损伤的作用

6.1 IL-15/CD122封闭抗体对阿霉素肾病模型小鼠CD8⁺T_RM的形成与活化的影响，以及对肾小球硬化与足细胞损伤的作用(图10)

对回输过T细胞的阿霉素肾病小鼠腹腔注射Anti-IL-15/CD122。利用流式细胞术检测肾脏CD8⁺T_RM的比例与IFN-γ的产生；利用全自动生化仪检测小鼠尿液微量白蛋白与尿肌酐的比值(UACR)；利用PAS染色技术检测小鼠肾小球糖原累积情况；利用免疫荧光染色检测足细胞的nephrin，podocin的表达。

6.2 db/db小鼠肾皮质IL-15水平检测(图11)

通过Elisa检测小鼠肾皮质组织IL-15的含量。同时用全自动生化仪分析小鼠尿微量白蛋白与尿肌酐的比值(UACR)，GraphpadPrism软件进行相关性分析。

6.3 IL-15/CD122封闭抗体对db/db小鼠肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的影响，以及对肾小球硬化与足细胞损伤的作用(图12)

对db/db小鼠腹腔注射Anti-IL-15/CD122抗体。利用流式细胞术检测肾脏CD8⁺T_RM的比例与IFN-γ的产生；利用全自动生化仪检测小鼠尿液微量白蛋白与尿肌酐；利用PAS染色技术检测小鼠肾小球糖原累积情况；利用免疫荧光染色检测足细胞的nephrin，podocin的表达。

6.4体外实验：IL-15/CD122封闭抗体针对足细胞损伤的作用(图13)

6.4.1小鼠足细胞凋亡检测

体外实验利用Transwell将小鼠足细胞系与阿霉素肾病模型组的CD8⁺T_RM细胞分隔开，同时向体系中加入Anti-IL-15/CD122封闭抗体，流式细胞仪检测小鼠足细胞凋亡比例。

6.4.2小鼠足细胞podocin的mRNA水平检测

体外实验利用Transwell将小鼠足细胞系与阿霉素肾病模型组的CD8⁺T_RM细胞分隔开，同时向体系中加入Anti-IL-15/CD122封闭抗体，qPCR实验检测小鼠足细胞podocin的表达水平。

二、实验结果

1.肾脏组织区域免疫微环境组成分析

1.1肾脏区域免疫微环境组成(图1A，C左)

1.1.1人肾脏区域免疫微环境组成

正常人肾脏中T淋巴细胞含量丰富。这提示我们T淋巴细胞可能参与肾脏疾病的发生发展。

1.1.2小鼠肾脏区域免疫微环境组成(图1B，C右)

正常小鼠肾脏中T淋巴细胞含量丰富。这提示我们T淋巴细胞可能参与肾脏疾病的发生发展。

1.2肾脏中T淋巴细胞标记在肾脏区域免疫微环境中的分布

正常人和小鼠肾脏中存在T_RM

2.肾脏T_RM的表型特征分析

2.1正常小鼠肾脏T_RM的趋化，归巢特性的表征(图2A)

正常小鼠肾脏T_RM(CD3⁺CD69⁺CD44⁺)相比非定居记忆性T细胞高表达趋化因子受体CXCR3，低表达归巢受体CD62L。突出其定居的特性。

2.2正常小鼠肾脏T_RM的细胞活性的表征(图2B)

正常小鼠肾脏T_RM(CD3⁺CD69⁺CD44⁺)相比非定居记忆性T细胞高表达IFN-γ和perforin。

3.小鼠和人的肾小球损伤中T_RM的比例活性表征(图3)

3.1小鼠肾小球损伤中T_RM的比例活性表征

与对照组小鼠相比，阿霉素肾病和db/db小鼠中CD8⁺T_RM而并非CD4⁺T_RM比例升高，产生的IFN-γ和perforin的比例增多，活性增强。

3.2 FSGS和DN患者肾脏T_RM的分布(图4)

与癌旁肾脏相比，FSGS和DN患者肾脏中CD8⁺T_RM而并非CD4⁺T_RM数量增多，并集中在肾小球球周。说明CD8⁺T_RM可能参与肾小球疾病的发展。

4病理条件下肾脏CD8⁺T_RM主要来源于外周血浸润的CD69^-T细胞

4.1体内证明病理条件下肾脏CD8⁺T_RM来自外周浸润的T细胞(图5)

FTY720作为1-磷酸鞘氨醇的拮抗剂，抑制外周T细胞浸润至组织。我们注射FTY720后发现阿霉素肾病小鼠肾脏CD8⁺T_RM无明显增殖情况，因此我们推断在病理条件下CD8⁺T_RM来源于外周浸润。

4.2体内证明肾脏CD8⁺T_RM来自浸润的CD69^-T细胞(图6)

裸鼠回输实验进一步证明肾脏CD8⁺T_RM可能来自CD69^-T细胞向CD69⁺T细胞的分化。

5 IL-15促进CD8⁺T_RM的形成与活化

5.1阿霉素肾病模型小鼠肾皮质IL-15检测(图7)

