JP6028596B2 - Flavonols and sinapinic acid reaction products for preventive and therapeutic effects on cardiovascular diseases - Google Patents

Description

本発明は、非常に簡便で新しい方法かつ食品でも応用可能な合成方法によって得られるフラボノール類とシナピン酸の反応生成物を有効成分とするアポリポプロテインＢ１００（ＡｐｏＢ１００）分泌抑制剤、脂質異常症予防・治療剤、高コレステロール血症予防・治療剤および動脈硬化予防剤に関するものである。   The present invention is an apolipoprotein B100 (ApoB100) secretion inhibitor comprising a reaction product of flavonols and sinapinic acid obtained by a very simple and new method and a synthesis method applicable to foods as an active ingredient. The present invention relates to a therapeutic agent, a hypercholesterolemia preventive / therapeutic agent and an arteriosclerosis preventive agent.

フラボノール類などのポリフェノールは広く食品中に含まれ、これらを摂取することによる様々な機能性の発現と、さらなる高機能化が大きく注目されている。   Polyphenols such as flavonols are widely contained in foods, and attention has been paid to the expression of various functions and further enhancement of functionality by ingesting them.

フラボノール類の一種であるケルセチンは植物の二次代謝産物の一つであり、多くの植物、食品等に存在する。例えば、ケルセチンおよびその配糖体は、タマネギ、ソバ、グリーンアスパラおよびかんきつ類等に多く含まれていることが知られている。   Quercetin, a kind of flavonols, is one of the secondary metabolites of plants and is present in many plants and foods. For example, it is known that quercetin and its glycoside are contained in a large amount in onions, buckwheat, green asparagus and citrus fruits.

このようなケルセチンおよびケルセチン誘導体の循環器系疾患に対する知見が報告されている。ケルセチン含有組成物によるＣ反応性タンパク質関連障害（循環器障害を含む）の治療、またはコレステロール値の低下に関する報告（特許文献１）、ケルセチンなどのフラボノイドを酵素とともに含有し、ＬＤＬコレステロールの酸化を抑制するサプリメントに関する報告（特許文献２）、ルチンおよびケルセチンを高血中脂質濃度に因る疾患の予防または治療に用いる報告（特許文献３）などがある。   Knowledge of such quercetin and quercetin derivatives for cardiovascular diseases has been reported. Report on treatment of C-reactive protein-related disorders (including cardiovascular disorders) with quercetin-containing compositions, or a decrease in cholesterol levels (Patent Document 1), contains flavonoids such as quercetin together with enzymes, and suppresses oxidation of LDL cholesterol There are reports on supplements (Patent Document 2), reports on the use of rutin and quercetin for the prevention or treatment of diseases caused by high blood lipid concentrations (Patent Document 3), and the like.

しかし、特許文献１では、実施例が示されておらず、効果のほどは不明である。また、特許文献２では、血小板活性およびＬＤＬコレステロール酸化のみを抑制しており、ＬＤＬコレステロール濃度の低下に関しては記述がない。また、特許文献３では、ルチンおよびケルセチンを投与し、ラット、ウサギでの血中総コレステロール量の減少および、ヒトでのルチン摂取による血中コレステロールの減少を報告しているが、より効果を強めるためさらなる高機能化が望まれている。   However, in patent document 1, an Example is not shown and the effect is unknown. Moreover, in patent document 2, only platelet activity and LDL cholesterol oxidation are suppressed, and there is no description regarding the fall of LDL cholesterol concentration. Patent Document 3 reports that rutin and quercetin are administered to reduce the amount of total cholesterol in rats and rabbits, and the amount of blood cholesterol in humans due to the intake of rutin. Therefore, further enhancement of functionality is desired.

また、本発明者らは、フラボノール類とシナピン酸から、フラボノール骨格を残した全く新しい物質を非常に簡便な新しい方法で生成することに成功し、報告済みである（特許文献４）。   The present inventors have succeeded in producing a completely new substance leaving a flavonol skeleton from flavonols and sinapinic acid by a very simple new method, and have been reported (Patent Document 4).

一方、現在の社会生活においては、過剰なストレスや食物摂取、運動不足が蔓延している。これらが原因となるメタボリックシンドロームが大きな社会問題になっている。メタボリックシンドロームとは、内蔵脂肪型肥満に加えて高血糖、高血圧、脂質異常のうち二つ以上を併せ持った状態であり、動脈硬化のリスクが高くなる。   On the other hand, in today's social life, excessive stress, food intake, and lack of exercise are prevalent. Metabolic syndrome caused by these has become a major social problem. Metabolic syndrome is a condition that has two or more of hyperglycemia, hypertension, and lipid abnormalities in addition to built-in fat obesity, and increases the risk of arteriosclerosis.

脂質異常症とは、血液中に含まれる脂質が過剰もくしは不足している状態を指し、これまで高脂血症と呼ばれていた疾患である。脂質異常症が発症すると、血中の低比重リポタンパク（ＬＤＬ）コレステロール濃度の増加（高コレステロール血症）、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）コレステロール濃度の低下（低コレステロール血症）、中性脂肪などの脂質の増加（高トリグリセリド血症）により、動脈硬化のリスクが高くなることが知られている。   Dyslipidemia refers to a condition in which the lipid contained in blood is excessive or insufficient, and is a disease that has been called hyperlipidemia. When dyslipidemia develops, increased low-density lipoprotein (LDL) cholesterol level in the blood (hypercholesterolemia), decreased high-density lipoprotein (HDL) cholesterol level (hypocholesterolemia), neutral fat, etc. Increased lipids (hypertriglyceridemia) are known to increase the risk of arteriosclerosis.

食物中もしくは生体内で合成された脂肪酸は血流に乗って肝臓に達する。肝臓では脂肪酸からトリグリセリドが合成される。肝臓で発現する血漿タンパク質であるアポリポプロテインは合成されたトリグリセリドやコレステロールなどを可溶化して末梢組織に運搬する機能を有している。特にアポリポプロテインＢ１００（ＡｐｏＢ１００）は超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）やＬＤＬ、カイロミクロンといったリポタンパク質の構成成分であり、リポタンパク質粒子の構造維持あるいはＬＤＬ受容体との結合に重要な役割を果たしている（非特許文献１）。   Fatty acids synthesized in food or in vivo reach the liver in the bloodstream. In the liver, triglycerides are synthesized from fatty acids. Apolipoprotein, a plasma protein expressed in the liver, has a function of solubilizing synthesized triglycerides and cholesterol and transporting them to peripheral tissues. In particular, apolipoprotein B100 (ApoB100) is a component of lipoproteins such as very low density lipoprotein (VLDL), LDL, and chylomicron, and plays an important role in maintaining the structure of lipoprotein particles or binding to LDL receptors. (Non-Patent Document 1).

