JP6000956B2 - 膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法 - Google Patents
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Description
本願は、2011年9月13日に日本国に出願された特願2011−199357号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
しかし、血液中と膵液中では、含まれているプロテアーゼの種類は大きく異なる。このため、特許文献1に記載されている血液中のプロテアーゼの活性低下に有効なプロテアーゼ阻害剤を、膵液、十二指腸液等の膵液成分を含む体液に添加したとしても、当該体液中のプロテアーゼの活性を抑制し得るわけではない。
前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、PMSF、AEBSF、及びp−APMSFからなる群より選択される1種以上であり、
前記スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、TLCK及びTPCKからなる群より選択される1種以上である、膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法である。
(2) 前記(1)の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤は、PMSF、AEBSF、及びp−APMSFからなる群より選択される2種以上であることが好ましい。
(3) 前記(1)又は(2)の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、最終濃度が1mM以上のPMSF、4mM以上のAEBSF、又は2mM以上のp−APMSFとなるように、前記生体試料にPMSF、AEBSF、又はp−APMSFを添加することが好ましい。
(4) 前記(1)〜(3)のいずれかの膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、前記スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、TLCKであることが好ましい。
(5) 前記(1)〜(4)のいずれかの膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、前記生体試料は、膵液又は十二指腸液であることが好ましい。
(6) 本発明の第二の態様は、PMSF、AEBSF、及びp−APMSFからなる群より選択されるフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と、TLCK及びTPCKからなる群より選択される1種以上のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤とを含み、膵液成分を含有する生体試料を保存するために用いられる、膵液成分を含有する生体試料の保存用キットである。
(7) 前記(6)の膵液成分を含有する生体試料の保存用キットは、さらに、採取された体液を貯留するための貯留部を備える保存用容器を含み、前記貯留部に、前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と前記スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤とが予め含まれていることが好ましい。
本発明の第二の態様に係る膵液成分を含有する生体試料用プロテアーゼ阻害剤(以下、「本発明のプロテアーゼ阻害剤」ということがある。)は、フッ化スルホニル基を有する化合物であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、かつ膵液成分を含有する生体試料に、当該生体試料中のプロテアーゼを阻害するために添加されることを特徴とする。
本発明の第一の態様に係る膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法(以下、「本発明のプロテアーゼ阻害方法」ということがある。)は、膵液成分を含有する生体試料に、少なくとも1種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤(すなわち、本発明のプロテアーゼ阻害剤)を添加することにより、当該生体試料中のプロテアーゼの酵素活性を阻害することを特徴とする。本発明のプロテアーゼ阻害剤は、他のプロテアーゼ阻害剤と比べて、膵液や十二指腸液中に含まれているプロテアーゼに対する阻害活性が非常に高い。このため、膵液成分を含有する生体試料に本発明のプロテアーゼ阻害剤を添加することにより、当該生体試料中の膵液や十二指腸液由来のプロテアーゼによる膵液成分の分解を簡便かつ効果的に抑制できる。
