JP6009154B2 - Cell membrane permeable boron peptide - Google Patents

Description

本発明は、がん治療に用いるホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）における、ホウ素含有化合物に関する。より具体的には、細胞膜透過シグナルペプチドおよびホウ素化合物を含む細胞膜透過型ホウ素ペプチドおよびそれを含むホウ素製剤に関する。   The present invention relates to a boron-containing compound in boron neutron capture therapy (BNCT) used for cancer treatment. More specifically, the present invention relates to a cell membrane permeation type boron peptide containing a cell membrane permeation signal peptide and a boron compound and a boron preparation containing the same.

ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）とは、ホウ素化合物自体には、毒性や腫瘍抑制効果は無いが、ホウ素を含んだがん細胞に対して中性子を照射すると、細胞内でアルファ崩壊と呼ばれる核***反応がおこり、腫瘍を殺傷するというものである。この際の腫瘍殺傷効果は、ホウ素を含んでいる細胞レベルで起こるものであり、正常細胞にホウ素が入っていなければ、がん細胞のみを細胞レベルで殺すことができる次世代のがん治療法である。現在、ホウ素製剤を使用した粒子線癌治療は、臨床研究段階であり、２種類のホウ素製剤が検討されている。それは、１個のホウ素原子に対してアミノ酸のフェニルアラニンが結合したＢＰＡ（ホウ素フェニルアラニン）と１２個のホウ素からなる分子であるＢＳＨ（メルカプトウンデカハイドロドデカボレート）の二剤であり、具体的にはいずれも難治性疾患である悪性脳腫瘍、頭頚部がん、悪性黒色腫などの疾患を対象に行われている。   Boron neutron capture therapy (BNCT) means that boron compounds themselves have no toxicity or tumor suppressive effects, but when neutrons are irradiated to boron-containing cancer cells, a fission reaction called alpha decay occurs in the cells. , Killing the tumor. The tumor killing effect at this time occurs at the cell level containing boron, and if the normal cells do not contain boron, the next generation cancer treatment method that can kill only cancer cells at the cell level It is. Currently, particle beam cancer treatment using boron preparations is in the clinical research stage, and two types of boron preparations are being studied. It is a dual agent of BSH (mercaptoundecahydrododecaborate), which is a molecule consisting of 12 boron atoms and BPA (boron phenylalanine) in which the amino acid phenylalanine is bonded to one boron atom. All of them are performed for intractable diseases such as malignant brain tumors, head and neck cancer, and malignant melanoma.

今後、ＢＮＣＴががん治療として確立されれば、他のがんに対しても行われる可能性は非常に高い。その中において、中性子源とならびホウ素化合物は治療効果を決める上で最も大事な要素である。つまり、ホウ素が細胞に取り込まれていない場合、中性子を照射しても影響は無いため、腫瘍に対して、特に腫瘍細胞の内部にホウ素を導入することは、治療の成果を上げるために最も大事なことである。   In the future, if BNCT is established as a cancer treatment, it is very likely to be performed on other cancers. Among them, the neutron source and boron compound are the most important factors in determining the therapeutic effect. In other words, if boron is not taken up by cells, irradiation with neutrons has no effect, so introducing boron into tumors, especially inside tumor cells, is the most important for improving the outcome of treatment. It is a thing.

また、ＢＮＣＴでは、理論上、ホウ素化合物を選択的にがん細胞内部へ導入することができれば、周囲の正常組織に対しては影響を与えることなく、がん細胞のみを選択的に殺傷することができる。この際、細胞の外延や細胞膜近くにホウ素化合物が留まり、細胞内部へと充分に局在化できなければ、周りの正常組織・細胞にも影響を与えることになる。このため、ホウ素化合物を目的とする細胞内に局在させることも望まれている。   In theory, in BNCT, if a boron compound can be selectively introduced into a cancer cell, only the cancer cell can be selectively killed without affecting the surrounding normal tissue. Can do. At this time, if the boron compound stays in the vicinity of the cell extension or cell membrane and does not sufficiently localize inside the cell, it affects the surrounding normal tissues and cells. For this reason, it is also desired that the boron compound be localized in the target cell.

ここで、現在臨床研究で用いられている、ＢＳＨによるＢＮＣＴは、がん組織や悪性腫瘍組織などの腫瘍血管は脆弱な構造であるため、その部分においてホウ素製剤が正常部分と比較して多く漏出することを利用し、その漏出部分に対して中性子照射を行うことによりホウ素中性子補足反応を起こし癌や腫瘍を殺傷するものである。しかしながら、ＢＳＨには細胞膜透過能がないため、細胞と細胞の間の細胞組織間に局在してしまい、がん細胞などに対しての腫瘍殺傷効果が充分に高くないという問題がある。   Here, BNCT by BSH, which is currently used in clinical research, has a fragile structure of tumor blood vessels such as cancer tissue and malignant tumor tissue, so that boron preparation leaks more in that part than normal part. By utilizing this, neutron irradiation is performed on the leaked part, thereby causing a boron neutron supplemental reaction and killing cancer and tumor. However, since BSH does not have a cell membrane permeability, it is localized between cell tissues between cells, and there is a problem that the tumor killing effect on cancer cells and the like is not sufficiently high.

また、前述のＢＰＡは、メラニンの生成のためにフェニルアラニンやチロシンが細胞中に強く取り込まれることを利用した黒色皮膚がん治療のための薬剤であり、水溶性の向上等の改良がなされている（特許文献１）。ＢＰＡは、***する細胞であれば、正常細胞でもがん細胞でも細胞内へと取り込まれるが、腫瘍細胞の方がアミノ酸の取り込みが盛んなため、正常細胞に比較して腫瘍細胞へたくさん取り込まれるという性質を利用している。この方法では、正常細胞にもホウ素製剤が取り込まれてしまうこと、およびがん細胞でも***していない細胞には取り込まれないことなどの問題がある。   The aforementioned BPA is a drug for the treatment of black skin cancer utilizing the fact that phenylalanine and tyrosine are strongly taken into cells for the production of melanin, and improvements such as improved water solubility have been made. (Patent Document 1). BPA is taken up into cells, both normal and cancer cells, as long as it divides, but because tumor cells are more active in taking up amino acids, they are taken up more in tumor cells than in normal cells. Is used. In this method, there are problems such as that the boron preparation is taken up into normal cells and that the cancer cells are not taken up into cells that are not dividing.

標的細胞にターゲッティングする試みとしては、ホウ素化合物とホルモン類似体（リガンド）との複合体を用い、該ホルモンに対する細胞内受容体を有する細胞に特異的にターゲッティングする方法（特許文献２）や、腫瘍細胞特異的抗原に結合する抗体を含む結合対を投与し、任意にはその非腫瘍部分における結合対の相補的な構成物とホウ素原子を含む接合体を投与することからなる、腫瘍細胞にホウ素原子をターゲッティングする方法（特許文献３）が試みられている。   As an attempt to target a target cell, a method of specifically targeting a cell having an intracellular receptor for the hormone using a complex of a boron compound and a hormone analog (ligand) (Patent Document 2), or a tumor Boron to tumor cells comprising administering a binding pair comprising an antibody that binds to a cell specific antigen, optionally administering a conjugate comprising a complementary member of the binding pair in its non-tumor portion and a boron atom Attempts have been made to target atoms (Patent Document 3).

さらに、腫瘍細胞中のホウ素の濃度を正常な組織中の濃度に対して高めることを目的として、多孔性のシリコンにホウ素を組み込んだホウ素含有治療用組成物も開示されている（特許文献４）。   Furthermore, a boron-containing therapeutic composition in which boron is incorporated into porous silicon for the purpose of increasing the concentration of boron in tumor cells relative to the concentration in normal tissue is also disclosed (Patent Document 4). .

薬剤を特異的に体内に送達できるビヒクルとして、ヒアルロン酸および／またはポリエチレングリコールが結合したカチオン化ゼラチンとセンダイウイルス由来のベクターなどのウイルスエンベロープベクターを組み合わせたビヒクルを用いてホウ素含有化合物を封入して使用する方法も報告されている（特許文献５）。この方法では、実際にはほとんど細胞内へ導入されておらず、実用的なものではない。   As a vehicle capable of specifically delivering drugs to the body, a boron-containing compound is encapsulated using a vehicle in which hyaluronic acid and / or polyethylene glycol-conjugated cationized gelatin and a virus envelope vector such as a Sendai virus-derived vector are combined. A method of use has also been reported (Patent Document 5). This method is practically hardly introduced into cells and is not practical.

このように、現在のところ細胞内においても細胞の中心部に存在する核に局在させることができるようなホウ素製剤は一切報告されていない。   Thus, at present, no boron preparation that can be localized in the nucleus located in the center of the cell even in the cell has been reported.

一方、細胞膜を通過するシグナルペプチドとして、これまでＨＩＶ−１ Ｔａｔなどのアルギニンを多く含む塩基性ペプチドが知られている。また、アルギニンが複数個連続したアミノ酸配列を有するペプチドが生体膜透過シグナル配列として機能し、細胞膜透過性を有することが報告されている（特許文献６）。   On the other hand, basic peptides containing a large amount of arginine such as HIV-1 Tat have been known as signal peptides that pass through cell membranes. Moreover, it has been reported that a peptide having an amino acid sequence in which a plurality of arginines are continuous functions as a biological membrane permeation signal sequence and has cell membrane permeability (Patent Document 6).

しかしながら、これらのペプチドをホウ素化合物の細胞内への送達に使用するという試みはこれまで一切なされていない。   However, no attempt has been made to use these peptides for the delivery of boron compounds into cells.

特開平８−３２５２７１号公報JP-A-8-325271 特表平１１−５０５５０４号公報Japanese National Patent Publication No. 11-505504 特表２０００−５１６２１７号公報Special Table 2000-516217 特表２００６−５１６５９９号公報JP 2006-516599 A 特開２００８−３０８４４０号公報JP 2008-308440 A 特開２００３−２５２８９８号公報JP 2003-252898 A

本発明の目的は、細胞膜を透過し細胞内、とりわけ核に局在する細胞膜透過型ホウ素製剤を提供することである。   An object of the present invention is to provide a cell membrane permeable boron preparation that permeates the cell membrane and is localized in the cell, particularly in the nucleus.

ホウ素化合物ＢＳＨに細胞膜透過ペプチドと呼ばれるペプチドを用いて修飾を行ったところ、これまで細胞内への導入が困難であったホウ素化合物ＢＳＨを細胞内部に導入することが可能となり、さらには、時間経過によりホウ素化合物が、細胞の中心に局在する核へ集積することを見出し、本発明が完成された。   When the boron compound BSH is modified with a peptide called a cell membrane permeable peptide, it becomes possible to introduce the boron compound BSH, which has been difficult to introduce into the cell, into the cell. Thus, the boron compound was found to accumulate in the nucleus located in the center of the cell, and the present invention was completed.

