JP6050289B2 - 組換え蛋白質高発現細胞株の選択法 - Google Patents
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Description
(1)組換え蛋白質を高発現する細胞株を選択する方法であって,
(a)細胞を所望の蛋白質をコードする遺伝子と選択マーカーとを組み込んだ発現ベクターで形質転換させて形質転換細胞を得るステップと,
(b)該形質転換細胞を,該選択マーカーに対応する薬剤存在下で選択培養することにより,複数の細胞株を選択するステップと,
(c)該細胞株を,それぞれ無血清培地で培養し,該培養後に該細胞株の培養上清をそれぞれ回収するステップと,
(d)回収した該細胞株の培養上清をそれぞれ逆相クロマトグラフィーに付し,次いで,逆相カラムからの流出液を,連続的に流路に導き,該流路中を流れる該流出液の吸光度を連続的に測定するステップと,
(e)該測定により該組換え蛋白質に対応する吸光度のピークを同定するとともに,該細胞株の培養上清毎に得られる該ピークの面積を比較するステップと,
(f)該細胞株の中から,相対的に大きい該面積を示す細胞株を選択するステップと,を含む方法。
(2)該細胞が哺乳動物細胞である,上記(1)に記載の方法。
(3)該哺乳動物細胞がCHO細胞である,上記(2)に記載の方法。
(4)該逆相クロマトグラフィーが,オクタデシルシリル基で表面が修飾された化学結合型多孔性球状シリカゲルを固定相とし,0.08〜0.12%トリフルオロ酢酸を含有する20〜40%プロパノール水溶液を第1の移動相とし,そして,第1の移動相と比較して,トリフルオロ酢酸の濃度が同一である一方,プロパノールの濃度が高められた水溶液を第2の移動相として行うものである,上記(1)乃至(3)のいずれかに記載の方法。
(5)該組換え蛋白質が,α−ガラクトシダーゼA,イズロン酸2−スルファターゼ,グルコセレブロシダーゼ,ガルスルファーゼ,α−L−イズロニダーゼ,酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素,組織プラスミノーゲンアクチベーター(t−PA),血液凝固第VII因子,血液凝固第VIII因子,血液凝固第IX因子等の血液凝固因子,エリスロポエチン,ダルベポエチン,インターフェロン,トロンボモジュリン,卵胞刺激ホルモン,顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF),抗体,若しくはこれらの類縁体からなる群から選択されるものである,上記(1)乃至(4)のいずれかに記載の方法。
(6)該組換え蛋白質が,エリスロポエチン又はダルベポエチン,若しくはこれらの類縁体からなる群から選択されるものである,上記(1)乃至(4)のいずれかに記載の方法。
アミノ酸・・・3〜700mg/L,
ビタミン類・・・0.001〜50mg/L,
単糖類・・・0.3〜10g/L,
無機塩・・・0.1〜10000mg/L,
微量元素・・・0.001〜0.1mg/L,
ヌクレオシド・・・0.1〜50mg/L,
脂肪酸・・・0.001〜10mg/L,
ビオチン・・・0.01〜1mg/L,
ヒドロコルチゾン・・・0.1〜20μg/L,
インシュリン・・・0.1〜20mg/L,
ビタミンB12・・・0.1〜10mg/L,
プトレッシン・・・0.01〜1mg/L,
ピルビン酸ナトリウム・・・10〜500mg/L,及び
水溶性鉄化合物を含有する培地が好適に用いられる。所望により,チミジン,ヒポキサンチン,慣用のpH指示薬および抗生物質を添加してもよい。
発現ベクターとしては,選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだ,先行文献(特表2010−511378公報)に開示のpE−neoベクターを用いた。ダルベポエチン(ネスプ)は,天然型エリスロポエチンのペプチド鎖を構成する165個のアミノ酸残基に,Ala30Asn,His32Thr,Pro87Val,Trp88Asn及びPro90Thrの5箇所の変異を導入した変異型エリスロポエチンであり,先行文献(特表平08−506023)に開示されたものである。
CHO細胞(CHO−K1:American Type Culture Collectionより購入)にLipofectamine2000(Invitrogen社)を用いて,ダルベポエチン発現ベクター(pE−neo(DAR))をトランスフェクトした。トランスフェクション後,細胞を,5%FCSを含むD−MEM/F12(D−MEM/F12/5%FCS)培地に交換して5%炭酸ガス通気下37℃で2日間培養した。その後,0.6mg/mLG418を含むD−MEM/F12/5%FCS培地に交換して5%炭酸ガス通気下37℃で選択培養を行った。選択培地中で増殖する細胞を数代継代し,組換え細胞を得た。