一方、血漿中のＡｐｏＢ１００量の増加は、アテローム性動脈硬化症や高コレステロール血症（非特許文献２）、心筋梗塞（非特許文献３）、および血栓症（非特許文献４）などの疾患リスクの増加と関係していることも報告されている。   On the other hand, an increase in the amount of ApoB100 in plasma is associated with risk of diseases such as atherosclerosis, hypercholesterolemia (Non-patent document 2), myocardial infarction (Non-patent document 3), and thrombosis (Non-patent document 4). It has also been reported to be associated with an increase in

以上のことから、肝臓からのＡｐｏＢ１００の分泌を抑制することによって脂質異常症およびそれに伴う動脈硬化を予防・改善することが可能となると考えられている。   From the above, it is considered that dyslipidemia and accompanying arteriosclerosis can be prevented and improved by suppressing secretion of ApoB100 from the liver.

このような現状から、ＡｐｏＢ１００の過剰分泌の抑制作用に着目した先行技術は報告されている。たとえば、共役トリエン酸、その塩、および誘導体を有効成分とするＡｐｏＢ１００分泌抑制剤（特許文献５）、紫蘇エタノール抽出物を有効成分とするＡｐｏＢ１００分泌抑制剤（特許文献６）、クロロフィル関連化合物を有効成分とするＡｐｏＢ１００分泌抑制剤（特許文献７）などが知られている。また、化学修飾ｓｉＲＮＡによるＡｐｏＢ１００分泌抑制剤（特許文献８）なども知られている。   From such a current situation, the prior art focusing on the suppressive action of ApoB100 on excess secretion has been reported. For example, an ApoB100 secretion inhibitor containing conjugated trienoic acid, a salt thereof, and a derivative thereof as an active ingredient (Patent Document 5), an ApoB100 secretion inhibitor containing a Shiso ethanol extract as an active ingredient (Patent Document 6), and a chlorophyll-related compound are effective. ApoB100 secretion inhibitor (Patent Document 7) as a component is known. In addition, an ApoB100 secretion inhibitor using chemically modified siRNA (Patent Document 8) is also known.

しかし、特許文献５ではα−リノレン酸を添加した場合と比較してＡｐｏＢの分泌が抑制されているだけである。また、機能性成分は血中のタンパク質との非特異的な相互作用によって有効性が減衰するといわれているが、特許文献６および特許文献７では低濃度のウシ血清アルブミン（ＦＢＳ）を使用した場合の活性であり、生体内での有効性は疑問点がある。また、特許文献８に記載される化学修飾ｓｉＲＮＡでは使用範囲が限定される。   However, in patent document 5, the secretion of ApoB is only suppressed compared with the case where (alpha)-linolenic acid is added. Moreover, although it is said that a functional component attenuate | damps effectiveness by nonspecific interaction with the protein in blood, in the case of using low concentration bovine serum albumin (FBS) in patent document 6 and patent document 7, The effectiveness in vivo is questionable. In addition, the range of use of the chemically modified siRNA described in Patent Document 8 is limited.

以上のようにＡｐｏＢ１００分泌抑制剤はいくつか提案されているものの、更なるＡｐｏＢ１００分泌抑制作用に優れた新規素材の開発が望まれており、フラボノール類・シナピン酸反応生成物は有効であると考えられる。   Although several ApoB100 secretion inhibitors have been proposed as described above, development of a new material excellent in further ApoB100 secretion inhibitory action is desired, and flavonols and sinapic acid reaction products are considered to be effective. It is done.

特表２００９−５４３８８３号公報JP-T 2009-543883 特表２００１−５１３３３２号公報JP-T-2001-513332 特表２００２−５２４５２２号公報Special table 2002-524522 gazette 特願２０１２−１２１３７０号Japanese Patent Application No. 2012-121370 特開２００２−２６５９８５号公報JP 2002-265985 A 特開２００８−１００９２８号公報JP 2008-1000092 A 特開２００８−１０５９６６号公報JP 2008-105966 A 特開２０１１−１５５９１４号公報JP 2011-155914 A

日本臨床,５９（２）ｐ１０９−１１３（２００１）Japanese Clinical, 59 (2) p109-113 (2001) Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ,３２２,ｐ１４９４−１４９９（１９９０）The New England Journal of Medicine, 322, p1494-1499 (1990) Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,３６,ｐ２０−２３（１９９０）Clinical Chemistry, 36, p20-23 (1990) Ｐｃｄｉａｔｒｉｃｓ,９９,１９９７,ｐ．ｅ１１Pcdiatrics, 99, 1997, p. e11

本発明者らはこれまでフラボノール類を始めとする機能性素材の高機能化について様々に検討しており、その一例として、ケルセチンとシナピン酸を高温や高圧下で処理することにより、多数の新規なフラボノール類・シナピン酸反応生成物の合成に成功している（特許文献４）。これらの新規なフラボノール類・シナピン酸反応生成物の合成方法はいずれも簡便であることのみならず、食品にも応用可能な合成方法である点で優れたものであるが、その機能性についてはまだ十分に検討できていなかった。そこで、本発明者らは、これらの新規なフラボノール類・シナピン酸反応生成物の機能性について検討したところ、特定のフラボノール類・シナピン酸反応生成物がアポリポプロテインＢ１００（ＡｐｏＢ１００）分泌抑制作用を有していることを見出すことに成功し、本発明を完成するに至った。   The inventors of the present invention have been variously examining functional enhancement of functional materials such as flavonols, and as an example, by treating quercetin and sinapinic acid under high temperature and high pressure, a number of new materials can be obtained. Have successfully synthesized novel flavonols and sinapinic acid reaction products (Patent Document 4). The synthesis methods of these novel flavonols and sinapinic acid reaction products are not only simple but also excellent in that they can be applied to foods. It was not yet fully examined. Therefore, the present inventors examined the functionality of these novel flavonols and sinapinic acid reaction products. As a result, specific flavonols and sinapinic acid reaction products have an inhibitory action on apolipoprotein B100 (ApoB100) secretion. As a result, the present invention has been completed.

したがって、本発明は、ＡｐｏＢ１００分泌抑制作用を示す新規なフラボノール類・シナピン酸反応生成物を有効成分とする新たなＡｐｏＢ１００分泌抑制剤を提供することを目的とする。また、本発明は、前記ＡｐｏＢ１００分泌抑制作用に関連する脂質異常症予防・治療剤、高コレステロール血症予防・治療剤および動脈硬化予防剤を提供することを目的とする。   Therefore, an object of the present invention is to provide a novel ApoB100 secretion inhibitor containing as an active ingredient a novel flavonol / sinapinic acid reaction product exhibiting an ApoB100 secretion inhibitory action. Another object of the present invention is to provide a prophylactic / therapeutic agent for dyslipidemia, a prophylactic / therapeutic agent for hypercholesterolemia, and a prophylactic agent for arteriosclerosis related to the ApoB100 secretion inhibitory action.