本発明の第四の態様に係る膵液成分を含有する生体試料の保存用キット(以下、「本発明の保存用キット」ということがある。)は、少なくとも1種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤(すなわち、本発明のプロテアーゼ阻害剤)を含み、膵液成分を含有する生体試料を保存するために用いられる。当該キットを用いることにより、膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼをより簡便に阻害することができる。本発明の保存用キットに含まれる本発明のプロテアーゼ阻害剤は、1種類のみであってもよく、2種類以上を組み合わせていてもよい。また、当該キットは、さらに、少なくとも1種以上のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を含むことが好ましく、少なくとも1種以上の、プロテアーゼ阻害活性を有するアミノ酸クロロメチルケトン類を含むことがより好ましい。
膵液に対して最も効果が高いプロテアーゼ阻害剤を調べるため、市販されているプロテアーゼ阻害剤カクテル8種類の中から、膵液に対して阻害効果の高いプロテアーゼ阻害剤カクテルを探索した。用いたプロテアーゼ阻害剤カクテルは、complete(Roche社製)(阻害剤カクテル1)、Halt Protease Inhibitor Cocktail(Thermo社製)(阻害剤カクテル2)、Protease Inhibitor Cocktail(SIGMA社製)(阻害剤カクテル3)、Protease Inhibitor Mix(GE社製)(阻害剤カクテル4)、Protease Inhibitor Cocktail set I(MERCK社製)(阻害剤カクテル5)、Protease Inhibitor Cocktail set II(MERCK社製)(阻害剤カクテル6)、Protease Inhibitor Cocktail set III(MERCK社製)(阻害剤カクテル7)、及びProtease Inhibitor Cocktail(BioVision社製)(阻害剤カクテル8)である。
プロテアーゼ活性を阻害することによって、膵液中のタンパク質の保存安定性がどのように影響を受けるかについて検討した。一般的に膵液に含まれているS100P(カルシウム結合タンパク質)とパンクレアチン(擬似膵液)を混合した溶液中に、プロテアーゼ阻害剤を添加した場合としなかった場合において、S100Pがどの程度保存されるかを調べた。
具体的には、まず、25ng/mLのS100P(標品)溶液(試料溶液1)25ng/mLのS100P(標品)及び1mg/mLのパンクレアチンを含む溶液(試料溶液2)、25ng/mLのS100P(標品)及び1mg/mLのパンクレアチンを含み、さらに推奨濃度の2倍濃度(2×)のProtease Inhibitor Mix(GE社製)を含む溶液(試料溶液3)、25ng/mLのS100P(標品)及び1mg/mLのパンクレアチンを含み、さらに推奨濃度の5倍濃度(5×)のcomplete(Roche社製)を含む溶液(試料溶液4)を調製した。各試料溶液は、CircuLex S100P ELISA Kit(Cyclex社製、カタログ番号:CY−8060)に付属のバッファーを用いて調製した。これらの試料溶液を25℃、16時間インキュベートすることにより反応させた。その後、各試料溶液をCircuLex S100P ELISA Kit(Cyclex社製、カタログ番号:CY−8060)に付属のバッファーを用いて10倍希釈した希釈液に対して、CircuLex S100P ELISA Kitを用い、S100Pの検出を行った。
実施例1において最もプロテアーゼ阻害活性が高かった阻害剤カクテルに含まれる各種プロテアーゼ阻害剤の中で、膵液のプロテアーゼに対し、どのプロテアーゼ阻害剤が最も阻害活性が高いのかについて検討した。
Protease Inhibitor Mix(GE社製)に含まれるセリンプロテアーゼ阻害剤は、アプロチニン、ロイペプチン、PMSF、AEBSFの4種類である(濃度については非公開)。そこで、最終濃度が各プロテアーゼ阻害剤単剤における推奨最大濃度となるように調製し、4種類の阻害剤の組合せ全15通りについて、パンクレアチン及び2種類の膵液検体を用いてプロテアーゼ活性を、実施例1と同様にして測定した。各試料溶液に添加したプロテアーゼ阻害剤を表1に示す。なお、推奨最大濃度は、アプロチニン(Roche社製)は0.3μM、ロイペプチン(Roche社製)は50μM、PMSF(Roche社製)は1mM、AEBSF(Roche社製)は4mMであった。また、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液(対照試料溶液1)、推奨濃度の阻害剤カクテル1(Roche社のcomplete)を含む試料溶液(対照試料溶液2)、推奨濃度の5倍濃度(5×)の阻害剤カクテル1を含む試料溶液(対照試料溶液3)、推奨濃度の阻害剤カクテル4(GE社のProtease Inhibitor Mix)を含む試料溶液(対照試料溶液4)、及び推奨濃度の5倍濃度(5×)の阻害剤カクテル4を含む試料溶液(対照試料溶液5)のプロテアーゼ活性も同様に測定した。
