JP6039965B2

JP6039965B2 - イムノクロマトグラフィー用デバイス

Info

Publication number: JP6039965B2
Application number: JP2012183560A
Authority: JP
Inventors: 勉本庄
Original assignee: Morinaga and Co Ltd
Current assignee: Morinaga and Co Ltd
Priority date: 2012-08-22
Filing date: 2012-08-22
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2032-08-22
Also published as: US20140057292A1; CN103630680A; EP2700449B1; EP2700449A1; JP2014041061A

Description

本発明は、イムノクロマトグラフィー用デバイスに関する。

現在、イムノクロマトグラフィー法は、インフルエンザウイルスなどの抗原検査キットとして、幅広く使用されている（例えば、特許文献１参照）。そこでは、ニトロセルロースやガラス繊維濾紙などが試料の担体として用いられている（例えば、特許文献１参照）。

特願２００９−１５９０２０公開公報

本発明は、定量性の高いイムノクロマトグラフィー用デバイスを提供することを目的とする。

本発明の一実施態様は、イムノクロマトグラフィー用デバイスであって、抗原を含んだ試料を前記デバイスに添加するための試料添加部と、前記試料添加部に添加された試料をデバイスから回収するための試料回収部と、前記試料が前記試料添加部から前記試料回収部まで移動するための展開部と、前記展開部に存在し、前記抗原を結合させるための抗体を担持するための抗体担持部と、を有するガラス板を含み、前記展開部は透明な板を含み、前記ガラス板と前記透明な板は、試料が毛細管現象によって前記展開部を移動することができる間隔を有して平行に設置されている、イムノクロマトグラフィー用デバイスである。前記間隔が３〜５０μｍであることが好ましい。また、前記ガラス板における前記展開部又は前記抗体担持部が、粗面ガラスからなることが好ましい。そして、前記粗面ガラスの平均の粗さは０．０１−２０．０μｍであり、突出の最大の深さは０．１−１５０．０μｍであり、突出の間隔は１０−２０００μｍであることが好ましい。

あるいは、前記透明な板において、前記ガラス板における前記展開部及び／又は前記抗体担持部の粗面ガラスに対応する部分が、粗面ガラスからなることが好ましい。そして、前記ガラス板と前記透明な板における前記展開部及び前記抗体担持部が、粗面ガラスからなり、前記ガラス板と前記透明な板の間隔を保つためのスペーサーを有しないことが好ましい。

本発明の他の一実施態様は、イムノクロマトグラフィー用デバイスを用いて試料中の抗原を検出するための検出方法であって、前記デバイスは、前記試料を前記デバイスに添加するための試料添加部と、前記試料添加部に添加された前記試料を前記デバイスから回収するための試料回収部と、前記試料が前記試料添加部から前記試料回収部まで移動するための展開部と、前記展開部に存在し、前記抗原を結合させるための抗体担持部と、を有するガラス板を含み、前記展開部は、前記試料が毛細管現象によって前記展開部を移動することができる間隔を有して、前記ガラス板と平行に設置されている透明な板を含み、前記検出方法は、前記試料を前記試料添加部に添加し、前記展開部に展開させる工程と、前記展開部に展開した前記試料を前記試料回収部から回収する工程と、前記抗体担持部に結合した前記抗原を検出する工程と、を含み、前記展開部又は前記抗体担持部が、粗面ガラスからなり、前記粗面ガラスの平均の粗さは０．０１−２０．０μｍであり、突出の最大の深さは０．１−１５０．０μｍであり、突出の間隔は１０−２０００μｍであることを特徴とする検出方法である。

本発明によって、定量性の高いイムノクロマトグラフィー用デバイスを提供することができるようになった。

本発明の一実施態様のイムノクロマトグラフィー用デバイスの模式図である。本発明の一実施態様のイムノクロマトグラフィー用デバイスの構成部品の模式図である。本発明の一実施態様のイムノクロマトグラフィー用デバイスを用いて行うイムノクロマトグラフィー法の流れを示す図である。本発明の別の実施態様のイムノクロマトグラフィー用デバイスの模式図である。本発明の一実施態様において、スペーサー無しで両方のガラスを直接合わせた、イムノクロマトグラフィー用デバイスの模式図である。本発明の一実施例において、本発明のイムノクロマトチップを用いて行ったイムノクロマトグラフィーの結果を表すグラフである。

