JP5542195B2 - エリスロポエチンの多糖誘導体 - Google Patents
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Description
(red blood cell))前駆細胞に対するサイトカインである。ヘマトポエチン又はヘモポエチンとも呼ばれ、腎臓によって産生され、赤血球産生を調節する。
中の製品がある。これは、EPOよりも長い半減期を有することが示されており、頻繁な注射の必要性を低減させる。さらなる新規赤血球造血刺激剤は、慢性腎疾患及び癌に随伴する貧血を治療するための新規PEG化合成ペプチド、Hematideである。これはFan他(2006)によってさらに記載されている。
組成物が最も持続的な効力を示すことを見出した。
よって、n=約80以上のシアル酸残基から、最小でn=2のシアル酸残基までの各種重合度で製造することができる。
デヒド体を得ることができる。この反応を図1及び図2に示す。ここで、
図1は、過ヨウ素酸ナトリウムを用いたコロミン酸(大腸菌由来のα−2,8結合ポリシアル酸)の酸化により、非還元末端でタンパク質反応性アルデヒドが形成されることを示し、
図2は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いたシッフ塩基の選択的還元により、タンパク質のアミノ基との安定で不可逆的な共有結合が形成されることを示す。
体を形成する新規な方法であって、それによりタンパク質のN末端の高い反応性を利用することができ、且つタンパク質と過ヨウ素酸塩酸化した天然のコロミン酸との還元的アミノ化に関する確立された方法(図1及び図2)を使用して得られる生成物の複雑度を回避する、新規な方法を開発した。
して測定することができる。マウスの脾臓から単離した赤血球前駆細胞のin vitroでの増殖を誘導する際のEPO試料の活性を測定する。マウスは、事前にフェニルヒドラジンの腹腔内注射を通じて人工的に貧血状態にしている。アッセイにおいて、EPOを赤血球前駆細胞に加え、DNA複製速度を、3H−チミジン取り込み速度を求めることによって測定する。タンパク質は、NIBSC由来の標準EPOと比較して、10%〜200%の複製速度を誘導する場合、「EPO様」として分類される。典型的には、EPO様タンパク質は、標準EPOの活性の少なくとも35%、好ましくは、標準EPOの活性の少なくとも50%を有する。
かどうかは、当該技術分野において既知の用語である、%類似性又は%同一性を使用してルーチン的に計算される。配列は、スイスプロット(swissprot)アクセッション番号P
O1588のヒトEPO前駆体である、配列番号1と比較するものとする。活性EPOは、この配列の28残基〜193残基である。EPOホモログ配列は、配列番号1の全体と比較してもよく、又はその28残基〜193残基と比較してもよい。好ましくは、EPOホモログ配列は、活性EPO、すなわち、28残基〜193残基と比較される。
酸レベル)、好ましくは60%、70%、80%以上、より好ましくは90%以上、例えば、95%又は99%の同一性又は類似性(アミノ酸レベル)を有する。類似性又は同一性の計算には多数のプログラムが利用可能であるが、好ましいプログラムは、BLASTnプログラム、BLASTpプログラム及びBLASTxプログラムであり、初期設定パラメータで実行され、www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能である。例えば、2個のアミノ酸配列は、初期設定パラメータ(スコア=100、ワード長=11、期待値=11、低複雑度フィルタリング=オン)でBLASTnプログラムを使用して比較し得る。上記の相同性のレベルは、これらの初期設定パラメータを使用して計算し得る。
アルギニン、グルタミン、チロシン、グルタミン酸又はヒスチジンの側鎖で、EPO又はEPO様タンパク質と結合し得る。典型的には、側鎖は、リジンアミノ酸又はシステインアミノ酸の側鎖である。
り得る。
分解性であり、例えば、ポリペプチド又は合成オリゴマーを含み得る。リンカーは、国際公開第WO2005/016973号でさらに記載されるように、二官能性部分に由来し得る。好適な二官能性試薬は、例えば、Bis−NHSである。試薬は、一般式Z−R1−Z(式中、各Zは官能基であり、同一であってもよく、又は異なっていてもよく、且つR1は二官能性有機基である)を有し得る。好ましくは、R1は、アルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン及びアルキルヘテロアリーレン(これらは任意でカルボニル結合、エステル結合、スルフィド結合、エーテル結合、アミド結合及び/又はアミン結合によって置換及び/又は介在され得る)から成る群より選択される。特に好ましくは、C3〜C6アルカンジイルである。最も好ましくは、R1は、好適な二官能性試薬の適切な部分に相当する。