PMSF及びAEBSFは、いずれもフッ化スルホニル基を有する有機化合物である。そこで、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と、フッ化スルホニル基を有さないプロテアーゼ阻害剤について、その阻害効果を検討した。プロテアーゼ阻害剤としては、PMSF(Roche社製)、AEBSF(Roche社製)、p−APMSF(SIGMA社製)、TLCK(SIGMA社製)、及びTPCK(SIGMA社製)を用いた。
具体的には、パンクレアチン及び2種類の膵液検体を用いて、プロテアーゼ阻害剤として、1mMのPMSFと4mMのAEBSFを添加した試料溶液、1mMのPMSFを添加した試料溶液、4mMのAEBSFを添加した試料溶液、5mMのp−APMSFを添加した試料溶液、100μMのTLCKを添加した試料溶液、及び100μMのTPCKを添加した試料溶液を調製し、各試料溶液のプロテアーゼ活性を、実施例1と同様にして測定した。また、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液(阻害剤なし)、推奨濃度の阻害剤カクテル1(Roche社のcomplete)を含む試料溶液、推奨濃度の5倍濃度(5×)の阻害剤カクテル1を含む試料溶液、推奨濃度の阻害剤カクテル4(GE社のProtease Inhibitor Mix)を含む試料溶液、及び推奨濃度の5倍濃度(5×)の阻害剤カクテル4を含む試料溶液のプロテアーゼ活性も同様に測定した。
図1に示すように、PMSF、AEBSF、及びp−APMSFは、いずれも非常に類似した化学構造を持つ。特に、これらの化合物は共通してフッ化スルホニル基を有していた。そのため、フッ化スルホニル基が膵液中のプロテアーゼの阻害に大きく影響を与えている可能性が示唆された。フッ化スルホニル基を有する構造が、膵液の中でも分解カスケードのトリガーとして知られているセリンプロテアーゼの阻害に有効に働いていると考えられる。
フッ化スルホニル基を有していないプロテアーゼ阻害剤について、そのプロテアーゼ阻害効果を検討した。フッ化スルホニル基を有していないプロテアーゼ阻害剤としては、Elastase Inhibitor I(MERCK社製)、EDTA(和光純薬社製)、アプロチニン(Roche社製)、ロイペプチン(Roche社製)、TLCK(SIGMA社製)、及びTPCK(SIGMA社製)を用いた。
具体的には、パンクレアチン及び2種類の膵液検体を用いて、プロテアーゼ阻害剤として、10〜50μMのElastase Inhibitor Iを添加した試料溶液、1〜10mMのEDTAを添加した試料溶液、0.0003〜0.3mMのアプロチニンを添加した試料溶液、0.005〜5mMのロイペプチンを添加した試料溶液、0.01〜1mMのTLCKを添加した試料溶液、又は0.01〜1mMのTPCKを添加した試料溶液を調製し、各試料溶液のプロテアーゼ活性を、実施例1と同様にして測定した。また、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液(阻害剤なし)、推奨濃度の阻害剤カクテル1(Roche社のcomplete)を含む試料溶液、推奨濃度の5倍濃度(5×)の阻害剤カクテル1を含む試料溶液、推奨濃度の阻害剤カクテル4(GE社のProtease Inhibitor Mix)を含む試料溶液、及び推奨濃度の5倍濃度(5×)の阻害剤カクテル4を含む試料溶液のプロテアーゼ活性も同様に測定した。
膵炎治療薬であるメシル酸ガベキサート(FOY)(和光純薬社製)、メシル酸カモスタット(フォイパン)(和光純薬社製)、メシル酸ナファモスタット(Futhan)(BD社製)について、そのプロテアーゼ阻害効果を検討した。
具体的には、パンクレアチン及び2種類の膵液検体を用いて、FOY及びフォイパンについては最終濃度が0.5〜50mMとなるように、Futhanについては最終濃度が0.5〜5mMとなるようにそれぞれ添加した試料溶液を調製し、各試料溶液のプロテアーゼ活性を、実施例1と同様にして測定した。また、プロテアーゼ阻害剤として、1mMのPMSFを添加した試料溶液、4mMのAEBSFを添加した試料溶液、及び5mMのp−APMSFを添加した試料溶液のプロテアーゼ活性も同様に測定した。
PMSF、AEBSF、及びp−APMSFに対し、膵液のプロテアーゼを阻害するための最適濃度の検討を行った。
具体的には、パンクレアチン及び2種類の膵液検体を用いて、プロテアーゼ阻害剤として、様々な濃度でPMSF(Roche社製)、AEBSF(Roche社製)、又はp−APMSF(SIGMA社製)を添加した試料溶液を調製し、各試料溶液のプロテアーゼ活性を、実施例1と同様にして測定した。対照として、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液(阻害剤なし)のプロテアーゼ活性も同様に測定した。
PMSF、AEBSF、及びp−APMSFについて、これらを組み合わせることによってプロテアーゼ阻害活性にどのような効果が見られるかについて検討した。プロテアーゼ阻害剤としては、PMSF(Roche社製)、AEBSF(Roche社製)、及びp−APMSF(SIGMA社製)を用いた。