本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

＝＝イムノクロマトグラフィー用デバイス＝＝
本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイス１０は、（１）抗原を含んだ試料をデバイス１０に添加するための試料添加部１１と、（２）試料添加部１１に添加された試料をデバイス１０から回収するための試料回収部１２と、（３）試料が試料添加部１１から試料回収部１２まで移動するための展開部１３と、（４）展開部１３に存在し、その抗原を結合させるための抗体を担持するための抗体担持部１４と、を含むガラス板１５を有する。また、サンドイッチ法によって、試料中の抗原を検出する場合（方法の詳細は後述）、（５）展開部に存在し、抗原に対する標識抗体を認識する２次抗体を担持するための陽性対照部２０を有してもよい。図１にデバイスの一実施態様を示す。

このガラス板１５は、滑面ガラスであっても粗面ガラスであっても構わないが、ガラス板１５の展開部１３又は抗体担持部１４は、粗面ガラスとするのが好ましい。この粗面ガラスの平均の粗さ（Ra）は、０．０１−２０．０μｍであることが好ましく、０．０５−１０．０μｍであることがより好ましく、０．１−１μｍであることがさらに好ましく、０．２−０．３μｍであることがさらに好ましく、０．２２６−０．２５２μｍであることが最も好ましい。また、この粗面ガラスの突出の最大の深さ（Rz）は、０．１−１５０．０μｍであることが好ましく、０．５−１００．０μｍであることがより好ましく、１．０−１０．０μｍであることがさらに好ましく、２．０−３．０μｍであることがさらに好ましく、２．１９−２．７０μｍであることが最も好ましい。また、この粗面ガラスの突出の間隔（Sm）は、１０−２０００μｍであることが好ましく、３０−１０００μｍであることがより好ましく、５０−５００μｍであることがさらに好ましく、１００−２００μｍであることがさらに好ましく、１６５−１７９μｍであることが最も好ましい。なお、平均の粗さ（Ra）、最大の深さ（Rz）、突出の間隔（Sm）は、JIS B0601で規定された定義を用いるものとする。このように抗体担持部１４を粗面ガラスとすることによって、担持できる抗体の量を増やすことができる。また、抗体担持部１４を粗面ガラスとした場合、展開部１３も粗面ガラスとした方が、製造が容易になる。

展開部は透明な板１６を有し、ガラス板１５と透明な板１６は、試料が毛細管現象によって展開部に導入される程度の間隔を有して平行に設置されている。このガラス板１５と透明な板１６は、スペーサーなどによって、間隔が保たれていても良いが、展開部が板の表面から窪んでいて、それによって、間隔が保たれていても良い。後者の場合、スペーサーは特に必要としない。ガラス板１５と透明な板１６の間隔は、試料が毛細管現象によって展開部を移動すれば特に限定されないが、１〜１００μｍであっても良く、３〜５０μｍであることが好ましく、５〜３０μｍであることが最も好ましい。透明な板１６は、イムノクロマトグラフィーに使用可能な板であれば、特にその材料は限定されず、例えば、ガラス板であってもよく、アクリル板やポリプロピレン板などのプラスティック板であってもよい。ここで、「透明な板」とは、乾いた状態で透明である板だけでなく、イムノクロマトグラフィー法を行ったとき、例えば、展開部１３がバッファーでぬれた時に透明になる板、具体的には、粗面ガラスや粗面プラスティックも含まれるものとする。透明な板１６がガラス板である場合、滑面ガラスであっても粗面ガラスであっても構わないが、展開部１３は、粗面ガラスが好ましい。また、ガラス板１５と透明な板１６は、分離していても、直接的、または、スペーサーなどを介して間接的に接着されていても構わない。