本発明の要旨は、
〔１〕式（１）： The gist of the present invention is as follows.
[1] Formula (1):

で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とするＡｐｏＢ１００分泌抑制剤、
〔２〕前記式（１）で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする脂質異常症予防・治療剤、
〔３〕前記式（１）で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする高コレステロール血症予防・治療剤、
〔４〕前記式（１）で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする動脈硬化予防剤、
に関する。 ApoB100 secretion inhibitor characterized by containing at least one compound selected from the group consisting of a reaction product of flavonols and sinapinic acid represented by the formula:
[2] A lipid comprising at least one compound selected from the group consisting of a reaction product of a flavonol represented by the formula (1) and sinapinic acid and a pharmaceutically acceptable salt thereof. Abnormal disease prevention / treatment agent,
[3] One or more compounds selected from the group consisting of a reaction product of a flavonol represented by the formula (1) and sinapinic acid and a pharmaceutically acceptable salt thereof. Cholesterolemia preventive / therapeutic agent,
[4] An artery comprising one or more compounds selected from the group consisting of a reaction product of a flavonol represented by the formula (1) and sinapinic acid and a pharmaceutically acceptable salt thereof Curing preventive agent,
About.

本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤は、アテローム性動脈硬化症や高コレステロール血症、心筋梗塞、および血栓症などの疾患リスクの増加に関連するＡｐｏＢ１００の過剰な分泌を抑制する作用を有していることから、新規なＡｐｏＢ１００分泌抑制剤として有用である。
また、本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤は、新規な脂質異常症予防・治療剤、高コレステロール血症予防・治療剤および動脈硬化予防剤としても有用である。 The ApoB100 secretion inhibitor of the present invention has an action of suppressing excessive secretion of ApoB100 associated with an increased risk of diseases such as atherosclerosis, hypercholesterolemia, myocardial infarction, and thrombosis Therefore, it is useful as a novel ApoB100 secretion inhibitor.
The ApoB100 secretion inhibitor of the present invention is also useful as a novel dyslipidemia preventive / therapeutic agent, a hypercholesterolemia preventive / therapeutic agent, and an arteriosclerosis preventive agent.

図１は実施例２で行った細胞培養液中のＡｐｏＢ１００量を、ＤＭＳＯを使用したときのＡｐｏＢ１００量を１００とした相対値で比較した結果を示す。FIG. 1 shows the result of comparison of the amount of ApoB100 in the cell culture medium performed in Example 2 with a relative value when the amount of ApoB100 when DMSO was used was 100.

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「アポリポプロテインＢ１００（ＡｐｏＢ１００）分泌抑制剤」とは、肝細胞からのアポリポプロテインＢ１００の分泌を抑制することができる薬剤をいう。本明細書中での「ＡｐｏＢ１００」は特に規定がないかぎりアポリポプロテインＢ１００を指す。前記ＡｐｏＢ１００分泌抑制作用は，具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定することができる。
また、「脂質異常症予防・治療剤」とは、血中のトリグリセリド濃度の上昇を抑制または血中のトリグリセリド濃度を低下させることができる薬剤をいう。
また、「高コレステロール血症予防・治療剤」とは、血中のコレステロール濃度の上昇を抑制または血中コレステロール濃度を低下させることができる薬剤をいう。
また、「動脈硬化予防剤」とは、血中のトリグリセリド濃度およびコレステロール濃度の上昇を抑制または血中のトリグリセリド濃度およびコレステロール濃度を低下させることにより動脈硬化を予防できる薬剤をいう。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, “apolipoprotein B100 (ApoB100) secretion inhibitor” refers to a drug capable of suppressing the secretion of apolipoprotein B100 from hepatocytes. In this specification, “ApoB100” refers to apolipoprotein B100 unless otherwise specified. Specifically, the ApoB100 secretion inhibitory action can be measured by the method described in Examples below.
Moreover, the “dyslipidemia preventive / therapeutic agent” refers to a drug capable of suppressing an increase in blood triglyceride concentration or lowering blood triglyceride concentration.
The “hypercholesterolemia preventive / therapeutic agent” refers to a drug capable of suppressing an increase in blood cholesterol level or lowering blood cholesterol level.
The “arteriosclerosis preventive agent” refers to a drug capable of preventing arteriosclerosis by suppressing an increase in blood triglyceride concentration and cholesterol concentration or lowering blood triglyceride concentration and cholesterol concentration.

本発明では、ＡｐｏＢ１００分泌抑制剤、脂質異常症予防・治療剤，高コレステロール血症予防・治療剤および動脈硬化予防剤の構成は同じであるため、これらをまとめて、本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等と略する。   In the present invention, the ApoB100 secretion inhibitor, the dyslipidemia preventive / therapeutic agent, the hypercholesterolemia preventive / therapeutic agent, and the arteriosclerosis preventive agent have the same configuration. Abbreviated as etc.

本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等は、式（１）：   The ApoB100 secretion inhibitor of the present invention has the formula (1):

で示されるフラボノール類とシナピン酸の反応生成物およびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする。 It contains at least one compound selected from the group consisting of a reaction product of flavonols and sinapinic acid represented by the formula (1) and a pharmaceutically acceptable salt thereof.

前記フラボノール類とシナピン酸の反応生成物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩またはそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩は、単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。   Examples of the pharmaceutically acceptable salt of the reaction product of flavonols and sinapinic acid include alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt and potassium salt; alkaline earth salts such as magnesium salt, calcium salt and barium salt Metal salt; Aluminum salt; Metal hydroxide salt such as aluminum hydroxide salt; Alkylamine salt, dialkylamine salt, trialkylamine salt, alkylenediamine salt, cycloalkylamine salt, arylamine salt, aralkylamine salt, heterocyclic Amine salts such as amine salts; amino acid salts such as α-amino acid salts and ω-amino acid salts; peptide salts or primary, secondary, tertiary or quaternary amine salts derived therefrom. . These pharmaceutically acceptable salts can be used alone or in admixture of two or more.

本発明で使用する前記式（１）で示されるフラボノール類とシナピン酸の反応生成物およびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物（以下、フラボノール類・シナピン酸反応生成物と略する。）は、フラボノール類とシナピン酸を原料として、金属塩の存在下で加熱処理して得ることができる。
以下に、前記フラボノール類・シナピン酸反応生成物の製造方法について具体的に説明する。 One or more compounds selected from the group consisting of reaction products of flavonols represented by the above formula (1) and sinapinic acid used in the present invention and pharmaceutically acceptable salts thereof (hereinafter referred to as flavonols / cinapine) The abbreviated acid reaction product) can be obtained by heat treatment in the presence of a metal salt using flavonols and sinapinic acid as raw materials.
Below, the manufacturing method of the said flavonols and a sinapinic acid reaction product is demonstrated concretely.

