JP6055506B2 - ポリサッカライドによるタンパク質のn末端誘導体化 - Google Patents
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Description
A)非還元性末端でタンパク質反応性アルデヒドを形成する、過ヨウ素酸ナトリウムによるコロミン酸(大腸菌由来のα−2,8結合ポリシアル酸)の酸化を示し、
B)タンパク質アミノ基との安定な不可逆共有結合を形成する、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによるシッフ塩基の選択的還元を示す。
性は、通常より低いpHでPEG−アルデヒドによるタンパク質の還元アルキル化を行うことによって達成される。しかし本方法は、PEGのみとの結合に適用された。
デヒド基と反応し、還元するとタンパク質又はペプチドのN末端誘導体を生成する付加物を産生する。
等の固定化試薬によって行ってもよい。最も直接的な方法は溶解試薬を使用して行われる。酸化剤は好適には過ルテニウム酸、又は好ましくは過ヨウ素酸塩である。1mM〜1Mの範囲の濃度の過ヨウ素酸塩、3〜10の範囲のpH、0℃〜60℃の範囲の温度、1分〜48時間の範囲の時間で酸化を行ってもよい。
キシ水素化ホウ素等である。
はK92、B群髄膜炎菌(meningococci)、又はさらに牛乳若しくはN−CAM)等の自然源に由来し、シアル酸ポリマーは、ナイセリア−メニンジティディス(N. meningitidis)の135群又はV群等のヘテロ高分子ポリマーであり得る。
か又は両方における水溶液中に存在してもよい。
部のいずれかでタンパク質又はペプチドを安定化することが可能な賦形剤を意図する。賦形剤は、安定剤、可溶化剤又は金属イオンであり得る。製剤添加剤の好適な例としては、バッファー、安定剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール、又はアミノ酸のうちの1つ又は複数が挙げられる。これらは単独で又は組合せて使用してもよい。
F68、Brij35及びTriton X100が挙げられる。
HNBは、タンパク質のN末端アミンであるB−NH2由来であり、
Lは化学結合若しくは連結基であるか、又はポリペプチド若しくは合成オリゴマーを含み、
GlyOはシアル酸ユニットであり、
連結基(存在する場合)は、一般式−Y−C(O)−R1−C(O)−(式中、YはNR2又はNR2−NR2であり、R1は上記のような二官能性有機基であり、R2はH又はC1〜6アルキルである)を有する)を有し得る。
有する溶液の粘性を高め得る。新規の方法は、モノポリシアル化タンパク質複合体の生成に関して特別な価値がある。このことは、低pHでN末端のアミン基がプロトン化すればするほど、反応性が高くなるという理解に基づく。
炭酸アンモニウム、エチレングリコール、ポリエチレングリコール(8kDa)、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(98%超純粋)、メタ過ヨウ素酸ナトリウム及び分子量マーカーは、Sigma Chemical Laboratory(英国)から得た。使用されるコロミン酸、鎖状α
−(2→8)結合大腸菌K1ポリシアル酸(平均22.7kDa 高多分散度1.34、39kDa 多分散度1.4、11kDa 多分散度1.27)はCamida(アイルランド)から、放射性ヨウ化物(Na125I)はAmersham(英国)から購入した。他の材料は
、2,4ジニトロフェニルヒドラジン(Aldrich Chemical Company、英国)、透析チューブ(3.5kDa及び10kDaのカットオフ限界、Medicell International Limited、英国)、Sepharose SP HiTrap、PD−10カラム(Pharmacia、英
国)、トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル(4%〜20%及び16%)、トリス−グリシンドデシル硫酸ナトリウムランニングバッファー及びローディングバッファー(Novex、英国)を含んでいた。脱イオン水は、Elgastat Option4水精製ユ
ニット(Elga Limited、英国)から得た。使用される全ての試薬は分析用グレードであった。プレートリーダー(Dynex Technologies、英国)を、タンパク質又はCA分析における分光測定に使用した。B6D2F1マウス(7週齢〜8週齢、体重20g)は、Harlan(英国)から購入し、これらを使用する前に少なくとも1週間順化させた。
