JP5998589B2 - Yeast containing γ-Glu-X - Google Patents

Description

本発明は、一般式γ-Glu-X（Ｘはアミノ酸を表す）で表記されるγ−グルタミルジペプチドを含有する酵母、及び当該酵母を用いて調製される酵母エキスに関するものである。当該酵母エキスや酵母は食品分野で有用である。   The present invention relates to a yeast containing γ-glutamyl dipeptide represented by the general formula γ-Glu-X (X represents an amino acid), and a yeast extract prepared using the yeast. The yeast extract and yeast are useful in the food field.

γ−グルタミル化合物の１つであるグルタチオン（γ-Glu-Cys-Gly）はすべての生物が有する細胞内に最も多量に存在する非タンパク質性チオールである。グルタチオンは生体内において抗酸化作用、免疫支援、細胞毒の除去など生体維持に必要な様々な機能を有しており、医薬品、化粧品原料として用いられる。また、グルタチオンはコク味を有し、食品原料としても利用される。そのため、グルタチオンを安価に大量に生産することは重要である。グルタチオンは、例えば、グルタチオンを高生産する出芽酵母を分離して利用することにより、効率よく生産することが可能である（非特許文献１）。一方、グルタチオンの前駆体であるγ-Glu-Cysの有用性も明らかになりつつあり、γ-Glu-Cysを含有する酵母に関する研究も行われている（特許文献１〜３）。それらの研究の多くは、γ-Glu-Cysからグルタチオンを生合成するグルタチオン合成酵素の活性を破壊または弱化することにより、γ-Glu-Cys ＋ Gly → γ-Glu-Cys-Glyの反応が進行することを阻害し、γ-Glu-Cysを蓄積させるものである。それに対し、もう一方の基質となるGlyの供給を制限する検討はなされていない。   Glutathione (γ-Glu-Cys-Gly), which is one of γ-glutamyl compounds, is a non-protein thiol that is present in the largest amount in cells of all living organisms. Glutathione has various functions necessary for living body maintenance such as antioxidant action, immune support, and removal of cytotoxins in vivo, and is used as a raw material for pharmaceuticals and cosmetics. Glutathione has a rich taste and is also used as a food material. Therefore, it is important to produce glutathione in large quantities at low cost. Glutathione can be efficiently produced, for example, by separating and using a budding yeast that produces glutathione at a high level (Non-Patent Document 1). On the other hand, the usefulness of γ-Glu-Cys, which is a precursor of glutathione, is becoming clear, and studies on yeasts containing γ-Glu-Cys are also being conducted (Patent Documents 1 to 3). In many of these studies, the reaction of γ-Glu-Cys + Gly → γ-Glu-Cys-Gly proceeds by destroying or weakening the activity of glutathione synthase that biosynthesizes glutathione from γ-Glu-Cys. That inhibits the accumulation of γ-Glu-Cys. On the other hand, no study has been made to limit the supply of Gly as the other substrate.

また、近年、コク味受容体が特定され、グルタチオンだけでなく一般式γ-Glu-X-Glyであらわされるトリペプチドがコク味に関与することが明らかになった（非特許文献２）。グルタチオンの場合と同様に、前駆体となる一般式γ-Glu-Xであらわされるジペプチドの有用性も今後明らかになると思われる。例えば、γ-Glu-Abuやγ-Glu-nValなどがコク味に関与する例などがすでに報告されている。   In addition, a kokumi receptor has recently been identified, and it has become clear that not only glutathione but also a tripeptide represented by the general formula γ-Glu-X-Gly is involved in kokumi (Non-patent Document 2). As in the case of glutathione, the usefulness of the dipeptide represented by the general formula γ-Glu-X as a precursor will be clarified in the future. For example, examples in which γ-Glu-Abu, γ-Glu-nVal, etc. are involved in the rich taste have already been reported.

酵母の細胞内でGlyは２つの経路で生合成されることが知られている。１つは、Thrを基質としてスレオニンアルドラーゼによって生成される経路であり（非特許文献３）、もう１つは、Serを基質としてセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによって生成される経路である（非特許文献４）。このように、２つの生成経路があるため、たとえ１つの経路が欠損したとしても、もう１つの経路で必要量のGlyが細胞内で補充されると考えられる。   It is known that Gly is biosynthesized by two pathways in yeast cells. One is a pathway generated by threonine aldolase using Thr as a substrate (Non-patent Document 3), and the other is a pathway generated by serine hydroxymethyltransferase using Ser as a substrate (Non-patent Document 4). . Thus, since there are two production pathways, even if one pathway is lost, it is considered that the necessary amount of Gly is supplemented intracellularly by the other pathway.

特許第04622204号Patent No. 04622204 特許第04273689号Patent No. 04273689 特許第04352877号Patent No. 04352877

Appl Microbiol Biotechnol. DOI 10.1007/s00253-010-2968-6 (2010)Appl Microbiol Biotechnol. DOI 10.1007 / s00253-010-2968-6 (2010) J. Biol. Chem. 285(2): 1016-1022 (2010)J. Biol. Chem. 285 (2): 1016-1022 (2010) Eur. J. Biochem. 245: 289-293 (1997)Eur. J. Biochem. 245: 289-293 (1997) Genetics 140: 1213-1222 (1995)Genetics 140: 1213-1222 (1995)

本発明は、産業上の有用性が期待されるγ−グルタミルシステイン（γ-Glu-Cys）等の一般式γ-Glu-Xで表記されるγ−グルタミルジペプチドを高濃度に蓄積する酵母、当該酵母を利用したγ−グルタミルジペプチドを含有する酵母エキス、および当該酵母エキスを含有する飲食品、並びにそれらの製造方法を提供することを課題とする。   The present invention relates to a yeast that accumulates a high concentration of γ-glutamyldipeptide represented by the general formula γ-Glu-X such as γ-glutamylcysteine (γ-Glu-Cys), which is expected to be industrially useful, It is an object of the present invention to provide a yeast extract containing γ-glutamyldipeptide using yeast, a food and drink containing the yeast extract, and methods for producing them.

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするGSH1遺伝子の高発現によってγ-Glu-X合成能を強化した酵母において、さらに酵母細胞内でのGly生成酵素の一つであるスレオニンアルドラーゼの活性を低下させることで、細胞内の一般式γ-Glu-Xで表記されるγ−グルタミルジペプチドの蓄積量が増大することを見出し、本発明を完成させた。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor has further improved the ability to synthesize γ-Glu-X by high expression of the GSH1 gene encoding γ-glutamylcysteine synthetase, By reducing the activity of threonine aldolase, one of the Gly-producing enzymes, the amount of accumulated γ-glutamyldipeptide represented by the general formula γ-Glu-X in cells increases. Completed the invention.

すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
γ−グルタミルジペプチド合成酵素の活性が増大し、かつグリシン生成酵素の活性が低下するよう改変された酵母。
［２］
γ−グルタミルジペプチド合成酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めることにより、または該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、γ−グルタミルジペプチド合成酵素の活性が増大するように改変された、前記酵母。
［３］
前記γ−グルタミルジペプチド合成酵素がγ−グルタミルシステイン合成酵素である、前記酵母。
［４］
グリシン生成酵素をコードする遺伝子の発現が弱化されることにより、または該遺伝子が破壊されることにより、グリシン生成酵素の活性が低下するように改変された、前記酵母。
［５］
前記グリシン生成酵素がスレオニンアルドラーゼである、前記酵母。
［６］
さらに、Ｌ−システインの生合成経路および／またはα−アミノ酪酸の生合成経路が強化されるよう改変された、前記酵母。
［７］
前記酵母がサッカロミセス属に属する酵母である、前記酵母。
［８］
前記酵母がサッカロミセス・セレビシエである、前記酵母。
［９］
前記酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することを特徴とする、酵母エキスの製造方法。
［１０］
前記酵母エキスを飲食品の原料に添加することを特徴とする、飲食品の製造方法。
［１１］
前記酵母エキスを含有する飲食品。 That is, the present invention can be exemplified as follows.
[1]
Yeast modified so that the activity of γ-glutamyl dipeptide synthase is increased and the activity of glycine-producing enzyme is decreased.
[2]
The yeast modified so as to increase the activity of γ-glutamyl dipeptide synthase by increasing the copy number of a gene encoding γ-glutamyl dipeptide synthase or by modifying the expression regulatory sequence of the gene .
[3]
The yeast, wherein the γ-glutamyl dipeptide synthase is γ-glutamylcysteine synthase.
[4]
The yeast modified so that the activity of the glycine-producing enzyme is reduced by weakening the expression of the gene encoding the glycine-producing enzyme or by destroying the gene.
[5]
The yeast, wherein the glycine-producing enzyme is threonine aldolase.
[6]
Furthermore, the yeast modified so as to enhance the biosynthesis pathway of L-cysteine and / or the biosynthesis pathway of α-aminobutyric acid.
[7]
The yeast as described above, wherein the yeast belongs to the genus Saccharomyces.
[8]
Said yeast, wherein said yeast is Saccharomyces cerevisiae.
[9]
A method for producing a yeast extract, comprising preparing a yeast extract using the yeast as a raw material.
[10]
A method for producing a food or drink, comprising adding the yeast extract to a raw material for the food or drink.
[11]
A food or drink containing the yeast extract.

本発明により、細胞内にγ-Glu-Cys等の一般式γ-Glu-Xで表記されるγ‐グルタミルジペプチドを高蓄積する酵母が提供される。それら酵母を原料として用いることにより、これらγ‐グルタミルジペプチドを含有する酵母エキスを効率的に製造でき、また、それら酵母エキスを利用して飲食品を製造することができる。   The present invention provides a yeast that highly accumulates γ-glutamyldipeptide represented by the general formula γ-Glu-X such as γ-Glu-Cys in a cell. By using these yeasts as raw materials, yeast extracts containing these γ-glutamyl dipeptides can be efficiently produced, and foods and drinks can be produced using these yeast extracts.

以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明の酵母
（１−１）本発明の酵母
本発明の酵母は、γ−グルタミルジペプチド合成酵素の活性が増大し、かつグリシン生成酵素の活性が低下するように改変された、酵母である。本発明の酵母は、細胞内にγ-Glu-Cys等の一般式γ-Glu-Xで表記されるγ‐グルタミルジペプチドを蓄積できる。本発明の酵母においては、細胞内のグリシン生成酵素の活性が低下することにより、細胞内でのグリシンの生合成を制限し、その生育を過度に悪化させることなく一般式γ-Glu-Xで表記されるγ‐グルタミルジペプチドの蓄積量が向上するのが好ましい。「生育を過度に悪化させることなく」とは、例えば、本発明の酵母の対数増殖期の生育速度が、野生株や親株等の非改変株と比較して、５０％以上、７０％以上、または９０％以上維持されることであってよい。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) Yeast of the Present Invention (1-1) Yeast of the Present Invention The yeast of the present invention is a yeast modified so that the activity of γ-glutamyl dipeptide synthase is increased and the activity of glycine producing enzyme is decreased. It is. The yeast of the present invention can accumulate γ-glutamyl dipeptide represented by the general formula γ-Glu-X such as γ-Glu-Cys in the cell. In the yeast of the present invention, by reducing the activity of intracellular glycine-producing enzyme, the biosynthesis of glycine in the cell is limited, and the general formula γ-Glu-X is used without excessively deteriorating its growth. It is preferable that the amount of accumulated γ-glutamyldipeptide expressed is improved. “With no excessive deterioration in growth” means, for example, that the growth rate in the logarithmic growth phase of the yeast of the present invention is 50% or more, 70% or more, compared to an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain, Or 90% or more may be maintained.

本発明において、「γ−グルタミルジペプチド」とは、一般式γ-Glu-Xで表記される化合物をいう。式中、「Glu」はグルタミン酸を示す。また、式中、「-」はペプチド結合を表す。また、式中、「γ」とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を介してＸが結合していることを意味する。   In the present invention, “γ-glutamyl dipeptide” refers to a compound represented by the general formula γ-Glu-X. In the formula, “Glu” represents glutamic acid. In the formula, “-” represents a peptide bond. In the formula, “γ” means that X is bonded through a carboxyl group at the γ-position of glutamic acid.

式中、「Ｘ」は、アミノ酸を表す。アミノ酸としては、例えば、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）などの中性アミノ酸、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）などの酸性アミノ酸、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）などの塩基性アミノ酸、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）などの芳香族アミノ酸、ノルバリン（ＮｖａまたはｎＶａｌ）、ノルロイシン（ＮｌｅまたはｎＬｅｕ）、ｔｅｒｔ‐ロイシン（ｔＬｅｕ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、α‐アミノ酪酸（Ａｂｕ）、およびβ‐アミノ酪酸が挙げられる。なお、本発明において、アミノ酸は特記しない限りいずれもＬ−体である。   In the formula, “X” represents an amino acid. Examples of amino acids include glycine (Gly), alanine (Ala), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile), serine (Ser), threonine (Thr), cysteine (Cys), and methionine (Met). , Neutral amino acids such as asparagine (Asn), glutamine (Gln), proline (Pro), acidic amino acids such as aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu), lysine (Lys), arginine (Arg), histidine (His) Basic amino acids such as, phenylalanine (Phe), tyrosine (Tyr), aromatic amino acids such as tryptophan (Trp), norvaline (Nva or nVal), norleucine (Nle or nLeu), tert-leucine (tLeu), hydroxyproline ( yp), alpha-aminobutyric acid (Abu), and β- aminobutyric acid and the like. In the present invention, all amino acids are L-forms unless otherwise specified.

「Ｘ」は、Ｇｌｙを除くアミノ酸から選択されるアミノ酸であるのが好ましい。   “X” is preferably an amino acid selected from amino acids excluding Gly.