XBは、EPO又はEPO様タンパク質であるB−XHに由来し(ここで、XHは、NH2又はSHである)、
Lは、結合、連結基であるか、又はポリペプチド若しくは合成オリゴマーを含み、
GlyOは、アニオン性糖ユニットであり、
結合基は、存在すれば、一般式−Y−C(O)−R1−C(O)−であり、Yは、NR2又はNR2−NR2であり、且つR1は、上記で規定した二官能性有機基であり、且つR2は、H又はC1−6アルキルである)
のものである。
ヒドリル基と反応し得る。好ましくは、基は、アミン基、より好ましくは末端アミン基である。アミンは、代替的には、アミノ酸、例えばリジンアミノ酸のアミン側鎖であり得る。多糖はまた、EPO上の任意の糖質残基、例えばペンダントグリコン基で反応し得る。
te(商標)−担持型ホウ水素化物)。好ましくは、水素化ホウ素ナトリウム等のアルカリ金属水素化物が、1μM〜0.1Mの範囲の濃度、5.0〜10の範囲のpH、0℃〜60℃の範囲の温度、及び1分〜48時間の範囲の期間で、還元剤として使用される。出発原料上のペンダントカルボキシル基が還元されない反応条件が選択される。他の好適な還元剤は、酸性条件下でのシアノホウ水素化物(cyanoborohydride)、例えば、ポリマー担持型シアノホウ水素化物又はアルカリ金属シアノホウ水素化物、L−アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、L−セレクトリド、トリアセトキシホウ水素化物等である。
e2+、Mg2+又はCa2+が挙げられる。
炭酸アンモニウム、エチレングリコール、ポリエチレングリコール(8KDa)、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(sodium cyanoborohydride)(純度98%超)、メタ過ヨウ素
酸ナトリウム及び分子量マーカー、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ソルビトール、Tween 20並びにびTrisは、Sigma Chemical Laboratory
、英国から入手した。酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムは、BDH、英国から入手した
。使用するコロミン酸、直鎖α−(2,8)−結合大腸菌K1ポリシアル酸(平均22.7kDa、高多分散度1.34、39kDa、多分散度1.4;11kDa、多分散度1.27)は、Camida、アイルランド及びS.I.I.L. India Ltd.から入手した。他の材料と
しては、2,4−ジニトロフェニルヒドラジン(Aldrich Chemical Company、英国)、透析管(3.5KDa及び10KDaカットオフ限界;Medicell International Limited、英国)、Sepharose SP HiTrap、PD−10カラム、Q FF[カラム1ml又は5ml];Hitrap Butyl HPカラム[1ml又は5ml](Pharmacia、英国)、Tris−グリシンポリアクリルアミドゲル(4%〜20%及び8
%〜16%)、Tris−グリシンドデシル硫酸ナトリウムランニングバッファー及びローディングバッファー(Novex、英国)が含まれた。脱イオン水は、Elgastat
Option 4水精製ユニット(Elga Limited、英国)から入手した。使用した全ての試薬は分析用(analytical grade)である。プレートリーダー(Dynex Technologies、英国)をタンパク質アッセイ及びCAアッセイにおける分光光度定量に使用した。マウス及びラットは、Harlan、英国から購入し、使用前の少なくとも1週間馴化させた。EPOはSIIL、インドから入手した。
1.タンパク質及びコロミン酸の定量
他で記載されているように[Gregoriadis他、1993;Fernandes及びGregoriadis、1996
、1997]、レゾルシノール法[Svennerholm、1957]によって、レゾルシノール試薬を用
いた(シアル酸としての)ポリシアル酸の定量的評価を実行した。タンパク質を、BCA比色法又は280nmでのUV吸光度によって測定した。
2.1.コロミン酸の活性化