FF(カラム1ml又は5ml、Amersham Biosciences、英国)、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、Hitrap Butyl HPカラム(1ml又は5ml、Amersham Biosciences、英国)、マウスレプチン組み換え体(Biomyx)、エリスロポエチン(EPO)及び非グリコシル化EPO(NGEPO)(分子量30600、SIIL、インド)、トリス(Sigma、英国)、酢酸ナトリウム(BDH、英国)、リン酸ナトリウム(BDH、英国)、
インスリン(Sigma、英国)。
1. タンパク質及びコロミン酸測定
レゾルシノール試薬を用いたポリシアル酸(シアル酸として)の定量的評価は、別記されるようなレゾルシノール法(Svennerholm, 1957)によって行われた(Gregoriadis et.al., 1993;Fernandes and Gregoriadis, 1996, 1997)。タンパク質を、BCA比色法又は280nmでのUV吸光によって測定した。
2.1 コロミン酸の活性化
新たに調製した0.02Mのメタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)溶液(8倍モル過剰)を20℃でCAと混合し、反応混合物を暗所で15分間、磁気的に攪拌した。その後、2倍体積のエチレングリコールを反応混合物に添加して過剰なNaIO4を消費し、混合物を20℃でさらに30分間攪拌した。酸化したコロミン酸を、4℃で、0.01%炭酸アンモニウムバッファー(pH7.4)に対して十分に(24時間)透析した(分子量カットオフが3.5kDaの透析チューブ)。限外濾過(分子量カットオフが3.5kDaを超える)を、透析チューブからCAO溶液を濃縮するために用いた。必要な体積に濃縮した後、濾液を凍結乾燥し、後に使用するまで−40℃で保存した。代替的に、エタノールによる(2回の)析出によって、CAを反応混合物から回収した。
2.2 CA及び誘導体の酸化状態の測定
コロミン酸の酸化度の定量的評価は、カルボニル化合物との相互作用において、やや溶けにくい2,4ジニトロフェニル−ヒドラゾンを生じる2,4ジニトロフェニルヒドラジン(2,4−DNPH)を用いて行われた。非酸化コロミン酸(CA)/酸化コロミン酸(CAO)を、2,4−DNPH試薬(1.0ml)に添加し、溶液を振盪し、その後、結晶性沈殿が観察されるまで37℃に置いた(Shriner et al., 1980)。CAの酸化度(定量的)は、アルカリ性溶液中のフェリシアン化物イオンのフェロシアン化第二鉄(ペルシアンブルー)への還元(その後630nmで測定する)に基づく方法(Park and Johnson, 1949)を用いて測定した。この例では、グルコースを標準として用いた。
2.3 ゲル浸透クロマトグラフィ
コロミン酸試料(CA及びCAO)をNaNO3(0.2M)、CH3CN(10%、5mg/ml)に溶解し、2倍を超えるGMPWXLカラム上で、屈折率を検出しながら(GPCシステム:VE1121 GPC溶媒ポンプ、VE3580 RI検出器及びTrisec3ソフトウェア(Viscotek Europe Ltd.)による照合)、クロマトグラフィを行った。試料(5mg/ml)を、0.45μmナイロン膜で濾過し、移動相として0.2MのNaNO3及びCH3CN(10%)を用いて0.7cm/分で流した。
結果
コロミン酸(CA)(ポリシアル酸)は、N−アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)残基の鎖状のα−2,8結合したホモポリマーである(図1a)。室温で20mMの過ヨウ素酸塩を使用して15分間、コロミン酸の酸化曝露を行った(Lifely et. al., 1981)。ゲル浸透クロマトグラフィ、及び酸化コロミン酸(CAO)に関して得られたクロマトグラフによって、過ヨウ素酸塩処理後の内部のα−2,8結合したNeu5Ac残基の完全性を分析し、その物質を天然CAのものと比較した。酸化及び天然のCAは、ほとんど同一の溶出プロファイルを示し、連続する酸化工程によって、ポリマー鎖の顕著な断片化が起こる証拠はないことが見出された。
ド、n=3±標準偏差)。
3. 製剤添加剤を使用したN末端タンパク質−CA複合体の調製
3.1 GCSF−CA複合体の調製
G−CSF(18.8kDa)は溶液として与られ(5%ソルビトール、0.025mg/mlのポリソルベート80を含有する10mMの酢酸ナトリウムバッファー(pH4.0)中で1.05mg/ml)、2℃〜8℃で保存した。必要量のGCSFをエッペン
ドルフ管に入れ、氷上に置いた。結合のために添加するCA(例えば酸化又は非酸化CA、11モル過剰を超えるタンパク質)の量を式:
CAの重量={タンパク質量(g)/(タンパク質分子量)}×(CA分子量)×(モル過剰のCA)