また、「Ｘ」は、Ｃｙｓ、Ｎｖａ、Ａｂｕから選択されるアミノ酸であるのが好ましい。すなわち、γ−グルタミルジペプチドは、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Nva、γ-Glu-Abuから選択される化合物であるのが好ましい。これらのγ−グルタミルジペプチドの機能としては、例えば、コク味付与作用が提唱されている。   “X” is preferably an amino acid selected from Cys, Nva, and Abu. That is, the γ-glutamyl dipeptide is preferably a compound selected from γ-Glu-Cys, γ-Glu-Nva, and γ-Glu-Abu. As a function of these γ-glutamyl dipeptides, for example, a body taste imparting action has been proposed.

本発明において、蓄積するγ−グルタミルジペプチドは、１種のみであってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。   In the present invention, the γ-glutamyldipeptide that accumulates may be only one type, or two or more types.

本発明の酵母は、酵母の適当な菌株、例えば後述する菌株を改変することで取得することができる。   The yeast of the present invention can be obtained by modifying an appropriate strain of yeast, for example, a strain described later.

本発明の酵母は、上記のように改変されγ−グルタミルジペプチドを細胞内に蓄積できる限り特に制限されず、出芽酵母であってもよく、***酵母であってもよい。出芽酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロミセス属、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）等のキャンディダ属、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等のピヒア属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymor
pha）等のハンゼヌラ属等に属する酵母を例示することができる。***酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロミセス属等に属する酵母を例示することができる。中でも、酵母エキスの生産によく用いられているサッカロミセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスが好ましい。本発明の酵母は、１倍体でもよいし、２倍性またはそれ以上の倍数性を有するものであってもよい。 The yeast of the present invention is not particularly limited as long as it can be modified as described above and accumulates γ-glutamyldipeptide in cells, and may be budding yeast or fission yeast. As budding yeast, Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) genus Saccharomyces, Candida utilis (Candida utilis) genus Pichia pastoris (Pichia pastoris (Pichia pastoris) Pichia genus, Hansenula polymorph (Hansenula polymor (Hansenula polymor (Hansenula polymorpha)
Examples include yeast belonging to the genus Hansenula such as pha). Examples of the fission yeast include yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces pombe such as Schizosaccharomyces pombe. Of these, Saccharomyces cerevisiae and Candida utilis, which are often used for the production of yeast extract, are preferable. The yeast of the present invention may be haploid or may have diploidity or higher ploidy.

サッカロミセス・セレビシエとしては、具体的には、サッカロミセス・セレビシエＹ００６株を用いることができる。サッカロミセス・セレビシエＹ００６株は、平成２２年８月１８日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所 郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９９が付与されている。   As Saccharomyces cerevisiae, specifically, Saccharomyces cerevisiae Y006 strain can be used. Saccharomyces cerevisiae Y006 strain was internationally deposited on August 18, 2010 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (address postal number 305-8656 Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 1-Chome, 1-Chuo 1-Chuo 6) Accession number FERM BP-11299 is given.

また、サッカロミセス・セレビシエとしては、具体的には、ＢＹ４７４３株（ＡＴＣＣ２０１３９０）やＳ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ２６１０８）を用いることができる。また、キャンディダ・ユティリスとしては、具体的には、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ２２０２３株を用いることができる。これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。   As Saccharomyces cerevisiae, specifically, the BY4743 strain (ATCC201390) and the S288C strain (ATCC26108) can be used. As Candida utilis, specifically, Candida utilis ATCC22023 strain can be used. These strains can be sold, for example, from the American Type Culture Collection (address 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). That is, a registration number corresponding to each strain is given, and it is possible to receive a sale using this registration number (see http://www.atcc.org/). The registration number corresponding to each strain is described in the catalog of American Type Culture Collection.

（１−２）グリシン生成酵素活性の低下
本発明の酵母は、グリシン生成酵素の活性が低下するように改変されている。 (1-2) Decrease in glycine-producing enzyme activity The yeast of the present invention is modified so that the activity of glycine-producing enzyme is reduced.

＜グリシン生成酵素＞
グリシンの生成経路としては、スレオニンを基質とする経路とセリンを基質とする経路の２つが知られている。本発明において、「グリシン生成酵素」とはスレオニンまたはセリンを基質としてグリシンを生成する活性を有するタンパク質をいう。また、同活性を「グリシン生成酵素活性」ともいう。また、グリシン生成酵素をコードする遺伝子を「グリシン生成酵素遺伝子」ともいう。 <Glycine synthase>
There are two known glycine production pathways, a pathway using threonine as a substrate and a pathway using serine as a substrate. In the present invention, “glycine synthase” refers to a protein having an activity of producing glycine using threonine or serine as a substrate. This activity is also referred to as “glycine synthase activity”. A gene encoding glycine synthase is also referred to as “glycine synthase gene”.

スレオニンを基質としてグリシンを生成する酵素としては、スレオニンアルドラーゼが挙げられる。セリンを基質としてグリシンを生成する酵素としては、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼが挙げられる。サッカロミセス・セレビシエでは、スレオニンアルドラーゼはGLY1遺伝子に、セリンメチルキシトランスフェラーゼはSHM1遺伝子およびSHM2遺伝子によってコードされている。   Examples of the enzyme that produces glycine using threonine as a substrate include threonine aldolase. Examples of the enzyme that produces glycine using serine as a substrate include serine hydroxymethyltransferase. In Saccharomyces cerevisiae, threonine aldolase is encoded by the GLY1 gene, and serine methylxytransferase is encoded by the SHM1 and SHM2 genes.

サッカロミセス・セレビシエのGLY1遺伝子、SHM1遺伝子、およびSHM2遺伝子の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。上記データベースより取得したサッカロミセス・セレビシエのGLY1遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするGly1タンパク質（Gly1p）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。また、同様に、SHM1遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするShm1タンパク質（Shm1p）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および４に示す。また、同様に、SHM2遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするShm2タンパク質（Shm2p）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５および６に示す。   The base sequences of Saccharomyces cerevisiae GLY1, SHM1 and SHM2 genes are disclosed in the Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). The base sequence of the GLY1 gene of Saccharomyces cerevisiae obtained from the above database and the amino acid sequence of the Gly1 protein (Gly1p) encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. Similarly, the nucleotide sequence of the SHM1 gene and the amino acid sequence of the Shm1 protein (Shm1p) encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively. Similarly, the nucleotide sequence of the SHM2 gene and the amino acid sequence of the Shm2 protein (Shm2p) encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively.

グリシン生成酵素は、グリシン生成酵素活性を有する限り、上記グリシン生成酵素のバリアント、すなわち、配列番号２、４、または６のアミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントであってもよい。なお、そのようなバリアントを「保存的バリアント」という場
合がある。保存的バリアントには、例えば、配列番号２、４、または６のアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログや人為的な改変体も含まれる。また、グリシン生成酵素をコードする遺伝子は、上記グリシン生成酵素やその保存的バリアントをコードする限り、上記グリシン生成酵素遺伝子のバリアント、すなわち配列番号１、３、または５に示す塩基配列を有する遺伝子のバリアントであってもよい。 The glycine synthase may be a variant of the glycine synthase, that is, a protein variant having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, or 6 as long as it has glycine synthase activity. Such variants may be referred to as “conservative variants”. Conservative variants also include, for example, homologues and artificial variants of proteins having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, or 6. Further, the gene encoding the glycine-generating enzyme is a variant of the glycine-generating enzyme gene, that is, a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, or 5 as long as it encodes the glycine-generating enzyme or a conservative variant thereof. It may be a variant.

上記グリシン生成酵素遺伝子のバリアントは、配列番号１、３、または５に示す塩基配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索等によって公開データベースから容易に取得することができる(http://blast.genome.jp/)。また、上記グリシン生成酵素のホモログをコードする遺伝子としては、任意の生物、例えば酵母等の真核微生物、あるいは腸内細菌やコリネ型細菌等の細菌の染色体を鋳型にして、例えば配列番号１、３、または５の塩基配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲで増幅可能な遺伝子が挙げられる。   The variant of the glycine synthase gene can be easily obtained from a public database by BLAST search, FASTA search or the like using the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, or 5 as a query sequence (http: // blast .genome.jp /). In addition, as a gene encoding the homologue of the glycine-producing enzyme, a chromosome of any organism, for example, eukaryotic microorganisms such as yeast, or bacteria such as enteric bacteria and coryneform bacteria, for example, SEQ ID NO: 1, Examples thereof include genes that can be amplified by PCR using synthetic oligonucleotides prepared based on 3 or 5 base sequences.

また、グリシン生成酵素遺伝子は、グリシン生成酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、上記グリシン生成酵素のアミノ酸配列、例えば配列番号２、４、または６のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。   Moreover, as long as the glycine synthase gene encodes a protein having glycine synthase activity, the amino acid sequence of the glycine synthase, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, or 6, is at one or several positions. It may be a gene encoding a protein having a sequence including substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids. The “one or several” differs depending on the position of the protein in the three-dimensional structure of the amino acid residue and the type of the amino acid residue, but specifically preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, More preferably, it means 1-5. One or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions described above are conservative mutations in which the function of the protein is maintained normally. A typical conservative mutation is a conservative substitution. Conservative substitution means, for example, when a substitution site is an aromatic amino acid, between Phe, Trp, and Tyr, and when a substitution site is a hydrophobic amino acid, between Leu, Ile, and Val, a polar amino acid Is an amino acid having a hydroxyl group between Gln and Asn, in the case of a basic amino acid, between Lys, Arg, and His, and in the case of an acidic amino acid, between Asp and Glu. In some cases, it is a mutation that substitutes between Ser and Thr. Specifically, substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, substitution from Met to Ile, Leu, Val or Phe, substitution from Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitution, substitution from Thr to Ser or Ala, substitution from Trp to Phe or Tyr, substitution from Tyr to His, Phe or Trp, and substitution from Val to Met, Ile or Leu. In addition, amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutants or variants) such as cases based on individual differences in microorganisms from which genes are derived, or differences in species. Also included by

さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、上記グリシン生成酵素のアミノ酸配列全体、例えば配列番号２、４、または６のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、グリシン生成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。   Furthermore, the gene having a conservative mutation as described above is 80% or more, preferably 90% or more, with respect to the entire amino acid sequence of the glycine-producing enzyme, for example, the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, or 6. More preferably, it may be a gene encoding a protein having a homology of 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more, and having glycine synthase activity. In the present specification, “homology” may refer to “identity”.

また、グリシン生成酵素遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば配列番号１、３、または５に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、グリシン生成酵素活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。 The glycine-generating enzyme gene hybridizes under stringent conditions with a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a complementary sequence to the whole or a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, or 5. It may be a DNA encoding a protein having glycine synthase activity. Here, “stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, highly homologous DNAs, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more DNAs having homology. Are hybridized and DNAs with lower homology do not hybridize with each other, or normal Southern hybridization washing conditions of 60 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 60 ° C. Washing once, more preferably 2-3 times at a salt concentration and temperature corresponding to 0.1 × SSC, 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 × SSC, 0.1% SDS The conditions to do are mentioned.

上述の通り、プローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片をプローブとして用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳが挙げられる。   As described above, the probe may be a part of the complementary sequence of the gene. Such a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared on the basis of a known gene sequence as a primer and a DNA fragment containing these base sequences as a template. For example, when a DNA fragment having a length of about 300 bp is used as a probe, hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 × SSC, and 0.1% SDS.

なお、上記グリシン生成酵素遺伝子およびグリシン生成酵素のバリアントに関する記載は、本明細書中の他の遺伝子およびタンパク質についても準用できる。   In addition, the description regarding the said glycine synthetase gene and the variant of a glycine synthetase is applicable mutatis mutandis also about the other gene and protein in this specification.

＜酵素活性を低下させる手法＞
「酵素の活性が低下する」とは、目的の酵素活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。目的の酵素活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、非改変株と比較して好ましくは５０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下に低下していてよい。また、目的の酵素活性は、実質的に消失しているのが好ましい。 <Method to reduce enzyme activity>
“Enzyme activity decreases” means that the target enzyme activity is reduced as compared to a non-modified strain such as a wild strain or a parent strain, and includes a case where the activity is completely lost. The target enzyme activity is not particularly limited as long as it is lower than that of the non-modified strain, but is preferably 50% or less, more preferably 20% or less, still more preferably 10% or less, compared to the non-modified strain. Particularly preferably, it may be reduced to 5% or less. Moreover, it is preferable that the target enzyme activity is substantially lost.

上述の通り、グリシンの生成経路としては、スレオニンを基質とする経路とセリンを基質とする経路の２つが知られている。本発明においては、いずれか一方の経路のグリシン生成酵素活性のみが低下していてもよく、両方の経路のグリシン生成酵素活性が低下していてもよい。また、いずれか一方の経路のグリシン生成酵素活性のみが実質的に消失していてもよく、両方の経路のグリシン生成酵素活性が実質的に消失していてもよい。また、いずれか一方の経路のグリシン生成酵素活性が実質的に消失しているのが好ましく、他方の経路のグリシン生成酵素活性は完全には消失せず残存しているのが好ましい。いずれの経路のグリシン生成酵素活性を低下させるかは、目的とするγ−グルタミルジペプチドの種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。例えば、γ-Glu-Abuの蓄積を目的とする場合、スレオニンを基質とする経路の酵素であるスレオニンアルドラーゼの活性を低下させるのが、スレオニンからグリシンの生成が抑制され、スレオニンからα−アミノ酪酸（Abu）の生成に有利となる点で、好ましい。   As described above, there are two known glycine production pathways: a pathway using threonine as a substrate and a pathway using serine as a substrate. In the present invention, only the glycine synthase activity of either pathway may be reduced, or the glycine synthase activity of both pathways may be decreased. Moreover, only the glycine synthase activity of any one path | route may lose | disappear substantially, and the glycine synthase activity of both paths | routes may lose | disappear substantially. Moreover, it is preferable that the glycine synthase activity of any one path | route is substantially lose | disappeared, and it is preferable that the glycine synthase activity of the other path | route does not lose | disappear completely but remains. Which pathway to reduce the glycine-producing enzyme activity can be appropriately selected according to various conditions such as the type of the target γ-glutamyldipeptide. For example, for the purpose of accumulation of γ-Glu-Abu, the activity of threonine aldolase, a pathway enzyme that uses threonine as a substrate, decreases the production of glycine from threonine and α-aminobutyric acid from threonine. This is preferable because it is advantageous for the production of (Abu).

