JP6009080B2 - 老化及び認知症の予防及び/または治療活性を有する乳酸菌 - Google Patents
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Description
また、本発明は、前記乳酸菌を含む、抗酸化及び抗老化組成物及び認知症の予防または治療用組成物の提供を目的とする。
また、本発明は、前記乳酸菌で発酵させた、抗酸化及び抗老化発酵組成物及び認知症の予防または治療用発酵組成物の提供を目的とする。
また、本発明は、ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29を有効成分として含む、抗酸化及び抗老化薬学組成物を提供する。
また、本発明は、ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29を有効成分として含む、認知症の予防または治療用の薬学組成物を提供する。
また、本発明は、ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29を有効成分として含む、抗酸化及び抗老化効果を有する健康機能食品を提供する。
また、本発明は、ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29を有効成分として含む、認知症の予防または改善用の健康機能食品を提供する。
また、本発明は、ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29で発酵した発酵組成物を有効成分として含む、認知症の予防または治療用組成物を提供する。
また、本発明は、ラクトバチルス・カルバタスC3を有効成分として含む、抗酸化及び抗老化薬学組成物を提供する。
また、本発明は、ラクトバチルス・カルバタスC3を有効成分として含む、認知症の予防または治療用の薬学組成物を提供する。
また、本発明は、ラクトバチルス・カルバタスC3を有効成分として含む、抗酸化及び抗老化効果を有する健康機能食品を提供する。
また、本発明は、ラクトバチルス・カルバタスC3を有効成分として含む、認知症の予防または改善用の健康機能食品を提供する。
また、本発明は、ラクトバチルス・カルバタスC3で発酵した発酵組成物を有効成分として含む、認知症の予防または治療用組成物を提供する。
本発明のラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29及びラクトバチルス・カルバタスC3は、白菜キムチから分離した新規の微生物である。
a:Zanoni,P.,Farrow,J.A.E.,Phillips,B.A.,Collins,M.D.(1987)Lactobacillus pentosus(fred,peterson, and anderson)sp.Nov.,norn,rev.Int J Syst Bacteriol 37, 339-341より入手
前記三つの乳酸菌のいずれも2−ケト−グルコネート、5−ケト−グルコネート、エリスリトール、D−アラビノース、L−キシロース、β−メチル−D−キシロシド、L−ソルボース、イノシトール、グリコーゲン、キシリトール、D−リキソース、D−タガトース、D−フコース、L−フコース、L−アラビトールを発酵しなかった。
b:Zanoni,P.,Farrow,J.A.E.,Phillips,B.A.,Collins,M.D.(1987)Lactobacillus pentosus(fred,peterson,and anderson)sp.Nov.,norn,rev.Int J Syst Bacteriol 37, 339-341より入手。
a:エル.プランタルム:Van Reenen,C.A.,Dicks,L.M.(1996)Evaluation of numerical analysis of random amplified polymorphic DNA(rapd)-pcr as a method to differentiate lactobacillus plantarum and lactobacillus pentosus.Curr Microbiol 32, 183-187より入手。
エル.ペントーサス:Zanoni,P.,Farrow,J.A.E.,Phillips,B.A.,Collins,M.D.(1987)Lactobacillus pentosus(fred,peterson,and anderson)sp.Nov.,norn,rev.Int J Syst Bacteriol 37, 339-341より入手。
本発明は、さらに、C29菌株またはC3菌株を有効成分として含む、抗酸化及び抗老化効果を有する健康機能食品と認知症の予防または改善用の健康機能食品を提供する。