に基づき算出した。
置くことによってゆっくり混合させた。最終反応混合物中で50mM又は3.17mg/mlにするために、100mg/mlのNaCNBH3溶液を添加し、ゆっくりと混合して、最終反応混合物のpHを調べ、必要に応じて4±1℃の1MのNaOH/HClでpHを5.5に調整した。最後に10mMのNaOAc、5%ソルビトール(pH5.5)を用いて、反応体積を調整し、反応混合物中で0.67mg/mlのタンパク質濃度を得た。管を封止し、所望の温度(4±1℃)で24時間撹拌した。適切な方法で反応を止め、MNFS60セル、SDS−PAGE(4%〜20%トリスグリシンゲルを使用する)、SE−HPLC;superose6カラム)でのin vitro活性分析のために試料を回収し、反応混合物のpHを調べた。いかなる析出物も取り除くために、反応混合物を13000rpmで5分間遠心分離した後、SE−HPLC分析及び精製を行った。SE−HPLCに好ましいバッファーは0.1Mのリン酸Na(pH6.9)であった。3.2 GCSF−CA複合体の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料をAEXバッファーA(20mMの酢酸ナトリウム、50mMの塩化ナトリウム(pH5.0))で希釈して(反応混合物1.5ml+バッファーA 9ml)、pHを調べ、必要に応じてpHを5.0に調整し、AEXバッファーAで予め平衡化したAEXカラムに充填した。充填画分を回収し、標識した。カラムをAEXバッファーA(少なくとも5カラム体積)で洗浄し、画分(各画分1.5カラム体積)を回収し
、標識した。AEXバッファーB(50mMのリン酸ナトリウム、0.65Mの塩化ナトリウム(pH7.0))で生成物を溶離し、画分(各1カラム体積の画分、6カラム体積)を回収し、標識した。2つの連続した画分がタンパク質含量中に存在しなかった場合(UV280nm)、次の工程に移った。精製中は試料を氷上に置いた。UV(280nm)でタンパク質濃度を分析した(1mg/mlのG−CSFの吸光度は約0.872であった)。SDS−PAGE及びSE−HPLCのために試料を回収した。混合物から遊離CAを取り除くために、HICを使用した。必要に応じて、試料を濃縮した。
結果
低pH(pH5.5)及び4±1℃で反応を行うことによってN末端で選択的に、(20mgスケールで)顆粒球−コロニー刺激因子(G−CSF)のコロミン酸(CA)複合体を調製及び精製する手法が上記に詳述される。これは、シアノ水素化ホウ素ナトリウム存在下での結合、その後の遊離G−CSFを取り除くためのイオン交換クロマトグラフィ(AEX)を用いた精製、その後の疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)によるCAの除去を伴う。N末端のαアミノ基の選択的誘導体化に有利なように、及びまた反応中のGCSFの凝集を最小限にするのに低pHを用いた。最終反応バッファーの組成は、10mMのNaOAc(pH5.5)において5%ソルビトール、0.5mg/mlのTween20であった。
4.1 製剤添加剤によるN末端レプチン−CA複合体の調製
レプチンは凍結乾燥粉末として与えられ(分子量16240)、−80℃で保存した。結合のために添加するコロミン酸(例えば酸化又は非酸化コロミン酸、7.5モル過剰)の量を算出した。最小量の酢酸ナトリウムバッファー中にコロミン酸を溶解し、濾過して、pHを5.5に調整した。レプチン溶液(20mMの酢酸ナトリウム、1%スクロース、10mMのL−グルタミン酸および0.01% Tween20(pH5.5)におけるタンパク質)中にコロミン酸溶液を添加した後、反応混合物中で50mM又は3.17mg/mlにするのに必要なμlのNaCNBH3を添加して、ゆっくり混合し、最終反応混合物のpHを調べて、pHを5.5に調整した。管を封止し、所望の温度(4±1℃)で24時間撹拌した。インキュベート後、(SDS−PAGE、SE−HPLC等のために)必要な試料を回収した。UV(280nm)でタンパク質濃度を分析した(1mg/mlのレプチンの吸光度は0.878である)。タンパク質の誘導体化度及び安定性への影響が異なる様々なプロセスを試験した。
4.2 レプチン−CA複合体の精製及び特徴付け
余分なCA及び遊離レプチンを反応混合物から取り除くのに、それぞれHIC及びIECを使用した。タンパク質分析及びCA分析のためにアリコートを取り出した。使用するまで残りを−80℃で保存した。SDS−PAGE、SE−HPLC、ウェスタンブロッティング、CA及びタンパク質分析等によって、生成物を特徴付けた。
結果