本発明は、細胞膜透過ペプチドおよびホウ素化合物を含む細胞膜透過型ホウ素ペプチドに関する。   The present invention relates to a cell membrane permeable boron peptide containing a cell membrane permeable peptide and a boron compound.

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドにおいて、細胞膜透過ペプチドは、アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチド、ＴＡＴ（配列番号１：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ（３４−５０）（配列番号２：ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ）、ＦＨＶ Ｃｏａｔ（３５−４９）（配列番号３：ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ）、ＢＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号４：ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ）、ＨＴＬＶ−II Ｒｅｘ（４−１６）（配列番号５：ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ）、ＣＣＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号６：ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲ）、Ｐ２２ Ｎ（１４−３０）（配列番号７：ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ）、λＮ（１−２２）（配列番号８：ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ）、φ２１Ｎ（１２−２９）（配列番号９：ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ）および酵母ＰＲＰ６（１２９−１４４）（配列番号１０：ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ）からなる群より選択されることが好ましい。   In the cell membrane permeable boron peptide of the present invention, the cell membrane permeable peptide is a peptide consisting of an amino acid sequence in which 3 to 13 residues of arginine are continuous, TAT (SEQ ID NO: 1 GRKKRRQRRR), HIV-1 Rev (34-50) (sequence) Number 2: TRQARNRNRRRWRERRQ), FHV Coat (35-49) (SEQ ID NO: RRRRNRTRRNRRRVR), BMV Gag (7-25) (SEQ ID NO: 4: KMTRAQRRAAARNRNRWTAR), HTLV-II Rex (4-16) (SEQ ID NO: 5) TRRQRTRRRRRNR), CCMV Gag (7-25) (SEQ ID NO: 6: KLTRAQRRAAARNKNKRNTR), P22 N (14-30) (SEQ ID NO: 7: NAKTRRHERRRKRLAIER), λN (1-22) (SEQ ID NO: No. 8: MDAQTRRERRAEKQAQWKAAN), φ21N (12-29) (SEQ ID NO: 9: TAKTRYKARRAELIAERR) and yeast PRP6 (129-144) (SEQ ID NO: 10: TRRNRKRNRIQEQLNRK).

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドにおいて、細胞膜透過ペプチドは、アルギニン９〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。   In the cell membrane permeable boron peptide of the present invention, the cell membrane permeable peptide is preferably a peptide consisting of an amino acid sequence in which 9 to 13 residues of arginine are continuous.

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドにおいて、ホウ素化合物が、アミノ酸と結合可能な官能基を有するホウ素クラスターであることが好ましい。   In the cell membrane permeable boron peptide of the present invention, the boron compound is preferably a boron cluster having a functional group capable of binding to an amino acid.

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドにおいて、ホウ素化合物は、メルカプトウンデカハイドロドデカボレートであることがさらに好ましい。   In the cell membrane permeable boron peptide of the present invention, the boron compound is more preferably mercaptoundecahydrododecaborate.

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドにおいては、細胞膜透過ペプチド１分子に対してメルカプトウンデカハイドロドデカボレート１〜８分子を含むことができる。   In the cell membrane permeation type boron peptide of the present invention, 1 to 8 molecules of mercaptoundecahydrododecaborate can be contained per molecule of the cell membrane permeation peptide.

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、好ましくは核内に集積されることを特徴とする。   The cell membrane permeable boron peptide of the present invention is preferably characterized in that it is accumulated in the nucleus.

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わせてホウ素製剤とすることができる。   The cell membrane permeable boron peptide of the present invention can be combined with at least one pharmaceutically acceptable excipient to form a boron preparation.

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、腫瘍組織内に選択的に取り込まれ、２４時間後にも安定に残留し、従来のホウ素製剤と比べて１５〜５０倍もの高濃度のホウ素を腫瘍細胞内に、さらには核内に蓄積させることができる。   The cell membrane permeable boron peptide of the present invention is selectively taken up into the tumor tissue, remains stable after 24 hours, and has a concentration of boron in the tumor cells that is 15 to 50 times higher than that of conventional boron preparations. And can even be accumulated in the nucleus.

また、本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、たとえば、ペプチドとホウ素化合物との間のリンカーにリジンとシステインの組合せを利用することにより、１つの分子で複数個のホウ素化合物を運ぶことが可能であり、効率的にホウ素化合物を細胞の核内に局在させることができる。   In addition, the cell membrane permeable boron peptide of the present invention can carry a plurality of boron compounds in one molecule by using, for example, a combination of lysine and cysteine as a linker between the peptide and the boron compound. Yes, the boron compound can be efficiently localized in the nucleus of the cell.

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドを用いることにより、効率的にホウ素化合物を細胞内、とりわけ核内に集積することができ、実際に従来のホウ素製剤ＢＳＨと比較して、極めて高い腫瘍殺傷効果が得られる。   By using the cell membrane permeable boron peptide of the present invention, it is possible to efficiently accumulate boron compounds in cells, especially in the nucleus, and in fact, an extremely high tumor killing effect compared with the conventional boron preparation BSH. can get.

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドを用いることにより、ホウ素製剤が細胞膜周辺に留まる場合と比較して数十倍から数百倍の腫瘍殺傷効果をもたらすことが可能となる。また、さらに細胞の中心部に存在する核に局在させた場合には、さらに腫瘍殺傷効果を誘導することが可能となる。   By using the cell membrane permeable boron peptide of the present invention, it is possible to bring about a tumor killing effect several tens to several hundred times that of a case where the boron preparation stays around the cell membrane. In addition, when it is localized in the nucleus existing in the center of the cell, it is possible to further induce a tumor killing effect.

実施例１（ＢＳＨ−１１Ｒ）および実施例５（ＢＳＨ−ＴＡＴ）を細胞内へ導入し、１２時間後に観察した、（ａ）ヘキストによる核染色、および（ｂ）ＢＳＨを示す共焦点レーザー顕微鏡写真データ（×４００）である。（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ね合わせたものである。Example 1 (BSH-11R) and Example 5 (BSH-TAT) were introduced into cells and observed after 12 hours, (a) nuclear staining with Hoechst, and (b) confocal laser micrograph showing BSH Data (× 400). (C) is a superposition of (a) and (b). 図１Ａの（ｃ）のスケッチである。ドットがＢＳＨを斜線部が核を示す。It is a sketch of (c) of Drawing 1A. The dots indicate BSH and the shaded area indicates the nucleus. 誘導結合プラズマ発光分光分析データにより定量化した細胞内のホウ素濃度を示すグラフである。It is a graph which shows the boron concentration in the cell quantified by the inductively coupled plasma emission spectral analysis data. 実施例２（２ＢＳＨ−１１Ｒ）、実施例３（４ＢＳＨ−１１Ｒ）の腫瘍細胞内への導入１２時間後に観察した共焦点レーザー顕微鏡写真データである（×６００）。（ａ）はＢＳＨ、（ｂ）は（ａ）のＢＳＨにｆ−アクチンの染色を重ねたもの、（ｃ）は（ｂ）にヘキストによる核染色を重ねたものである。It is confocal laser micrograph data observed 12 hours after introduction | transduction in the tumor cell of Example 2 (2BSH-11R) and Example 3 (4BSH-11R) (x600). (A) is BSH, (b) is the BSH of (a) overlaid with f-actin, and (c) is overlaid with nuclear staining with Hoechst. 実施例４（８ＢＳＨ−１１Ｒ）の腫瘍細胞内への導入を経時的に観察した共焦点レーザー顕微鏡写真データである（×６００）。（ａ）がＢＳＨ染色、ヘキストによる核染色およびアクチン染色を重ねたものであり、（ｂ）がＢＳＨのみのデータである。FIG. 5 is confocal laser micrograph data obtained by observing the introduction of Example 4 (8BSH-11R) into tumor cells over time (× 600). (A) is a result of overlaying BSH staining, nuclear staining with Hoechst, and actin staining, and (b) is data of BSH only. 図４Ａの（ａ）中、アクチン染色部分の輪郭および核染色部分（斜線部）のスケッチである。4A is the outline of the actin-stained portion and the sketch of the nucleus-stained portion (shaded portion). 誘導結合プラズマ発光分光分析データにより定量化した細胞内のホウ素濃度を示すグラフである。It is a graph which shows the boron concentration in the cell quantified by the inductively coupled plasma emission spectral analysis data. 脳腫瘍モデルマウスに対して実施例４（８ＢＳＨ−１１Ｒ）をマウス尾静脈より投与した後の６時間および２４時間に観察した共焦点レーザー顕微鏡写真データである。（ａ）はヒトＧＦＡＰによる脳腫瘍染色とヘキストによる核染色、（ｂ）はＢＳＨ、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ねたものである。It is the confocal laser scanning micrograph data observed for 6 hours and 24 hours after administering Example 4 (8BSH-11R) to a brain tumor model mouse | mouth from a mouse | mouth tail vein. (A) is brain tumor staining with human GFAP and nuclear staining with Hoechst, (b) is BSH, (c) is an overlay of (a) and (b). 脳腫瘍モデルマウスに対して実施例４（８ＢＳＨ−１１Ｒ）をマウス尾静脈より投与した後の６時間に観察した共焦点レーザー顕微鏡写真データである。（ａ）はヒトＧＦＡＰによる脳腫瘍染色とヘキストによる核染色、（ｂ）はＢＳＨ、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ねたものである。It is the confocal laser micrograph data observed for 6 hours after administering Example 4 (8BSH-11R) from a mouse | mouth tail vein with respect to a brain tumor model mouse. (A) is brain tumor staining with human GFAP and nuclear staining with Hoechst, (b) is BSH, (c) is an overlay of (a) and (b). ＷＳＲ−１アッセイによる細胞毒性評価を示すグラフである。It is a graph which shows the cytotoxicity evaluation by WSR-1 assay. ホウ素化合物の細胞内分布による核へのエネルギー付与率を示すグラフである。It is a graph which shows the energy provision rate to the nucleus by intracellular distribution of a boron compound.