酵素活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理又は遺伝子組換え技術により達成できる。   Modifications that reduce enzyme activity can be achieved, for example, by mutation treatment or genetic recombination techniques.

突然変異処理としては、紫外線照射、または、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異処理に通常用いられている変異剤による処理が挙げられる。   Mutation treatment includes ultraviolet irradiation or mutation treatment of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethyl methanesulfonate (EMS), methylmethanesulfonate (MMS), etc. Treatment with a commonly used mutagen can be mentioned.

遺伝子組換え技術としては、例えば、公知の技術（FEMS Microbiology Letters 165 (1998) 335-340、JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Dec. 1995, p7171-7177、Curr Genet 1986; 1
0(8):573-578、WO 98/14600等）を利用できる。 Examples of gene recombination techniques include known techniques (FEMS Microbiology Letters 165 (1998) 335-340, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Dec. 1995, p7171-7177, Curr Genet 1986; 1
0 (8): 573-578, WO 98/14600, etc.).

酵素活性が低下するような改変は、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。   The modification that reduces the enzyme activity can be achieved, for example, by reducing the expression of a gene encoding the target enzyme. In addition, “the expression of the gene is reduced” is also referred to as “the expression of the gene is weakened”. Reduction of gene expression can be achieved, for example, by modifying an expression regulatory sequence such as a gene promoter. In the case of modifying the expression control sequence, the expression control sequence is preferably modified by 1 base or more, more preferably 2 bases or more, particularly preferably 3 bases or more. Further, part or all of the expression regulatory sequence may be deleted.

また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。   Moreover, the modification that decreases the enzyme activity can be achieved, for example, by destroying a gene encoding the protein.

遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域の一部または全部を欠失させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。酵素活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。   Gene disruption can be achieved, for example, by deleting part or all of the coding region of the gene encoding the target enzyme on the chromosome. Furthermore, the entire gene including the sequences before and after the gene on the chromosome may be deleted. The region to be deleted may be any region such as an N-terminal region, an internal region, or a C-terminal region as long as a decrease in enzyme activity can be achieved. Usually, the longer region to be deleted can surely inactivate the gene. Moreover, it is preferable that the reading frames of the sequences before and after the region to be deleted do not match.

また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる。   In addition, gene disruption can be performed, for example, by introducing an amino acid substitution (missense mutation) into a coding region of a gene encoding a target enzyme on a chromosome, introducing a stop codon (nonsense mutation), or 1-2 bases. It can also be achieved by introducing a frame shift mutation that adds or deletes.

また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の機能を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、マーカー遺伝子やγ−グルタミルジペプチドの生産に有用な遺伝子が挙げられる。   In addition, gene disruption can be achieved, for example, by inserting another sequence into the coding region of the gene encoding the target enzyme on the chromosome. The insertion site may be any region of the gene, but the longer the sequence to be inserted, the more reliably the gene can be inactivated. Moreover, it is preferable that the reading frames of the sequences before and after the insertion site do not match. Other sequences are not particularly limited as long as they reduce or eliminate the function of the encoded protein, and examples thereof include genes useful for the production of marker genes and γ-glutamyl dipeptides.

染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで酵母を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。また、前記組換えＤＮＡは、制限酵素で切断する等により直鎖状にしておくと、染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率よく取得することができる。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。   Modifying a gene on a chromosome as described above includes, for example, deleting a partial sequence of the gene and preparing a deleted gene modified so as not to produce a normally functioning protein. This can be achieved by replacing the gene on the chromosome with the deletion-type gene by transforming yeast with the recombinant DNA containing, and causing homologous recombination between the deletion-type gene and the gene on the chromosome. At this time, the recombinant DNA can be easily manipulated by including a marker gene in accordance with a trait such as auxotrophy of the host. In addition, if the recombinant DNA is linearized by cutting with a restriction enzyme or the like, a strain in which the recombinant DNA is incorporated into the chromosome can be efficiently obtained. Even if the protein encoded by the deletion-type gene is produced, it has a three-dimensional structure different from that of the wild-type protein, and its function is reduced or lost.

用いる組換えＤＮＡの構造によっては、相同組換えの結果として、野生型遺伝子と欠失型遺伝子とが組換えＤＮＡの他の部分（例えば、ベクター部分及びマーカー遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入される場合がある。この状態では野生型遺伝子が機能するため、当該２個の遺伝子間で再度相同組換えを起こさせ、１コピーの遺伝子を、ベクター部分及びマーカー遺伝子とともに染色体ＤＮＡから脱落させ、欠失型遺伝子が残ったものを選抜する必要がある。   Depending on the structure of the recombinant DNA used, as a result of homologous recombination, the wild-type gene and the deletion-type gene are inserted into the chromosome with other parts of the recombinant DNA (for example, the vector part and the marker gene) sandwiched between them. May be. Since the wild-type gene functions in this state, homologous recombination occurs again between the two genes, and one copy of the gene is dropped from the chromosomal DNA together with the vector portion and the marker gene, leaving the deleted gene. It is necessary to select the ones.

また、例えば、任意の配列を含む線状ＤＮＡであって、当該任意の配列の両端に染色体
上の置換対象部位の上流および下流の配列を備える線状ＤＮＡで酵母を形質転換して、置換対象部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで置換対象部位を当該任意の配列に置換することができる。当該任意の配列としては、例えば、マーカー遺伝子を含む配列を用いればよい。マーカー遺伝子は、その後、必要により除去してもよい。マーカー遺伝子を除去する場合には、マーカー遺伝子を効率的に除去できるよう、相同組み換え用の配列をマーカー遺伝子の両端に付加しておいてもよい。 In addition, for example, a linear DNA containing an arbitrary sequence, wherein yeast is transformed with a linear DNA having sequences upstream and downstream of the site to be replaced on both ends of the arbitrary sequence, and the target to be replaced By causing homologous recombination respectively upstream and downstream of the site, the site to be replaced can be replaced with the arbitrary sequence in one step. As the arbitrary sequence, for example, a sequence including a marker gene may be used. The marker gene may then be removed if necessary. When removing the marker gene, sequences for homologous recombination may be added to both ends of the marker gene so that the marker gene can be efficiently removed.

目的の酵素活性が低下したことの確認は、同酵素の活性を測定することによって行うことが出来る。グリシン生成酵素の活性は、公知の手法（非特許文献３、非特許文献４）により測定することができる。   Confirmation that the target enzyme activity has decreased can be performed by measuring the activity of the enzyme. The activity of the glycine-producing enzyme can be measured by a known method (Non-patent document 3, Non-patent document 4).

また、目的の酵素活性が低下したことの確認は、目的の酵素をコードする遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、目的の酵素の量が低下したことを確認することにより行うことが出来る。   Confirm that the target enzyme activity has been reduced by confirming that the amount of transcription of the gene encoding the target enzyme has decreased or that the amount of the target enzyme has been reduced. I can do it.

目的の酵素をコードする遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。   Confirmation that the transcription amount of the gene encoding the target enzyme has decreased can be confirmed by comparing the amount of mRNA transcribed from the gene with the unmodified strain. Examples of methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR and the like (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). The amount of mRNA is not particularly limited as long as it is lower than that of the non-modified strain, but is 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0, compared to the non-modified strain. % Is preferable.

目的の酵素の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。目的の酵素の量は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。   Confirmation that the amount of the target enzyme is reduced can be confirmed by Western blotting using an antibody (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). The amount of the target enzyme is not particularly limited as long as it is lower than that of the non-modified strain. For example, it is 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, Or it is preferable to have fallen to 0%.

本発明の酵母が２倍体以上の倍数性を有する場合には、本発明の酵母は、γ−グルタミルジペプチドを蓄積できる限り、酵素活性が低下するように改変された遺伝子と野生型遺伝子とをヘテロで有していてもよいが、通常は、酵素活性が低下するように改変された遺伝子のホモ型であるのが好ましい。   When the yeast of the present invention has a polyploidy of diploid or higher, the yeast of the present invention contains a gene and a wild type gene that have been modified so that the enzyme activity is reduced as long as γ-glutamyldipeptide can be accumulated. Although it may be hetero, it is usually preferable to be a homozygous gene modified so that the enzyme activity decreases.

酵母の形質転換法としては、プロトプラスト法、ＫＵ法（H.Ito et al., J. Bateriol., 153-163 (1983)）、ＫＵＲ法（発酵と工業 vol.43, p.630-637 (1985)）エレクトロポレーション法（Luis et al., FEMS Micro biology Letters 165 (1998) 335-340）、キャリアＤＮＡを用いる方法（Gietz R.D. and Schiestl R.H., Methods Mol.Cell. Biol. 5:255-269 (1995)）等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。また、酵母の胞子形成、１倍体酵母の分離、等の操作については、「化学と生物 実験ライン３１ 酵母の実験技術」、初版、廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ１０ 酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社等に記載されている。   Yeast transformation methods include protoplast method, KU method (H. Ito et al., J. Bateriol., 153-163 (1983)), KUR method (fermentation and industry vol.43, p.630-637 ( 1985)) Electroporation method (Luis et al., FEMS Micro biology Letters 165 (1998) 335-340), method using carrier DNA (Gietz RD and Schiestl RH, Methods Mol. Cell. Biol. 5: 255-269) (1995)) and the like, a method usually used for transformation of yeast can be employed. In addition, for the procedures such as yeast spore formation and haploid yeast separation, see “Chemistry and Biology Experiment Line 31 Yeast Experiment Technique”, first edition, Yodogawa Shoten; “Biomanual Series 10 Genetic Experiment Method Using Yeast” First Edition , Yodosha, etc.

このような＜酵素活性を低下させる手法＞は、グリシン生成酵素に限られず、その他の任意の酵素またはタンパク質に適用できる。   Such <method for reducing enzyme activity> is not limited to glycine-producing enzyme, and can be applied to any other enzyme or protein.

（１−３）γ−グルタミルジペプチド合成酵素活性の増大
本発明の酵母は、γ−グルタミルジペプチド合成酵素活性が増大するよう改変されている。 (1-3) Increase in γ-glutamyl dipeptide synthase activity The yeast of the present invention has been modified to increase γ-glutamyl dipeptide synthase activity.

本発明において、「γ−グルタミルジペプチド合成酵素」とは、L-GluとXからγ-Glu-Xで表記されるγ−グルタミルジペプチドを生成する活性を有するタンパク質をいう。また、同活性を「γ−グルタミルジペプチド合成酵素活性」ともいう。   In the present invention, “γ-glutamyl dipeptide synthase” refers to a protein having an activity of generating γ-glutamyl dipeptide represented by γ-Glu-X from L-Glu and X. This activity is also referred to as “γ-glutamyl dipeptide synthase activity”.

γ−グルタミルジペプチド合成酵素としては、γ−グルタミルシステイン合成酵素が挙げられる。本発明において、「γ−グルタミルシステイン合成酵素」とは、L-GluおよびL-Cysを基質として認識し、γ−グルタミルシステイン（γ-Glu-Cys）を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。また、γ−グルタミルシステイン合成酵素は、正反応であるγ-Glu-Cysを生成する反応以外に、L-Cys以外の任意のＬ−アミノ酸「X」を基質として認識し、L-Gluと結合させることでγ-Glu-Xを生成する反応を触媒する活性を有していてもよい。すなわち、目的とするγ−グルタミルジペプチドがγ-Glu-Cys以外である場合でも、γ−グルタミルシステイン合成酵素が目的とするγ−グルタミルジペプチドを生成する反応を触媒する活性を有するのであれば、当該γ−グルタミルシステイン合成酵素を、目的とするγ−グルタミルジペプチドの合成酵素として利用できる。本発明において、「γ−グルタミルシステイン合成酵素活性」とは、上述したγ-Glu-Cysを生成する反応を触媒する活性に限られず、目的とするγ−グルタミルジペプチドに応じて、１またはそれ以上のγ−グルタミルジペプチドを生成する反応を触媒する活性を含むものであってよい。γ−グルタミルシステイン合成酵素としては、GSH1遺伝子によりコードされるGsh1タンパク質（Gsh1p）が挙げられる。   Examples of γ-glutamyl dipeptide synthetase include γ-glutamylcysteine synthetase. In the present invention, “γ-glutamylcysteine synthetase” refers to a protein that recognizes L-Glu and L-Cys as substrates and has an activity that catalyzes a reaction that generates γ-glutamylcysteine (γ-Glu-Cys). Say. Γ-glutamylcysteine synthetase recognizes any L-amino acid “X” other than L-Cys as a substrate in addition to the reaction that produces γ-Glu-Cys which is a positive reaction, and binds to L-Glu. It may have an activity to catalyze a reaction for producing γ-Glu-X. That is, even if the target γ-glutamyldipeptide is other than γ-Glu-Cys, the γ-glutamylcysteine synthetase has the activity to catalyze the reaction to produce the target γ-glutamyldipeptide. γ-glutamylcysteine synthetase can be used as a target γ-glutamyldipeptide synthase. In the present invention, the “γ-glutamylcysteine synthetase activity” is not limited to the activity of catalyzing the above-described reaction to produce γ-Glu-Cys, and one or more depending on the target γ-glutamyldipeptide. It may have an activity of catalyzing a reaction to produce a γ-glutamyldipeptide. Examples of γ-glutamylcysteine synthetase include Gsh1 protein (Gsh1p) encoded by GSH1 gene.