低pH(pH5.5)及び4±1℃で反応を行うことによってN末端で選択的に、(5mgスケールで)レプチンのコロミン酸(CA)複合体を調製及び精製する手法が上記に示されている。これは、シアノ水素化ホウ素ナトリウム存在下での結合、その後の遊離G−CSFを取り除くためのイオン交換クロマトグラフィ(AEX)を用いた精製、その後の疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)によるCAの除去を伴う。N末端のαアミノ基の選択的誘導体化に有利なように、及びまた反応中のGCSFの凝集を最小限にするのに低pH及び製剤添加剤を用いた。最終反応バッファーの組成は、20mMの酢酸ナトリウム、1%スクロース、10mMのL−グルタミン酸及び0.01% Tween20(pH5.5)中のタンパク質であった。
5.1 N末端エリスロポエチン(EPO)−CA複合体の調製
EPOは溶液として与えられ(10mMのリン酸バッファー、130mMのNaCl(pH7.0)中0.34mg/ml、比活性:110,000U/ml、分子量30600)、−32℃で保存した。タンパク質を2℃〜8℃で解凍し、必要量を2ml容エッペンドルフ管に入れた。必要量のコロミン酸を取り、タンパク質溶液を固体CAに添加しゆっくり混合した。反応混合物中で50mM又は3.17mg/mlにするのに必要なμlのシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を添加し、ボルテックスして、最終反応混合物のpHを調べて、必要に応じてpHを7.4に調整した。管を封止し、所望の温度(4±1℃)で24時間撹拌した。インキュベート後、(例えば活性分析、SDS−PAGE、SE−HPLCのために)必要な試料を回収した。
5.2 epo−CA複合体の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料をHICバッファーA(1.2Mの硫酸アンモニウム(pH6.3))で希釈して(試料1ml+バッファーA 4ml)、HICバッファーAで予め平衡化したHICカラムに充填した。充填画分を回収し、標識した。カラムをHICバッファーA(1.2Mの硫酸アンモニウム(pH6.3))(少なくとも10ml)で洗浄し、画分を回収し、標識した。HICバッファーB(10mMのトリスバッファー(pH7.0))で生成物を溶離し、初めの画分(0.5ml)を回収し、その後の0.5ml〜1ml画分を標識した。精製中は試料を氷上に保持した。
。この分析は、赤血球前駆細胞にEPOを添加すること、及び3H−チミジンの取り込み速度を求めることによってDNA複製速度を測定することによる。in vivoの薬物動態(PK)及び薬力学(PD)試験をB6D2F1マウスで行った。
結果
SE−HPLC(EPOと比較したEPO−CAのリテンションタイムの変化、両方の部分が同時に溶離もする)、イオン交換クロマトグラフィ(AECカラムへの複合体の結合)及びポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE、分子量の高い種のバンドのシフト)によって、EPO−CA複合体の形成を確認した(図5.3)。ポリシアル化試料はin vitroで活性であり、未処理(plain)EPOに対して非常に優れたプ
ロファイル(PK及びPD)を示した。図5.1及び図5.2はin vivoの結果を示す。
無処理の(naked)EPOは溶液として与えられ(20mMのリン酸ナトリウムバッフ
ァー、300mMのNaCl(pH6.65)中0.18mg/ml、比活性:100000U/ml、分子量19000)、−32℃で保存した。タンパク質を2℃〜8℃で解凍し、必要量を2ml容エッペンドルフ管に入れた。結合のために添加するコロミン酸(例えば酸化又は非酸化コロミン酸)の量を算出した。必要量のコロミン酸を秤量し、重量を記録した。タンパク質溶液を固体CAに添加しゆっくり混合した。反応混合物中で50mM又は3.17mg/mlにするのに必要なμlのシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を添加し、ボルテックスして、最終反応混合物のpHを調べて、必要に応じてpHを7.4に調整した。管を封止し、所望の温度(4±1℃)で24時間撹拌した。インキュベート後、(例えば活性分析、SDS−PAGE、SE−HPLCのために)必要な試料を回収した。