具体的には、3種類の膵液検体及び2種類の十二指腸液検体を用いて、プロテアーゼ阻害剤として、1mMのPMSFを添加した試料溶液、4mMのAEBSFを添加した試料溶液、2mMのp−APMSFを添加した試料溶液、1mMのPMSFと4mMのAEBSFを添加した試料溶液、4mMのAEBSFと2mMのp−APMSFを添加した試料溶液、並びに1mMのPMSFと2mMのp−APMSFを添加した試料溶液を調製し、各試料溶液のプロテアーゼ活性を、実施例1と同様にして測定した。対照として、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液(阻害剤なし)のプロテアーゼ活性も同様に測定した。
前記実施例8の結果より、膵液を含む生体試料に対して、PMSF、AEBSF、及びp−APMSFの中から2種類以上のプロテアーゼ阻害剤を組み合わせて添加すると、プロテアーゼ阻害効果が高まることが明らかとなった。そこで、これら2種類の阻害剤と他の阻害剤の組合せにより、さらにプロテアーゼ阻害効果が高まるかどうかについて検討を行った。プロテアーゼ阻害剤としては、PMSF(Roche社製)、AEBSF(Roche社製)、アプロチニン(Roche社製)、TLCK(SIGMA社製)を用いた。
具体的には、4種類の十二指腸液検体を用いて、プロテアーゼ阻害剤として、1mMのPMSFと4mMのAEBSFを添加した試料溶液、1mMのPMSFと4mMのAEBSFと0.3mMのアプロチニンを添加した試料溶液、並びに1mMのPMSFと4mMのAEBSFと1mMのTLCKを添加した試料溶液を調製し、各試料溶液のプロテアーゼ活性を、実施例1と同様にして測定した。対照として、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液(阻害剤なし)のプロテアーゼ活性も同様に測定した。
Claims (7)
- 膵液成分を含有する生体試料に、少なくとも1種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と少なくとも1種以上のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤とを添加することにより、当該生体試料中のプロテアーゼの酵素活性を阻害し、
前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、PMSF、AEBSF、及びp−APMSFからなる群より選択される1種以上であり、
前記スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、TLCK及びTPCKからなる群より選択される1種以上である、膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。 - 前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、PMSF、AEBSF、及びp−APMSFからなる群より選択される2種以上である、請求項1に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
- 最終濃度が1mM以上のPMSF、4mM以上のAEBSF、又は2mM以上のp−APMSFとなるように、前記生体試料にPMSF、AEBSF、又はp−APMSFを添加する、請求項1又は2に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
- 前記スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、TLCKである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
- 前記生体試料が、膵液又は十二指腸液である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
- PMSF、AEBSF、及びp−APMSFからなる群より選択される1種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と、TLCK及びTPCKからなる群より選択される1種以上のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤とを含み、膵液成分を含有する生体試料を保存するために用いられる、膵液成分を含有する生体試料の保存用キット。
- さらに、採取された体液を貯留するための貯留部を備える保存用容器を含み、前記貯留部に、前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と前記スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤とが予め含まれている、請求項6に記載の膵液成分を含有する生体試料の保存用キット。
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