本発明に使用する「細胞膜透過ペプチド」は、細胞膜を透過し細胞内へ内在化する能力を有するアルギニンに富むアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドを意味する。このようなペプチドとしては、細胞膜透過能が知られている既知の塩基性ペプチド、たとえばＴＡＴ（配列番号１）、アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチド、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ（３４−５０）（配列番号２）、ＦＨＶ Ｃｏａｔ（３５−４９）（配列番号３）、ＢＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号４）、ＨＴＬＶ−II Ｒｅｘ（４−１６）（配列番号５）、ＣＣＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号６）、Ｐ２２ Ｎ（１４−３０）（配列番号７）、λＮ（１−２２）（配列番号８）、φ２１Ｎ（１２−２９）（配列番号９）および酵母ＰＲＰ６（１２９−１４４）（配列番号１０）などが挙げられる。これらのペプチドには、もちろん各起源のタンパク質の対応する配列のアミノ酸を１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個伸長したものや、アルギニンやリジンを１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個加えたものも同様に使用することができる。 The “cell membrane-penetrating peptide” used in the present invention means a basic peptide having an amino acid sequence rich in arginine having the ability to permeate the cell membrane and internalize into the cell. Examples of such peptides include known basic peptides with known cell membrane permeability, such as TAT (SEQ ID NO: 1), peptides consisting of an amino acid sequence consisting of 3 to 13 residues of arginine, HIV-1 Rev (34 -50) (SEQ ID NO: 2), FHV Coat (35-49) (SEQ ID NO: 3), BMV Gag (7-25) (SEQ ID NO: 4), HTLV-II Rex (4-16) (SEQ ID NO: 5), CCMV Gag (7-25) (SEQ ID NO: 6), P22 N (14-30) (SEQ ID NO: 7), λN (1-22) (SEQ ID NO: 8), φ21N (12-29) (SEQ ID NO: 9) and Examples include yeast PRP6 (129-144) (SEQ ID NO: 10). Of these peptides, of course, the amino acid of the corresponding sequence of the protein of each origin is extended by 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and 1 to 20 arginine and lysine. , Preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5 can be used in the same manner.

これらのなかでも、細胞膜透過能の点からＴＡＴ（配列番号１）、アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチド、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ（３４−５０）（配列番号２）、ＦＨＶ Ｃｏａｔ（３５−４９）（配列番号３）、ＢＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号４）、ＨＴＬＶ−II Ｒｅｘ（４−１６）（配列番号５）、ＣＣＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号６）またはＰ２２ Ｎ（１４−３０）（配列番号７）が好ましく、ＴＡＴ（配列番号１）、アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチド、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ（３４−５０）（配列番号２）、ＦＨＶ Ｃｏａｔ（３５−４９）（配列番号３）、ＢＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号４）またはＨＴＬＶ−II Ｒｅｘ（４−１６）（配列番号５）がより好ましい。また、ＴＡＴ（配列番号１）またはアルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドがより効果的に使用でき、核への局在化に優れていることが確認された点からアルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドが最も好ましい。 Among these, from the viewpoint of cell membrane permeability, TAT (SEQ ID NO: 1), a peptide consisting of an amino acid sequence in which arginine 3 to 13 residues are continuous, HIV-1 Rev (34-50) (SEQ ID NO: 2), FHV Coat (35-49) (SEQ ID NO: 3), BMV Gag (7-25) (SEQ ID NO: 4), HTLV-II Rex (4-16) (SEQ ID NO: 5), CCMV Gag (7-25) (SEQ ID NO: 6) ) Or P22 N (14-30) (SEQ ID NO: 7), TAT (SEQ ID NO: 1), a peptide consisting of an amino acid sequence comprising 3 to 13 residues of arginine, HIV-1 Rev (34-50) (sequence) No. 2), FHV Coat (35-49) (SEQ ID NO: 3), BMV Gag (7-25) (SEQ ID NO: 4) or HTLV-II Rex (4-16) (SEQ ID NO: 5) preferable. In addition, it was confirmed that TAT (SEQ ID NO: 1) or a peptide consisting of an amino acid sequence consisting of 3 to 13 residues of arginine can be used more effectively and is excellent in localization to the nucleus. Most preferred is a peptide consisting of an amino acid sequence of ˜13 residues.

このアルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドにおいては、連続するアルギニンの残基数が９〜１３が好ましく、１１が最も好ましい。アルギニン残基が２以下または１４以上であると、薬物の導入効率が悪くなる傾向がある。アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドは、細胞増殖に影響を及ぼすことなく、また細胞障害性も示さないため、安全な薬剤である。   In a peptide having an amino acid sequence in which 3 to 13 residues of arginine are continuous, the number of consecutive arginine residues is preferably 9 to 13, and most preferably 11. When the arginine residue is 2 or less or 14 or more, the drug introduction efficiency tends to deteriorate. A peptide consisting of an amino acid sequence of 3 to 13 residues of arginine is a safe drug because it does not affect cell proliferation and does not show cytotoxicity.

本発明に使用する「ホウ素化合物」としては、従来から粒子線治療に用いられている種々の物を使用することができる。   As the “boron compound” used in the present invention, various materials conventionally used for particle beam therapy can be used.

たとえば、ペプチドと結合させることができる官能基、チオール基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、アジド基、ハロゲン基（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなど）、リン酸基などを有するホウ素含有化合物であれば、本発明の「ホウ素化合物」として使用することができる。そのなかでも、ホウ素原子を一分子に多く含むことからクラスター分子であることが好ましい。具体的なホウ素化合物としては、ＢＰＡ、ＢＳＨなどが挙げられる。   For example, boron-containing functional groups that can be bound to peptides, thiol groups, hydroxyl groups, carboxyl groups, amino groups, amide groups, azide groups, halogen groups (F, Cl, Br, I, etc.), phosphate groups, etc. Any compound can be used as the “boron compound” of the present invention. Among these, a cluster molecule is preferable because it contains many boron atoms in one molecule. Specific examples of the boron compound include BPA and BSH.

本発明の「細胞膜透過型ホウ素ペプチド」は、前述のホウ素化合物に細胞膜透過ペプチドを付加することにより製造することができる。ここで、本明細書において「付加する」との記載は、ホウ素化合物と細胞膜透過ペプチドとを、共有結合、ペプチド−ペプチドによる疎水性相互作用、イオン性相互作用（イオン結合）、水素結合等により結合させることを意味する。結合の方法は、特に限定されるものではないが、ホウ素化合物および細胞膜透過ペプチドそれぞれの活性を損なわない限り、たとえば、システインなどのアミノ酸や他の化合物を介して行なうことができ、細胞膜透過ペプチドとホウ素化合物の間には、たとえば１〜２０個、または１〜１０個、または１〜３個のアミノ酸残基が挿入されていてもよい。システインを利用する場合には、たとえば反応性のニトロピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）基などを用いて様々なホウ素化合物を容易にＳ−Ｓ結合により連結することができる。   The “cell membrane permeable boron peptide” of the present invention can be produced by adding a cell membrane permeable peptide to the aforementioned boron compound. Here, in the present specification, “addition” means that a boron compound and a cell membrane permeable peptide are bonded by a covalent bond, a hydrophobic interaction by a peptide-peptide, an ionic interaction (ionic bond), a hydrogen bond, or the like. It means to combine. The binding method is not particularly limited, and can be performed, for example, via an amino acid such as cysteine or another compound as long as the activities of the boron compound and the cell membrane permeable peptide are not impaired. For example, 1 to 20, or 1 to 10, or 1 to 3 amino acid residues may be inserted between the boron compounds. When cysteine is used, various boron compounds can be easily linked by an S—S bond using, for example, a reactive nitropyridine sulfenyl (NPYS) group.

さらに、ホウ素化合物を結合させるためのシステインと細胞膜透過ペプチドとの間に、リジンなどを介在させることにより、１つのペプチド分子に複数個、たとえば２〜８個のホウ素化合物を結合させることができる。   Further, by interposing lysine or the like between cysteine for binding a boron compound and a cell membrane permeable peptide, a plurality of, for example, 2 to 8 boron compounds can be bound to one peptide molecule.

細胞膜透過ペプチドは、通常の人工合成法、たとえばペプチドの固相合成法などによって、または一般に市販されている人工合成機を用いて、当業者により容易に製造することができる。   A cell membrane-penetrating peptide can be easily produced by a person skilled in the art by an ordinary artificial synthesis method, for example, a solid phase synthesis method of a peptide, or by using a commercially available artificial synthesizer.

たとえば、ペプチド合成において使用する保護ペプチド樹脂担体としては、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。   For example, protected peptide resin carriers used in peptide synthesis include benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, poly Examples include acrylamide resin and 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin.

ペプチドの固相合成法において、アミノ酸は、保護基によって分子内のアミノ基を予め保護して用いられる。保護基としては、たとえば、９−フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、アミノ酸は、必要に応じて、側鎖の官能基を当該官能基に応じた保護基により保護して用いることができる。なお、本明細書において、アミノ基や側鎖の官能が保護されているアミノ酸を「保護アミノ酸」という。   In the solid phase synthesis method of peptides, amino acids are used by preliminarily protecting amino groups in the molecule with protecting groups. Examples of the protecting group include, but are not limited to, a 9-fluorenyl-methoxycarbonyl (Fmoc) group and a tert-butyloxycarbonyl (Boc) group. In addition, an amino acid can be used by protecting the functional group of the side chain with a protecting group corresponding to the functional group, if necessary. In the present specification, amino acids whose amino group or side chain functions are protected are referred to as “protected amino acids”.

縮合には、一般的なペプチド合成に用いられる活性化試薬などが用いられる。縮合の際の反応温度は、ペプチドの合成において一般的な温度であればよい。通常、反応温度は、約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。所望の細胞膜透過ペプチド配列に相当する配列からなるペプチドを合成した後、ホウ素化合物との結合に使用するための官能基を有するアミノ酸、たとえばシステインを縮合させ、ホウ素化合物との結合に使用する官能基を導入することができる。   For the condensation, an activating reagent used for general peptide synthesis is used. The reaction temperature at the time of condensation may be a general temperature in peptide synthesis. Usually, the reaction temperature is appropriately selected from the range of about −20 ° C. to 50 ° C. After synthesizing a peptide consisting of a sequence corresponding to the desired cell membrane permeabilizing peptide sequence, an amino acid having a functional group for use in binding to a boron compound, such as cysteine, is condensed, and the functional group used for binding to the boron compound Can be introduced.

得られた生成物がその分子内に保護基を有する場合、常法にしたがって、たとえば酸処理、アルカリ処理、触媒の存在下での水素気流中での接触還元などにより行なうことができる。なお、保護基の導入と脱保護に関しては、例えば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第４版〔ペーターＧ．Ｍ．ワッツ（Peter G. M. Wuts）およびテオドラ．Ｗ．グリーン（Theodora W. Greene）, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 2006〕に記載の方法にしたがって行なうこともできる。   When the obtained product has a protecting group in the molecule, it can be carried out according to a conventional method, for example, by acid treatment, alkali treatment, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst, and the like. Regarding the introduction and deprotection of protecting groups, for example, Greens Protective Groups in Organic Synthesis 4th edition [Peter G. M.M. Watts (Peter G. M. Wuts) and Theodora. W. Green (Theodora W. Greene), Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 2006].