このデバイス１０は、さらに、ガラス板１５と透明な板１６の間隔を保つためのスペーサー１７を有してもよい。スペーサー１７の厚さは、ガラス板１５と透明な板１６の間隔と同じであって、１〜１００μｍであっても良いが、３〜５０μｍであることが好ましく、５〜３０μｍであることが最も好ましい。スペーサー１７の材料は特に限定されないが、アクリルなどのプラスティック、ガラスなど、ガラス板１５と透明な板１６に密着できるように加工できるものが好ましい。また、ここでいうスペーサー１７は、展開部１３においてガラス板１５と透明な板１６の間隔を確保することができれば形状は限定されず、、直方体又は立方体であってガラス板１５や透明な板１６と板状や線状に広い領域で接着するものであってもよく、先端が鋭端になっていてガラス板１５や透明な板１６と点状に接着するものであってもよい。スペーサー１７の数も特に限定されず、その形状に応じて適宜決定することができる。また、ガラス板１５もしくは透明な板１６の表面には、樹脂やインクがコートされていたり、印刷されていてもよい。そして、ガラス板１５と、透明な板１６と、展開部の左右両側に設置されたスペーサー１７は、展開部１３に流れる試料が展開部１３から外れて漏れないように、密着していることが好ましい。ガラス板１５、透明な板１６、及びスペーサー１７は、それぞれ、接着剤などで接着されていても良いが、クリップなどで、圧着されていてもよい。

ガラス板１５と透明な板１６の展開部１３が両方とも、滑面ガラスを削って作製された粗面ガラスの場合、図５のように、ガラス板１５および透明な板１６の、展開部１３を挟んで左右両側を滑面にし、スペーサー無しで両方のガラスを直接合わせることにより、デバイス１０を作ることができる。滑面ガラス同士が合わさることによって、粗面同士が合わさった所に、試料が毛細管現象によって展開部１３を移動することができる間隔が生じ、その両側の滑面ガラスで試料の漏れを抑えることが可能にある。この場合、透明な板１６を構成する粗面ガラスも、ガラス板１５に対して記述したのと同様の粗面ガラス条件が適用できる。

＝＝イムノクロマトグラフィー法＝＝
上記のイムノクロマトグラフィー用デバイス１０を用いたイムノクロマトグラフィー法は、競合法、サンドイッチ法など特に限定されないが、一例としてサンドイッチ法を以下に述べる。

まず、ガラス板１５の抗体担持部１４に、試料に含まれる抗原を、直接的または間接的に結合させるための抗体を固相化する。その固相化方法は特に限定されず、シランカップリング法、シリコンバイオ法（特願２００６−１３５５７２）など、当業者に公知の方法で固相化することができる。その後、スペーサー１７や透明な板１６などをセットし、デバイス１０を組み立てる（図２）。

一方、調べたい対象の抗原を含む試料を、その抗原に対する標識抗体と混合する。標識は特に限定されず、例えば、酵素、金コロイド、白金−金コロイド、蛍光色素、などが使用できる。標識抗体、及び標識抗体と結合した抗原を含む試料を第１のガラス板１５上の試料添加部１１に添加し、試料を展開部１３に導入する（図３Ａ）。この導入は、ピペットマンやマイクロピペットなどの器具１９で直接行なってもよく、サンプルパッドなどを通して行っても良い。また、抗原に対する標識抗体の代わりに、抗原に対する１次抗体及び１次抗体に対する標識２次抗体を用いてもよい。また、抗体担持部１４に固相化する抗体は、直接的に抗原に結合する抗体でも良いが、抗原に対する１次抗体を特異的に認識するというように、間接的に抗原に結合する２次抗体であっても良い。このように、これらの技術の応用技術は多数存在し、いずれも、本発明の技術的範囲内にある。