新たに調製した0.02Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)溶液(8倍モル過剰)を20℃でCAと混合し、反応混合物を暗所で15分間、磁気的に撹拌した。次に、2倍容量のエチレングリコールを反応混合物に加えて、過剰のNaIO4を消費し、混合物をそのまま20℃でさらに30分間撹拌した。酸化したコロミン酸を、4℃の0.01%炭酸アンモニウムバッファー(pH7.4)に対して長時間(extensively)(24時
間)透析した(3.5KDa分子量カットオフ透析管)。限外濾過(分子量カットオフ3.5kDaに対する)を使用して、透析管からCAO溶液を濃縮した。必要容量まで濃縮した後、濾液を凍結乾燥し、さらに使用するまで−40℃で保存した。代替的には、CAOを、エタノールによる沈殿(2回)によって反応混合物から回収した。
2.2.CA及び誘導体の酸化状態の定量
カルボニル化合物との相互作用で難溶性の2,4−ジニトロフェニルヒドラゾンを生じる、2,4−ジニトロフェニルヒドラジン(2,4−DNPH)を用いて、コロミン酸酸化度の定性的評価を実行した。非酸化コロミン酸(CA)/酸化コロミン酸(CAO)を2,4−DNPH試薬(1.0ml)に加え、溶液を振盪した後、結晶性の沈殿物が観察されるまで37℃で放置した[Shriner他、1980]。CAの酸化度(定量的)を、アルカ
リ性溶液中でのフェリシアン化物イオンのフェロシアン化第二鉄(プルシアンブルー(Persian blue))への還元に基づく方法[Park及びJohnson、1949]を用いて測定した(こ
れは次に630nmで測定される)。この場合、グルコースを標準として使用した。
2.3.ゲル浸透クロマトグラフィ
コロミン酸試料(CA及びCAO)をNaNO3(0.2M)、CH3CN(10%;5mg/ml)に溶解し、2×GMPWXLカラムでクロマトグラフィにかけ、屈折率により検出した(GPC系:VE1121 GPC溶媒ポンプ、VE3580 RI検出器及びTrisec 3ソフトウェアによる照合、Viscotek Europe Ltd)。試料(5mg
/ml)を0.45μmのナイロン膜で濾過し、移動相として0.2M NaNO3 及びCH3CN(10%)を用いて0.7cm/分で流した。
2.4.コロミン酸の安定性
PEG化の化学反応に関するルールをそのままポリシアル化に応用することができないのは、これらの分子の生理化学的特性が異なるからである。PSAは、酸に不安定なポリマーであると共に、中性付近のpHでは何週間も安定である(図3a)。図3aの結果から、pH6.0及び7.4では、CAは8日間安定であり、pH5.0では緩徐に分解し(48時間後、初期分子量の92%)、pH4.0では緩徐に分解する(48時間後、初期分子量の70%)ことが示される。ポリシアル酸は親水性が高いが、PEGは両親媒性である。PEG化に使用される条件を使用してポリシアル化を実行すると、多くの場合、タンパク質の凝集及び沈殿が観察される。
3.製剤添加物を含むN末端タンパク質−CA複合体の調製
3.1.EPO−CA複合体(N末端法)の調製
EPOを溶液(10mMリン酸ナトリウムバッファー、130mM NaCl、pH7.0中、0.34mg/ml;比活性:110,000U/mg、分子量:30600)
として供給し、−32℃で保存し、タンパク質を2℃〜8℃で解凍し、必要量を、2mlのエッペンドルフチューブに採取した。必要量(25倍モル過剰)のコロミン酸を取り、タンパク質溶液を固体CAに加え、緩やかに混合した。反応混合物中で50mM又は3.17mg/mlとなるように、必要容量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を加え、ボルテックスし、最終反応混合物のpHをチェックした(必要に応じて、pHを6.0に調整する)。チューブをシールし、所望の温度で24時間撹拌するか、又は反応混合物を最初に室温(22℃)で8時間インキュベートした後、4℃±1℃で一晩(14時間)保持した。インキュベーション後、必要な試料を採取した(例えば、活性アッセイ、SDS−PAGE、SE−HPLC用)。
3.1.1.EPO−CA複合体の精製及び特徴付け(N末端法)
残りの反応混合物試料を、最終濃度が2Mとなるように、HICバッファーA1(3M硫酸アンモニウム、pH6.3)で希釈し、室温で1.5ml/分の速度でHICバッファーAで事前に平衡化したHICカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをHICバッファーA2(2M硫酸アンモニウム、pH6.3)(少なくとも6カラム容量)で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物をHICバッファーB(50mM Na2HPO4、pH7.4)で溶出し、第1の画分(0.5ml)及びその後の画分(0.5ml〜1ml)(6CV)を回収及び標識した。精製中、試料を氷上(4℃±1℃)に保持した。