化合物の製造後、必要に応じて、得られた生成物の単離や精製を行なってもよい。生成物の単離や精製は、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって行なうことができる。   After the production of the compound, the obtained product may be isolated or purified as necessary. The product can be isolated and purified by chromatography such as reverse phase high performance liquid chromatography or ion exchange chromatography.

つぎに、得られた官能基を導入した細胞膜透過ペプチドにホウ素化合物を導入し、精製し、目的の細胞膜透過型ホウ素ペプチドを得ることができる。   Next, a boron compound is introduced into the cell membrane-penetrating peptide into which the functional group has been introduced and purified to obtain the target cell membrane-permeable boron peptide.

たとえば、ホウ素化合物がＢＳＨの場合、ペプチドの固相合成によりアミノ酸を１残基ずつカルボキシル末端側から結合させ、所望の細胞膜透過型ペプチド配列を得た後、必要に応じて、リジン残基を導入し、ニトロピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）基などの反応性の側鎖を有するシステイン残基を対応残基数導入する。その後定法にて脱保護および精製したのち純水、または適当な緩衝液または有機溶媒に溶解し、ＢＳＨと反応させ、ＨＰＬＣなどで反応を追跡し、原料ペプチドの消失を確認したのち、分取用ＨＰＬＣにて目的とする細胞膜透過型ＢＳＨペプチドを得ることができる。   For example, when the boron compound is BSH, amino acids are bound one by one from the carboxyl terminal side by solid phase synthesis of the peptide to obtain the desired cell membrane permeation type peptide sequence, and then lysine residues are introduced as necessary Then, a corresponding number of cysteine residues having a reactive side chain such as a nitropyridine sulfenyl (NPYS) group are introduced. Then, after deprotection and purification by a conventional method, dissolve in pure water or an appropriate buffer or organic solvent, react with BSH, follow the reaction with HPLC, etc. The target cell membrane permeation type BSH peptide can be obtained by HPLC.

また、本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドには、有効成分であるホウ素化合物以外に、研究モデルに使用する場合など、細胞内、さらには核内に導入されたことを確認するためのマーカーを含有しても良い。マーカーは、特に限定されるものではなく、たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略称する）、ローダミンなどの蛍光色素、およびＧＦＰなどの蛍光タンパク質を使用することができる。   In addition to the boron compound, which is an active ingredient, the cell membrane permeable boron peptide of the present invention contains a marker for confirming that it has been introduced into the cell or into the nucleus, such as when used in a research model. You may do it. The marker is not particularly limited, and for example, fluorescein isothiocyanate (hereinafter abbreviated as FITC), a fluorescent dye such as rhodamine, and a fluorescent protein such as GFP can be used.

さらに、本発明細胞膜透過型ホウ素ペプチドには、有効成分であるホウ素化合物以外に、腫瘍に対する選択性を高めるために、いわゆる腫瘍マーカーを含有させることができる。このような腫瘍マーカーとしては、特に限定されるものではなく、たとえば腫瘍に多く発現しているＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）やＣＤ１３３（癌幹細胞マーカー）などといった、癌表面に特異的に多く発現しているマーカーに対して結合するペプチド等のリガンドを使用することができる。   Furthermore, in addition to the boron compound which is an active ingredient, the cell membrane permeation type boron peptide of the present invention can contain a so-called tumor marker in order to enhance selectivity for tumors. Such a tumor marker is not particularly limited, and for example, EGFR (epidermal growth factor receptor) and CD133 (cancer stem cell marker) that are highly expressed in tumors are specifically expressed on the surface of cancer. A ligand such as a peptide that binds to the marker in question can be used.

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、適当な薬学的に許容され得る賦形剤、担体、溶媒、ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、ｐＨ安定化剤など、本技術分野において通常用いられている添加剤を配合し、ホウ素製剤とすることができる。これらの添加剤は、通常当業者により適宜選択される。このようなホウ素製剤は、溶液、懸濁液、注射剤、カプセル、ゲル、軟膏、クリーム、エマルジョンなど、種々の剤形に調製することができる。つまり、生理食塩水、等張液や一般臨床で用いられる注射液用の添加剤と共に注射剤とすること、カプセル化しての内服薬やゲル化剤や皮膚科薬剤と混ぜて経皮的導入薬剤などとすることも可能である。   The cell membrane permeation type boron peptide of the present invention can be produced by using the appropriate pharmaceutically acceptable excipient, carrier, solvent, gel forming agent, antioxidant, diluent, tonicity agent, pH stabilizer, etc. Additives commonly used in the field can be blended into a boron preparation. These additives are usually appropriately selected by those skilled in the art. Such boron preparations can be prepared in various dosage forms such as solutions, suspensions, injections, capsules, gels, ointments, creams, emulsions and the like. In other words, it should be used as an injection together with physiological saline, isotonic solutions and additives for injections used in general clinical practice, and transdermally introduced drugs mixed with encapsulated oral medicines, gelling agents and dermatological drugs. It is also possible.

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、経静脈的、経動脈的に投与されることが一般的である。その他、内服薬による投与、筋肉注射による投与、経皮的投与なども有効に使用することができる。   The cell membrane permeable boron peptide of the present invention is generally administered intravenously or transarterially. In addition, administration by internal medicine, administration by intramuscular injection, transdermal administration, etc. can also be used effectively.

本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、治療に有効な量腫瘍細胞内に蓄積できる濃度および量で投与される。腫瘍組織部において最終的に２５ｐｐｍ以上のホウ素濃度となるように投与することが好ましい。そのような投与量としては、ＢＳＨ８分子を付加した細胞膜透過ペプチドの場合、０．０５〜１ｇ／ｋｇを投与することが好ましい。   The cell membrane permeable boron peptide of the present invention is administered in a concentration and amount that can be accumulated in tumor cells in a therapeutically effective amount. It is preferable to administer so that the final boron concentration is 25 ppm or more in the tumor tissue part. As such a dose, 0.05 to 1 g / kg is preferably administered in the case of a cell membrane permeable peptide to which a BSH8 molecule is added.

以下、実施例によって、本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドをさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲から逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。   Hereinafter, the cell membrane-permeable boron peptide of the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited to these without departing from the spirit and scope of application.

実施例１〜４：ＢＳＨ−細胞膜透過ペプチドの製造
（Ａ）保護ペプチド樹脂の構築
ペプチド自動合成機（４３３Ａ、アプライドバイオシステム（Applied Biosystems）社製）を用いて添付のソフトにしたがい、固相合成法により１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）］₁₁−樹脂の合成を定法にて行なった。 Examples 1-4: Production of BSH-cell membrane-penetrating peptide (A) Construction of protected peptide resin Solid phase synthesis using peptide automatic synthesizer (433A, manufactured by Applied Biosystems) according to the attached software Amino acids were bound one by one from the carboxyl terminal side by the method, and Boc-Cys (Npys)-[Arg (Pbf)] ₁₁ -resin was synthesized by a conventional method.

Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ Ｒｅｓｉｎ（０．３４ｍｍｏｌ／ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を出発樹脂担体として使用し、通常の９−フルオレニル−メトキシカルボニル（以下、Ｆｍｏｃ−と略称する）ペプチド合成法に使われる各Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として、配列にしたがって逐次ペプチド鎖の延長を行った。Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を上記ペプチド合成機の反応容器にセットし、合成機に添付されているソフトウェアにしたがって、活性化剤として、１−［ビスジメチルアミノメチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシド−ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）とＮ−メチルピロリドンに溶解して反応槽に加えて縮合反応させた。得られた樹脂をピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン中で緩やかに攪拌してＦｍｏｃ基を除いて次のアミノ酸誘導体の縮合に進めた。   Each Fmoc-amino acid used in the usual 9-fluorenyl-methoxycarbonyl (hereinafter abbreviated as Fmoc-) peptide synthesis method using Rink Amide MBHA Resin (0.34 mmol / g, 0.25 mmol) as a starting resin carrier Using the derivative as a raw material, the peptide chain was sequentially extended according to the sequence. Fmoc-amino acid derivative is set in the reaction vessel of the above peptide synthesizer, and 1- [bisdimethylaminomethylene] -1H-benzotriazolium-3-as an activator according to the software attached to the synthesizer. It was dissolved in oxide-hexafluorophosphate (HBTU), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) and N-methylpyrrolidone and added to the reaction vessel to cause a condensation reaction. The obtained resin was gently stirred in piperidine-containing N-methylpyrrolidone to remove the Fmoc group and proceed to condensation of the next amino acid derivative.

使用したＦｍｏｃアミノ酸誘導体は、側鎖に官能基のあるＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を用いた。   As the Fmoc amino acid derivative used, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Lys (Boc), and Boc-Cys (Npys) having a functional group in the side chain were used.

配列にしたがって、逐次Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を延長して最終Ａｒｇ（Ｐｂｆ）残基の縮合後、最後にＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を水溶性カルボジイミドを用いて縮合し、相当するＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）］₁₁−Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ保護ペプチド樹脂を得た。引き続き脱保護、精製処理を行った。 According to the sequence, Fmoc-Arg (Pbf) is sequentially extended to condense the final Arg (Pbf) residue, and finally Boc-Cys (Npys) is condensed with water-soluble carbodiimide, and the corresponding Boc-Cys ( Npys)-[Arg (Pbf)] ₁₁ -Rink Amide MBHA protected peptide resin was obtained. Subsequently, deprotection and purification were performed.

（Ｂ）脱保護と樹脂からの切り出し
得られた保護ペプチド樹脂をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いる定法のＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／Ｈ₂Ｏ（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ）脱保護条件で、室温にて２時間処理し、Ｎｙｐｓ以外の脱保護と樹脂からのペプチドの切り離しを同時におこなった。反応液から担体樹脂をろ別した後、ＴＦＡを留去した。残渣にエーテルを加えて得られるＣｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ａｒｇ₁₁−ＮＨ₂粗生成物の沈殿をろ取し、ＨＰＬＣおよび質量分析にて生成を確認したのち、つぎのＢＳＨとのジスルフィド形成反応に供した。 (B) Deprotection and excision from resin The obtained protected peptide resin was subjected to a conventional TFA / triisopropylsilane (TIS) / H ₂ O (95 / 2.5 / 2.5, trifluoroacetic acid (TFA)). v / v) The treatment was performed at room temperature for 2 hours under deprotection conditions, and deprotection other than Nyps and cleaving of the peptide from the resin were performed simultaneously. After the carrier resin was filtered off from the reaction solution, TFA was distilled off. The precipitate of the crude Cys (Npys) -Arg ₁₁ -NH ₂ obtained by adding ether to the residue is collected by filtration, confirmed to be produced by HPLC and mass spectrometry, and then subjected to the next disulfide formation reaction with BSH. did.