前記の製造方法では、前駆体としてフラボノール類を用いる。フラボノール類とは、３位に水酸基およびその配糖体をもつフラボン骨格を有する化合物をいい、植物界では多種類にわたって分布している化合物であり、代表的なものとしては、ケルセチン、ミリセチン、ケンフェロール、ルチンなどが挙げられる。
前記フラボノール類は、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のフラボノール類を用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的にフラボノール類・シナピン酸反応生成物が得られるから、フラボノール類以外の成分を含む混合物も使用できる。また、フラボノール類には、塩の誘導体もあるが、前記製造方法では、これらの誘導体も原料として使用することができる。
ただし、フラボノール類・シナピン酸反応生成物の回収率の観点からは、フラボノール類換算で１重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。
前記フラボノール類を含む混合物としては、フラボノール類を含有する植物、例えば、かんきつ類やタマネギの鬼皮等の原料からの抽出物やその凍結乾燥品等を使用してもよい。 In the production method described above, flavonols are used as precursors. Flavonols are compounds having a flavone skeleton having a hydroxyl group and its glycoside at the 3-position, and are distributed over many types in the plant kingdom. Typical examples include quercetin, myricetin, ken Examples include ferrol and rutin.
The flavonols may be naturally derived or chemically synthesized chemical products with high purity. When natural flavonols are used, they do not have to be completely purified, and the desired production reaction proceeds as will be described later, and finally flavonols and sinapinic acid reaction products are obtained. Mixtures containing other ingredients can also be used. Moreover, although flavonols also have salt derivatives, these derivatives can also be used as raw materials in the production method.
However, from the viewpoint of the recovery rate of flavonols and sinapinic acid reaction products, a mixture containing 1% by weight or more in terms of flavonols is desirable as a raw material.
As the mixture containing the flavonols, an extract from a raw material such as a plant containing flavonols, for example, citrus or onion skin, freeze-dried products thereof, and the like may be used.

また、前記製造方法では、前駆体としてシナピン酸も必要である。シナピン酸は、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のシナピン酸を用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に前記フラボノール類・シナピン酸反応生成物が得られるのであれば、シナピン酸以外の成分を含む混合物も使用できる。
ただし、フラボノール類・シナピン酸反応生成物の回収量の観点からは、シナピン酸換算で５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、例えば、リンゴ果実、穀物等の原料からの抽出物、その凍結乾燥品等を使用してもよい。 Further, in the production method, sinapinic acid is also required as a precursor. Sinapic acid may be naturally derived or may be a chemically synthesized chemical product with high purity. When naturally occurring sinapinic acid is used, it does not need to be completely purified, as long as the desired production reaction proceeds and finally the flavonols and sinapinic acid reaction product can be obtained as described later. A mixture containing components other than sinapinic acid can also be used.
However, from the viewpoint of the recovered amount of flavonols and sinapinic acid reaction product, a mixture containing 5% by weight or more in terms of sinapinic acid is desirable as a raw material. As such a raw material, for example, an extract from a raw material such as apple fruit or cereal, a freeze-dried product thereof, or the like may be used.

前記製造方法では、フラボノール類、シナピン酸、またはフラボノール類とシナピン酸との混合物を適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであれば、フラボノール類やシナピン酸の水への溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、フラボノール類やシナピン酸が十分に溶解すれば良い。中でも、メタノールやエタノールのみの溶媒や、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。例えば、フラボノール類・シナピン酸反応生成物を含む反応後組成物に対して最終的な精製を十分に適用せずにその組成物を食品に使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや含水エタノールを使用することが望ましい。   In the production method, flavonols, sinapinic acid, or a mixture of flavonols and sinapinic acid is dissolved in an appropriate solvent. At this time, if the solvent is only water, the solubility of flavonols and sinapinic acid in water is extremely low, and therefore, the solvent may be dissolved only in a mixed solution of water and an organic solvent or only in an organic solvent. There is no restriction | limiting in particular about the compounding ratio of water and an organic solvent, and the kind of organic solvent, What is necessary is just to fully melt | dissolve flavonols and sinapinic acid. Among them, it is preferable from the viewpoint of safety and cost to use a solvent containing only methanol or ethanol, or a mixed solution of water and methanol, water and ethanol, or the like. For example, when using the composition in foods without applying final purification to the post-reaction composition containing the flavonols and sinapinic acid reaction product, as a solvent for safety and legal reasons. It is desirable to use ethanol or hydrous ethanol.

前記のようにして得られるフラボノール類、シナピン酸、またはフラボノール類とシナピン酸との混合物を含有する溶液中のフラボノール類およびシナピン酸の濃度について特に制限はないが、それぞれの濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、フラボノール類およびシナピン酸の濃度は各々の溶媒に対しフラボノール類およびシナピン酸がそれぞれ飽和する濃度近くに調整することが好ましい。   There is no particular limitation on the concentration of flavonols and sinapinic acid in the solution containing the flavonols, sinapinic acid, or a mixture of flavonols and sinapinic acid obtained as described above, but the higher the respective concentrations, the more the solvent Since there are also merits such as a small amount used, it is preferable to adjust the concentrations of flavonols and sinapinic acid close to the concentrations at which the flavonols and sinapinic acid are saturated with respect to each solvent.

また、フラボノール類、シナピン酸は前記溶液中において生成反応前に完全に溶解していなくともよい。例えば、フラボノール類含有溶液とシナピン酸含有溶液とを混合する場合、それぞれの溶液中のフラボノール類濃度、シナピン酸濃度がともに飽和濃度以上であっても、混合液とした場合には、飽和濃度近くになるように調整しておけばよい。   Further, the flavonols and sinapinic acid may not be completely dissolved in the solution before the production reaction. For example, when a flavonol-containing solution and a sinapinic acid-containing solution are mixed, even if both the flavonol concentration and the sinapinic acid concentration in the respective solutions are equal to or higher than the saturated concentration, the mixture solution is close to the saturated concentration. You should adjust so that

次に、前記フラボノール類およびシナピン酸を含有する溶液（以下、フラボノール類、シナピン酸含有溶液）のｐＨを８．０未満に調整することが好ましい。調整方法として、例えば、フラボノール類、シナピン酸含有溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加してｐＨを調整しても良いし、前記溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。フラボノール類、シナピン酸含有溶液の反応開始時のｐＨは８．０以上であれば、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的なフラボノール類・シナピン酸反応生成物の回収量が低下する。したがって、反応開始時のｐＨは３．０以上８．０未満が望ましい。   Next, it is preferable to adjust the pH of the solution containing flavonols and sinapinic acid (hereinafter referred to as flavonols and sinapinic acid-containing solution) to less than 8.0. As an adjustment method, for example, after preparing a flavonol or sinapinic acid-containing solution, a pH adjuster may be added to adjust the pH, or the pH of the solvent may be adjusted in advance when preparing the solution. . If the pH at the start of the reaction of the flavonols or sinapinic acid-containing solution is 8.0 or more, other reactions and decomposition of the target compound may occur on the other hand, so the final recovered amount of flavonols and sinapinic acid reaction products Decreases. Accordingly, the pH at the start of the reaction is desirably 3.0 or more and less than 8.0.