度は約0.743である)。SDS−PAGE用の試料を採取した。CAの分子量が、SE−HPLCによる複合体及びEPOの分離には小さ過ぎる場合(例えば、22kDa)、非複合体形成EPOの分離を陰イオン交換クロマトグラフィ(AEC)を使用して実施した。AECでは、タンパク質を含有するHIC画分をAEC バッファーA(50mM
Tris、150mM NaCl、pH8.0)(試料1ml+AECバッファーA 5ml)で希釈し、1.0ml/分でAECバッファーAを用いて事前に平衡化したECカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをAECバッファーA(少なくとも10ml)で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物を溶出バッファーB(50mM Tris、600mM NaCl、pH8.0)で溶出し、2.0ml/分での第1の画分(0.5ml)及びその後の画分(0.5ml〜1ml)を回収及び標識した。精製中、試料を氷上に保持した。
743である)。SDS−PAGE用の試料を採取した。
に基づき改作した。アッセイは、赤血球前駆細胞へのEPOの添加及び3H−チミジン取り込み速度の定量によるDNA複製速度の測定に基づく。B6D2F1マウスにおいて、in vivoでの薬物動態(PK)試験及び薬力学(PD)試験を行った。
3.2.EPO−CA複合体(ランダム)の調製
EPOを溶液(10mMリン酸ナトリウムバッファー、130mM NaCl、pH7.0中、0.34mg/ml;比活性:110000U/mg、分子量:30600)として供給し、−32℃で保存し、タンパク質を2℃〜8℃で解凍し、必要量を2mlのエッペンドルフチューブに採取した。必要量のコロミン酸を取り、タンパク質溶液を固体CAに加え、緩やかに混合した。反応混合物中で50mM又は3.17mg/mlとなるよ
うに、必要容量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を加え、ボルテックスし、最終反応混合物のpHをチェックした(必要に応じて、pHを7.4に調整する)。チューブをシールし、所望の温度(4℃±1℃)で24時間撹拌した。インキュベーション後、必要な試料を採取した(例えば、活性アッセイ、SDS−PAGE、SE−HPLC用)。
3.2.1.EPO−CA複合体(ランダム)の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料を、最終濃度が2Mとなるように、HICバッファーA1(3M硫酸アンモニウム、pH6.3)で溶解し、室温で1.5ml/分の速度でHICバッファーAで事前に平衡化したHICカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをHICバッファーA2(2M硫酸アンモニウム、pH6.3)(少なくとも6カラム容量)で洗浄し、洗浄画分を回収及び標識した。生成物をHICバッファーB(50mM Na2HPO4、pH7.4)で溶出し、第1の画分(0.5ml)及びその後の画分(0.5ml〜1ml)(6CV)を回収及び標識した。精製中、試料を氷上(4℃±1℃)に保持した。
Tris、150mM NaCl、pH8.0)(試料1ml+AXCバッファーA 5ml)で希釈し、1.0ml/分でAXCバッファーAで事前に平衡化したAXCカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをAXCバッファーA(少なくとも10ml)で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物を溶出バッファー(50mM Tris、600mM NaCl、pH8.0)で溶出し、2.0ml/分での第1の画分(0.5ml)及びその後の画分(0.5ml〜1ml)を回収及び標識した。精製中、試料を氷上に保持した。
3である)。SDS−PAGE用の試料を採取した。
3.3.グリコンケミストリー
ヒドラジドコロミン酸を、最終CA濃度が10mMとなるようにEPO溶液に溶解した。溶液のpHを5.5に調整した。必要容量のNaIO4溶液のNaOAc溶液を、最終濃度が5mM NaIO4となるように加えた。NaHSO3(NaHSO3の最終濃度20mM)を用いて反応を停止した。反応混合物を室温でインキュベートした。最後に、必要容量のNaCNBH3溶液のNaOAc溶液を、最終濃度が50mM NaCNBH3となるように加えた。振盪器上で反応を4℃±1℃で1時間継続した。インキュベーション後、SDS、SE−HPLC、活性アッセイに必要な試料を採取した。