（Ｃ）Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ａｒｇ₁₁−ＮＨ₂（ＢＳＨ−１１Ｒ）の合成
（Ｂ）で得られた、Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−［Ａｒｇ］₁₁−ＮＨ₂（７７．９ｍｇ）を純水（２４ｍｌ）に溶解し、ＢＳＨ（Ｎａ₂Ｂ₁₂Ｈ₁₁ＳＨ；４．２ｍｇ、０．８３当量／ＮＨ₂）をアルゴン気流中で室温にて攪拌しながら添加した。一昼夜反応後、反応溶液を直接分取精製に供した。 (C) Synthesis of Cys (BSH) -Arg ₁₁ -NH ₂ (BSH-11R) Cys (Npys)-[Arg] ₁₁ -NH ₂ (77.9 mg) obtained in (B) was purified with pure water (24 ml). BSH (Na ₂ B ₁₂ H ₁₁ SH; 4.2 mg, 0.83 equivalent / NH ₂ ) was added with stirring at room temperature in a stream of argon. After the reaction overnight, the reaction solution was directly subjected to preparative purification.

得られた粗生成物をＨＰＬＣ分取装置（ＬＣ−８Ａ−１、島津製作所製、カラム：ＯＤＳ３０×２５０ｍｍ）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸を含む水−アセトニトリルの系で分取精製し、目的のペプチド誘導体の分画を得、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥粉末とし、目的物であるＢＳＨのペプチド誘導体（ＢＳＨ−１１Ｒと略称する）５６ｍｇをトリフルオロ酢酸塩として得た（純度９２．８％）。構造は質量分析にて確認した。
Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ａｒｇ₁₁−ＮＨ₂
分子量：２００１．３７ Ｃ₆₉Ｈ₁₅₂Ｂ₁₂Ｎ₄₆Ｏ₁₂Ｓ₂
ＭＳ：m/z 668.4([M+3H]³⁺ 668.13), m/z 706.5([M+TFA+3H]³⁺ 706.14), m/z 782.3([M+3TFA+3H]³⁺ 782.16) The obtained crude product was separated and purified in a water-acetonitrile system containing 0.1% trifluoroacetic acid using an HPLC fractionator (LC-8A-1, manufactured by Shimadzu Corporation, column: ODS 30 × 250 mm). The fraction of the desired peptide derivative was obtained, and acetonitrile was distilled off, followed by lyophilized powder to obtain 56 mg of the desired peptide derivative of BSH (abbreviated as BSH-11R) as trifluoroacetate (purity) 92.8%). The structure was confirmed by mass spectrometry.
Cys (BSH) -Arg ₁₁ -NH ₂
Molecular weight: 2001.37 C ₆₉ H ₁₅₂ B ₁₂ N ₄₆ O ₁₂ S ₂
MS: m / z 668.4 ([M + 3H] ³⁺ 668.13), m / z 706.5 ([M + TFA + 3H] ³⁺ 706.14), m / z 782.3 ([M + 3TFA + 3H] ³⁺ 782.16)

（Ｄ）［Ｃｙｓ（ＢＳＨ）］₈−Ｌｙｓ₇−Ａｒｇ₁₁−ＮＨ₂（８ＢＳＨ−１１Ｒ）の合成
枝分かれしたＢｏｃ−［Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）］ｍ−（Ｌｙｓ）ｎ−Ａｒｇ₁₁（表１）保護ペプチド樹脂の構築は、前記（Ａ）のＡｒｇ₁₁保護ペプチドの構築後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を適宜順次繰り返し縮合させ、さらにＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を定法に従って縮合させることにより表１に示すような枝分かれ構造を有するペプチドの合成を行った。 (D) [Cys (BSH) ] 8 -Lys 7 -Arg 11 -NH 2 was synthesized branched (8BSH-11R) Boc- [Cys (Npys)] m- (Lys) n-Arg 11 ( Table 1) Protection The construction of the peptide resin is shown in Table 1 after the construction of the Arg _11- protected peptide of (A) above, and Fmoc-Lys (Fmoc) is condensed repeatedly in sequence, and Boc-Cys (Npys) is condensed according to a conventional method. A peptide having such a branched structure was synthesized.

上記（ｂ）と同様に脱保護と樹脂からの切り出しを行ない、［Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）］₈−Ｌｙｓ₇−Ａｒｇ₁₁−ＮＨ₂を得た。 Similar to the above (b) performs excision from deprotection and resin to obtain _{[Cys (Npys)] 8 -Lys} 7 -Arg 11 -NH 2.

得られた［Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）］₈−Ｌｙｓ₇−Ａｒｇ₁₁−ＮＨ₂（６１．８ｍｇ）を純水（３ｍｌ）、ＭｅＯＨ（１．５ｍｌ）に溶解し、ＢＳＨ（１９．８ｍｇ、０．９当量／ＮＨ₂）をアルゴン気流中で室温にて攪拌しながら加えて反応させた。５．５時間の反応後、反応溶液を直接、分取精製に供した。 The obtained [Cys (Npys)] ₈ -Lys ₇ -Arg ₁₁ -NH ₂ (61.8 mg) was dissolved in pure water (3 ml) and MeOH (1.5 ml), and BSH (19.8 mg, 0.9) was obtained. Equivalent / NH ₂ ) was added to the reaction in an argon stream at room temperature with stirring. After the reaction for 5.5 hours, the reaction solution was directly subjected to preparative purification.

上記（ｂ）と同様に分取精製し、目的物であるＢＳＨのペプチド誘導体（８ＢＳＨ−１１Ｒと略称する）１５．８ｍｇをトリフルオロ酢酸塩として得た（純度９７．８％）。構造は質量分析にて確認した。
［Ｃｙｓ（ＢＳＨ）］₈−Ｌｙｓ₇−Ａｒｇ₁₁−ＮＨ₂
分子量：４７７１．９５ Ｃ₁₃₂Ｈ₃₅₅Ｂ₉₆Ｎ₆₇Ｏ₂₆Ｓ₁₆
ＭＳ：m/z 1591.8([M+3H]³⁺ 1591.7), m/z 398.9([M+12H]¹²⁺ 398.7), m/z 486.9([M+5TFA+11H]¹¹⁺ 486.7), m/z 648.8([M+15TFA+10H]¹⁰⁺ 649.3) Preparative purification was carried out in the same manner as in the above (b), and 15.8 mg of the target BSH peptide derivative (abbreviated as 8BSH-11R) was obtained as a trifluoroacetate salt (purity 97.8%). The structure was confirmed by mass spectrometry.
_{[Cys (BSH)] 8 -Lys} 7 -Arg 11 -NH 2
Molecular weight: 4771.95 C ₁₃₂ H ₃₅₅ B ₉₆ N ₆₇ O ₂₆ S ₁₆
MS: m / z 1591.8 ([M + 3H] ³⁺ 1591.7), m / z 398.9 ([M + 12H] ¹²⁺ 398.7), m / z 486.9 ([M + 5TFA + 11H] ¹¹⁺ 486.7), m / z 648.8 ([M + 15TFA + 10H] ¹⁰⁺ 649.3)

（Ｅ）［Ｃｙｓ（ＢＳＨ）］₂−Ｌｙｓ−Ａｒｇ₁₁−ＮＨ₂（２ＢＳＨ−１１Ｒ）の合成
縮合させるリジンを１つとし、Ｎｐｙｓ−Ｃｙｓを２つ付けた保護ペプチドを製造、使用した以外は前記（Ｄ）と同様にして合成、精製し目的物であるＢＳＨのペプチド誘導体（２ＢＳＨ−１１Ｒ）を得た（純度９４．５％）。
［Ｃｙｓ（ＢＳＨ）］₂−Ｌｙｓ−Ａｒｇ₁₁−ＮＨ₂
分子量：２３９４．１ Ｃ₇₈Ｈ₁₇₇Ｂ₂₄Ｎ₄₉Ｏ₁₄Ｓ₄
ＭＳ：m/z 398.9([M+12H]¹²⁺ 398.7) (E) Synthesis of [Cys (BSH)] ₂ -Lys-Arg ₁₁ -NH ₂ (2BSH-11R) Except for producing and using a protected peptide with one lysine to be condensed and two Npys-Cys attached The peptide was synthesized and purified in the same manner as in (D) above to obtain the target peptide derivative of BSH (2BSH-11R) (purity 94.5%).
_{[Cys (BSH)] 2 -Lys} -Arg 11 -NH 2
Molecular weight: 2394.1 C ₇₈ H ₁₇₇ B ₂₄ N ₄₉ O ₁₄ S ₄
MS: m / z 398.9 ([M + 12H] ¹²⁺ 398.7)

（Ｆ）［Ｃｙｓ（ＢＳＨ）］₄−Ｌｙｓ₃−Ａｒｇ₁₁−ＮＨ₂（４ＢＳＨ−１１Ｒ）の合成
縮合させるリジンを２つとし、Ｎｐｙｓ−Ｃｙｓを４つ付けた保護ペプチドを製造、使用した以外は前記（Ｄ）と同様にして合成、精製し目的物であるＢＳＨのペプチド誘導体（２ＢＳＨ−１１Ｒ）を得た（純度９２．８％）。
［Ｃｙｓ（ＢＳＨ）］₄−Ｌｙｓ₃−Ａｒｇ₁₁−ＮＨ₂
分子量：３１８１．４ Ｃ₉₈Ｈ₂₃₁Ｂ₄₈Ｎ₅₅Ｏ₁₈Ｓ₈
ＭＳ：m/z 399.4([M+8H]⁸⁺ 398.7), m/z 376.2([M+5TFA+10H]¹⁰⁺ 376.1) (F) Synthesis of [Cys (BSH)] ₄ -Lys ₃ -Arg ₁₁ -NH ₂ (4BSH-11R) Except for the production and use of a protected peptide with two lysines to be condensed and four Npys-Cys attached Was synthesized and purified in the same manner as in (D) above to obtain the target peptide derivative of BSH (2BSH-11R) (purity 92.8%).
[Cys (BSH)] ₄ -Lys ₃ -Arg ₁₁ -NH ₂
Molecular weight: 3181.4 C ₉₈ H ₂₃₁ B ₄₈ N ₅₅ O ₁₈ S ₈
MS: m / z 399.4 ([M + 8H] ⁸⁺ 398.7), m / z 376.2 ([M + 5TFA + 10H] ¹⁰⁺ 376.1)

実施例５：Ｃｙｓ（ＢＨＳ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ₂（ＢＳＨ−ＴＡＴ）の製造
（Ａ）保護ペプチド樹脂の構築
ペプチド自動合成機（４３３Ａ、アプライドバイオシステム（Applied Biosystems）社製）を用いて添付のソフトにしたがい、固相合成法により１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させ保護ペプチド樹脂の合成を定法にて行なった。 Example 5: Cys (BHS) -Tyr- Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH 2 (BSH-TAT) Construction peptide automatic production (A) protected peptide resin Using a synthesizer (433A, manufactured by Applied Biosystems) according to the attached software, amino acids are bound one by one from the carboxyl terminal side by solid phase synthesis, and a protected peptide resin is synthesized by a conventional method. It was.

Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ Ｒｅｓｉｎ（０．３６ｍｍｏｌ／ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を出発樹脂担体として使用し、通常Ｆｍｏｃ−ペプチド合成法に使われる各Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として、配列にしたがって逐次ペプチド鎖の延長を行った。Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を上記ペプチド合成機の反応容器にセットし、合成機に添付されているソフトウェアにしたがって、活性化剤として、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔとＮ−メチルピロリドンに溶解して反応槽に加えて縮合反応させた。得られた樹脂をピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン中で緩やかに攪拌してＦｍｏｃ基を除いて次のアミノ酸誘導体の縮合に進めた。   Rink Amide MBHA Resin (0.36 mmol / g, 0.25 mmol) is used as a starting resin carrier, and each Fmoc-amino acid derivative usually used in Fmoc-peptide synthesis is used as a raw material to sequentially extend the peptide chain according to the sequence. went. Fmoc-amino acid derivative is set in the reaction vessel of the above peptide synthesizer, dissolved in HBTU, HOBt and N-methylpyrrolidone as activators according to the software attached to the synthesizer, added to the reaction vessel and condensed Reacted. The obtained resin was gently stirred in piperidine-containing N-methylpyrrolidone to remove the Fmoc group and proceed to condensation of the next amino acid derivative.

使用したＦｍｏｃアミノ酸誘導体は、側鎖に官能基のあるＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を用いた。   As the Fmoc amino acid derivatives used, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Tyr (OBut), and Boc-Cys (Npys) having a functional group in the side chain are used. It was.

配列にしたがって、逐次Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）から延長して最終Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を水溶性カルボジイミドを用いて縮合し、相当するＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ保護ペプチド樹脂を得た。引き続き脱保護、精製処理を行った。   According to the sequence, the final Boc-Cys (Npys) is sequentially extended from Fmoc-Arg (Pbf) and condensed with water-soluble carbodiimide, and the corresponding Boc-Cys (Npys) -Tyr (OBut) -Gly-Arg ( Pbf) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Arg (Pbf) -Arg (Pbf) -Gln (Trt) -Arg (Pbf) -Arg (Pbf) -Arg (Pbf) -Rink Amide MBHA protected peptide resin Obtained. Subsequently, deprotection and purification were performed.

（Ｂ）脱保護と樹脂からの切り出し
前記実施例１〜４の（Ｂ）と同様の方法により脱保護と樹脂からの切り出しを行なった。 (B) Deprotection and cutting out from resin Deprotection and cutting out from resin were performed in the same manner as in Examples 1 to 4 (B).

（Ｃ）Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ₂（ＢＳＨ−ＴＡＴ）の合成
（Ｂ）で得られた、Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ₂（８０ｍｇ）と、純水（４ｍｌ）、ＢＳＨ／２Ｎａ（８．３ｍｇ、０．９当量）を使用した以外は、実施例１〜４の（Ｃ）と同様の方法により、目的物であるＢＳＨのＴＡＴペプチド誘導体（ＢＳＨ−ＴＡＴと略称する）７０ｍｇをトリフルオロ酢酸塩として得た（純度９９．９％）。構造は質量分析にて確認した。
Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ₂
分子量：１８２６．３ Ｃ₆₇Ｈ₁₃₆Ｂ₁₂Ｎ₃₄Ｏ₁₂Ｓ₂
ＭＳ：m/z 610.0([M+3H]³⁺ 609.8), m/z 457.9([M+4H]⁴⁺ 4457.6), m/z 648.0([M+TFA+3H]³⁺ 647.8) (C) Synthesis of Cys (BSH) -Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH ₂ (BSH-TAT) Cys (Npys) obtained in (B) ) and -Tyr-Gly-Arg-Lys- Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH 2 (80mg), pure water (4ml), BSH / 2Na ( 8.3mg, 0.9 equiv) The target BSH TAT peptide derivative (abbreviated as BSH-TAT) (70 mg) was obtained as a trifluoroacetate salt in the same manner as in (C) of Examples 1 to 4 (purity 99). .9%). The structure was confirmed by mass spectrometry.
Cys (BSH) -Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH ₂
Molecular weight: 1826.3 C ₆₇ H ₁₃₆ B ₁₂ N ₃₄ O ₁₂ S ₂
MS: m / z 610.0 ([M + 3H] ³⁺ 609.8), m / z 457.9 ([M + 4H] ⁴⁺ 4457.6), m / z 648.0 ([M + TFA + 3H] ³⁺ 647.8)

比較例１：Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（ＢＳＨ−ＮＬＳ）の製造
（Ａ）保護ペプチド樹脂の構築
ペプチド自動合成機（４３３Ａ、アプライドバイオシステム（Applied Biosystems）社製）を用いて添付のソフトにしたがい、固相合成法により１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させ保護ペプチド樹脂の合成を定法にて行なった。 Comparative Example 1: Production of Cys (BSH) -Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (BSH-NLS) (A) Construction of protected peptide resin Peptide automatic synthesizer (433A, Applied Biosystems In accordance with the attached software, a protected peptide resin was synthesized by a conventional method by binding amino acids one by one from the carboxyl terminal side by a solid phase synthesis method.

Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＰＡＭ Ｒｅｓｉｎ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を出発樹脂担体として使用し、通常ｔ−ブトキシカルボニル（以下Ｂｏｃ−）ペプチド合成法に使われる各Ｂｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として、配列にしたがって逐次ペプチド鎖の延長を行った。Ｂｏｃ−アミノ酸誘導体を上記ペプチド合成機の反応容器にセットし、合成機に添付されているソフトウェアにしたがって、活性化剤として、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ＨＯＢｔとＮ−メチルピロリドンに溶解して反応槽に加えて縮合反応させた。得られた樹脂をプログラムにしたがってトリフルオロ酢酸処理によりＢｏｃ基を除いて次のアミノ酸誘導体の縮合に進めた。   Boc-Val-PAM Resin (0.5 mmol / g, 0.5 mmol) is used as a starting resin carrier, and each Boc-amino acid derivative usually used in a t-butoxycarbonyl (hereinafter Boc-) peptide synthesis method is used as a raw material. Sequential peptide chain extension was performed according to the sequence. Boc-amino acid derivative is set in the reaction vessel of the above peptide synthesizer, and according to the software attached to the synthesizer, N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), HOBt and N-methylpyrrolidone are used as activators. It melt | dissolved and it added to the reaction tank and made it condensation reaction. The obtained resin was subjected to trifluoroacetic acid treatment to remove the Boc group according to a program and proceeded to condensation of the next amino acid derivative.

使用したＢｏｃアミノ酸誘導体は、側鎖に官能基のあるＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を用いた。   As the Boc amino acid derivatives used, Boc-Arg (Tos), Boc-Gln (Trt), Boc-Lys (Cl-Z), and Boc-Cys (Npys) having a functional group in the side chain were used.

配列にしたがって、逐次Ｂｏｃ−Ｖａｌ樹脂から延長して最終Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）まで縮合し、相当するＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ｖａｌ−保護ペプチド樹脂を得た。引き続き脱保護、精製処理を行った。   According to the sequence, it is sequentially extended from the Boc-Val resin and condensed to the final Boc-Cys (Npys), and the corresponding Boc-Cys (Npys) -Pro-Lys (Cl-Z) -Lys (Cl-Z) -Lys (Cl-Z) -Arg (Pbf) -Lys (Cl-Z) -Val-protected peptide resin was obtained. Subsequently, deprotection and purification were performed.

（Ｂ）脱保護と樹脂からの切り出し
得られた保護ペプチド樹脂を無水フッ化水素を用いる定法のＨＦ−ｐＣｒｅｓｏｌｅ（８：２、ｖ／ｖ）脱保護条件で、−２〜−５℃で１時間処理し、Ｎｙｐｓ以外の脱保護と樹脂からのペプチドの切り離しを同時におこなった。反応液から担体樹脂をろ別した後、ＨＦを留去した。残渣にエーテルを加えて得られるＣｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＮＨ₂粗生成物の沈殿をろ取し、ＨＰＬＣおよび質量分析にて生成を確認したのち、つぎのＢＳＨとのジスルフィド形成反応に供した。 (B) Deprotection and excision from the resin The obtained protected peptide resin was subjected to the usual HF-pCresole (8: 2, v / v) deprotection conditions using anhydrous hydrogen fluoride at −2 to −5 ° C. After time treatment, deprotection other than Nyps and separation of the peptide from the resin were performed simultaneously. After the carrier resin was filtered off from the reaction solution, HF was distilled off. After adding ether to the residue, the precipitate of Cys (Npys) -Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-NH ₂ crude product was collected by filtration and confirmed by HPLC and mass spectrometry. The following disulfide formation reaction with BSH was performed.

（Ｃ）Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（ＢＳＨ−ＮＬＳ）の合成
（Ｂ）で得られた、Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（１１４ｍｇ）を純水（４ｍｌ）に溶解し、ＢＳＨ／２Ｎａ（１５ｍｇ、０．９当量）をアルゴン気流中で室温にて攪拌しながら加え反応させた。一昼夜反応後、反応溶液を直接分取精製に供した。 (C) Synthesis of Cys (BSH) -Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (BSH-NLS) Cys (Npys) -Pro-Lys-Lys-Lys-Arg obtained in (B) -Lys-Val (114 mg) was dissolved in pure water (4 ml), and BSH / 2Na (15 mg, 0.9 equivalent) was added and reacted in an argon stream at room temperature with stirring. After the reaction overnight, the reaction solution was directly subjected to preparative purification.