本発明の健康機能食品は、形態により、通常の方法で、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、甘味剤、芳香剤、保存剤、界面活性剤、潤滑剤、賦形剤などを適切に使用して製造することができる。
また、本発明は、C29菌株またはC3菌株で発酵した発酵組成物を有効成分として含む、抗酸化及び抗老化効果を有する組成物と認知症の予防または改善用組成物を提供する。
本発明において、前記発酵組成物は、大豆または脱脂大豆発酵組成物、ハリギリの樹皮発酵組成物、ニンジン発酵組成物、及びツルニンジン発酵組成物を含む。
本発明において、前記ハリギリの樹皮、ニンジン、及びツルニンジンは、抽出物またはエキス形態であってもよく、好ましくは、熱水抽出法、酒精抽出法または混合抽出法によって製造された抽出物の形態を使用してもよいが、これに限定されるものではない。前記抽出物の抽出効率を高めるために、粉砕または粉末化してもよく、当業界に公知された通常の抽出法によって行なってもよい。例えば、水抽出法、アルコール抽出法、有機溶媒抽出法及び超臨界抽出法などを使用することができ、好ましくは水抽出法を利用するが、これに限定されるものではない。
前記エキスは、減圧蒸留法や薄膜蒸留法で製造することができる。
前記C29菌株またはC3菌株の接種量は、発酵に利用する抽出物の種類によって異なるが、1×108CFU/ml以上で、発酵温度は20〜40℃が好ましい。本発明の目的に符合すれば、発酵時間は特に制限されないが、C29菌株またはC3菌株を接種して10〜30時間発酵することができる。ここで、発酵が10時間以下であれば、発酵組成物が充分に作られず、発酵が30時間以上であれば、有機酸が作られ過ぎて酸味が強くて食感が落ちるため、上述した発酵時間範囲内で発酵することが好ましい。
白菜キムチをMRSブロス(broth)に懸濁し、上澄液をMRS寒天(agar)培地に移植した後、24時間37℃で嫌気的に培養して育ったコロニーを選別し、グラム染色と16S rDNAを分析してラクトバチルス菌株を分離した。
また、ヒトの糞便をGAMブロス(Nissui Pharmaceutical Company,Ltd.、日本)に懸濁し、上澄液をBL寒天培地(Nissui製薬)に移植した後、48時間37℃で嫌気的に培養して育ったコロニーを選別し、グラム染色と16S rDNAを分析してラクトバチルスとビフィドバクテリウム菌株を分離した。
分離した菌株は、以下の通りである。
リゥコノストック・メゼンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)C1
リゥコノストック・キムチ(Leuconostoc kimchii)C2
ラクトバチルス・カルバタス(Lactobacillus curvatus)C3
ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)C4
ラクトバチルス・ブレビスC5
ラクトコッカス・プランタルム(Lactococcus plantarum)C6
リゥコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)C7
ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)C8
ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)C9
ラクトバチルス・ラクチス(Lactobacillus lactis)C10
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)C11
ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)C12
ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)C13
ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)C14
ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)C15
ラクトバチルス・サケイC21
ラクトバチルス・サケイC22
ラクトバチルス・サケイC23
ラクトバチルス・プランタルムC24
ラクトバチルス・プランタルムC25
ラクトバチルス・プランタルムC26
ラクトバチルス・ペントーサスC27
ラクトバチルス・ペントーサスC28
ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29
ラクトバチルス・サケイC30
ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)C16
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)C17
ビフィドバクテリウム・アドレセンティス(Bifidobacterium adolescentis)C18
ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)C19
ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)C20
キムチと糞便から分離した30種の乳酸菌のうち抗認知症効果を有する乳酸菌を確認するために、上記のC1〜C30菌株と実験動物を利用して実験を実施した。
実験に使用された全ての動物は、28〜30gの雄ICR系マウスで、実験動物の使用及び管理に関する指針(NIH publication No.85-23)に基づいて実験を行った。
実験動物をケージ(cage)あたり5〜6匹を入れて、エサの摂取は自由に放置した。飼育場内の温度は23±1℃、湿度は60±10%であり、12時間(07:30〜19:30)日長を常に維持した。
実験器具として、実験箱(50×15×40cm、electrofiable frid floor)は、仕切りを利用して二つの区画に区分するが、小さい入口を通じて一方から他方の区画に入れば自動的に入口が閉まるようになっている。仕切りで分けられた区画の一方に照明をつけて動物を入れると、周りを察して照明のない暗い区画に入れば自動的に入口が閉まり、直ちに0.25mAの電流を底のステンレスグリッドを通じて1秒間流して電気衝撃(foot shock)を与える。翌日、照明がつけられた区画に実験動物を入れてから該動物が暗い区画に行って入口が閉まるまでの時間(latency)を測定する。対照群と試験群に、このように暗い区画に入るまでの時間を測定、比較する。最大制限時間は300秒とするが、300秒を超えてからも暗い区画に入らなければ、受動回避反応時間を300秒と決める。動物が暗い区画に入って入口が閉まるまでの時間が大きいほど、学習を通じた受動回避に対する記憶がよく維持されると判断した。
最も効果が優れたものと確認されたC29乳酸菌を1×109及び1×1010CFU(個)を1日1回ずつ、2日間マウスに投与した。スコポラミン(0.9mg/kg)は、乳酸菌の最後の投与1時間後に投与した。その結果、図4で確認できるように、C29は、濃度依存的に効果を表した。
上記のような実験結果は、C29とC3乳酸菌が記憶力の改善を通じて認知症改善効果を有することをよく示す。
Y字形迷路測定装置は、3個の通路(arm)を伸ばせてアルファベットY字状をなし、各枝は、長さ25cm、高さ14cm、幅5cmであり、同一の角度で位置する。Y字形迷路の一通路の終端部に実験動物の頭部が向かうように置き、8分間自由に通路を歩き回るようにする。動物の動きを記録し、動物の後ろ足まで通路に入った場合を通過したもの(arm entry)と見なす。動物の動きを交差回数(alternation)で表すが、交差回数とは、動物が連続的に3個の通路を通過した時に一度交差したことと定義する。自発的な交差行動量は、実際の交差回数と最大可能な交差回数(即ち、総交差回数から2を引いた値)の百分比で表示する。
その結果、図6で確認できるように、スコポラミンのみを投与した試験群に比べて、C29を投与した試験群は、濃度依存的に記憶改善効果を表した。
円形の水槽(直径100cm、高さ35cm)に温度23℃の水中に設置したプラットホームが見えないように粉ミルクを入れて不鮮明にした水を15cmの深さで満たした。 マウスを利用する場合、プラットホーム(platform、直径4.5cm、高さ14.5cm)を、全体水槽を4等分したもののうち一つの扇形中央におき、プラットホーム上端が水面0.5cm下に位置するようにした。この装置を位置が確認できるような標識のある実験室に設置した。訓練試験(Training trial)は、1日3回ずつ、5日間連続的に実施した。一旦、マウスがプラットホームを見つければ約10秒間プラットホームに留まるようにおき、元のケージに帰らせた5分後に次の試験を実施した。もしマウスが120秒以内にプラットホームを見つけなければ、これをプラットホームに10秒間置いてから試験を終わらせた。訓練が終わった動物を対象として最後の訓練試験24時間後にプローブ試験(probe test)を実施した。この時は、水槽からプラットホームを除去し、90秒間プラットホームが置かれていた4分円に留まる時間を測定して百分率で表した。
その結果、図7で確認できるように、C29乳酸菌は、濃度依存的に記憶改善効果を表した。
抗酸化、抗老化及び抗認知症効果の確認のために、16ヶ月令マウスに3つの乳酸菌C29、C3、C24(それぞれ1×109CFU)を週5日ずつ12週間投与し、酸化反応の進行が速い大腸で、乳酸菌の抗酸化効果と老化関連の遺伝子AKT、FOXO3、NF−kB(p65)、mTorリン酸化体を測定した。比較遺伝子としてベータ−アクチンを測定した。また、記憶力改善効果を測定した。
実験動物の大腸組織100mgにプロテアーゼインヒビターカクテルが含有された250μlのRIPA bufferを添加して均質化した。その後、4℃、13000rpmで15分間遠心分離した後、上澄液を−80℃で保管しながら脂質過酸化の分析に使用した。