肾脏中什么因素可以导致CD8⁺T_RM的形成与活化？有文献报道IL-15可以参与这一过程。因此我们检测了阿霉素肾病小鼠肾皮质组织的IL-15，发现与对照组小鼠相比，IL-15水平升高，同时与小鼠蛋白尿水平呈正相关。

5.2 IL-15促进CD8⁺T_RM的形成与活化(图8)

体外实验用重组IL-15刺激脾脏单个核细胞，发现IL-15促进CD69⁺T细胞的形成，同时促进IFN-γ的产生。而与其有共同受体的IL-2并没有这些作用。

5.3 Anti-CD122对CD8⁺T_RM的形成与活化的影响(图9)

5.3.1 CD122的表达

CD122作为IL-15在T细胞传递信号的受体，在小鼠肾脏CD8⁺T_RM高表达。

5.3.2 Anti-CD122对CD8⁺T_RM的形成与活化的影响

CD122的封闭抗体的使用显著抑制IL-15对CD8⁺T_RM的形成与活化作用。

6 IL-15/CD122封闭抗体对CD8⁺T_RM的形成与活化的影响，以及对肾小球硬化与足细胞损伤的作用

6.1 IL-15/CD122封闭抗体对阿霉素肾病模型小鼠CD8⁺T_RM的影响，肾小球硬化与足细胞损伤的作用(图10)

与单纯的阿霉素肾病小鼠模型组相比，给予IL-15/CD122抗体治疗组的小鼠CD8⁺T_RM的形成与活化明显减少，蛋白尿症状明显减轻，肾小球系膜增生减少，足细胞损伤减轻。

6.2 db/db小鼠肾皮质IL-15水平检测(图11)

db/db小鼠肾皮质IL-15水平升高，同时小鼠与蛋白尿水平呈正相关性，这提示我们小鼠肾脏IL-15可以作为疾病中的重要标志分子，参与疾病的发生发展。

6.3 IL-15/CD122封闭抗体对db/db小鼠肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的影响，以及对肾小球硬化与足细胞损伤的作用(图12)

与单纯的db/db小鼠模型组相比，给予IL-15/CD122抗体治疗组的小鼠CD8⁺T_RM的形成与活化明显减少，蛋白尿症状明显减轻，肾小球系膜增生减少，足细胞损伤减轻。

6.4体外实验：IL-15/CD122封闭抗体对于足细胞的损伤的作用(图13)

体外共培养实验证明活化的CD8⁺T_RM明显促进足细胞凋亡以及功能蛋白podocin的表达，而IL-15/CD122封闭抗体明显抑制足细胞损伤。这提示我们IL-15/CD122作为足细胞损伤治疗的关键靶点。

本发明未尽事宜为公知技术。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.靶向抑制肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的物质在如下a1)-a5)至少一种中的应用：

a1)减轻蛋白尿症状和/或制备减轻蛋白尿症状的产品；

a2)抑制肾小球系膜增生和/或制备抑制肾小球系膜增生的产品；

a3)减轻足细胞损伤和/或制备减轻足细胞损伤的产品；

a4)减轻肾小球硬化和/或制备减轻肾小球硬化的产品；

a5)治疗肾小球损伤相关疾病和和/或制备治疗肾小球损伤相关疾病的产品。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶向抑制肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的物质包括IL-15信号阻断剂，所述IL-15信号阻断剂为小分子化合物或抗体，优选为抗体。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述IL-15信号阻断剂为IL-15信号阻断抗体，包括Anti-IL-15/CD122。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述a1)-a5)中，所述产品为药物或者实验试剂。

5.一种组合物，其特征在于，所述组合物其活性成分至少包括靶向抑制肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的物质。

6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述靶向抑制肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的物质包括IL-15信号阻断剂，所述IL-15信号阻断剂为小分子化合物或抗体，优选为抗体。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述IL-15信号阻断剂为IL-15信号阻断抗体，包括Anti-IL-15/CD122。

8.权利要求5-7任一项所述组合物在如下任意一种或多种中的应用：

a1)减轻蛋白尿症状和/或制备减轻蛋白尿症状的产品；

a2)抑制肾小球系膜增生和/或制备抑制肾小球系膜增生的产品；

a3)减轻足细胞损伤和/或制备减轻足细胞损伤的产品；

a4)减轻肾小球硬化和/或制备减轻肾小球硬化的产品；

a5)治疗肾小球损伤相关疾病和和/或制备治疗肾小球损伤相关疾病的产品。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述产品为药物或者实验试剂；

优选的，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。

10.一种肾小球损伤相关疾病的治疗方法，其特征在于，所述治疗方法包括向受试者施用治疗有效剂量的靶向抑制肾脏CD8⁺T_RM的形成与活化的物质或权利要求5-7任一项所述组合物；

优选的，肾小球损伤相关疾病的治疗至少包括改善肾小球硬化和足细胞损伤。

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