得られた粗生成物をＨＰＬＣ分取装置（ＬＣ−８Ａ−１、島津製作所製、カラム：ＯＤＳ３０×２５０ｍｍ）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸を含む水−アセトニトリルの系で分取精製し、目的のペプチド誘導体の分画を得、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥粉末とし、目的物であるＢＳＨのＮＬＳペプチド誘導体（ＢＳＨ−ＮＬＳと略称する）２３ｍｇ（１０％）をトリフルオロ酢酸塩として得た（純度９９．９％）。構造は質量分析にて確認した。
Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＮＨ₂
分子量：１１４８．６ Ｃ₄₃Ｈ₉₃Ｂ₁₂Ｎ₁₅Ｏ₉Ｓ₂
ＭＳ：m/z 576.1([M+2H]²⁺ 575.3) The obtained crude product was separated and purified in a water-acetonitrile system containing 0.1% trifluoroacetic acid using an HPLC fractionator (LC-8A-1, manufactured by Shimadzu Corporation, column: ODS 30 × 250 mm). A fraction of the desired peptide derivative was obtained, acetonitrile was distilled off, and then freeze-dried powder, and 23 mg (10%) of the target BSH NLS peptide derivative (abbreviated as BSH-NLS) was added to trifluoroacetate. (Purity 99.9%). The structure was confirmed by mass spectrometry.
Cys (BSH) -Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-NH ₂
Molecular _{weight: 1148.6 C 43 H 93 B 12} N 15 O 9 S 2
MS: m / z 576.1 ([M + 2H] ²⁺ 575.3)

試験例１：細胞内へのＢＳＨ導入
６０ｍｍディッシュにて培養したヒト神経膠芽腫細胞株（Ｕ８７ delta ＥＧＦＲ）１×１０⁶個細胞に対して終濃度がそれぞれ０．０１、０．１、１および１０μＭとなるように、ＢＳＨ、実施例１（ＢＳＨ−１１Ｒ）、実施例５（ＢＳＨ−ＴＡＴ）および比較例１（ＢＳＨ−ＮＬＳ：陰性対照）のホウ素ペプチド（各群ｎ＝６）をそれぞれ培養上清中に添加し、３７度、恒温槽で培養した。添加後１２時間に免疫染色を行なった。同時に核染色も行い、さらに導入されたＢＳＨを抗マウスＢＳＨ抗体にて染色し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。 Test Example 1: Introduction of BSH into cells Final concentration of 0.01, 0.1, 1 for human glioblastoma cell line (U87 delta EGFR) 1 × 10 ⁶ cells cultured in 60 mm dish And BSH, Example 1 (BSH-11R), Example 5 (BSH-TAT), and Comparative Example 1 (BSH-NLS: negative control) boron peptides (each group n = 6), respectively. It added in the culture supernatant and it culture | cultivated at 37 degree | times in a thermostat. Immunostaining was performed 12 hours after the addition. At the same time, nuclear staining was performed, and the introduced BSH was stained with an anti-mouse BSH antibody and observed with a confocal laser microscope.

濃度１μＭでの結果を図１Ａに示す。（ａ）はヘキストによる核１の染色（青）、（ｂ）はホウ素化合物２の染色（赤）のグレースケールデータである。（ａ）と（ｂ）を（ｃ）の重ね合わせ図と見比べ、さらに図１Ｂを参照すると分かるように、実施例１および５のホウ素ペプチドの多くは細胞内へと導入された。細胞内導入能をもたないＮＬＳを付けた比較例１のホウ素ペプチドは、細胞内に導入されなかった。これにより実施例１および５の本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、細胞内にＢＳＨを局在化できることが証明された。つまり、従来のＢＳＨとは異なり、細胞内でホウ素中性子捕捉反応を呈し、非常に高い抗腫瘍効果をもたらすことが期待できる。   The results at a concentration of 1 μM are shown in FIG. 1A. (A) is the gray scale data of staining of nucleus 1 with Hoechst (blue), and (b) is the staining of boron compound 2 (red). By comparing (a) and (b) with the overlay of (c) and further referring to FIG. 1B, many of the boron peptides of Examples 1 and 5 were introduced into the cells. The boron peptide of Comparative Example 1 to which NLS having no intracellular introduction ability was attached was not introduced into the cells. Thereby, it was proved that the cell membrane permeation type boron peptide of the present invention of Examples 1 and 5 can localize BSH in cells. That is, unlike the conventional BSH, it can be expected to exhibit a boron neutron capture reaction in the cell and bring about a very high antitumor effect.

また、各群における添加後１２時間での細胞内に導入されたホウ素濃度を、ＩＣＰ−ＡＥＳ（誘導結合プラズマ発光分光分析装置）にて測定した。
結果を図２に示す。ＢＳＨのみおよび比較例１（ＢＳＨ−ＮＬＳ）では、細胞膜に接着しているホウ素を検出していると考えられる。したがって、ＢＳＨのみ、比較例１（ＢＳＨ−ＮＬＳ）では、濃度を上げても、１０〜２０ｎｇ¹⁰Ｂ／１０⁶cellsにとどまっていたが、細胞膜透過作用を有する１１ＲおよびＴＡＴを付けた群、すなわち実施例１および実施例５においては、１０μＭで適用した場合、細胞内ホウ素濃度は、１５０〜２２０ｎｇ¹⁰Ｂ／１０⁶cellsという値になった。 Moreover, the boron concentration introduced into the cells 12 hours after the addition in each group was measured with ICP-AES (inductively coupled plasma emission spectrometer).
The results are shown in FIG. Only BSH and Comparative Example 1 (BSH-NLS) are considered to detect boron adhering to the cell membrane. Therefore, in BSH only, in Comparative Example 1 (BSH-NLS), even though the concentration was increased, it remained at 10 to 20 ng ¹⁰ B / 10 ⁶ cells, but a group with 11R and TAT having a cell membrane permeation action, that is, In Example 1 and Example 5, when applied at 10 μM, the intracellular boron concentration was 150 to 220 ng ¹⁰ B / 10 ⁶ cells.

以上より、実施例１（ＢＳＨ−１１Ｒ）および実施例５（ＢＳＨ−ＴＡＴ）は、通常のＢＳＨと比較して１０倍以上の細胞内導入量を示し（図２）、導入されたＢＳＨはすべて細胞内に局在していた（図１Ａおよび図１Ｂ）。   From the above, Example 1 (BSH-11R) and Example 5 (BSH-TAT) show an amount of intracellular introduction more than 10 times that of normal BSH (FIG. 2). It was localized in the cell (FIGS. 1A and 1B).

試験例２：ペプチド１分子中のＢＳＨの分子数の影響
実施例２〜４（２ＢＳＨ−１１Ｒ、４ＢＳＨ−１１Ｒ、８ＢＳＨ−１１Ｒ）のホウ素ペプチドを、６０ｍｍディッシュにて培養したヒト神経膠芽腫細胞株（Ｕ８７ delta ＥＧＦＲ）１×１０⁶個細胞に対して終濃度が０．１、１、１０μＭとなるように投与した。添加後１２時間で共焦点レーザー顕微鏡にて観察した（図３（濃度１μＭ群））。実施例４については、添加後、０．５、３、６および２４時間と経時的に観察した（図４Ａ（濃度１μＭ群））。 Test Example 2: Effect of the number of BSH molecules in one peptide molecule Human glioblastoma cells obtained by culturing the boron peptides of Examples 2 to 4 (2BSH-11R, 4BSH-11R, 8BSH-11R) in a 60 mm dish The strain (U87 delta EGFR) was administered to 1 × 10 ⁶ cells so that the final concentration was 0.1, 1, 10 μM. It observed with the confocal laser microscope 12 hours after addition (FIG. 3 (concentration 1 micromol group)). Example 4 was observed over time at 0.5, 3, 6 and 24 hours after addition (FIG. 4A (concentration 1 μM group)).

図３において、（ａ）はＢＳＨ２（緑）、（ｂ）は（ａ）のＢＳＨ（緑）にｆ−アクチン３（赤）の染色を重ねたもの、（ｃ）は（ｂ）にヘキストによる核１の染色（青）を重ねたもののグレースケールデータである。図３の（ａ）と（ｂ）および（ｃ）を見比べることにより、実施例２および３では、添加後１２時間でいずれも細胞内へと導入され核へと強く局在していたことがわかる。また、図４Ａにおいて、（ａ）がＢＳＨ２染色（緑）、ヘキストによる核１染色（青）およびアクチン３染色（赤）を重ねたもののグレースケールデータであり、（ｂ）がＢＳＨ２染色（緑）のみのグレースケールデータである。図４Ａの（ａ）のアクチンによる細胞輪郭と核を示すスケッチを示す図４Ｂを参考に（ａ）および（ｂ）を見比べると、添加の０．５時間後には細胞質へと導入され、この時点では核へはあまり導入されていないが、その後、３時間後には核へと局在化したことがわかる。つまり、導入されたＢＳＨは、経時的に細胞質より核へと局在していき、最終的には多くのＢＳＨが核へと局在している。   In FIG. 3, (a) is BSH2 (green), (b) is the BSH (green) of (a) overlaid with f-actin 3 (red), (c) is Hoechst in (b) This is gray scale data of the nucleus 1 stained (blue). By comparing (a), (b) and (c) in FIG. 3, it was found that in Examples 2 and 3, both were introduced into the cells and strongly localized in the nucleus 12 hours after the addition. Recognize. In FIG. 4A, (a) is grayscale data of BSH2 staining (green), nuclear 1 staining with Hoechst (blue), and actin 3 staining (red), and (b) is BSH2 staining (green). Only grayscale data. When comparing (a) and (b) with reference to FIG. 4B showing a sketch of the cell outline and nucleus by actin in FIG. 4A, it was introduced into the cytoplasm 0.5 hours after the addition. Then, it is not so much introduced into the nucleus, but it can be seen that it was localized to the nucleus after 3 hours. That is, the introduced BSH is localized from the cytoplasm to the nucleus over time, and finally many BSH are localized to the nucleus.

試験例１と同様に、濃度１０μＭで適用した場合の細胞内のホウ素濃度を比較すると、細胞外膜へ接着しているＢＳＨは、１０〜２０ｎｇ¹⁰Ｂ／１０⁶cells、実施例２（２ＢＳＨ−１１Ｒ）は２５０〜３５０ｎｇ¹⁰Ｂ／１０⁶cells、実施例３（４ＢＳＨ−１１Ｒ）は５００〜６００ｎｇ¹⁰Ｂ／１０⁶cells、実施例４（８ＢＳＨ−１１Ｒ）は５０００ｎｇ¹⁰Ｂ／１０⁶cellsと高度の集積を認めた（図５）。 As in Test Example 1, when comparing the intracellular boron concentration when applied at a concentration of 10 μM, BSH adhering to the outer membrane was 10-20 ng ¹⁰ B / 10 ⁶ cells, Example 2 (2BSH− 11R) is 250-350 ng ¹⁰ B / 10 ⁶ cells, Example 3 (4BSH-11R) is 500-600 ng ¹⁰ B / 10 ⁶ cells, and Example 4 (8BSH-11R) is 5000 ng ¹⁰ B / 10 ⁶ cells. (Fig. 5).