前記製造方法では、前記フラボノール類、シナピン酸含有溶液中に金属塩を添加する。前記金属塩としては、酸性塩、塩基性塩、正塩のいずれでもよく、また、単塩、複塩、錯塩のいずれでもよい。さらに、金属塩は１種類であっても、複数種類の混合物であってもよい。金属塩の例としては、食品添加物として認可されているものが安全性の面で好ましい。例えば、食品に添加することが認められているマグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、亜鉛塩、銅塩等が挙げられる。
また、前記金属塩の混合物としては、例えば、ミネラルプレミックス（田辺製薬株式会社、グルコン酸亜鉛、クエン酸鉄アンモニウム、乳酸カルシウム、グルコン酸銅、リン酸マグネシウムを主成分としたミネラル混合物）のように金属塩を数種類含む物質が挙げられる。また、複数の金属塩を含む混合物として、ミネラルウォーターも挙げることができる。
なお、前記金属塩の含有量としては、フラボノール類・シナピン酸反応生成物を生成可能な量であればよく、特に限定はない。 In the manufacturing method, a metal salt is added to the flavonols and sinapinic acid-containing solution. The metal salt may be any of an acid salt, a basic salt, and a normal salt, and may be any of a single salt, a double salt, and a complex salt. Furthermore, the metal salt may be one kind or a mixture of plural kinds. As an example of the metal salt, those approved as food additives are preferable in terms of safety. For example, magnesium salt, calcium salt, sodium salt, potassium salt, zinc salt, copper salt and the like that are permitted to be added to foods can be mentioned.
Moreover, as a mixture of the metal salts, for example, a mineral premix (Tanabe Seiyaku Co., Ltd., a mineral mixture mainly composed of zinc gluconate, ammonium iron citrate, calcium lactate, copper gluconate, and magnesium phosphate) In addition, substances containing several kinds of metal salts are listed. Moreover, mineral water can also be mentioned as a mixture containing a some metal salt.
The content of the metal salt is not particularly limited as long as it is an amount capable of generating a flavonol / sinapinic acid reaction product.

次に、金属塩存在下で、フラボノール類、シナピン酸含有溶液を加熱処理する。この加熱処理により、フラボノール類・シナピン酸反応生成物の生成反応を行う。生成反応を効率的に進ませるために、フラボノール類、シナピン酸含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加熱が望ましい。例えば、開放容器にフラボノール類、シナピン酸含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加熱する、密閉容器にフラボノール類、シナピン酸含有溶液を入れて前記容器を加熱する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加熱する等、少なくとも部分的に溶液温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。回収効率面から、溶液温度が均一に１１０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近に加熱する場合は、５分〜３６０分の加熱時間が望ましい。また、加熱は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良い。複数回に分けて加熱する場合、蒸発した溶媒を補うために溶媒を新たに追加して行うことが好ましい。   Next, the flavonols and sinapinic acid-containing solution are heat-treated in the presence of a metal salt. By this heat treatment, a flavonol / sinapic acid reaction product is generated. In order to advance the production reaction efficiently, the heating temperature of the flavonols and sinapinic acid-containing solution is preferably adjusted to 110 ° C. or higher. Also, considering the boiling point of the solvent used, pressure heating is desirable. For example, a flavonol or sinapinic acid-containing solution is placed in an open container and the container is heated at a high temperature exceeding the boiling point of the solvent. A flavonol or sinapinic acid-containing solution is placed in a sealed container and the container is heated. It is preferable to heat the solution so that the solution temperature reaches 110 ° C. or more, for example, by heating under pressure using an autoclave. From the viewpoint of recovery efficiency, it is more preferable that the solution temperature be 110 ° C. to 150 ° C. uniformly. The heating time is not limited as in the case of the heating temperature, and may be a time condition in which the target reaction efficiently proceeds. In particular, the heating time depends on the heating temperature, and it is desirable to set the heating time according to the heating temperature. For example, when heating near 130 ° C., a heating time of 5 minutes to 360 minutes is desirable. Further, the heating may be performed once or may be repeated repeatedly in a plurality of times. In the case of heating in a plurality of times, it is preferable to add a new solvent to supplement the evaporated solvent.

前記加熱処理によるフラボノール類・シナピン酸反応生成物の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析によりフラボノール類・シナピン酸反応生成物の生成量を確認して判断すればよい。   The completion of the formation reaction of the flavonols / sinapic acid reaction product by the heat treatment may be judged by confirming the amount of the flavonols / sinapic acid reaction product generated by, for example, component analysis by HPLC.

得られる反応溶液中には、生成したフラボノール類・シナピン酸反応生成物が含有されている。
また、安全な原料のみを用いた工程でフラボノール類・シナピン酸反応生成物を製造した場合には、前記フラボノール類・シナピン酸反応生成物を含む混合物の状態で食品、医薬品または医薬部外品に使用することが可能である。例えば、天然由来のフラボノール類、シナピン酸を含水エタノール溶媒に溶解し、ミネラルウォーターやミネラルプレミックスを添加して加熱処理した場合には、得られる反応溶液を食品原料の一つとして使用することが可能である。 The resulting reaction solution contains the produced flavonols and sinapinic acid reaction product.
In addition, when a flavonol / sinapic acid reaction product is produced by a process using only safe raw materials, it is used as a food, medicine or quasi-drug in the state of a mixture containing the flavonols / sinapic acid reaction product. It is possible to use. For example, when natural flavonols and sinapinic acid are dissolved in a water-containing ethanol solvent and heated by adding mineral water or mineral premix, the resulting reaction solution may be used as one of the food ingredients. Is possible.

また、風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応溶液を濃縮してフラボノール類・シナピン酸反応生成物の濃度を高める、あるいは前記反応溶液を精製しフラボノール類・シナピン酸反応生成物の純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等を用いた溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出してフラボノール類・シナピン酸反応生成物を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。   In addition, if you want to improve flavor and improve functionality, concentrate the reaction solution to increase the concentration of flavonols and sinapic acid reaction products, or purify the reaction solution to flavonols and sinapic acid reaction. A pure product can be obtained. Concentration and purification can be performed by a known method. For example, flavonols and sinapinic acid reaction products can be concentrated by extraction using a solvent extraction method using chloroform, ethyl acetate, ethanol, methanol or the like, a supercritical extraction method using carbon dioxide gas, or the like. It is also possible to perform concentration and purification using column chromatography. A membrane treatment method such as a recrystallization method or an ultrafiltration membrane can also be applied.