各細胞株を,細胞濃度が2×105個/mLの濃度となるように,4mM L−グルタミン,10mg/Lヒポキサンチン,4mg/L チミジン及び120mg/L G418を添加した市販の無血清培地EX−CELL302培地(JRH社)で希釈し,4日間,37℃で5%CO2存在の下に静置培養した。培養後,培養上清を回収し,孔径0.45μmの膜フィルターでろ過した。このとき,細胞を加えない無血清培地のみも同条件下で静置し,これを培養後に穴径0.45μmの膜フィルターでろ過したものをコントロール液とした。
(1)装置
島津HPLCシステムLC−20A(島津製作所)に逆相カラムであるAerisTM widepore XB−C18(充填剤:非多孔質シリカゲルの表面に多孔質シリカゲルを被覆したもの,細孔径:300Å,カラムサイズ:4.6mm径×250mm長,Phenomenex社)をセットし,更にこのカラムを25℃の恒温槽(カラム恒温槽)内に設置した。また,カラムの下流に吸光光度計を設置し,カラムからの流出液の吸光度(測定波長215nm)を連続して測定できるようにした。
1mLのトリフルオロ酢酸に純水を加えて1Lとした溶液を溶液A(0.1%TFA水溶液)とした。また,1mLのトリフルオロ酢酸と700mLの1−プロパノールに純水を加えて1Lとした溶液を溶液B(0.1%TFA,70%プロパノール水溶液)とした。
上記のフィルター濾過した細胞株の培養上清及びコントロール液を,各々100μLずつ,溶液Aと溶液Bとを当容量混合させた第1の移動相で平衡化させた逆相カラムに負荷した。負荷後,0.2mL/分の流速で30分かけて溶液Bの体積比率を100%まで直線的に高め,更に10分間溶液Bを同一流速で流し,その後,35分間第1の移動相を同一流速で流した。この間,カラムからの流出液の吸光度(測定波長215nm)を連続して測定してチャートを得た。
細胞株(細胞株1)の培養上清とコントロール液とを逆相クロマトグラフィーで分析して得られたチャートを比較した(図1)。その結果,細胞株の培養上清では,コントロール液では現れない,ダルベポエチンに由来するピーク(ピークA)が検出され,無血清培地を用いて細胞株を培養した場合,フィルター濾過した細胞株の培養上清を逆相カラムクロマトグラフィーで分析することにより,ダルベポエチンを発現する細胞株を判別できることがわかった。
配列番号2:Primer EPO−3’,synthetic sequence
【配列表】
1189P
Claims (5)
- 組換え蛋白質を高発現する細胞株を選択する方法であって,
(a)細胞を所望の蛋白質をコードする遺伝子と選択マーカーとを組み込んだ発現ベクターで形質転換させて形質転換細胞を得るステップと,
(b)該形質転換細胞を,該選択マーカーに対応する薬剤存在下で選択培養することにより,複数の細胞株を選択するステップと,
(c)該細胞株を,それぞれ無血清培地で培養し,該培養後に該細胞株の培養上清をそれぞれ回収するステップと,
(d)回収した該細胞株の培養上清をそれぞれ逆相クロマトグラフィーに付し,次いで,逆相カラムからの流出液を,連続的に流路に導き,該流路中を流れる該流出液の吸光度を連続的に測定するステップであって,該逆相クロマトグラフィーが,オクタデシルシリル基で表面が修飾された化学結合型多孔性球状シリカゲルを固定相とし,0.08〜0.12%トリフルオロ酢酸を含有する20〜40%プロパノール水溶液を第1の移動相とし,そして,第1の移動相と比較して,トリフルオロ酢酸の濃度が同一である一方,プロパノールの濃度が高められた水溶液を第2の移動相として行うものであるステップと,
(e)該測定により該組換え蛋白質に対応する吸光度のピークを同定するとともに,該細胞株の培養上清毎に得られる該ピークの面積を比較するステップと,
(f)該細胞株の中から,相対的に大きい該面積を示す細胞株を選択するステップと,
を含む方法。 - 該細胞が哺乳動物細胞である,請求項1に記載の方法。
- 該哺乳動物細胞がCHO細胞である,請求項2に記載の方法。
- 該組換え蛋白質が,α−ガラクトシダーゼA,イズロン酸2−スルファターゼ,グルコセレブロシダーゼ,ガルスルファーゼ,α−L−イズロニダーゼ,酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素,組織プラスミノーゲンアクチベーター(t−PA),血液凝固第VII因子,血液凝固第VIII因子,血液凝固第IX因子等の血液凝固因子,エリスロポエチン,ダルベポエチン,インターフェロン,トロンボモジュリン,卵胞刺激ホルモン,顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF),抗体,若しくはこれらの類縁体からなる群から選択されるものである,請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。
- 該組換え蛋白質が,エリスロポエチン又はダルベポエチン,若しくはこれらの類縁体からなる群から選択されるものである,請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。
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