サッカロミセス・セレビシエのGSH1遺伝子の塩基配列は、それぞれSaccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。上記データベースより取得したサッカロミセス・セレビシエのGSH1遺伝子（システマティックネーム：YJL101C）の塩基配列、および同遺伝子がコードするGsh1pのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７および８に示す。   The nucleotide sequence of the GSH1 gene of Saccharomyces cerevisiae is disclosed in the Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/), respectively. The nucleotide sequence of the GSH1 gene (systematic name: YJL101C) of Saccharomyces cerevisiae obtained from the database and the amino acid sequence of Gsh1p encoded by this gene are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively.

酵素が由来する生物によってγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子は、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号７に示す塩基配列のバリアントであってもよい。γ−グルタミルシステイン合成酵素およびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したグリシン生合成酵素をコードする遺伝子群についてのバリアントの記載を準用できる。   Since the base sequence of the gene encoding γ-glutamylcysteine synthetase may vary depending on the organism from which the enzyme is derived, the gene encoding γ-glutamylcysteine synthetase has γ-glutamylcysteine synthetase activity. As long as it encodes a protein, it may be a variant of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. Regarding the variants of γ-glutamylcysteine synthetase and the gene encoding it, the description of the variants for the gene group encoding glycine biosynthesis enzyme described above can be applied mutatis mutandis.

＜酵素活性を増大させる手法＞
「酵素活性が増大する」とは、目的の酵素活性が野性株や親株等の非改変株と比較して増大していることを意味する。目的の酵素活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、非改変株と比較して好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に増大していてよい。また、「酵素活性が増大する」とは、もともと目的の酵素活性を有する菌株において目的の酵素活性を増大させることだけでなく、もともと目的の酵素活性を有さない菌株に目的の酵素活性を付与することを含む。また、結果として目的の酵素活性が増大する限り、酵母が本来有する目的の酵素活性を低下または消失させた上で、好適な目的の酵素を導入してもよい。 <Method to increase enzyme activity>
“Enzyme activity increases” means that the target enzyme activity is increased as compared to a non-modified strain such as a wild strain or a parent strain. The target enzyme activity is not particularly limited as long as it is increased compared to the unmodified strain, but is preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, and even more preferably 3 times compared to the non-modified strain. It may increase more than that. In addition, “enzyme activity increases” not only increases the target enzyme activity in a strain originally having the target enzyme activity, but also imparts the target enzyme activity to a strain that does not originally have the target enzyme activity. Including doing. In addition, as long as the target enzyme activity increases as a result, a suitable target enzyme may be introduced after reducing or eliminating the target enzyme activity inherent in yeast.

本発明においては、目的とするγ−グルタミルジペプチドに応じたγ−グルタミルジペプチド合成酵素、例えば、目的とするγ−グルタミルジペプチドを生成する反応を触媒する活性を有するγ−グルタミルシステイン合成酵素の活性を増大させればよい。目的とするγ−グルタミルジペプチドが２種またはそれ以上である場合、単一のγ−グルタミルジペプチド合成酵素が当該２種またはそれ以上のγ−グルタミルジペプチド全ての合成酵素活性を有していてもよく、そうでなくともよい。本発明においては、１種のγ−グルタミルジペプチド合成酵素の活性を増大させてもよく、２種またはそれ以上のγ−グルタミル
ジペプチド合成酵素の活性を増大させてもよい。 In the present invention, the activity of γ-glutamyldipeptide synthase according to the target γ-glutamyldipeptide, for example, γ-glutamylcysteine synthetase having an activity of catalyzing the reaction to produce the target γ-glutamyldipeptide is achieved. What is necessary is just to increase. When there are two or more γ-glutamyl dipeptides of interest, a single γ-glutamyl dipeptide synthase may have the synthase activity of all the two or more γ-glutamyl dipeptides. It does n’t have to be. In the present invention, the activity of one γ-glutamyl dipeptide synthase may be increased, and the activity of two or more γ-glutamyl dipeptide synthases may be increased.

酵素活性が増大するような改変は、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を増大させることにより達成できる。   Modifications that increase the enzyme activity can be achieved, for example, by increasing the expression of a gene encoding the target enzyme.

遺伝子の発現の増大は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。また、より強力なプロモーターとしては、公知の高発現プロモーター、例えば、PGK1、PDC1、TDH3、TEF1、HXT7、ADH1等の遺伝子のプロモーターを用いてもよい。なお、強力なプロモーターへの置換は、後述する遺伝子のコピー数の増加と組み合わせて利用できる。より強力なプロモーターを利用した例としては、染色体上のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のプロモーターを強転写プロモーターで置換することによりγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を増大させる方法が開示されている（大竹康之ら、バイオサイエンスとインダストリー、第５０巻第１０号、第９８９〜９９４頁、１９９２年）。   Increased gene expression can be achieved, for example, by replacing the promoter of the gene on the chromosome with a stronger promoter. By “stronger promoter” is meant a promoter that improves transcription of the gene over the native wild-type promoter. As a stronger promoter, a highly active type of a conventional promoter may be obtained by using various reporter genes. As a stronger promoter, a known high expression promoter, for example, a promoter of a gene such as PGK1, PDC1, TDH3, TEF1, HXT7, ADH1, etc. may be used. The replacement with a strong promoter can be used in combination with an increase in the copy number of a gene described later. As an example using a stronger promoter, a method for increasing the γ-glutamylcysteine synthetase activity by replacing the promoter of the γ-glutamylcysteine synthetase gene on the chromosome with a strong transcription promoter is disclosed (Otake). Yasuyuki et al., Bioscience and Industry, Vol. 50, No. 10, pp. 989-994, 1992).

また、遺伝子の発現の増大は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。   Further, increase in gene expression can be achieved, for example, by increasing the copy number of the gene.

遺伝子のコピー数の増加は、染色体上に目的の遺伝子を導入することにより達成できる。染色体上への遺伝子の導入は、例えば相同的組み換えを利用して行うことができる。例えば、染色体中に多数のコピーが存在する配列を標的として相同的組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体中に多数のコピーが存在する配列としては、特有の短い繰り返し配列からなる自律複製配列（ＡＲＳ）や、約150コピー存在するrDNA配列が挙げられる。ＡＲＳを含むプラスミドを用いて酵母の形質転換を行った例が、国際公開９５／３２２８９号パンフレットに記載されている。また、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それを染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させてもよい。   An increase in gene copy number can be achieved by introducing the gene of interest onto the chromosome. Introduction of a gene onto a chromosome can be performed using, for example, homologous recombination. For example, multiple copies of a gene can be introduced into a chromosome by performing homologous recombination with a sequence having multiple copies in the chromosome as a target. Examples of the sequence having a large number of copies in a chromosome include an autonomously replicating sequence (ARS) consisting of a unique short repetitive sequence and an rDNA sequence having about 150 copies. An example of transformation of yeast using a plasmid containing ARS is described in International Publication No. 95/32289. Alternatively, a gene may be incorporated into a transposon and transferred to introduce multiple copies of the gene into the chromosome.

また、遺伝子のコピー数の増加は、目的遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。ベクターとしては、例えば、CEN4の複製開始点を持つプラスミドや2μm DNAの複製開始点を持つ多コピー型プラスミドを好適に用いることができる。目的遺伝子は、好適なプロモーターと組み合わせてベクターに挿入し、目的遺伝子を発現させてもよい。また、遺伝子を発現させるのに好適なプロモーターを含むベクターを用いる場合には、ベクター中のプロモーターを利用して目的遺伝子を発現させてもよい。   An increase in gene copy number can also be achieved by introducing a vector containing the target gene into the host. As a vector, for example, a plasmid having a CEN4 replication origin and a multicopy plasmid having a 2 μm DNA replication origin can be preferably used. The target gene may be inserted into a vector in combination with a suitable promoter to express the target gene. In addition, when a vector containing a promoter suitable for expressing a gene is used, the target gene may be expressed using the promoter in the vector.

また、酵素活性が増大するような改変は、例えば、目的の酵素の比活性を増大させることによっても達成できる。比活性が増大した酵素は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来の酵素に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。比活性を増大させる手法は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増大させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。   Modification that increases the enzyme activity can also be achieved, for example, by increasing the specific activity of the target enzyme. An enzyme having an increased specific activity can be obtained by searching for various organisms, for example. Alternatively, a highly active type may be obtained by introducing a mutation into a conventional enzyme. The technique for increasing the specific activity may be used alone or in any combination with the technique for increasing gene expression as described above.

目的の酵素活性が増大したことの確認は、同酵素の活性を測定することによって行うことが出来る。γ−グルタミルシステイン合成酵素活性は、Jacksonの方法（Jackson, R. C., Biochem.J., 111, 309 (1969)）によって測定することができる。   Confirmation that the target enzyme activity has increased can be performed by measuring the activity of the enzyme. The γ-glutamylcysteine synthetase activity can be measured by the method of Jackson (Jackson, R. C., Biochem. J., 111, 309 (1969)).

また、目的の酵素活性が増大したことの確認は、目的の酵素をコードする遺伝子の転写量が増大したことを確認することや、目的の酵素の量が増大したことを確認することによ
り行うことが出来る。 Confirm that the target enzyme activity has increased by confirming that the amount of transcription of the gene encoding the target enzyme has increased or that the amount of the target enzyme has increased. I can do it.

目的の酵素をコードする遺伝子の転写量が増大したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大しているのが好ましい。   Confirmation that the transcription amount of the gene encoding the target enzyme has increased can be performed by comparing the amount of mRNA transcribed from the gene with that of the unmodified strain. Examples of methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR and the like (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). The amount of mRNA is not particularly limited as long as it is increased compared to the non-modified strain, but is increased, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more compared to the non-modified strain. It is preferable.

目的の酵素の量が増大したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。目的の酵素の量は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大しているのが好ましい。   Confirmation that the amount of the target enzyme is increased can be confirmed by Western blotting using an antibody (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). The amount of the target enzyme is not particularly limited as long as it is increased compared to the non-modified strain. However, for example, it is 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more compared to the non-modified strain. It is preferable.

本発明の酵母が２倍体以上の倍数性を有する場合であって、染色体の改変により酵素活性が増大している場合には、本発明の酵母は、γ−グルタミルジペプチドを蓄積できる限り、酵素活性が増大するように改変された染色体と野生型染色体とをヘテロで有していてもよく、酵素活性が増大するように改変された染色体のホモ型であってもよい。   When the yeast of the present invention has a polyploidy of diploid or more and the enzyme activity is increased by modification of the chromosome, the yeast of the present invention can be used as long as it can accumulate γ-glutamyldipeptide. A chromosome modified to increase activity and a wild-type chromosome may be heterogeneous, or may be a homozygous chromosome modified to increase enzyme activity.

このような＜酵素活性を増大させる手法＞は、γ−グルタミルジペプチド合成酵素に限られず、その他の任意の酵素またはタンパク質に適用できる。   Such a <method for increasing enzyme activity> is not limited to γ-glutamyl dipeptide synthase, and can be applied to any other enzyme or protein.

（１−５）その他の改変
また、本発明の酵母は、γ−グルタミルジペプチド化合物を蓄積できる限りにおいて、上記のような改変に加えて、その他の任意の改変がなされていてもよい。そのような改変としては、細胞内のγ−グルタミルジペプチド濃度が高まるような改変が挙げられる。 (1-5) Other Modifications The yeast of the present invention may be subjected to other arbitrary modifications in addition to the above modifications as long as the γ-glutamyldipeptide compound can be accumulated. Such modifications include modifications that increase the intracellular γ-glutamyldipeptide concentration.

細胞内のγ−グルタミルジペプチド濃度が高まるような改変としては、例えば、γ−グルタミルジペプチドを構成するアミノ酸の生合成経路の強化が挙げられる。本発明の酵母は、例えば、Cys生合成経路やAbu生合成経路が強化されているのが好ましい。   Examples of the modification that increases the intracellular γ-glutamyldipeptide concentration include enhancement of the biosynthetic pathway of amino acids constituting the γ-glutamyldipeptide. The yeast of the present invention preferably has, for example, enhanced Cys biosynthesis pathway or Abu biosynthesis pathway.

Cys生合成経路の強化方法としては、例えば、MET25遺伝子（システマティックネーム：YLR303W）、CYS3遺伝子（システマティックネーム：YAL012W）、および／またはCYS4遺伝子（システマティックネーム：YGR155W）にコードされる酵素の活性を増大させることが挙げられる。これらの酵素の活性は、これらの転写調節因子であるMET4遺伝子（システマティックネーム：YNL103W）やMET30遺伝子（システマティックネーム：YIL046W）を改変することにより増大させてもよい。具体的には、例えば、ＭＥＴ２５遺伝子の発現量を増大させる方法として、変異型ＭＥＴ４遺伝子（大村ら, FEBS Letters 387 (1996) 179-183、クリスet. al., Molecular Biology of the Cell., 8, 1699-1707, 1997)）、変異型ＭＥＴ３０遺伝子（DOMINIQUE et. al., MOLECULAR AND CELLUAR BIOLOGY, Dec 1995 p6526-6534、特開2004-113155）を利用する方法等が報告されている。酵母においては、ＭＥＴ２５遺伝子の発現量を増大させることにより菌体内γ−グルタミルシステイン含有量が上昇することが報告されている。   Examples of methods for enhancing the Cys biosynthetic pathway include increasing the activity of the enzyme encoded by the MET25 gene (systematic name: YLR303W), the CYS3 gene (systematic name: YAL012W), and / or the CYS4 gene (systematic name: YGR155W). Can be mentioned. The activity of these enzymes may be increased by modifying the transcriptional regulatory factors MET4 gene (systematic name: YNL103W) and MET30 gene (systematic name: YIL046W). Specifically, for example, as a method for increasing the expression level of the MET25 gene, a mutant MET4 gene (Omura et al., FEBS Letters 387 (1996) 179-183, Chris et. Al., Molecular Biology of the Cell., 8 , 1699-1707, 1997)), and a method using a mutant MET30 gene (DOMINIQUE et. Al., MOLECULAR AND CELLUAR BIOLOGY, Dec 1995, p6526-6534, JP 2004-113155) has been reported. In yeast, it has been reported that the γ-glutamylcysteine content in cells increases by increasing the expression level of the MET25 gene.