3.3.1.EPO−CA複合体の精製及び特徴付け(グリコンケミストリー)
残りの反応混合物試料を、最終濃度が2Mとなるように、HICバッファーA1(3M硫酸アンモニウム、pH6.3)で希釈し、室温で1.5ml/分の速度でHICバッファーAで事前に平衡化したHICカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した(L1〜Lx)。カラムをHICバッファーA2(2M硫酸アンモニウム、pH6.3)(少なくとも6カラム容量)で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物をHICバッファーB(50mM Na2HPO4、pH7.4)で溶出し、第1の画分(0.5ml)及びその後の画分(0.5ml〜1ml)(6CV)を回収及び標識した。精製中は、試料を氷上(4℃±1℃)に保持した。
3.4.EPOのPEG化:
EPO(30.6kDa)を溶液(5%ソルビトール、0.025mg/mlポリソルベート80を含有する10mM酢酸ナトリウムバッファー、pH4.0中、0.954m
g/ml)として供給し、2℃〜8℃で保存した。EPO溶液を濃縮して、約1.0mg/mlの溶液とした。必要量のEPOをエッペンドルフチューブに取り、氷上に載置した
。複合体形成用に添加したPEGの量は、式:
PEGの重量={タンパク質の量(g)/(タンパク質の分子量)}×(PEGの分子量)×(PEGのモル過剰)
に基づいて計算した。
ル、pH5.5を使用して調整した。チューブをシールし、所望の温度(4℃±1℃)で24時間撹拌した。反応を適切な方法によって停止し、in vitro活性、SDS−PAGE(4%〜20%Tris−グリシンゲルを使用)、SE−HPLC(superose 6カラム)用の試料を採取し、反応混合物のpHをチェックした。いかなる沈殿物も除去するために、SE−HPLC分析及び精製前に反応混合物を13000rpmで5分間遠心した。好ましいSE−HPLC用バッファーは0.1Mリン酸ナトリウム(pH6.9)であった。結果を図5に示す。
3.5.N末端非グリコシル化エリスロポエチン(NG EPO−CA)複合体の調製
NG EPOを溶液(20mMリン酸ナトリウムバッファー、300mM NaCl、pH6.65中、0.18mg/ml;比活性:100000U/mg;分子量:19000)として供給し、−32℃で保存し、タンパク質を2℃〜8℃で解凍し、必要量を2mlのエッペンドルフに採取した。複合体形成に必要なコロミン酸(例えば、酸化コロミン酸又は非酸化コロミン酸)の量を計算した。必要量のコロミン酸を秤量した。タンパク質溶液を固体CAに加え、穏やかに混合した。反応混合物中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの最終濃度が50mM又は3.17mg/mlとなるように、必要容量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を、反応混合物に加えた。最終反応混合物をボルテックスし、pHをチェックした(必要に応じて、pHを7.4に調整した)。チューブをシールし、所望の温度(4℃±1℃)で24時間撹拌した。インキュベーション後、活性アッセイ、SDS−PAGE、SE−HPLC等に必要な試料を採取した。
3.5.1.NG EPO−CA複合体の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料をHICバッファーA(1.2M硫酸アンモニウム、pH6.3)で希釈し(試料1ml+バッファーA 4ml)、HICバッファーAで事前に平衡化したHICカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをHICバッファーA(少なくとも10ml)で洗浄した。洗浄画分を回収し標識した。生成物をHICバッファーBで溶出し、第1の画分(0.5ml)及びその後の画分(0.5ml〜1ml)を回収及び標識した。精製中、試料を氷上に保持した。タンパク質濃度をUV(280nm)によって分析した(1mg/mlのnEPOの吸光度は約0.743であった)。試料をSDS−PAGE用に採取した。反応条件により、反応混合物中に有意な遊離のNG EPOが存在しなかったため、さらなる精製は不必要であった。NG
EPOが反応混合物中に存在した場合には、タンパク質を含有するHIC画分をVivaspin 6(5000 MWCO)を使用して濃縮し、SE−HPLCによって精製を行った。タンパク質濃度をUV(280nm)によって分析した(1mg/mlのNG