そして、展開部１３に導入された試料は、毛管現象によって、展開部１３を広がって移動し、抗体担持部１４を越えて、試料回収部１２に到達する（図３Ｂ）。そこで、試料回収部１２から試料を回収するが、全量回収しても、展開部１３に一部の試料を残しても良い。バックグラウンドが測定の障害になる場合には試料を通じた後に金コロイドを含まない緩衝液のみを通じて、展開部１３を洗浄しても良い。回収の仕方は特に限定されず、ピペットマンやマイクロピペットなどで回収してもよいが、サンプルパッドやスポンジ、濾紙などの液体吸収体１８を試料回収部１２に置くことによって、試料を浸み込ませて回収してもよい（図３Ｃ；図４）。

この作業の際、定量性を上げるために、試料は全量、抗体担持部１４を通るように、抗体を固相化するのが好ましい。例えば、展開部１３が密閉された通路状であって、その入口と出口にそれぞれ試料添加部１１と試料回収部１２が位置するような場合、通路を横切るように抗体を担持させておけば、試料が通路を通れば、必ず担持された抗体上を通ることになるので、担体保持部１４の抗原結合活性を最大限活用でき、多くの抗原を回収できるようになる。。同様に、陽性対照部２０を設ける場合も、その効果を最大限に発揮させるために、抗体担持部１４と試料回収部１２の間に、通路を横切るように標識抗体に対する抗体を担持させておくことが好ましい。

その後、抗体担持部１４に結合した抗原を検出すれば良いが、上述のようにその抗原に対する標識抗体を用いた場合、抗体担持部１４にトラップされた標識抗体を、標識を指標にして検出すれば良い。例えば、標識が酵素の場合、試料と同様にして基質溶液を展開部１３に広げ、酵素と反応させることで発色させることができ、標識がルシフェラーゼなどの場合、ルシフェリンなどの基質を同様に与えることで発光させることができる。また、フルオレセインなどの蛍光色素の場合、励起させることで蛍光を放出させることができる。デバイス１０が陽性対照部２０を有する場合、試料に混合された標識抗体が陽性対照部２０の抗体に結合し、陽性対照部２０でも発色または発光する。

最後に、標識による発色の検出方法は特に限定されないが、ガラス板１５及び透明な板１６の透明性を利用し、透過光で標識による発色を検出できる。例えば、適切に選択された波長の光を上部から抗体担持部に照射し、透過光の量を解析することによりシグナル強度を定量することができる。また、ライトボックスの上に発色後のデバイス１０を置き、ccdカメラで撮影したデジタル写真を解析ソフトでシグナルの濃さを定量することができる。あるいは、白い紙の上に発色後のデバイスを置き、反射光を検出してもよい。厳密に定量するためには、毎回検量線を作成することが好ましいが、条件をできるだけ一定にすることによって、シグナルの濃さから、直接抗原の濃度を算出できる。

（１）イムノクロマトチップの作製
９９ｍＬの水を撹拌しながら、０．５ｍＬの酢酸を加え、さらに、０．５ｍＬの3-Glycidyloxypropyl-trimethoxysilaneを滴下して、室温で１時間撹拌した。この溶液に、５ｍｍｘ２５ｍｍの片面粗面ガラス板または滑面ガラス板を、室温で一晩浸漬した。その後、ガラス板を水で洗浄して風乾し、１１５℃で５分加熱し、ガラス表面を活性化した。用いた粗面ガラス板の特徴は以下の表１に示す。

０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液で調整した１ｍｇ／ｍＬのウサギ抗卵白アルブミン抗体１μＬで磨りガラス面の長辺の中央付近にラインを引き、水を含ませたろ紙を敷いたディッシュの中で、室温、１時間静置して抗体を固相化した。その後、２ｍＬのＴＴ（１５０ｍＭＮａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））を吹き付けるようにして洗浄し、ＴＴＢ（１ｍｇ／ｍＬの牛血清アルブミンを含有するＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）に浸漬して、室温で１時間静置し、未反応の活性基をブロックした。

抗体を結合させた面を５ｍｍｘ４０ｍｍのプラスティック板の中央に貼り合わせ、テープで固定した。こうして作製したイムノチップは、プラスティック面とガラス面に液体が通る薄い空間を有する。