また、Abu生合成経路の強化方法としては、例えば、BAT1遺伝子（システマティックネーム：YHR208W）、ILV1遺伝子（システマティックネーム：YER086W）、CHA1遺伝子（システマティックネーム：YCL064C）、および／またはHOM3遺伝子（システマティックネーム：YER052C）にコードされる酵素の活性を増大させることが挙げられる。   Examples of methods for enhancing the Abu biosynthetic pathway include BAT1 gene (systematic name: YHR208W), ILV1 gene (systematic name: YER086W), CHA1 gene (systematic name: YCL064C), and / or HOM3 gene (systematic name: YER052C) increases the activity of the enzyme encoded.

また、特定のγ−グルタミルジペプチドの蓄積量を増加させたい場合は、対象となるアミノ酸の生成経路の強化とそれ以外のアミノ酸の生成経路の弱化を組み合わせてもよい。例えば、γ-Glu-Abuの蓄積量を増加させたい場合は、Abu生成経路を強化し、Cys生成経路を弱化させてもよい。   Moreover, when it is desired to increase the accumulation amount of a specific γ-glutamyldipeptide, enhancement of the production pathway of the target amino acid and weakening of the production pathway of other amino acids may be combined. For example, when it is desired to increase the accumulation amount of γ-Glu-Abu, the Abu generation pathway may be strengthened and the Cys generation pathway may be weakened.

また、細胞内のγ−グルタミルジペプチド濃度が高まるような改変としては、例えば、グルタチオン液胞トランスポーターの活性を増強させることや、液胞局在グルタチオン分解酵素の活性を低下させることが挙げられる。酵母のグルタチオン液胞トランスポーターをコードする遺伝子としてYCF1遺伝子が、液胞局在グルタチオン分解酵素をコードする遺伝子としてECM38遺伝子が、それぞれ挙げられる。   Examples of modifications that increase the intracellular γ-glutamyldipeptide concentration include enhancing the activity of glutathione vacuolar transporters and decreasing the activity of vacuolar localized glutathione degrading enzymes. The YCF1 gene is a gene encoding a glutathione vacuolar transporter of yeast, and the ECM38 gene is a gene encoding a vacuolar localized glutathione degrading enzyme.

また、本発明の酵母は、グルタチオン合成酵素活性が低下するように改変されていてもよく、そうでなくてもよいが、例えば生育の観点から、グルタチオン合成酵素活性が低下するように改変されていないのが好ましい場合がありうる。また、グルタチオン合成酵素活性が低下するように改変されている場合にも、例えば生育の観点から、グルタチオン合成酵素活性が完全には消失せず残存しているのが好ましい場合がありうる。酵母のグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子としては、GSH2遺伝子が挙げられる。   In addition, the yeast of the present invention may or may not be modified so that glutathione synthetase activity is reduced. For example, from the viewpoint of growth, the yeast is modified so that glutathione synthetase activity is decreased. It may be preferable not to. Even when the glutathione synthetase activity is modified so as to decrease, it may be preferable that the glutathione synthetase activity does not completely disappear and remains, for example, from the viewpoint of growth. Examples of the gene encoding yeast glutathione synthetase include the GSH2 gene.

これら遺伝子の塩基配列は、前述の遺伝子と同様にそれぞれSaccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。また、これら遺伝子は、Saccharomyces Genome Databaseに開示された塩基配列のバリアントであってもよい。これら遺伝子およびコードされるタンパク質のバリアントについては、上述したグリシン生合成酵素をコードする遺伝子群についてのバリアントの記載を準用できる。   The base sequences of these genes are disclosed in the Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/), respectively, in the same manner as the aforementioned genes. These genes may be variants of the base sequences disclosed in the Saccharomyces Genome Database. Regarding the variants of these genes and encoded proteins, the description of the variants for the gene group encoding the glycine biosynthetic enzyme described above can be applied mutatis mutandis.

上記のような改変、すなわちγ−グルタミルジペプチド合成酵素活性の増大、グリシン生成酵素活性の低下、基質となるCysやAbuなどの生成経路の強化、および、その他の任意の改変は、いずれの改変を先に行ってもよい。   Modifications as described above, that is, increase in γ-glutamyl dipeptide synthase activity, decrease in glycine synthase activity, enhancement of production pathways such as substrates Cys and Abu, and any other modification, You may go first.

（２）本発明の酵母エキス
次に、酵母エキスを製造する方法を説明する。本発明の酵母エキスは、本発明の酵母を原料として用いる以外は、通常の酵母エキスと同様に製造することができる。 (2) Yeast extract of this invention Next, the method to manufacture a yeast extract is demonstrated. The yeast extract of the present invention can be produced in the same manner as a normal yeast extract except that the yeast of the present invention is used as a raw material.

まず、本発明の酵母を培地で培養する。培地は、酵母が増殖し得るものであれば特に制限されないが、実施例に記載したSD培地に限定されることなく通常工業的に用いられる培地を利用することができる。例えば、炭素源としてグルコース、蔗糖、糖蜜、エタノール、酢酸、亜硫酸パルプ廃液等を、窒素源として尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム硝酸塩等を、或いはコーンスチープリカー、カゼイン、酵母エキス、ペプトン、大豆蛋白分解物等を、燐酸、カリウム、マグネシウム源として、燐酸、燐酸カリウム、燐酸アンモニウム、過燐酸石灰、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等を、その他微量金属として、銅、マンガン、亜鉛、鉄イオン等の無機塩等を適宜組み合わせて含む培地などを例示することができる。また、必要により、酵母の栄養要求性に応じた成分を培地に添加してもよい。また、γ−グルタミルジペプチドの原料となる各種アミノ酸、例えばシステイン、その２量体であるシスチン、Ａｂｕ、および／またはＮｖａを培地に添加してもよい。   First, the yeast of the present invention is cultured in a medium. The medium is not particularly limited as long as yeast can grow, but is not limited to the SD medium described in the Examples, and a medium that is usually used industrially can be used. For example, glucose, sucrose, molasses, ethanol, acetic acid, sulfite pulp waste liquid etc. as carbon source, urea, ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride nitrate etc. as nitrogen source, or corn steep liquor, casein, yeast extract, peptone, soybean protein Decomposition products etc. as phosphoric acid, potassium, magnesium source, phosphoric acid, potassium phosphate, ammonium phosphate, lime perphosphate, potassium chloride, potassium hydroxide, magnesium sulfate, magnesium chloride etc., other trace metals such as copper, manganese, zinc Examples thereof include a medium containing an appropriate combination of inorganic salts such as iron ions. Moreover, you may add the component according to the nutrient requirement of yeast to a culture medium as needed. In addition, various amino acids as raw materials for γ-glutamyldipeptide, such as cysteine, and its dimer cystine, Abu, and / or Nva may be added to the medium.

培養条件は、通常の酵母エキスの製造と同様の条件を採用することができ、用いる酵母に応じて適宜変更することができる。バッチ培養、フェドバッチ培養、連続培養など任意の方法を使用することができる。サッカロミセス・セレビシエの場合は、25〜35℃で、より好ましくは、27〜33℃で、更に好ましくは28〜32℃で振とう培養等により好気的に培養することが好ましい。   The culture conditions can be the same as those used in the production of normal yeast extract, and can be appropriately changed depending on the yeast used. Any method such as batch culture, fed-batch culture, or continuous culture can be used. In the case of Saccharomyces cerevisiae, it is preferable to cultivate aerobically by shaking culture or the like at 25 to 35 ° C, more preferably at 27 to 33 ° C, still more preferably at 28 to 32 ° C.

上記のようにして本発明の酵母を培養すると、酵母の細胞中にγ−グルタミルジペプチドが蓄積する。上記のようにして培養された酵母は、乾燥菌体重量当たり、例えば、γ-Glu-Cysを、好ましくは0.3重量％以上、より好ましくは0.8％以上含有してよい。また、上記のようにして培養された酵母は、乾燥菌体重量当たり、例えば、γ-Glu-Abuを、好ましくは4μmol/g以上、より好ましくは7.5μmol/g以上含有してよい。γ−グルタミルジペプチドの検出および同定は、例えば、公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、およびＮＭＲが挙げられる。   When the yeast of the present invention is cultured as described above, γ-glutamyl dipeptide accumulates in the yeast cells. The yeast cultured as described above may contain, for example, γ-Glu-Cys, preferably 0.3% by weight or more, more preferably 0.8% or more, per dry cell weight. Further, the yeast cultured as described above may contain, for example, γ-Glu-Abu, preferably 4 μmol / g or more, more preferably 7.5 μmol / g or more, per dry cell weight. Detection and identification of γ-glutamyldipeptide can be performed by, for example, a known technique. Such techniques include, for example, HPLC, LC / MS, LC-MS / MS, GC / MS, and NMR.

得られた酵母からの酵母エキスの調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を自己消化や酵素添加により消化したものを処理したものでもよい。また、必要に応じて得られた酵母エキスを濃縮してもよいし、ペースト状でも、乾燥し粉末の形態にしてもよい。   Preparation of a yeast extract from the obtained yeast may be performed in the same manner as the preparation of a normal yeast extract. The yeast extract may be one obtained by treating a yeast cell extracted with hot water, or one obtained by digesting a yeast cell by self-digestion or enzyme addition. Moreover, the yeast extract obtained as needed may be concentrated, may be paste-like, or may be dried and made into a powder form.

上記のようにして、γ−グルタミルジペプチドの含有量が高められた酵母エキスが得られる。好適な形態では、酵母エキスは、酵母エキス中の固形分全量（酵母エキス中の全成分の乾燥重量）に対し、γ−グルタミルジペプチドを乾燥重量として一定量含む。酵母エキスは、例えば、γ-Glu-Cysを、好ましくは０．５重量%以上、より好ましくは１重量%以上、さらに好ましくは５重量%以上、特に好ましくは１０重量%以上含有してよい。γ-Glu-Abuの場合は、好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．４重量％以上、更に好ましくは１．０重量％以上、特に好ましくは２．０重量％以上含有する。γ-Glu-nValの場合は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０４重量％以上、更に好ましくは０．１０重量％以上、特に好ましくは０．２０重量％以上含有してよい。   As described above, a yeast extract having an increased content of γ-glutamyldipeptide is obtained. In a preferred form, the yeast extract contains a certain amount of γ-glutamyldipeptide as a dry weight with respect to the total amount of solid content in the yeast extract (dry weight of all components in the yeast extract). The yeast extract may contain, for example, γ-Glu-Cys, preferably 0.5% by weight or more, more preferably 1% by weight or more, further preferably 5% by weight or more, and particularly preferably 10% by weight or more. In the case of γ-Glu-Abu, the content is preferably 0.1% by weight or more, more preferably 0.4% by weight or more, still more preferably 1.0% by weight or more, particularly preferably 2.0% by weight or more. In the case of γ-Glu-nVal, it is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.04% by weight or more, still more preferably 0.10% by weight or more, and particularly preferably 0.20% by weight or more. Good.

（３）本発明の飲食品
上記のようにして得られるγ−グルタミルジペプチドの含有量が高められた酵母エキスは、飲食品の製造に用いることができる。前記酵母エキスを用いることにより、前記酵母エキスを含有する飲食品（本発明の飲食品ともいう）が得られる。飲食品としては、特に制限されず、例えば、アルコール飲料、パン食品、又は発酵食品調味料が挙げられる。 (3) Food / beverage products of this invention The yeast extract with which content of (gamma) -glutamyl dipeptide obtained as mentioned above was raised can be used for manufacture of food / beverage products. By using the yeast extract, a food or drink containing the yeast extract (also referred to as a food or drink of the present invention) is obtained. It does not restrict | limit especially as food / beverage products, For example, alcoholic beverage, bread food, or fermented food seasoning is mentioned.

本発明の飲食品は、本発明の酵母エキスを飲食品の原料に添加し、飲食品に加工することによって製造される。なお、酵母エキスの添加は、飲食品の製造工程のいずれの段階で行われてもよい。すなわち、酵母エキスは、飲食品の原料に添加されてもよく、製造途中の飲食品に添加されてもよく、製造された飲食品に添加されてもよい。本発明において、「酵母エキスを飲食品の原料に添加する」という場合の「飲食品の原料」には、いわゆる「飲食品の原料」に限られず、「製造途中の飲食品」や「製造された飲食品」も含まれるものとする。酵母エキスの添加量は、特に制限されず、酵母エキスの態様や飲食品の態様等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の飲食品は、前記酵母エキスを使用すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。このような原料としては、例えばアルコール飲料では、米、大麦、コーンスターチ等、パン食品では小麦粉、砂糖、食塩、バター、発酵用酵母菌等が、発酵食品調味料では大豆、小麦等が挙げられる。また、酵母エキスもしくはその濃縮物、またはそれらを乾燥したものは、それ自体で発酵食品調味料として用いることができる。   The food / beverage products of this invention are manufactured by adding the yeast extract of this invention to the raw material of food / beverage products, and processing it into food / beverage products. In addition, the addition of the yeast extract may be performed at any stage of the production process of the food or drink. That is, a yeast extract may be added to the raw material of food / beverage products, may be added to the food / beverage products in the middle of manufacture, and may be added to the manufactured food / beverage products. In the present invention, in the case of “adding a yeast extract to a raw material for food and drink”, the “raw material for food and drink” is not limited to the so-called “raw material for food and drink”, and “ Food and drink ". The addition amount of the yeast extract is not particularly limited, and can be appropriately set according to various conditions such as the mode of the yeast extract and the mode of the food and drink. The food / beverage products of this invention can be manufactured by the same method using the raw material similar to normal food / beverage products except using the said yeast extract. Examples of such raw materials include rice, barley and corn starch for alcoholic beverages, flour, sugar, salt, butter, yeast for fermentation, etc. for bread foods, and soybeans, wheat, etc. for fermented food seasonings. Yeast extract or a concentrate thereof, or a product obtained by drying them can be used as a fermented food seasoning by itself.