EPOの吸光度は約0.743である)。試料をSDS−PAGE用に採取した。
3.6.EPO製剤のSE−HPLC
4℃で冷却したJascoのAS−2057 plusオートサンプラー及びJascoのUV−975 UV/VIS検出器を備えたLiquid Chromatograph(Jasco)でHPLCを実施した。データをIBM/PC上のEZchrom Eliteソフ
トウェアによって記録した。SEC試料を、Superose 6カラムで、0.1Mリン酸Na、pH6.9の定組成移動相を用いて分析した(図5)。図6は室温での唯一のピーク=76.408を示し、これはEPOに帰属される。
4%〜20%のTris−グリシンゲルを使用して、SDS−PAGEを実施した。試料を、還元バッファー又は非還元バッファーのいずれかで希釈し、タンパク質5.0μgを各ウェルにローディングした。ゲルをトリグリセリンバッファー系で試験し、Coomassie Blueで染色した。抗PSA抗体を使用してウエスタンブロッティングを実施した(図4)。図4はEPO製剤のSDS−PAGEを示す(部位特異的、N末端)。
3.8.in vitroでの活性
フェニルヒドラジンの腹腔内注射を通じて人工的に貧血状態にしたマウスの脾臓から単離した赤血球前駆細胞のin vitroでの増殖を誘導する際のEPO試料の活性の定量を使用した。プロトコルは、Krystal[1972]により報告されている方法に基づき改作
した。アッセイは、赤血球前駆細胞へのEPOの添加及び3H−チミジン取り込み速度の定量によるDNA複製速度の測定に基づく。
3.9.安定性試験
無菌のEPO複合体を20mMリン酸ナトリウム、pH7.4;5%ソルビトール及び0.025mg/ml Tween 20中で、4℃で6週間保存した。下記条件の下、SECカラムを使用して試料のSE−HPLCを実施した:注入容量:100μl、流速:0.250ml/分、ランニングバッファー:0.1Mリン酸ナトリウム、pH:6.9。
3.10.EPO製剤のin vivoでの効力
EPO製剤のin vivoでの効力を、雌性マウスB6D2F1(7週齢〜8週齢)で試験し、5μg〜15μgのタンパク質用量(同一活性)をマウスに皮下注射した。これらの動物は、4匹ずつ7つの群に分けた。以下のようにEPO製剤を各群の各動物に与えた:EPO、EPO−PSA複合体、PBS、Aranesp(5μg)。各動物から血液50μlを採取し、retic count染料で染色した後、FACSによって分
析した(図8及び図9)。
3.11.Elisa
EPO−PSAをプレート全体にコーティングされた抗PSA抗体によって捕捉した。捕捉されたEPO−PSAを抗EPO抗体を用いて検出し、EPOとPSAとの複合体のみを検出した。
3.12.in vivoでのクリアランス
EPO製剤のin vivoでのクリアランスをマウスで試験した。適切量のタンパク質用量をマウスに皮下注射及び静脈内注射した。EPO製剤を125Iで放射標識し、血液試料の放射能を頻繁に測定した。
結果
CAの活性化及び酸化度の定量
N−アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)残基の直鎖α−2,8−結合ホモポリマーである、コロミン酸(CA)を使用した。コロミン酸の酸化への曝露を室温で20mM過ヨウ素酸塩を使用して15分間実行した。過ヨウ素酸塩処理後の内部α−2,8結合Neu5Ac残基の完全性をゲル浸透クロマトグラフィによって分析し、酸化コロミン酸(CAO)に対するクロマトグラフが得られ、物質を天然のCAの物質と比較した。酸化CA及び天然CAがほぼ同一の溶出プロファイルを示すことが分かり、逐次酸化段階がポリマー鎖の有意な断片化を引き起こすという証拠は無かった。
(100%超の)量の還元物質、すなわち、112mol%の見かけ上のアルデヒド含量(還元末端のヘミケタール及び(他の末端、非還元末端に)導入されたアルデヒドの還元力の組合せを含む)を有することが分かった。
低pH(pH5.5)及びランダムpH(7.4)並びに4℃±1℃で反応を行うことによってN末端選択的にエリスロポエチン(EPO)のコロミン酸(CA)複合体を調製
及び精製する手順は、上記に詳述されている。これには、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下での複合体形成、続く遊離のEPOを除去するためのイオン交換クロマトグラフィ(AEX)を使用する精製、その後の疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)によるCAの除去が包含される。N末端のα−アミノ基の選択的誘導体化が優勢となるように、また反応中のEPOの凝集を最小限にするために低pHを使用した。最終反応バッファーの組成は、10mM NaOAc中、5%ソルビトール、0.5mg/ml Tween 20(pH5.5)であった。