大腸組織内の脂質過酸化の程度は、TBARS分析キット(Cayman chem.、USA)を使用して分析した。大腸組織の均質液100μlを5mlのポリプロピレンスクリューキャップ遠心分離チューブに入れた後、100μlのSDS溶液を添加して軽く振った。4mlのカラー試薬をチューブに添加した後、1時間熱湯に入れて反応を中止した。その後、4℃、13000rpmで10分間遠心分離した後、室温で30分間静置し、ELISA読取機を利用して540nmで吸光度を測定した。標準物質としてマロンアルデヒド(MDA)を使用して標準曲線を作成し、これから生成されたMDAの量を測定した。
Cu、Zn−SOD活性は、キサンチンオキシダーゼシトクロム(xanthine oxidase-cytochrome)Cシステムを使用して測定した。50mMのリン酸カリウムバッファー(pH7.8、0.1mM EDTA含有)2.4ml、0.1mMのフェリチトクロムC0.3ml、1%のデオキシコレート0.2ml、1.5mMのシアン化カリウム0.1ml、0.5mMのキサンチン0.3ml及び希釈キサンチンオキシダーゼ20mlをよく混合して、フェリチトクロムCの減少率を25℃、550nmで測定した。SODの1unitは、シトクロムCの50%減少を阻害するためのSODの量と定義した。
50mMのリン酸塩バッファー(pH7.0)2mlに酵素原100μlを加え、10mMのH2O2溶液を1ml加えて240nmで2分間吸光度の減少を測定した。1unitは、1分間H2O2の1molを分解する酵素の量と定義した。
GSH濃度は、サンプルをリン酸塩バッファーで希釈してo−フタルアルデヒドを加え、15分振とう後、励起波長345nm、放射波長425nmで蛍光を測定した。
上記のような4種の実験の結果、下記の表6に示すように、実験に使用した3種の菌株は、全て優れた抗酸化及び抗老化の結果を表した。最も優れた菌株は、C29であり、次いでC24、C3の順であった。
Y字形迷路測定装置は、3個の通路(arm)を伸ばせてアルファベットY字状をなし、各枝は、長さ25cm、高さ14cm、幅5cmであり、同一の角度で位置する。Y字形迷路の一通路の終端部に実験動物の頭部が向かうように置き、8分間自由に通路を歩き回るようにする。動物の動きを記録し、動物の後ろ足まで通路に入った場合を通過したもの(arm entry)と見なす。動物の動きを交差回数(alternation)で表すが、交差回数とは、動物が連続的に3個の通路を通過した時に一度交差したことと定義する。自発的な交差行動量は、実際交差回数と最大可能な交差回数(即ち、総交差回数から2を引いた値)の百分比で表示する。
その結果、図9で確認できるように、老化したマウスの記憶力の改善効果は、C29乳酸菌が最も優れ、次いでC3乳酸菌、C24乳酸菌の順であった。
円形の水槽(直径100cm、高さ35cm)に温度23℃の水中に設置したプラットホームが見えないように粉ミルクを入れて不鮮明にした水を15cmの深さで満たした。マウスを利用する場合、プラットホーム(platform、直径4.5cm、高さ14.5cm)を、全体水槽を4等分したもののうち一つの扇形中央におき、プラットホーム上端が水面0.5cm下に位置するようにした。この装置を位置が確認できるような標識のある実験室に設置した。訓練試験(Training trial)は、1日3回ずつ、5日間連続的に実施した。一旦、マウスがプラットホームを見つければ約10秒間プラットホームに留まるようにおき、元のケージに帰らせた5分後に次の試験を実施した。もしマウスが120秒以内にプラットホームを見つけなければ、これをプラットホームに10秒間置いてから試験を終わらせた。訓練が終わった動物を対象として最後の訓練試験24時間後にプローブ試験(probe test)を実施した。この時は、水槽からプラットホームを除去し、90秒間プラットホームが置かれていた4分円に留まる時間を測定して百分率で表した。
その結果、図10で確認できるように、老化したマウスの記憶力の改善効果は、C29乳酸菌が最も優れ、次いでC3乳酸菌、C24乳酸菌の順であった。
前記実験において優れた抗酸化及び抗老化効果及び認知症改善効果を有すると確認されたC29菌株とC3菌株を同定するために、16S rDNA遺伝子配列の比較を通じた系統遺伝学的分析を実施した。
BLAST類似性調査プログラムを利用してrDNAの塩基配列を比較し、多様なラクトバチルス種菌株の16S rDNA遺伝子配列と共に多重配列アライメントを進行した後、系統樹における位置を判別した結果、C29乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタルム菌株BIM B−536とラクトバチルス・ペントーサス菌株LS3と99.9%以上の相同性を表して、ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29と命名し、寄託機関である韓国微生物保存センター(KCCM)に2012年7月9日付で寄託番号KCCM11291Pとして寄託した。また、C3乳酸菌は、ラクトバチルス・カルバタスと99.9%以上の相同性を表して、ラクトバチルス・カルバタスC3と命名し、寄託機関である韓国微生物保存センター(KCCM)に2012年7月9日付で寄託番号KCCM43009として寄託した。