また、前記反応溶液から式（１）で表されるフラボノール類・シナピン酸反応生成物を分離して回収する場合には、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等を用いてもよい。   Further, when the flavonols and sinapinic acid reaction products represented by the formula (1) are separated and recovered from the reaction solution, column chromatography, HPLC, or the like may be used.

前記のようにして得られる濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒除去することで、粉末状のフラボノール類・シナピン酸反応生成物を得ることができる。   If necessary, the concentrated or purified product obtained as described above is dried under reduced pressure or freeze-dried to remove the solvent, whereby a powdery flavonol / sinapinic acid reaction product can be obtained.

また、得られたフラボノール類・シナピン酸反応生成物は、必要に応じて、当該分野で公知の方法により、該化合物の塩としてもよい。   In addition, the obtained flavonols and sinapinic acid reaction product may be converted into a salt of the compound by a method known in the art, if necessary.

前記のフラボノール類・シナピン酸反応生成物は、優れたＡｐｏＢ１００分泌抑制作用を有する。
したがって、本発明は、前記のフラボノール類・シナピン酸反応生成物を有効成分として含有するＡｐｏＢ１００分泌抑制剤、さらにはＡｐｏＢ１００分泌抑制に関連する疾患の予防・治療剤、例えば、脂質異常症予防・治療剤、高コレステロール血症予防・治療剤、動脈硬化予防剤などを提供することができる。 The flavonols and sinapinic acid reaction product have an excellent inhibitory effect on ApoB100 secretion.
Accordingly, the present invention provides an ApoB100 secretion inhibitor containing the flavonols and sinapinic acid reaction product as an active ingredient, as well as a prophylactic / therapeutic agent for diseases related to ApoB100 secretion inhibition, for example, prevention / treatment of dyslipidemia. Agent, hypercholesterolemia preventive / therapeutic agent, arteriosclerosis preventive agent and the like.

本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等は、前記のフラボノール類・シナピン酸反応生成物のみを含有していてもよいが、フラボノール類・シナピン酸反応生成物をエタノール又はエタノール含有水溶液等の溶媒に溶解した液剤としたり、公知の方法で乳剤、懸濁剤としたりしてもよい。本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等中のフラボノール類・シナピン酸反応生成物の含有量は、０．００１重量％以上であればよい。   The ApoB100 secretion inhibitor of the present invention may contain only the flavonols and sinapinic acid reaction product, but the flavonols and sinapinic acid reaction product were dissolved in a solvent such as ethanol or an ethanol-containing aqueous solution. You may make it into a liquid agent, or you may make it into an emulsion and a suspension by a well-known method. The content of the flavonols and sinapinic acid reaction product in the ApoB100 secretion inhibitor of the present invention may be 0.001% by weight or more.

本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等の投与量としては、患者の性別、年齢、生理的状態、病態（肥満の進み具合等）、製剤形態、投与経路、投与回数、薬剤における有効成分濃度等に応じて広い範囲から適宜選択できるが、例えば、成人１日当たり、フラボノール類・シナピン酸反応生成物の含有量が０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ程度であればよい。投与は、例えば、１日当たり１回又は数回に分けてもよい。   The dosage of the ApoB100 secretion inhibitor of the present invention depends on the sex, age, physiological state, pathological condition (such as progress of obesity), formulation form, administration route, number of administrations, active ingredient concentration in the drug, etc. However, the content of flavonols and sinapinic acid reaction product per day for adults may be about 0.01 to 500 mg / kg, preferably about 0.1 to 100 mg / kg. . Administration may be divided, for example, once or several times per day.

本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等は、医薬品として製剤化してもよい。この製剤形態としては特に限定されず、例えば、注射剤、坐剤、点眼剤、軟膏剤、エアゾール剤等の非経口剤、錠剤、被覆錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、トローチ剤、チュアブル錠、シロップ剤等の経口剤等が挙げられる。製剤化の際には、薬学的に許容される担体、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤等が用いられる。   The ApoB100 secretion inhibitor of the present invention may be formulated as a pharmaceutical product. There are no particular limitations on the form of the preparation, and examples include parenteral preparations such as injections, suppositories, eye drops, ointments, aerosols, tablets, coated tablets, powders, fine granules, granules, capsules, and liquids. , Pills, suspensions, emulsions, lozenges, chewable tablets, syrups and other oral preparations. For formulation, pharmaceutically acceptable carriers, excipients, lubricants, binders, disintegrants, diluents, stabilizers, tonicity agents, pH adjusters, buffers, etc. are used. It is done.

担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム及びこれらの混合物等が挙げられる。   Carriers and excipients include, for example, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, maltose, mannitol, erythritol, xylitol, maltitol, inositol, dextran, sorbitol, albumin, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose , Silicic acid, methylcellulose, glycerin, sodium alginate, gum arabic and mixtures thereof.

滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。 Examples of the lubricant include purified talc, stearate, borax, polyethylene glycol, and a mixture thereof.
Examples of the binder include simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, polyvinyl pyrrolidone, carboxymethyl cellulose, shellac, methyl cellulose, ethyl cellulose, water, ethanol, potassium phosphate, and a mixture thereof. Can be mentioned.

崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖及びこれらの混合物等が挙げられる。   Examples of the disintegrant include dry starch, sodium alginate, agar powder, laminaran powder, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, starch, lactose and mixtures thereof. Is mentioned.

希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類及びこれらの混合物等が挙げられる。
安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸及びこれらの混合物等が挙げられる。 Examples of the diluent include water, ethyl alcohol, macrogol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and mixtures thereof.
Examples of the stabilizer include sodium pyrosulfite, ethylenediaminetetraacetic acid, thioglycolic acid, thiolactic acid, and a mixture thereof.

等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリン及びこれらの混合物等が挙げられる。
ｐＨ調整剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。 Examples of the isotonic agent include sodium chloride, boric acid, glucose, glycerin and a mixture thereof.
Examples of the pH adjuster and buffer include sodium citrate, citric acid, sodium acetate, sodium phosphate, and mixtures thereof.

さらに本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等は、増量剤、可溶化剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、抗酸化剤、細菌抑制剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を含んでいてもよい。   Furthermore, the ApoB100 secretion inhibitor and the like of the present invention may contain a bulking agent, a solubilizer, a dispersant, a suspending agent, an emulsifier, an antioxidant, a bacteria inhibitor, a coloring agent, a corrigent, a corrigent and the like. .