の反発で生じるポリマーの負に帯電した性質に起因する可能性がある。この試験は、図18の助けを借りて確認した。AranespのEmaxは、臨床的に良好ではなく、血栓症をもたらし、骨髄枯渇の原因となり得るEPO−PSAよりも遥かに大きいことが分かり、処置後、ベースライン未満まで網状赤血球を低下させることも分かった。EPO−PSAは、EPOよりも著しく優れていることが分かり、EPO−PSAは、EPO−PEGと同様に優れていることが分かり、EPO−PSAも一定の赤血球造血をもたらす。
Claims (10)
- エリスロポエチン(EPO)のアミノ末端ポリシアル酸(PSA)誘導体である化合物であって、該PSAが2個〜125個の糖ユニットを含み、EPOのアミノ末端PSA誘導体が下記の工程を含む方法によって製造される、化合物:
a)EPOの末端アミン基とPSA又は反応中間体をpHが4.0〜6.0の範囲である第1の水溶液中で化学的に反応させる工程であって、該PSAは2〜125個の糖ユニットを含み、該PSAが、還元末端に反応性アルデヒドを有し、且つEPOと反応しないように不動態化された非還元末端を有する、工程;及び
b)得られたEPOのアミノ末端PSA誘導体を、pHが6.5〜9.0の範囲である第2の水溶液中で精製する工程;
該PSAは、予備反応段階でアミンに変換された後、Nーマレイミド、ビニルスルホン、N−ヨードアセトアミド基、オルトピリジル基又はN−ヒドロキシコハク酸イミドから選択される少なくとも1個の官能基を含む二官能性試薬と反応して反応中間体を形成する反応性アルデヒド基を有し、該反応中間体を該EPOと反応させる。 - 前記PSAが、2〜100個の糖ユニットを含む、請求項1に記載の化合物。
- 前記PSAが、10〜80個の糖ユニットを含む、請求項2に記載の化合物。
- 前記EPOが、グリコシル化されている、請求項1に記載の化合物。
- EPOのアミノ末端ポリシアル酸(PSA)誘導体である化合物であって、該PSAの85%が該EPOのアミノ末端に結合しており、該PSAが2〜200個の糖ユニットを含み、EPOのアミノ末端ポリシアル酸が下記の工程を含む方法によって製造される、化合物:
a)EPOの末端アミン基とPSA又は反応中間体をpHが4.0〜6.0の範囲である第1の水溶液中で化学的に反応させる工程であって、該PSAは2〜200個の糖ユニットを含み、還元末端に反応性アルデヒドを有し、且つEPOと反応しないように不動態化された非還元末端を有する、工程;及び
b)得られたEPOのアミノ末端PSA誘導体を、pHが6.5〜9.0の範囲である第2の水溶液中で精製する工程;
該PSAは、予備反応段階でアミンに変換された後、Nーマレイミド、ビニルスルホン、N−ヨードアセトアミド基、オルトピリジル基又はN−ヒドロキシコハク酸イミドから選択される少なくとも1個の官能基を含む二官能性試薬と反応して反応中間体を形成する反応性アルデヒド基を有し、該反応中間体を該EPOと反応させる。 - 前記PSAが、80〜180個の糖ユニットを含む、請求項5に記載の化合物。
- 前記PSAが、100〜150個の糖ユニットを含む、請求項6に記載の化合物。
- 前記EPOが、グリコシル化されている、請求項6に記載の化合物。
- 以下の工程を含む、エリスロポエチン(EPO)のアミノ末端ポリシアル酸(PSA)誘導体の集団を製造する方法:
a)EPOの末端アミン基とPSA又は反応中間体をpHが4.0〜6.0の範囲である第1の水溶液中で化学的に反応させる工程であって、該PSAは2〜200個の糖ユニットを含み、還元末端に反応性アルデヒドを有し、且つEPOと反応しないように不動態化された非還元末端を有する、工程;及び
b)得られたEPOのアミノ末端PSA誘導体を、pHが6.5〜9.0の範囲である第2の水溶液中で精製する工程;
該集団中の少なくとも85%のEPOがPSAで誘導体化される。 - 前記PSAは、予備反応段階でアミンに変換された後、Nーマレイミド、ビニルスルホン、N−ヨードアセトアミド基、オルトピリジル基又はN−ヒドロキシコハク酸イミドから選択される少なくとも1個の官能基を含む二官能性試薬と反応して反応中間体を形成する反応性アルデヒド基を有し、該反応中間体を該EPOと反応させる、請求項9に記載の方法。
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