本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。   The invention is further illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting the invention in any way.

実施例１．γ−グルタミルシステイン合成酵素活性強化かつグリシン生成酵素活性弱化株の取得
本実施例では、γ―グルタミルシステイン合成酵素をコードするGSH1遺伝子の発現が増大し、γ−グルタミル化合物の蓄積能およびAbu生成能が強化され、且つ、グリシン生成酵素の１つであるスレオニンアルドラーゼをコードするGLY1遺伝子を欠損したサッカロミセス・セレビシエ△GLY1株を以下の手順で構築した。 Example 1. In this example, the expression of the GSH1 gene encoding γ-glutamylcysteine synthetase is increased, the accumulation ability of γ-glutamyl compound and the ability to produce Abu are obtained. And Saccharomyces cerevisiae ΔGLY1 strain lacking the GLY1 gene encoding threonine aldolase, which is one of glycine-producing enzymes, was constructed by the following procedure.

（１）γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の高発現
まず、Sofyanovichらの方法（Olga A. Sofyanovich et al: A New Method for Repeated "Self-Cloning" Promoter Replacement in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biotechnol., 48, 218-227 (2011)）に基づきサッカロミセス・セレビシエY006株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９９）のGSH1遺伝子のプロモーター領域を、構成発現プロモーターであるアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、ADH1）のプロモーター領域に置換することにより、GSH1高発現酵母（AG1株）を作製した。手順を以下に示す。なお、Y006株はURA3遺伝子の欠損株であり、ウラシル要求性を示す。 (1) High expression of γ-glutamylcysteine synthetase gene First, the method of Sofyanovich et al. (Olga A. Sofyanovich et al: A New Method for Repeated “Self-Cloning” Promoter Replacement in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biotechnol., 48, 218-227 (2011)) by replacing the promoter region of the GSH1 gene of Saccharomyces cerevisiae strain Y006 (FERM BP-11299) with the promoter region of the alcohol dehydrogenase gene (hereinafter ADH1), which is a constitutive expression promoter, A yeast highly expressing GSH1 (AG1 strain) was prepared. The procedure is shown below. The Y006 strain is a URA3 gene-deficient strain and exhibits uracil requirement.

5'端にGSH1の上流配列を有する配列番号９のプライマー（5'- TATTGCCCCAGTGTTCCCTCAACAACCTTGGTAGTTGGAGCGCAATTAGCGTATCCTGTACCATACTAATTCTCTTCTGCTCTTAACCCAACTGCACAGA-3'）、及びGSH1遺伝子の開始コドンから始まる一部のORF内配列を有する配列番号１０のプライマー（5'- ATACCTTCATCCCTTATGTGTTCATTGTACGTCCTAGACTCAAACCACTGCAAAGGCGTGCCCAAAGCTAAGAGTCCCATTGTATATGAGATAGTTGATT-3'）を用い、pAUAプラスミド（前述のSofyanovichらの報告に記載）を鋳型にPCRを行い、ADH1プロモーターに挟まれたURA3を有するDNA断片を得た。PCRの条件は、熱変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。このDNA断片でY006株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD平板培地に塗布した。生育した形質転換体から、GSH1プロモーターがpADH1-URA3-pADH1に置換された株を取得した。   A primer of SEQ ID NO: 9 having an upstream sequence of GSH1 at the 5 ′ end (5′-TATTGCCCCAGTGTTCCCTCAACAACCTTGGTAGTTGGAGCGCAATTAGCGTATCCTGTACCATACTAATTCTCTTCTGCTCTTAACCCAACTGCACAGA-3 ′) and a primer of SEQ ID NO: 10 having a partial intra-ORF sequence starting from the start codon of GSH1 gene Using ATACCTTCATCCCTTATGTGTTCATTGTACGTCCTAGACTCAAACCACTGCAAAGGCGTGCCCAAAGCTAAGAGTCCCATTGTATATGAGATAGTTGATT-3 ', PCR was performed using the pAUA plasmid (described in the report of Sofyanovich et al.) As a template to obtain a DNA fragment having URA3 sandwiched between ADH1 promoters. PCR conditions were heat denaturation (94 ° C., 10 sec), annealing (60 ° C., 10 sec), extension (72 ° C., 4 min), and 25 cycles. The Y006 strain was transformed with this DNA fragment and spread on an SD plate medium containing no uracil. From the grown transformant, a strain in which the GSH1 promoter was replaced with pADH1-URA3-pADH1 was obtained.

URA3遺伝子が欠損した細胞は５−フルオロオロト酸（5-FOA）耐性を示すため、5-FOAを含有する培地を利用してURA3選択マーカーが除去された株を選抜できる。そこで、GSH1プロモーターがpADH1-URA3-pADH1に置換された株を、ウラシル添加SD培地で一晩培養し、適量を5-FOA平板培地に塗布した。生育したコロニーから、導入された２つのADH1プロモーター間の相同組換えにより、URA3が除去され、GSH1プロモーターがADH1プロモーターに置換された株（AG1 ura3- 株）を取得した。   Since cells lacking the URA3 gene exhibit resistance to 5-fluoroorotic acid (5-FOA), a strain from which the URA3 selection marker has been removed can be selected using a medium containing 5-FOA. Therefore, the strain in which the GSH1 promoter was replaced with pADH1-URA3-pADH1 was cultured overnight in SD medium supplemented with uracil, and an appropriate amount was applied to a 5-FOA plate medium. A strain (AG1 ura3- strain) in which URA3 was removed and the GSH1 promoter was replaced with the ADH1 promoter was obtained from the grown colonies by homologous recombination between the two introduced ADH1 promoters.

（２）γ−グルタミル化合物の蓄積能の強化
酵母のグルタチオン液胞トランスポーターをコードする遺伝子としてYCF1遺伝子が、液胞局在グルタチオン分解酵素をコードする遺伝子としてECM38遺伝子が、それぞれ知られており、これらはγ−グルタミル化合物の蓄積に関与すると考えられる。そこで酵母細胞内でのγ−グルタミルジペプチドの蓄積量を増加させる目的で、AG1株のYCF1遺伝子のプロモーター領域を構成高発現プロモーターであるPGK1遺伝子のプロモーター領域に置換することによりYCF1を高発現し、さらに、ECM38遺伝子を破壊することにより液胞局在グルタチオン分解酵素活性が低下した株（AG1-PY-e株）を作製した。手順を以下に示す。 (2) Enhancement of accumulation ability of γ-glutamyl compounds YCF1 gene is known as a gene encoding yeast glutathione vacuolar transporter, and ECM38 gene is known as a gene encoding vacuolar localized glutathione degrading enzyme. These are considered to be involved in the accumulation of γ-glutamyl compounds. Therefore, for the purpose of increasing the accumulation amount of γ-glutamyl dipeptide in yeast cells, the YCF1 gene promoter region of the AG1 strain is replaced with the promoter region of the PGK1 gene, which is a high expression promoter, and YCF1 is highly expressed. Furthermore, a strain (AG1-PY-e strain) in which the vacuolar localized glutathione degrading enzyme activity was reduced by disrupting the ECM38 gene was prepared. The procedure is shown below.

5'端にYCF1の上流配列を有する配列番号１１（5'- GTTTCTTTATGATAATACAAAAATATGTAACTCCTGGTGTGATGCTTGGGCGGTGGAAGGTTACGGCTTAGTAATTACGATCTTAACCCAACTGCACAGA-3'）のプライマー、及びYCF1遺伝子の開始コドンから始まる一部のORF内配列を有する配列番号１２のプライマー（5'- TCACCGTAAAAGGATATAGGTCCAAACCCTTCAGGAGATCTACAGAGCTTGCAGGCCCATGAAACAAGATTACCAGCCATTGTTTTATATTTGTTGTAAA-3'）を用い、pPUP（前述のSofyanovichらの報告に記載）プラスミドを鋳型にPCRを行い、PGK1プロモーターに挟まれたURA3を有するDNA断片を得た。PCRの条件は、熱変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、
伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。このDNA断片でAG1 ura3- 株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD平板培地に塗布し得られる形質転換体から、YCF1プロモーターがpPGK1-URA3-pPGK1に置換された株を取得した。 A primer of SEQ ID NO: 11 (5'-GTTTCTTTATGATAATACAAAAATATGTAACTCCTGGTGTGATGCTTGGGCGGTGGAAGGTTACGGCTTAGTAATTACGATCTTAACCCAACTGCACAGA-3 ') having an upstream sequence of YCF1 at the 5' end, and a primer of SEQ ID NO: 12 having a partial intra-ORF sequence starting from the start codon of the YCF1 gene Using TCACCGTAAAAGGATATAGGTCCAAACCCTTCAGGAGATCTACAGAGCTTGCAGGCCCATGAAACAAGATTACCAGCCATTGTTTTATATTTGTTGTAAA-3 ′), PCR was performed using the plasmid pPUP (described in the aforementioned report of Sofyanovich et al.) To obtain a DNA fragment having URA3 sandwiched between PGK1 promoters. PCR conditions are heat denaturation (94 ° C, 10 sec), annealing (60 ° C, 10 sec),
Extension (72 ° C, 4 min), 25 cycles. The AG1 ura3- strain was transformed with this DNA fragment, and a strain in which the YCF1 promoter was replaced with pPGK1-URA3-pPGK1 was obtained from a transformant obtained by applying to an SD plate medium containing no uracil.

YCF1プロモーターがpPGK1-URA3-pPGK1に置換された株を、ウラシル添加SD培地で一晩培養し、適量を5-FOA平板培地に塗布した。生育したコロニーから、導入された２つのPGK1プロモーター間の相同組換えにより、URA3が除去され、YCF1プロモーターがPGK1プロモーターに置換された株（AG1-PY ura3- 株）を取得した。   The strain in which the YCF1 promoter was replaced with pPGK1-URA3-pPGK1 was cultured overnight in SD medium supplemented with uracil, and an appropriate amount was applied to a 5-FOA plate medium. From the grown colonies, a strain (AG1-PY ura3- strain) was obtained in which URA3 was removed and the YCF1 promoter was replaced with the PGK1 promoter by homologous recombination between the two introduced PGK1 promoters.

次に、ECM38の開始コドンより上流80塩基を付加した配列番号１３のプライマー（5'- AAAGCTAACGCAGATTCAAGTGGGGCGTTGTCAGGCACACAAAAAGACAAGACAAAAAGTAGCGTACTAGACTTACAGTTGTTCATCATCTCATGGATCT-3'）及びECM38の終止コドンより下流80塩基を付加した配列番号１４のプライマー（5'- TTATATACCACAGAAGCAGGCTCCCTACATTACGTACTATTATCTTGAACTATATTACAGTACCATTCTTACCCCACATCAGATTCCCGGGTAATAACTG-3'）を用い、S288C株のURA3遺伝子を増幅した。PCRの条件は、熱変性（94℃、10 sec）、アニーリング（50℃、10 sec）、伸張（72℃、2 min）、25 cycleとした。得られたDNA断片でAG1-PY ura3- 株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD培地に塗布した。生育した形質転換体からECM38遺伝子を欠損したAG1-PY ecm38D株（以下、AG1-PY-e株）を得た。   Next, the primer of SEQ ID NO: 13 added with 80 bases upstream from the start codon of ECM38 (5'-AAAGTATAGCAGATTCAAGTGGGGCGTTGTCAGGCACACAAAAAGACAAGACAAAAAGTAGCGTACTAGACTTACAGTTGTTCATCATCTCATGGATCT-3 ') the primer of SEQ ID NO: 14 with TACTC (TACTC -3 ′) was used to amplify the URA3 gene of S288C strain. PCR conditions were heat denaturation (94 ° C., 10 sec), annealing (50 ° C., 10 sec), extension (72 ° C., 2 min), and 25 cycles. The obtained DNA fragment was transformed into AG1-PY ura3- strain and applied to SD medium not containing uracil. The AG1-PY ecm38D strain lacking the ECM38 gene (hereinafter referred to as AG1-PY-e strain) was obtained from the grown transformant.