また、本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等を食品の形態に製剤化してもよい。食品としては特に限定されず、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子、機能性食品、健康食品、健康志向食品等が挙げられる。保存性、携帯性、摂取の容易さ等を考慮すると、菓子類が好ましく、菓子類の中でも、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット、チューイングガム等が好ましい。   Moreover, you may formulate the ApoB100 secretion inhibitor of this invention, etc. in the form of a foodstuff. It does not specifically limit as food, For example, a drink, alcoholic beverage, jelly, confectionery, functional food, health food, health-oriented food, etc. are mentioned. In consideration of preservability, portability, ease of ingestion and the like, confectionery is preferable, and among confectionery, hard candy, soft candy, gummy candy, tablet, chewing gum and the like are preferable.

本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等を食品の形態に製剤化する場合、フラボノール類・シナピン酸反応生成物の該食品における含有量は、通常０．００１〜２０重量％程度である。   When the ApoB100 secretion inhibitor or the like of the present invention is formulated into a food form, the content of the flavonols / sinapic acid reaction product in the food is usually about 0.001 to 20% by weight.

また、本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等を医薬部外品の形態に製剤化してもよい。医薬部外品としては特に限定されないが、例えば、ドリンク剤等の栄養補助医薬部外品が好ましい。この場合、有効成分であるフラボノール類・シナピン酸反応生成物の医薬部外品における含有量は、通常０．００１〜３０重量％程度である。   In addition, the ApoB100 secretion inhibitor of the present invention may be formulated into a quasi-drug form. Although it does not specifically limit as a quasi-drug, For example, nutritional supplement quasi-drugs, such as a drink, are preferable. In this case, the content of flavonols and sinapinic acid reaction products as active ingredients in quasi-drugs is usually about 0.001 to 30% by weight.

また、本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等は、ヒトに対してだけでなく、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。   The ApoB100 secretion inhibitor of the present invention is not only for humans but also for non-human animals such as rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc. May be added to a therapeutic agent or feed for mammals, birds, amphibians, reptiles, etc. As feed, for example, livestock feed used for sheep, pigs, cattle, horses, chickens, etc., feed for small animals used for rabbits, rats, mice, etc., feed for seafood used for eel, Thailand, yellowtail, shrimp, etc., dogs, The pet food used for a cat, a small bird, a squirrel, etc. is mentioned.

次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。ここでは、フラボノール類としてケルセチンを用いた反応を示すが他のフラボノール類でも同様の反応で化合物が得られる。   EXAMPLES Next, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited only to this Example. Here, a reaction using quercetin as a flavonol is shown, but a compound can be obtained by a similar reaction with other flavonols.

（実施例１：ＵＨＡ２０３６の生成および単離・精製）
本発明のフラボノール類・シナピン酸反応生成物であるＵＨＡ２０３６は筆者らが以前に報告した特許文献４（特願２０１２−１２１３７０号）の実施例２に記載の方法に従って作製した。すなわち、ケルセチン二水和物１ｇ、シナピン酸１ｇをエタノール２０ｍＬに溶解し、ミネラルウォーター２０ｍＬを加えて、ケルセチン、シナピン酸含有溶液（ｐＨ＝４．９）を得た。このケルセチン、シナピン酸含有溶液をオートクレーブ（三洋電機（株）、「ＳＡＮＹＯ ＬＡＢＯ ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」、以下同じ）にて１３０℃、１８０分間加熱した。得られた反応溶液のうち１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうちの１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。 (Example 1: Production, isolation and purification of UHA2036)
UHA2036, which is the flavonols and sinapinic acid reaction product of the present invention, was prepared according to the method described in Example 2 of Patent Document 4 (Japanese Patent Application No. 2012-121370) previously reported by the authors. That is, 1 g of quercetin dihydrate and 1 g of sinapinic acid were dissolved in 20 mL of ethanol, and 20 mL of mineral water was added to obtain a solution containing quercetin and sinapinic acid (pH = 4.9). The quercetin and sinapinic acid-containing solution was heated at 130 ° C. for 180 minutes in an autoclave (Sanyo Electric Co., Ltd., “SANYO LABO AUTOCLAVE”, hereinafter the same). 1 mL of the obtained reaction solution was diluted to 50 mL with methanol, and 10 μL of this was analyzed by HPLC.

ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ₂Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：１００％Ａ／０％Ｂから０％Ａ／１００％Ｂまで３３分間、１００％Ｂで７分間（全て直線） HPLC analysis was performed under the following conditions.
Column: Column for reverse phase “Develosil (registered trademark) C-30-UG-5” (4.6 mm.d. × 250 mm)
Mobile phase: A: H ₂ O (0.1% trifluoroacetic acid (TFA)), B: Acetonitrile (0.1% TFA)
Flow rate: 1 mL / min
Injection: 10 μL
Detection: 254 nm
Gradient (volume%): 100% A / 0% B to 0% A / 100% B for 33 minutes, 100% B for 7 minutes (all linear)

得られたＨＰＬＣ溶出物のうち、溶出時間が１８分前後のピークの化合物を回収した。得られた化合物をＵＨＡ２０３６と命名した。   Of the obtained HPLC eluate, a peak compound with an elution time of around 18 minutes was recovered. The resulting compound was named UHA2036.

次に、ＵＨＡ２０３６を分取ＨＰＬＣにより精製し、常法により乾燥したところ、黄色粉末状の物質となった。   Next, UHA2036 was purified by preparative HPLC and dried by a conventional method to obtain a yellow powdery substance.

次いで、前記ＵＨＡ２０３６の分子量を高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定したところ、測定値は４８１．４２８６であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ₂₅Ｈ₂₁Ｏ₁₀（Ｍ−Ｈ^-）：４８１．４２８２
分子式Ｃ₂₅Ｈ₂₂Ｏ₁₀ Subsequently, when the molecular weight of the UHA2036 was measured by high resolution negative-FAB-MS (Fast Atom Bombardment-Mass Spectrometry), the measured value was 481.4286. From the comparison with the theoretical value, the following molecular formula was obtained. .
Theoretical value C ₂₅ H ₂₁ O ₁₀ (M−H ⁻ ): 481.4282
Molecular formula C ₂₅ H ₂₂ O ₁₀

次に、前記ＵＨＡ２０３６を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ２０３６が前記式（１）で表される構造を有することを確認した。   Next, the UHA2036 is subjected to nuclear magnetic resonance (NMR) measurement, and from analysis of 1H-NMR, 13C-NMR and various two-dimensional NMR data, the UHA2036 has a structure represented by the formula (1). confirmed.

（実施例２ ＡｐｏＢ１００の定量）
ＡｐｏＢ１００分泌量を評価するために、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト由来肝臓癌細胞）を用いて評価を行った。 (Example 2 Quantification of ApoB100)
In order to evaluate the ApoB100 secretion amount, evaluation was performed using HepG2 cells (human-derived liver cancer cells).