6.2 NGepo−CA複合体の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料をHICバッファーA(1.2Mの硫酸アンモニウム(pH6.3))で希釈して(試料1ml+バッファーA 4ml)、HICバッファーAで予め平衡化したHICカラムに充填した。充填画分を回収し、標識した。カラムをHICバッファーA(少なくとも10ml)で洗浄し、画分を回収し、標識した。HICバッファーBで生成物を溶離し、初めの画分(0.5ml)を回収し、その後の0.5ml〜1ml画分を標識した。精製中は試料を氷上に保持した。UV(280nm)でタンパク質濃度を分析した(1mg/mlのnEPOの吸光度は約0.743であった)。SDS−PAGEのために試料を回収した。反応条件によっては、反応混合物中の無処理の遊離EPOがなくなるので、さらなる精製の必要はなかった。無処理のEPOが反応混合物中に存在していた場合は、Vivaspin6(5000 MWCO)を使用してHIC画分含有タンパク質を濃縮し、精製をSE−HPLCによって行うことが可能である。UV(280nm)でタンパク質濃度を分析した(1mg/mlのnEPOの吸光度は約0.743である)。SDS−PAGEのために試料を回収した。
結果
SE−HPLC(NGEPOと比較したNGepo−CAのリテンションタイムの変化、両方の部分が同時に溶離もする)、イオン交換クロマトグラフィ(AECカラムでの複合体の結合)及びポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE、分子量の高い種
のバンドのシフト)によって、NGepo−CA複合体の形成を確認した(図6.1〜図6.3)。図6.3の左側は、24時間後のEPO−CAの39kDaの複合体を示す。ポリシアル化試料はin vitroで活性であり、未処理NGepoに対して非常に優れたプロファイル(PK及びPD)を示した。
7.1 N末端インスリン−CA複合体の調製
インスリンを最低100mMのHClで溶解した後、必要なpHに調整した。結合のためのコロミン酸(例えば酸化又は非酸化コロミン酸)の量を算出した。必要量のコロミン酸を秤量し、最低量の反応バッファー中に溶解し、タンパク質溶液に添加して、ボルテックスミキサを使用してゆっくり混合した。反応混合物1ml当たり4mgの最終濃度を得るのに必要なμlのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。必要に応じて反応混合物中に好適な安定剤を使用した。管を封止し、所望の温度(場合に応じて37℃)で48時間撹拌した。使用するタンパク質によって時間及び温度を変えてもよい。ポリシアル化タンパク質をIEC及びHICで精製した。24時間後、タンパク質−ポリマー複合体が100%に達した。これは、native−page、SDS−page、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ等によって特徴付けられた。
反応混合物試料をAEXバッファーA(0.05Mの酢酸ナトリウム(pH4.4))で5倍に希釈し、pHを調べて、必要に応じてpHを4.4に調整し、AEXバッファーAで予め平衡化したAEXカラム(流速=1ml/分)に充填した。充填画分(各1.5カラム体積の画分)を回収し、標識した。AEXバッファーA(0.05Mの酢酸ナトリウム(pH4.4))でカラムを洗浄し(少なくとも5カラム体積、流速=1ml/分)、画分(各1.5カラム体積の画分)を回収し、標識した。AEXバッファーB(0.05Mの酢酸ナトリウム、1Mの塩化ナトリウム(pH4.4))で生成物を溶離し(流速=1ml/分)、画分(各1カラム体積の画分、6カラム)を回収し、標識した。2つの
連続した画分がタンパク質含量中に存在しなかった場合、次の工程に移った。精製中は試料を氷上に保持した。
結果
SE−HPLC(インスリンと比較したインスリン−CAのリテンションタイムの変化、両方の部分が同時に溶離もする)、イオン交換クロマトグラフィ(CECカラムでの複合体の溶離)及びポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE、分子量の高い種のバンドのシフト)によって、インスリン−CA複合体の形成を確認した(図7.1及び図7.2)。ポリシアル化試料は、天然タンパク質と比べて優れたin vivo有効性を示した。
8.1 N末端インターフェロン−CA複合体の調製
IFNα2bのコロミン酸(CA)複合体を調製及び精製する手法は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム存在下での結合、その後の遊離コロミン酸を取り除くためのHICによる精製、その後のAXC又はSE−HPLC(任意)のいずれかによる非結合IFNの除去を伴う(例として1mgスケール)。