C29またはC3菌株で発酵した大豆または脱脂大豆発酵組成物、ハリギリの樹皮発酵組成物、ニンジン発酵組成物、及びツルニンジン発酵組成物の抗認知症効果を確認するために、前記実施例2と同一の方法で実験動物を利用して受動回避反応試験(Passive avoidance task test)を実施した。
大豆または脱脂大豆粉末10gを水90mlに懸濁して滅菌し、1×108CFU(個)/0.1mlのC29またはC3菌株10mlを入れて24時間培養した。
ハリギリの樹皮水抽出物、ニンジン水抽出物及びツルニンジン水抽出物のそれぞれ10gを水90mlに懸濁して滅菌し、1×108/0.1mlのC29またはC3菌株10mlを入れて24時間培養した。
上記方法により製造された大豆または脱脂大豆発酵組成物、ハリギリの樹皮発酵組成物、ニンジン発酵組成物、及びツルニンジン発酵組成物のそれぞれの0.1mlを1日1回ずつ、2日間認知症モデル動物であるマウスに投与した。スコポラミン(Scopolamine)(0.9mg/kg)は、乳酸菌の最後の投与1時間後に投与した。その結果、図12で確認できるように、C29で発酵させた大豆発酵組成物が受動回避に対する記憶が最もよく維持され、認知症治療剤であるタクリン(Tacrin、TAC、10mg/kg)より効果が優れていることが表れ、次いでC29で発酵させたニンジン発酵組成物、C3で発酵させた大豆発酵組成物、C29で発酵させたツルニンジン発酵組成物の順であった。これは、C29またはC3菌株で発酵させた発酵組成物が記憶改善効果を有することを示すものである。
上記のような実験結果は、C29またはC3菌株で発酵させた発酵組成物が記憶力改善を通じて認知症改善効果を表すことをよく示す。
Claims (10)
- ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルム(Lactobacillus pentosus var.plantarum)C29 KCCM11291P。
- ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29 KCCM11291P菌株を有効成分として含む、抗酸化及び抗老化薬学組成物。
- ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29 KCCM11291P菌株を有効成分として含む、認知症の予防または治療用の薬学組成物。
- ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29 KCCM11291P菌株を有効成分として含む、抗酸化及び抗老化効果を有する健康機能食品。
- ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29 KCCM11291P菌株を有効成分として含む、認知症の予防または改善用健康機能食品。
- 認知症は、老人性認知症、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、パーキンソン病認知症、ハンチントン病認知症、正常圧脳水頭症による認知症、頭部損傷による認知症、及び物質で誘発される認知症からなる群から選択される、請求項3に記載の薬学組成物。
- 認知症は、老人性認知症、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、パーキンソン病認知症、ハンチントン病認知症、正常圧脳水頭症による認知症、頭部損傷による認知症、及び物質で誘発される認知症からなる群から選択される、請求項5に記載の健康機能食品。
- ラクトバチルス・ペントーサス変種プランタルムC29 KCCM11291P菌株を含む発酵組成物を有効成分として含む、認知症の予防または治療用組成物。
- 前記発酵組成物は、大豆または脱脂大豆発酵組成物、ハリギリの樹皮発酵組成物、ニンジン発酵組成物、及びツルニンジン発酵組成物からなる群から選択される、請求項8に記載の認知症の予防または治療用組成物。
- 認知症は、老人性認知症、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、パーキンソン病認知症、ハンチントン病認知症、正常圧脳水頭症による認知症、頭部損傷による認知症、及び物質で誘発される認知症からなる群から選択される、請求項8または9に記載の認知症の予防または治療用組成物。
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