AG1-Ye株作製時にECM38ローカスに導入したURA3を削除するため、まず、Y006株のゲノムDNAを鋳型に、ECM38の上流約１kbを配列番号１５のプライマー（5'-GGAATATCCTGGTGAGCCAT-3'）と配列番号１６のプライマー（5'-AACTGTAAGTCTAGTACGCT-3'）で増幅した。さらに、ECM38の下流約1kbを配列番号１７のプライマー（5'-ACTAGACTTACAGTTGATGTGGGGTAAGAATGGTA-3'）と配列番号１８のプライマー（5'-ATTGAATGGAAGAAGGGTCT-3'）で増幅した。続いて、これら２つのDNA断片を鋳型に、配列番号１５のプライマーと配列番号１８のプライマーで融合PCRを行い、得られた約2kbのDNA断片でAG1-Yeを形質転換し、5-FOA培地でECM38ローカスからURA3が除去された株、AG1-Ye URA3^-を選択した。 In order to delete URA3 introduced into ECM38 locus at the time of AG1-Ye strain preparation, first of all, about 1 kb upstream of ECM38 was sequenced with the primer (5'-GGAATATCCTGGTGAGCCAT-3 ') using the genomic DNA of Y006 strain as a template. Amplification was performed using the primer No. 16 (5′-AACTGTAAGTCTAGTACGCT-3 ′). Further, about 1 kb downstream of ECM38 was amplified with the primer of SEQ ID NO: 17 (5′-ACTAGACTTACAGTTGATGTGGGGTAAGAATGGTA-3 ′) and the primer of SEQ ID NO: 18 (5′-ATTGAATGGAAGAAGGGTCT-3 ′). Subsequently, using these two DNA fragments as templates, fusion PCR was performed with the primer of SEQ ID NO: 15 and the primer of SEQ ID NO: 18, and AG1-Ye was transformed with the obtained DNA fragment of about 2 kb, and 5-FOA medium was obtained. in ECM38 strain URA3 from locus it has been removed, AG1-Ye URA3 ^- were selected.

（３）Abu生成能の強化
酵母細胞内でのAbu生成能を強化する目的で、ThrからのAbu生成に関与するBAT1、CHA1、およびILV1の高発現を試みた。 (3) Enhancement of Abu production ability For the purpose of enhancing Abu production ability in yeast cells, high expression of BAT1, CHA1, and ILV1 involved in Abu production from Thr was attempted.

（３−１）TDH3プロモーターへのプロモーター置換プラスミドpTUTの構築
Sofyanovichらの報告を参考に、ターゲット遺伝子のプロモーター領域を高発現のTDH3遺伝子のプロモーターに置換するためのプラスミドpTUTを下記のようにして作成した。 (3-1) Construction of promoter replacement plasmid pTUT for TDH3 promoter
With reference to the report of Sofyanovich et al., A plasmid pTUT for replacing the promoter region of the target gene with the promoter of the highly expressed TDH3 gene was prepared as follows.

pUC19-URA3（前述のSofyanovichらの報告に記載）のAatII部位に、Y006株のゲノムDNAを鋳型に、配列番号１９のプライマー（5'- ATAGACGTCACGTAAGGGAGTTAGAATCA-3'）と配列番号２０のプライマー（5'- ATAGACGTCTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3'）で増幅したTDH3プロモーターをクローン化し、pUC19-URA3-TDH3pを作製した。さらにpUC19-URA3-TDH3pのPstI部位に、Y006株のゲノムDNAを鋳型に、配列番号２１のプライマー（5'-ATACTGCAGACGTAAGGGAGTTAGAATCA-3'）と配列番号２２のプライマー（5'-ATACTGCAGGAAACTAAGTTCTTGGTGTT-3'）で増幅したTDH3プロモーターをクローン化し、pTUT（pUC19-TDH3p-URA3-TDH3p）を作製した。   pUC19-URA3 (described in the above-mentioned report of Sofyanovich et al.), the primer of SEQ ID NO: 19 (5'-ATAGACGTCACGTAAGGGAGTTAGAATCA-3 ') and the primer of SEQ ID NO: 20 (5' -The TDH3 promoter amplified by ATAGACGTCTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3 ') was cloned to prepare pUC19-URA3-TDH3p. Furthermore, at the PstI site of pUC19-URA3-TDH3p, using the genomic DNA of the Y006 strain as a template, the primer of SEQ ID NO: 21 (5'-ATACTGCAGACGTAAGGGAGTTAGAATCA-3 ') and the primer of SEQ ID NO: 22 (5'-ATACTGCAGGAAACTAAGTTCTTGGTGTT-3') The amplified TDH3 promoter was cloned to prepare pTUT (pUC19-TDH3p-URA3-TDH3p).

（３−２）Abu生成経路の強化
まず、染色体上のBAT1遺伝子のプロモーター領域を、以下のようにしてTDH3遺伝子のプロモーター領域に置換した。 (3-2) Enhancement of Abu production pathway First, the promoter region of the BAT1 gene on the chromosome was replaced with the promoter region of the TDH3 gene as follows.

5’端にBAT1の上流配列を有する配列番号配列番号２３ののプライマー（5'- GCCAGGCGG
TTGATACTTTGTGCAGATTTCATACCGGCTGTCGCTATTATTACTGATGAATTGGCTCTCTTTTTGTTTAATCTTAACCCAACTGCACAGA-3'）、及びBAT1遺伝子の開始コドンから始まる一部のORF内配列を有する配列番号２４のプライマー（5'- TTGGATGCATCTAATGGGGCACCAGTAGCGAGTGTTCTGATGGAGAATTTCCCCAACTTCAAGGAATGTCTCTGCAACATTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3'）を用い、pTUTを鋳型にPCRを行い（熱変性 94℃, 10 sec、アニーリング 60℃, 10 sec、伸張 72℃, 4 min）、TDH3遺伝子のプロモーターに挟まれたURA3を有するDNA断片を調製した。このDNA断片でAG1-Ye URA3^-株を形質転換し、SD平板培地に塗布し得られる形質転換体から、BAT1プロモーターがpTDH3-URA3-pTDH3に置換された株を取得した。このようにして得られた株をウラシル添加SD培地で一晩培養し、適量を5-FOA平板培地に塗布した。生育したコロニーから、導入されたTDH3プロモーター間の相同組換えにより、URA3が除去され、BAT1プロモーターがTDH3プロモーターに置換された株AG1-BYe URA3^-を取得した。 The primer of SEQ ID NO: 23 having an upstream sequence of BAT1 at the 5 ′ end (5′-GCCAGGCGG
TTGATACTTTGTGCAGATTTCATACCGGCTGTCGCTATTATTACTGATGAATTGGCTCTCTTTTTGTTTAATCTTAACCCAACTGCACAGA-3 ') TT1 template (GT'TT) DNA fragment having URA3 sandwiched between promoters of TDH3 gene was prepared at a temperature of 10 ° C. for 10 seconds, annealing at 60 ° C. for 10 seconds, and an extension of 72 ° C. for 4 minutes. AG1-Ye URA3 ⁻ strain was transformed with this DNA fragment, and a strain in which the BAT1 promoter was replaced with pTDH3-URA3-pTDH3 was obtained from a transformant obtained by applying to an SD plate medium. The strain thus obtained was cultured overnight in SD medium supplemented with uracil, and an appropriate amount was applied to a 5-FOA plate medium. From the grown colonies, the homologous recombination between TDH3 promoter was introduced, URA3 is removed, BAT1 promoter strain AG1-BYE substituted with TDH3 promoter URA3 ^- were obtained.

次に、得られた株の染色体上のCHA1遺伝子のプロモーター領域を、以下のようにしてTDH3遺伝子のプロモーター領域に置換した。   Next, the promoter region of the CHA1 gene on the chromosome of the obtained strain was replaced with the promoter region of the TDH3 gene as follows.

5’端にCHA1の上流配列を有する配列番号２５のプライマー（5'- GAGTACTAATCACCGCGAACGGAAACTAATGAGTCCTCTGCGCGGAGACATGATTCCGCATGGGCGGCTCCTGTTAAGCCTCTTAACCCAACTGCACAGA-3'）、及びCHA1遺伝子の開始コドンから始まる一部のORF内配列を有する配列番号２６のプライマー（5' TATTTCAAGAAAAATTGTGCAGAAGCCTTTCCGGGGAAGAATTGACGTAATAATGGTGTTTTATTGTAGACTATCGACATTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3'）を用い、pTUTを鋳型にPCRを行い（熱変性 94℃, 10 sec、アニーリング 60℃, 10 sec、伸張 72℃, 4 min）、TDH3プロモーターに挟まれたURA3を有するDNA断片を調製した。このDNA断片でAG1-BYe URA3^-株を形質転換し、SD平板培地に塗布し得られた形質転換体から、CHA1プロモーターがpTDH3-URA3-pTDH3に置換された株を取得した。更に、BAT1プロモーターの置換の場合と同様の操作を行い、URA3が除去され、CHA1プロモーターがTDH3プロモーターに置換された株AG1-BCYe URA3^-を取得した。 Primer of SEQ ID NO: 25 having an upstream sequence of CHA1 at the 5 ′ end (5′-GAGTACTAATCACCGCGAACGGAAACTAATGAGTCCTCTGCGCGGAGACATGATTCCGCATGGGCGGCTCCTGTTAAGCCTCTTAACCCAACTGCACAGA-3GA) TT -3 '), PCR is performed using pTUT as a template (thermal denaturation 94 ° C, 10 sec, annealing 60 ° C, 10 sec, extension 72 ° C, 4 min), and a DNA fragment with URA3 sandwiched between TDH3 promoters is obtained. Prepared. The AG1-BYe URA3 ^- strain was transformed with this DNA fragment, and a strain in which the CHA1 promoter was replaced with pTDH3-URA3-pTDH3 was obtained from the transformant obtained by spreading on an SD plate medium. Further, the same operation as in the case of replacement of the BAT1 promoter, URA3 is removed, CHA 1 promoter strain AG1-BCYE substituted with TDH3 promoter URA3 ^- were obtained.

次に、得られた株の染色体上のILV1遺伝子のプロモーター領域を、以下のようにしてTDH3遺伝子のプロモーター領域に置換した。   Next, the promoter region of the ILV1 gene on the chromosome of the obtained strain was replaced with the promoter region of the TDH3 gene as follows.

5’端にILV1の上流配列を有する配列番号２７のプライマー（5'- CTCTTTATTGCATATTATCTCTGCTATTTTGTGACGTTCAATTTTAATTGACGCGAAAAAGAAAAAATAAGAAGGGCAAATCTTAACCCAACTGCACAGA-3'）、及びILV1遺伝子の開始コドンから始まる一部のORF内配列を有する配列番号２８のプライマー（5'- AGGTTCAATCCAGACACTTTGGACTGTTTACCTTGCCGAACAACCGTACATAATGGTTGCTTTAGTAGAGTAGCTGACATTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3'）を用い、pTUTを鋳型にPCRを行い（熱変性
94℃, 10 sec、アニーリング 60℃, 10 sec、伸張 72℃, 4 min）、TDH3プロモーターに挟まれたURA3を有するDNA断片を調製した。このDNA断片でAG1-BCYe URA3^-株を形質転換し、SD平板培地に塗布し得られた形質転換体から、ILV1プロモーターがpTDH3-URA3-pTDH3に置換された株を取得した。更に、BAT1プロモーター、CHA1プロモーターの置換の場合と同様の操作を行い、URA3が除去され、ILV1プロモーターがTDH3プロモーターに置換された株AG1-BCIYe URA3^-を取得した。 The primer of SEQ ID NO: 27 having an upstream sequence of ILV1 at the 5 'end (5'-CTCTTTATTGCATATTATCTCTGCTATTTTGTGACGTTCAATTTTAATTGACGCGAAAAAGAAAAAATAAGAAGGGCAAATCTTAACCCAACTGCACAGA-3') Use AGGTTCAATCCAGACACTTTGGACTGTTTACCTTGCCGAACAACCGTACATAATGGTTGCTTTAGTAGAGTAGCTGACATTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3 ') to perform PCR using pTUT as a template (thermal denaturation)
94 ° C., 10 sec, annealing 60 ° C., 10 sec, extension 72 ° C., 4 min), and a DNA fragment having URA3 sandwiched between TDH3 promoters was prepared. The AG1-BCYe URA3 ^- strain was transformed with this DNA fragment, and a strain in which the ILV1 promoter was replaced with pTDH3-URA3-pTDH3 was obtained from the transformant obtained by spreading on an SD plate medium. Furthermore, BAT1 promoter, the same operation as in the case of replacement of the CHA1 promoter, URA3 is removed, ILV1 promoter strain AG1-BCIYe substituted with TDH3 promoter URA3 ^- were obtained.

このようにして得られた菌株のBAT1遺伝子の発現量をさらに増加させる目的で、Y006株作成時に取り除かれた染色体上URA3 ORF領域に、以下の手順でBAT1遺伝子を導入した。   In order to further increase the expression level of the BAT1 gene in the strain thus obtained, the BAT1 gene was introduced into the URA3 ORF region on the chromosome that was removed when the Y006 strain was prepared by the following procedure.

まず、AG1-BCIYe URA3^-株に、野生型株であるS288C株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号２９のプライマー（5'- AGTTACAGCAATGAAAGAGCAGAGCGAGAG-3'）及び配列番号３０のプライマー（5'- ATTACTGCTGCTGTTCCAGCCCATATCCAA-3'）を用いて増幅したDNAを導入することにより、URA3が野生型に復元したAG1-BCIYe株を得た。 First, the AG1-BCIYe URA3 ⁻ strain was used as a template with the genomic DNA of the wild-type S288C strain as a template, the primer of SEQ ID NO: 29 (5′-AGTTACAGCAATGAAAGAGCAGAGCGAGAG-3 ′) and the primer of SEQ ID NO: 30 (5′-ATTACTGCTGCTGTTCCAGCCCATATCCAA- The AG1-BCIYe strain in which URA3 was restored to the wild type was obtained by introducing the DNA amplified using 3 ′).