ガラス板からはみ出ているプラスティック板上の両側に、ＴＴＢに浸した４ｍｍｘ５ｍｍの市販イムノクロマトグラフィー用サンプルパッドをガラス板に密着させて置き、一方のサンプルパッドには、卵白アルブミン（１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬ）、ウサギ抗卵白アルブミン抗体、金コロイド標識抗ウサギイムノグロブリン抗体、を等量混合した試料を１０μＬ添加し、もう一方の側のサンプルパッドには濾紙を重ね、展開部を流れてくる溶液を吸収した。最終的に２００μＬの試料を添加した。

（２）結果の解析
反応後のイムノクロマトチップを、デジタルカメラで撮影し、画像解析ソフトウエアImage-Jで、Gelsという解析手法を使用して、反応部位のシグナル強度をArea値として算出した。
表２に、得られた数値を示し、図６にグラフを示す。

このように、滑面ガラスより粗面ガラスの方が検出感度が高く、特に、粗面ガラスＩが検出感度が高い。

１０イムノクロマトグラフィー用デバイス
１１試料添加部
１２試料回収部
１３展開部
１４抗体担持部
１５ガラス板
１６透明な板
１７スペーサー
１８液体吸収体
１９器具
２０陽性対照部

Claims

イムノクロマトグラフィー用デバイスであって、
抗原を含んだ試料を前記デバイスに添加するための試料添加部と、
前記試料添加部に添加された試料をデバイスから回収するための試料回収部と、
前記試料が前記試料添加部から前記試料回収部まで移動するための展開部と、
前記展開部に存在し、前記抗原を結合させるための抗体を担持するための抗体担持部と、
を有するガラス板を含み、
前記展開部は透明な板を含み、
前記ガラス板における前記展開部が、粗面ガラスからなり、
前記ガラス板と前記透明な板は、試料が毛細管現象によって前記展開部を移動することができる間隔を有して平行に設置されている、イムノクロマトグラフィー用デバイス。
前記間隔が３〜５０μｍであることを特徴とする、請求項１に記載のイムノクロマトグラフィー用デバイス。
前記ガラス板における前記抗体担持部が、粗面ガラスからなることを特徴とする、請求項１または２に記載のイムノクロマトグラフィー用デバイス。
前記粗面ガラスの平均の粗さは０．０１−２０．０μｍであり、突出の最大の深さは０．１−１５０．０μｍであり、突出の間隔は１０−２０００μｍであることを特徴とする、請求項３に記載のイムノクロマトグラフィー用デバイス。
前記透明な板において、前記ガラス板における前記展開部及び／又は前記抗体担持部に対応する部分が、粗面であることを特徴とする、請求項３または４に記載のイムノクロマトグラフィー用デバイス。
前記ガラス板と前記透明な板における前記展開部及び前記抗体担持部が、粗面ガラスからなり、前記ガラス板と前記透明な板の間隔を保つためのスペーサーを有しないことを特徴とする、請求項５に記載のイムノクロマトグラフィー用デバイス。
イムノクロマトグラフィー用デバイスを用いて試料中の抗原を検出するための検出方法であって、
前記デバイスは、
前記試料を前記デバイスに添加するための試料添加部と、
前記試料添加部に添加された前記試料を前記デバイスから回収するための試料回収部と、
前記試料が前記試料添加部から前記試料回収部まで移動するための展開部と、
前記展開部に存在し、前記抗原を結合させるための抗体担持部と、
を有するガラス板を含み、
前記展開部は、前記試料が毛細管現象によって前記展開部を移動することができる間隔を有して、前記ガラス板と平行に設置されている透明な板を含み、
前記検出方法は、
前記試料を前記試料添加部に添加し、前記展開部に展開させる工程と、
前記展開部に展開した前記試料を前記試料回収部から回収する工程と、
前記抗体担持部に結合した前記抗原を検出する工程と、
を含み、
前記ガラス板における前記展開部が、粗面ガラスからなることを特徴とする検出方法。