試験例３：
ヌードマウス（雌性、８〜１０週齢、清水実験材料）に対してヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７デルタＥＧＦＲを３×１０⁵個、ブレグマより外側２ｍｍ、前方１ｍｍ、深さ３ｍｍの位置に定位的に細胞移植し、１４日後にマウス尾静脈より８ＢＳＨ−１１Ｒ（３．５ｍｇの８ＢＳＨ−１１Ｒを含むＰＢＳ２００μＬ）を投与し、６時間後および２４時間後に脳組織を摘出し、免疫染色を行い８ＢＳＨ−１１Ｒの局在をみたところ、腫瘍組織および腫瘍細胞への特異的な集積を認めた（図６）。図６において、（ａ）はヒトＧＦＡＰによる脳腫瘍染色（赤）とヘキストによる核染色（青）、（ｂ）はＢＳＨ（緑）、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ねたものであり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を見比べると、投与後６時間で腫瘍組織へと集積していたホウ素化合物ＢＳＨは、２４時間経過しても、腫瘍組織および腫瘍細胞内に留まっていた。 Test Example 3:
3 × 10 ⁵ human glioblastoma cell lines U87 Delta EGFR for nude mice (female, 8-10 weeks old, Shimizu experimental materials), 2 mm outside Bregma, 1 mm forward, 3 mm deep After 14 days, 8BSH-11R (200 μL of PBS containing 3.5 mg of 8BSH-11R) was administered from the tail vein of the mouse, and the brain tissue was excised 6 hours and 24 hours later, followed by immunostaining and 8BSH. As a result of -11R localization, specific accumulation in tumor tissue and tumor cells was observed (FIG. 6). In FIG. 6, (a) is brain tumor staining with human GFAP (red) and nuclear staining with Hoechst (blue), (b) is BSH (green), and (c) is an overlay of (a) and (b). When comparing (a), (b) and (c), the boron compound BSH accumulated in the tumor tissue 6 hours after administration remains in the tumor tissue and tumor cells even after 24 hours. It was.

８ＢＳＨ−１１Ｒ投与６時間後の免疫染色した腫瘍中心部、腫瘍周縁部および正常部を比較した共焦点レーザー顕微鏡写真データを図７に示す。図７（ａ）がヒトＧＦＡＰによる脳腫瘍染色（赤）とヘキストによる核染色（青）、（ｂ）はＢＳＨ（緑）、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ねたものである。（ｂ）において、明るく見えるところがＢＳＨの導入された部分であり、（ａ）と見比べ（ｃ）を参照すると、腫瘍中心部においてＢＳＨが細胞質に多く局在し、腫瘍周縁部では核へと局在していることが良く観察される。正常部においては、ＢＳＨはほとんど存在せず、腫瘍組織特異的に送達されたことが確認される。   FIG. 7 shows confocal laser micrograph data comparing the immunostained tumor central part, tumor peripheral part and normal part 6 hours after 8BSH-11R administration. FIG. 7A shows brain tumor staining with human GFAP (red) and nuclear staining with Hoechst (blue), FIG. 7B shows BSH (green), and FIG. 7C shows (a) and (b) superimposed. In (b), the portion that appears bright is the portion where BSH is introduced. Compared with (a), referring to (c), BSH is localized in the cytoplasm in the center of the tumor, and is localized to the nucleus in the periphery of the tumor. It is often observed that it exists. In the normal region, almost no BSH is present, confirming that tumor tissue was delivered specifically.

試験例４：細胞毒性評価
コンフルエント状態まで培養したヒト神経膠芽腫細胞株（Ｕ８７ delta ＥＧＦＲ）を回収し、９６ウェルプレートに１０００細胞／ウェルで撒いた。翌日、ホウ素製剤を終濃度１０μＭ、１００μＭになるようにそれぞれに加えた。投与後、１、２、３、４日後に各プレートに対して、Cell Proliferation Reagent (WST-1)（ロッシュ社）を１０μｌ／ウェルで加えた。３７℃で１時間インキュベートしたのち、MICROPLATE READER（MTP-300、コロナ電気）で各サンプルの吸光度（４５０ｎｍおよび６９０ｎｍ）を測定した。 Test Example 4: Cytotoxicity evaluation A human glioblastoma cell line (U87 delta EGFR) cultured to a confluent state was collected and plated on a 96-well plate at 1000 cells / well. The next day, boron formulations were added to final concentrations of 10 μM and 100 μM, respectively. 1, 2, 3, and 4 days after administration, Cell Proliferation Reagent (WST-1) (Roche) was added at 10 μl / well to each plate. After incubation at 37 ° C. for 1 hour, the absorbance (450 nm and 690 nm) of each sample was measured with MICROPLATE READER (MTP-300, Corona Electric).

結果を図８に示す。比較例１、実施例１および実施例５のいずれのホウ素製剤にも、細胞に対する明らかな毒性は認められない。   The results are shown in FIG. In any of the boron preparations of Comparative Example 1, Example 1 and Example 5, no obvious toxicity to cells is observed.

参考例１：細胞内局在による細胞の核へのエネルギー付与率の違い
細胞内でのホウ素分布が、核へのエネルギー付与率にどのような影響を与えるかを、シミュレーションにより解析した。 Reference Example 1: Difference in energy application rate to cell nucleus due to intracellular localization The influence of the boron distribution in the cell on the energy application rate to the nucleus was analyzed by simulation.

シミュレーションの条件は、つぎのとおりである。
（１）核内に対するホウ素１０と中性子との反応による直接エネルギー付与のみを考える。
（２）細胞は半径５μｍの球と仮定する。
（３）核も球とし、その中心は細胞の中心と一致すると仮定する。
（４）細胞膜、核膜の実効厚さ（ホウ素が分布する厚さ）は、０．１μｍと仮定する。
（５）熱中性子フルエンスを１．００Ｅ＋１３（ｃｍ^-2）、平均ホウ素濃度を１（ｐｐｍ）とする。このとき、平均吸収線量は０７４３（Ｇｙ）となる。
（６）核膜については、半径２μｍ、２．５μｍ、３μｍの３通りについてシミュレーションを行なった。 The simulation conditions are as follows.
(1) Consider only direct energy application by reaction of boron 10 and neutrons in the nucleus.
(2) The cells are assumed to be spheres with a radius of 5 μm.
(3) Assume that the nucleus is also a sphere, and its center coincides with the center of the cell.
(4) The effective thickness of the cell membrane and nuclear membrane (thickness in which boron is distributed) is assumed to be 0.1 μm.
(5) The thermal neutron fluence is 1.00E + 13 (cm ⁻² ), and the average boron concentration is 1 (ppm). At this time, the average absorbed dose is 0743 (Gy).
(6) With respect to the nuclear membrane, simulations were performed with respect to three types having a radius of 2 μm, 2.5 μm, and 3 μm.

結果は、細胞全体に均一にＢ１０が分布している場合、細胞核でのエネルギー付与は、細胞全体のエネルギー付与の５．４％（核半径２μｍ）、１０．９（核半径２．５μｍ）、１９．４％（核半径３μｍ）となり、核の体積に応じたものである。一方、核内や核膜に分布している場合、細胞全体でみれば同じ線量でも核でのエネルギー付与は均一に分布している場合に比べて非常に大きいことが分かる。均一分布の場合の核へのエネルギー付与を１００％とした場合の各分布条件での核へのエネルギー付与率を図９に示す。このグラフにおいて、たとえば、核半径２μｍの場合、細胞膜のみに分布する群を１とすると、核のみに分布する群は、５７．６倍の核へのエネルギー付与が起こり、核へのダメージも同様に５７．６倍となる（図９）。   As a result, when B10 is uniformly distributed throughout the cell, the energy application in the cell nucleus is 5.4% of the entire cell energy application (nucleus radius 2 μm), 10.9 (nucleus radius 2.5 μm), 19.4% (nucleus radius 3 μm), which corresponds to the volume of the nucleus. On the other hand, when distributed in the nucleus or in the nuclear membrane, it can be seen that the energy application in the nucleus is very large even when the dose is the same in the whole cell as compared with the case where the energy is uniformly distributed. FIG. 9 shows the energy application rate to the nucleus under each distribution condition when the energy application to the nucleus in the case of uniform distribution is 100%. In this graph, for example, in the case of a nucleus radius of 2 μm, if the group distributed only in the cell membrane is 1, the group distributed only in the nucleus will give 57.6 times more energy to the nucleus, and the damage to the nucleus will be the same 57.6 times (Fig. 9).

１ 核
２ ＢＳＨ
３ アクチン 1 nucleus 2 BSH
3 Actin

配列番号１１：ランダムなアミノ酸配列を有するＮＬＳペプチド SEQ ID NO: 11: NLS peptide having a random amino acid sequence

Claims (5)

細胞膜透過ペプチドおよびホウ素化合物を含む細胞膜透過型ホウ素ペプチドであって、細胞膜透過ペプチドが、アルギニン９〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドまたはＴＡＴ（配列番号１）であり、ホウ素化合物が、ホウ素フェニルアラニン、またはチオール基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、アジド基、ハロゲン基およびリン酸基からなる群より選択されるアミノ酸と結合可能な官能基を有するホウ素クラスターである細胞膜透過型ホウ素ペプチド。 A cell membrane permeation type boron peptide comprising a cell membrane permeation peptide and a boron compound, wherein the cell membrane permeation peptide is a peptide or TAT (SEQ ID NO: 1) comprising an amino acid sequence in which 9 to 13 residues of arginine are continuous, Cell membrane permeation type that is boron phenylalanine or a boron cluster having a functional group capable of binding to an amino acid selected from the group consisting of thiol group, hydroxyl group, carboxyl group, amino group, amide group, azide group, halogen group and phosphate group Boron peptide. 前記ホウ素化合物が、メルカプトウンデカハイドロドデカボレートである請求項１記載の細胞膜透過型ホウ素ペプチド。 The cell membrane permeable boron peptide according to claim 1, wherein the boron compound is mercaptoundecahydrododecaborate. 細胞膜透過ペプチド１分子に対してメルカプトウンデカハイドロドデカボレート１〜８分子を含む請求項２記載の細胞膜透過型ホウ素ペプチド。 The cell membrane permeable boron peptide according to claim 2, comprising 1 to 8 mercaptoundecahydrododecaborate molecules per molecule of cell membrane permeable peptide. 核内に集積されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞膜透過型ホウ素ペプチド。 The cell membrane permeable boron peptide according to any one of claims 1 to 3, which is accumulated in a nucleus. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞膜透過型ホウ素ペプチドおよび少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含むホウ素製剤。 A boron preparation comprising the cell membrane permeable boron peptide according to any one of claims 1 to 4 and at least one pharmaceutically acceptable excipient.