8.2 インターフェロン−CA複合体の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料をHICバッファーA(25mMのトリスバッファー、3Mの塩化ナトリウム(pH7.5))で希釈して(試料1ml+バッファーA 4ml)、HICバッファーAで予め平衡化したHICカラムに充填した。充填画分を回収し、標識した。カラムをHICバッファーA(25mMのトリスバッファー、3Mの塩化ナトリウム(pH7.5))(少なくとも10ml)で洗浄し、画分を回収し、標識した。HICバッファーB(25mMのトリスバッファー(pH7.5))でカラムを溶離し、初めの画分
(0.5ml)を回収し、その後の0.5ml〜1ml画分を回収し、標識した。精製中は試料を氷上に保持した。
結果
SE−HPLC(インターフェロンと比較したインターフェロン−CAのリテンションタイムの変化、両方の部分が同時に溶離もする)、イオン交換クロマトグラフィ(AECカラムへの複合体の結合)及びポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE、分子量の高い種のバンドのシフト)によって、インターフェロン−CA複合体の形成を確認した(図8.1〜図8.2)。ポリシアル化試料はin vitroで活性であり、未処理インターフェロンに対して非常に優れたプロファイル(PK)を示した。
オベスタチンは、2.5kDaの食欲抑制ホルモンである。グレリン遺伝子によってコードされるが、オベスタチンはグレリンの食欲刺激効果に拮抗する。ラットのオベスタチン処理によって、食物摂取の抑制、空腸収縮の阻害、及び体重増加の低減が示されている。
9.2 N末端結合(部位特異的)
15モル過剰の14kDaの酸化したポリシアル酸(PSA)をバッファー中で溶解し、pHを6.0に調整した。それから、オベスタチン及び50mM(最終濃度)のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、pHを再び調整して、反応混合物を必要量にした。18時間、ゆっくりと振盪させながら4±1℃で反応を行った。
9.3 ランダム結合(相対的)
10モル過剰の14kDaの酸化したPSAをバッファー中で溶解し、pHを7.4に調整した。それから、オベスタチン及び50mM(最終濃度)のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、pHを再調整して、反応混合物を必要量にした。18時間、ゆっくりと振盪させながら4±1℃で反応を行った。
結合の解析
サイズ排除高速液体クロマトグラフィ(SE−HPLC)でリテンションタイムの低減、したがってサイズの増大によって、結合を確認する。0.25mL/分の流速で、0.1Mのリン酸ナトリウム(pH6.9)で予め平衡化したSE−HPLC Superose12カラムに結合反応物100μLを注入した。280nmでの吸光度の記録した。
10.1 DNアーゼIのポリシアル化
嚢胞性線維症(CF)患者では、気道中の粘性の化膿分泌物の滞留が、肺機能の低下及び感染の増悪の一因となる。肺の化膿分泌物は、感染に応じて集積する白血球を変性することによって放出される非常に高濃度の細胞外DNAを含有する。デオキシリボヌクレアーゼI(DNアーゼI)によるCF患者の治療によって、DNAが加水分解し、これにより痰の粘弾性が低減する。この治療は、全身性エリテマトーデスの治療及び腫瘍の標的化にも提案されている。
10.2 N末端結合(部位特異的)
20モル過剰の26kDaの酸化したポリシアル酸(PSA)をバッファー中で溶解し、pHを6.0に調整した。それから、ウシDNアーゼI(Samsong & Sigma)及び50
mM(最終濃度)のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、pHを再び調整して、反応混合物を必要量にした。18時間、ゆっくりと振盪させながら、37±1℃及び4±1℃で反応を行った。
10.3 ランダム結合(相対的)
10〜50モル過剰の14kDaの酸化したPSAをバッファー中で溶解し、pHを7.4に調整した。それから、ウシDNアーゼI(Samsong & Sigma)及び50mM(最終
濃度)のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、pHを再び調整して、反応混合物を必要量にした。18時間、ゆっくりと振盪させながら、37±1℃及び4±1℃で反応を行った。
10.4 結合の解析
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)ゲルでの移動性の低減によって、複合体を可視化した(図10.1)。非変性条件下で4%〜20%トリスグリシンゲルで試料を電気泳動した。レーン1:分子量マーカー、2:ブランク、3:DNアーゼI、4:SigmaのDNアーゼI、5:ブランク、6:非酸化PSAを