試料にはケルセチン、ＵＨＡ２０３６の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）６ｍＭの濃度で溶解させて試験に使用した。   Two types of samples, quercetin and UHA2036, were used. Each sample was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a concentration of 6 mM and used for the test.

培養は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：バイオロジカル・インダストリーズ社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）を用いていった。試験に使用する細胞は定法に従って調製した。つまり、細胞培養用２４ｗｅｌｌディッシュ（日本ＢＤ社製）にＨｅｐＧ２細胞を１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬで１ｍＬ播種して３７℃、５％ＣＯ₂条件下で７２時間培養し、１００％コンフルエントしたものを使用した。 The culture is Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Sigma) containing 10% fetal bovine serum (FBS: manufactured by Biological Industries) and 1% antibiotic-antimycotic (manufactured by Gibco). Used). The cells used for the test were prepared according to a conventional method. That is, a 24-well dish for cell culture (manufactured by BD Japan) was seeded with 1 mL of HepG2 cells at 1 × 10 ⁵ cells / mL, cultured at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 72 hours, and 100% confluent. used.

試験は以下のように行った。培養した細胞に各試料を５μＬ（終濃度３０μＭ）添加して２４時間処理した。溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものをコントロールとした。２４時間の培養後、ＤＭＳＯで２００ｍＭに調整したオレイン酸を５μＬ（終濃度１ｍＭ）添加してさらに２４時間培養した。培養終了後，培養液を回収してＡｐｏＢ１００の定量に使用した。   The test was conducted as follows. 5 μL of each sample (final concentration 30 μM) was added to the cultured cells and treated for 24 hours. A control was added with only 0.5% of DMSO as a solvent. After culturing for 24 hours, 5 μL of oleic acid adjusted to 200 mM with DMSO (final concentration: 1 mM) was added and further cultured for 24 hours. After completion of the culture, the culture solution was collected and used for quantification of ApoB100.

ＡｐｏＢ１００の定量はＥＬＩＳＡ法にて行った。方法は，ＰＢＳ（−）で１０μｇ／ｍＬに調整したＡｎｔｉ−ＡｐｏＢポリクローナル抗体（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ社製）を９６ｗｅｌｌプレート（ＮＵＮＣ社製）に５０μＬずつ添加して４℃で１２時間静置した。１２時間後、ＰＢＳ（−）３００μＬで３回洗浄して，ＰＢＳ（−）で２０％に調整したイムノブロックを３００μＬ添加して２時間静置した。２時間後、ＰＢＳ（−）３００μＬで３回洗浄して細胞培養液５０μＬを添加して１時間静置した。ＰＢＳ（−）３００μＬで３回洗浄して、１０ｍＭＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭＮａＣｌ／０．１％ＢＳＡで１０μｇ／ｍＬに調整したＡｎｔｉ−ＡｐｏＢ ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ社製）を５０μＬ添加して１時間静置した。１時間後，ＰＢＳ（−）３００μＬで５回洗浄してＴＭＢ溶液（ＢｉｏＲａｄ社製）を５０μＬ添加した。反応後、０．５Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を２５μＬ添加して４５０ｎｍの吸光度を測定した。コントロールの吸光度を１００％として相対値で比較した。これらの結果を図１に示した。 ApoB100 was quantified by ELISA. In the method, Anti-ApoB polyclonal antibody (manufactured by Binding site) adjusted to 10 μg / mL with PBS (−) was added to a 96-well plate (manufactured by NUNC) in 50 μL aliquots and allowed to stand at 4 ° C. for 12 hours. After 12 hours, 300 μL of PBS (−) was washed 3 times, and 300 μL of an immunoblock adjusted to 20% with PBS (−) was added, and allowed to stand for 2 hours. After 2 hours, the cells were washed 3 times with 300 μL of PBS (−), added with 50 μL of cell culture solution, and allowed to stand for 1 hour. Washed 3 times with 300 μL of PBS (−), added 50 μL of Anti-ApoB HRP conjugated antibody (Binding site) adjusted to 10 μg / mL with 10 mM HEPES / 150 mM NaCl / 0.1% BSA, and allowed to stand for 1 hour. did. After 1 hour, the plate was washed 5 times with 300 μL of PBS (−) and 50 μL of TMB solution (manufactured by BioRad) was added. After the reaction, 25 μL of 0.5 MH ₂ SO ₄ was added and the absorbance at 450 nm was measured. The relative absorbance was compared with the absorbance of the control as 100%. These results are shown in FIG.

図１の結果より、ＵＨＡ２０３６においてコントロール及びケルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）と比較し、ＡｐｏＢ１００量が有意に低かったことから、優れたＡｐｏＢ１００分泌抑制作用が確認された。   From the result of FIG. 1, since the amount of ApoB100 was significantly lower in UHA2036 compared with control and quercetin, an excellent ApoB100 secretion inhibitory action was confirmed.

このようにＵＨＡ２０３６は、優れたＡｐｏＢ１００分泌抑制作用を有することから、ＡｐｏＢ１００分泌抑制として有効であることがわかる。また、前記ＡｐｏＢ１００分泌抑制作用に関連する疾患予防・治療剤、具体的には、脂質異常症の予防・治療剤、高コレステロール血症予防・治療剤または動脈硬化予防剤としても有効であることもわかる。   Thus, since UHA2036 has an excellent ApoB100 secretion inhibitory action, it can be seen that it is effective as ApoB100 secretion inhibition. It may also be effective as a disease preventive / therapeutic agent related to the ApoB100 secretion inhibitory action, specifically, as a prophylactic / therapeutic agent for dyslipidemia, a prophylactic / therapeutic agent for hypercholesterolemia, or an arteriosclerosis preventive agent. Recognize.

Claims (4)

式（１）：

で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とするアポリポプロテインＢ１００分泌抑制剤。 Formula (1):

Apolipoprotein B100 secretion inhibitor, comprising at least one compound selected from the group consisting of a reaction product of flavonols and sinapinic acid represented by the formula (1) and a pharmaceutically acceptable salt thereof. 式（１）：

で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする脂質異常症予防・治療剤。 Formula (1):

A prophylactic / therapeutic agent for dyslipidemia, comprising at least one compound selected from the group consisting of a reaction product of flavonols and sinapinic acid represented by the formula (1) and a pharmaceutically acceptable salt thereof. 式（１）：

で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする高コレステロール血症予防・治療剤。 Formula (1):

A prophylactic / therapeutic agent for hypercholesterolemia, comprising one or more compounds selected from the group consisting of a reaction product of flavonols and sinapinic acid represented by the formula (1) and a pharmaceutically acceptable salt thereof. 式（１）：

で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする動脈硬化予防剤。 Formula (1):

A prophylactic agent for arteriosclerosis comprising at least one compound selected from the group consisting of a reaction product of flavonols and sinapinic acid represented by the formula (1) and a pharmaceutically acceptable salt thereof.

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