有するDNアーゼI、7:DNアーゼI酸化PSA(pH7.4)反応物、8:DNアーゼI酸化PSA(pH6.0)反応物。
10.5 複合体の精製
疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)−フェニルセファロースマトリクス、2.0Mの硫酸アンモニウムを含有する開始バッファー、硫酸アンモニウムを有しないバッファー中の溶離を用いて、DNアーゼI−PSA複合体を精製した。それから、溶離画分をイオン交換マトリクスQ−セファロースFast Flowに加え、塩化ナトリウムを含有するバッファーで溶離した。サイズ排除高速液体クロマトグラフィ(SE−HPLC)で、複合体の精製を確認した(図10.2)。0.25mL/分の流速で、0.1Mのリン酸ナトリウム(pH6.9)で予め平衡化したSE−HPLC Superose12カラムに結合反応物100μlを注入した。280nmでの吸光度の記録した。
10.6 活性DNアーゼIの精製
ヘパリン−セファロース(sepahrose)クロマトグラフィによって活性DNアーゼIと
熱不活化DNアーゼIとの混合物から活性DNアーゼIを精製した。低塩バッファー中のカラムにDNアーゼI混合物を加え、漸増勾配の塩化ナトリウムで溶離した。画分A12中のDNアーゼI 1mg当たりの活性は、試料の活性よりもおよそ4倍高かった。
10.7 複合体の活性
複合体の活性を測定し、メチル−グリーン分析(Sinicropi et. al.,(1994) Anal Biochem, 222(2):351-8)を使用して非結合DNアーゼIの活性と比較した。37±1℃
で作製された精製DNアーゼI−PSA複合体は、非結合DNアーゼIと比べて(4mMのCaCl2バッファー(下記を参照されたい))中でおよそ10%の活性を示した。
結論
活性なDNアーゼI−PSA複合体は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で作製されている。複合体は、遊離DNアーゼIから精製され、遊離DNアーゼの活性に比べて、DNアーゼI 1mg当たりの活性はおよそ10%を示す。
参照文献
Claims (15)
- 以下の工程を含む、タンパク質の精製N末端ポリシアル酸誘導体を製造する方法:
(i)pHが7.4の水溶液中でタンパク質のN末端のアミン基でポリシアル酸を反応させる工程であって、実質的にタンパク質のN末端誘導体のみからなる集団を生成する、工程、及び
(ii)pHが6.5〜7.5の水溶液中で、得られたタンパク質のN末端誘導体を精製する工程、
該タンパク質のN末端誘導体が、2〜200個のシアル酸ユニットを含み、
該タンパク質がエリスロポエチン(EPO)である、方法。 - 前記ポリシアル酸が反応性アルデヒド基を有し、工程(i)を還元条件下で行う、請求項1に記載の方法。
- 前記反応性アルデヒド基が前記ポリシアル酸の非還元性末端にある、請求項2に記載の方法。
- 前記反応性アルデヒドが前記ポリシアル酸の還元性末端にあり、前記非還元性末端が、タンパク質のN末端と反応しないように不動態化している、請求項2に記載の方法。
- 製剤添加剤が、工程(i)における前記水溶液に添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記製剤添加剤が、バッファー、安定剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール又はアミノ酸のうちの1つ又は複数から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記糖が、ソルビトール、トレハロース又はスクロースである、請求項6に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項6に記載の方法。
- 前記ポリマーが、PSA、PEG又はヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択されるポリマーである、請求項6に記載の方法。
- 前記金属イオンが、二価の金属イオンである、請求項6に記載の方法。
- 前記バッファーが、リン酸ナトリウム/酢酸ナトリウムバッファーである、請求項6に記載の方法。
- 水素化ホウ素が工程(i)における前記水溶液中に存在することにより、前記還元条件が得られる、請求項2に記載の方法。
- 工程(ii)の前記水溶液のpHが7.0である、請求項1に記載の方法。
- 前記EPOが、グリコシル化されていない、請求項1に記載の方法。
- 前記EPOが、グリコシル化されている、請求項1に記載の方法。
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