次に、5’端にURA3の上流配列を有する配列番号３１のプライマー（5'- GTGTTGAAGAAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTGCAGGAAACGAAGATAAATCCTGTTATTATCCTTAAAAGT-3'）、及び5’端にURA3の下流配列を有する配列番号３２のプライマー（5'- CCGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAGCTCTAATTTGTGAGTTTAGTATACATGCATTTACTTATAATACAGTTTTATACTGTACTTGCACCTCTT-3'）を用い、AG1-BYe URA3^-株ゲノムを鋳型にPCRを行い（熱変性 98℃, 10 sec、アニーリング 50℃, 30 sec、伸張 68℃, 4 min）、TDH3-BAT1領域を持つDNA断片を調製した。このDNA断片でAG1-BCIYe株を形質転換し、FOA平板培地に塗布し得られる形質転換体から、URA3がTDH3p-BAT1で置換された株AG1-BCIYe ura3::TDH3p-BAT1を取得した。 Next, the primer of SEQ ID NO: 31 having an upstream sequence of URA3 at the 5 'end (5'-GTGTTGAAGAAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTGCAGGAAACGAAGATAAATCCTGTTATTATCCTTAAAAGT-3 TAG 3 ') with, AG1-BYe URA3 ^- strains genome was subjected to PCR as a template (thermal denaturation 98 ℃, 10 sec, annealing 50 ℃, 30 sec, extension 68 ℃, 4 min), DNA having the TDH3-BAT1 region Fragments were prepared. The AG1-BCIYe strain was transformed with this DNA fragment, and a strain AG1-BCIYe ura3 :: TDH3p-BAT1 in which URA3 was replaced with TDH3p-BAT1 was obtained from a transformant obtained by applying to a FOA plate medium.

最後に、前述の菌株のGLY1遺伝子を破壊するために、以下の操作を行った。配列番号３３のプライマー（5'- CAGCACGTGACCCACGCTTG-3'）および配列番号３４のプライマー（5'-
ATCCTGTGAAGAAACCCTGC-3'）を用い、YEAST KNOCK OUT STRAIN COLLECTION (フナコシ、YCS1056)のGLY1破壊株ゲノムを鋳型に、カナマイシン耐性遺伝子カセットKanMXに置換されたGLY1を含む領域を増幅した。PCRの条件は、熱変性 94℃, 10 sec、アニーリング 60℃,
10 sec、伸張 72℃, 3 min、28 cycleであった。次に、エタノール沈殿によってDNA断片を精製した後、AG1-BCIYe ura3::TDH3p-BAT1株に形質転換し、G418を添加したYPD平板培地に菌体を塗布した。得られた形質転換体から、GLY1を欠損したAG1-BCIYeg ura3::TDH3p-BAT1株を取得した。 Finally, in order to destroy the GLY1 gene of the aforementioned strain, the following operation was performed. The primer of SEQ ID NO: 33 (5'-CAGCACGTGACCCACGCTTG-3 ') and the primer of SEQ ID NO: 34 (5'-
ATCCTGTGAAGAAACCCTGC-3 ′) was used to amplify a region containing GLY1 substituted with the kanamycin resistance gene cassette KanMX, using the GLY1-disrupted genome of YEAST KNOCK OUT STRAIN COLLECTION (Funakoshi, YCS1056) as a template. PCR conditions are heat denaturation 94 ℃, 10 sec, annealing 60 ℃,
10 sec, elongation 72 ° C, 3 min, 28 cycles. Next, after the DNA fragment was purified by ethanol precipitation, it was transformed into AG1-BCIYeura3 :: TDH3p-BAT1 strain, and the cells were applied to a YPD plate medium supplemented with G418. From the transformant obtained, AG1-BCIYegura3 :: TDH3p-BAT1 strain lacking GLY1 was obtained.

このようにして取得したAG1-BCIYe ura3::TDH3p-BAT1株及び同株のGLY1遺伝子欠損株であるAG1-BCIYeg ura3::TDH3p-BAT1株はウラシル要求性であるため、ウラシル要求性を相補するURA3遺伝子を有する酵母−E.coliシャトルベクターpYES2-ADH1pを導入した。同シャトルベクターの構築手順は下記の通りである。プラスミドpYES2（インビトロジェン社）に酵母の構成発現プロモーターであるADH1pを導入した。具体的には、S288C株より調製したゲノムを鋳型として、配列番号３５のプライマー（5'- ATAACCGGTGGGTGTACAATATGGACTTC-3'）及び配列番号３６のプライマー（5'- ATAAAGCTTTGTATATGAGATAGTTGATT-3'）を用いたPCRによりADH1のプロモーター領域を増幅した（熱変性 94℃, 10 sec、アニーリング50℃, 10 sec、伸張 72℃, 1 min、25 cycle）。得られたDNA断片をエタノール沈殿により精製後、制限酵素HindIII及びAgeIで消化し、プラスミドpYES2のHindIII-AgeI部位に挿入し、pYES2-ADH1pを得た。   The AG1-BCIYe ura3 :: TDH3p-BAT1 strain obtained in this way and the AG1-BCIYeg ura3 :: TDH3p-BAT1 strain, which is a GLY1 gene-deficient strain of the same strain, are uracil-requiring, and thus complement uracil-requiring requirements. A yeast-E. Coli shuttle vector pYES2-ADH1p having the URA3 gene was introduced. The procedure for constructing the shuttle vector is as follows. ADH1p, a constitutive expression promoter for yeast, was introduced into plasmid pYES2 (Invitrogen). Specifically, using a genome prepared from the S288C strain as a template, PCR was performed using the primer of SEQ ID NO: 35 (5′-ATAACCGGTGGGTGTACAATATGGACTTC-3 ′) and the primer of SEQ ID NO: 36 (5′-ATAAAGCTTTGTATATGAGATAGTTGATT-3 ′). Was amplified (thermal denaturation 94 ° C., 10 sec, annealing 50 ° C., 10 sec, extension 72 ° C., 1 min, 25 cycles). The obtained DNA fragment was purified by ethanol precipitation, digested with restriction enzymes HindIII and AgeI, and inserted into the HindIII-AgeI site of plasmid pYES2 to obtain pYES2-ADH1p.

このようにして取得したAG1-BCIYe ura3::TDH3p-BAT1／pYES2-ADH1p株を「コントロール株」と命名し、同株のGLY1遺伝子欠損株であるAG1-BCIYeg ura3::TDH3p-BAT／pYES2-ADH1p株を「△GLY1株」と命名し、以下の解析に用いた。   The AG1-BCIYe ura3 :: TDH3p-BAT1 / pYES2-ADH1p strain obtained in this way is named “control strain” and AG1-BCIYeg ura3 :: TDH3p-BAT / pYES2- is a GLY1 gene-deficient strain of the same strain. The ADH1p strain was named “ΔGLY1 strain” and used for the following analysis.

実施例２．グリシン生成能の弱化効果の検証
実施例１で構築したコントロール株及び△GLY1株を各々SD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃、120rpmで24時間振とう培養した。 Example 2 Verification of the effect of weakening glycine-producing ability The control strain and ΔGLY1 strain constructed in Example 1 were each inoculated into SD medium (50 ml in a 500 ml Sakaguchi flask) for 1 ase and cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm for 24 hours. did.

＜SD培地組成＞
グルコース ２％
Nitrogen Base １倍濃度
（10倍濃度Nitrogen Baseは、1.7gのBacto Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and
Ammonium Sulfate (Difco社)と5gの硫酸アンモニウムを混合したものを100mlの滅菌水に溶解し、pHを5.2程度に調整し、フィルター濾過滅菌したもの） <SD medium composition>
Glucose 2%
Nitrogen Base 1x Concentration (10x Nitrogen Base is 1.7g Bacto Yeast Nitrogen Base w / o Amino Acids and
Ammonium Sulfate (Difco) mixed with 5 g of ammonium sulfate dissolved in 100 ml of sterilized water, pH adjusted to about 5.2, and filter sterilized by filtration)

得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD600が0.02になるように、SD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml）に植菌し、30℃、120rpmで約24時間振とう培養した。なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。OD600が1.1になるタ
イミングで培養液をサンプリングした。得られた培養液から、40 ODunits（OD600が1である培養液1mlに含まれる菌体を1 ODunitと定義する。）分の菌体を遠心分離により採取した。上清は可能な限り取り除き、残った菌体を45mlのmilliQ水に懸濁した。再度遠心分離により菌体を集菌し、45mlのmilliQ水に再懸濁した。この操作を累計3回繰り返すことにより、菌体から培地分を完全に除去した。得られた洗浄菌体は、約1.5mlのmilliQ水に懸濁し、70℃で10分間加熱した。この工程にて菌体内に含まれるエキス分を抽出した。次に、遠心操作によりエキス分を含む画分と菌体残渣を分離した。 The absorbance of the obtained culture solution was measured, and inoculated into SD medium (50 ml in a 500 ml Sakaguchi flask) so that the initial OD600 was 0.02, and cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm for about 24 hours. The absorbance was measured using DU640 SPECTROPHTOMETER manufactured by BECKMAN COULTER. The culture solution was sampled at a timing when OD600 was 1.1. From the obtained culture solution, 40 ODunits (bacteria contained in 1 ml of culture solution having an OD600 of 1 is defined as 1 ODunit) was collected by centrifugation. The supernatant was removed as much as possible, and the remaining cells were suspended in 45 ml of milliQ water. The cells were collected again by centrifugation and resuspended in 45 ml of milliQ water. By repeating this operation three times in total, the medium was completely removed from the cells. The obtained washed cells were suspended in about 1.5 ml of milliQ water and heated at 70 ° C. for 10 minutes. In this step, the extract contained in the cells was extracted. Next, the fraction containing the extract and the bacterial cell residue were separated by centrifugation.

エキス分を含む画分から10kDaの遠心濾過膜（MILLIPORE社：Amicon Ultra - 0.5mL 10K（カタログ番号UFC501096））を用いて細胞デブリを除去し、得られた画分を解析サンプルとした。   Cell debris was removed from the fraction containing the extract using a 10 kDa centrifugal filtration membrane (MILLIPORE: Amicon Ultra-0.5 mL 10K (catalog number UFC501096)), and the obtained fraction was used as an analysis sample.

サンプル中のγ-Glu-Cys及びGSH含量は、公知の方法（Nishiuhi et al., An improved method to determine gamma-glutamylcysteine content in foodstuffs using 4-(aminosulfonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole, Food Sci. Technol. Res., 17, 573-577 (2011)）によりサンプル中の当該化合物をABD-F試薬で誘導体化し、HPLCにて測定した。   The γ-Glu-Cys and GSH content in the sample was determined by a known method (Nishiuhi et al., An improved method to determine gamma-glutamylcysteine content in foodstuffs using 4- (aminosulfonyl) -7-fluoro-2,1,3- benzoxadiazole, Food Sci. Technol. Res., 17, 573-577 (2011)), the compound in the sample was derivatized with an ABD-F reagent and measured by HPLC.

また、サンプル中のγ-Glu-Abu及びγ-Glu-Abu-Gly含量は、公知の方法（WO2011/129462の実施例１）に準じて、サンプル中の当該化合物をAQC試薬にて誘導体化し、LC-MS/MSにより測定した。WO2011/129462の実施例１からの変更点は、下記の通りである。
変更点１：サンプルの誘導体化時に使用する５μMの内部標準物質として、５μMの“3-methyl-His-d2（シグマ社、安定同位体で標識されている。）”と５μMの“Gly-d2（シグマ社、安定同位体で標識されている。）”からなる標準液を用いた。
変更点２：下記表１に記載の質量を質量分析計での選択イオンに用いた。
変更点３：定量を行うための内部標準物質として、γ-Glu-Abu又はγ-Glu-Abu-Glyの誘導体化物の測定にGly-d2の誘導体化物を用いた。なお、γ-Glu-Abuの定量の際に、極まれにサンプルによって夾雑ピークが見られた場合は、第二のマスアナライザーでの選択イオンを、145.2、或いは、104.1に変更して定量した。 The γ-Glu-Abu and γ-Glu-Abu-Gly contents in the sample were derivatized with the AQC reagent in accordance with a known method (Example 1 of WO2011 / 129462) Measured by LC-MS / MS. The changes from Example 1 of WO2011 / 129462 are as follows.
Change 1: 5 μM “3-methyl-His-d2 (Sigma, labeled with a stable isotope)” and 5 μM “Gly-d2” are used as a 5 μM internal standard for derivatization of samples. (SIGMA, labeled with a stable isotope.) ”Was used.
Change point 2: The mass described in Table 1 below was used for selected ions in the mass spectrometer.
Change point 3: As an internal standard substance for quantification, a derivatized product of Gly-d2 was used for measurement of a derivatized product of γ-Glu-Abu or γ-Glu-Abu-Gly. When γ-Glu-Abu was quantified, if a rare peak was observed in the sample, the selected ion in the second mass analyzer was changed to 145.2 or 104.1 for quantification.

また、乾燥菌体重量は、洗浄菌体を4時間、104℃で乾燥させることにより測定した。このようにして測定した一定量の培養液に含まれるγ-Glu-Cys、GSH、γ-Glu-Abu、及びγ-Glu-Abu-Gly及び乾燥菌体重量から、乾燥菌体重量あたりに含まれるγ-Glu-Cys、GSH、γ-Glu-Abu、及びγ-Glu-Abu-Glyの含量を算出した。   The dry cell weight was measured by drying the washed cell at 104 ° C. for 4 hours. From the γ-Glu-Cys, GSH, γ-Glu-Abu, and γ-Glu-Abu-Gly and the dry cell weight contained in a certain amount of the culture solution measured in this way, it is included per dry cell weight. The contents of γ-Glu-Cys, GSH, γ-Glu-Abu, and γ-Glu-Abu-Gly were calculated.

その結果、表２、表３に示すように△GLY1株ではコントロール株に比べてトリペプチドであるGSH及びγ-Glu-Abu-Glyの含量が減少し、代わりにジペプチドであるγ-Glu-Cys及びγ-Glu-Abuの含量が増加していた。このように細胞内のグリシン生成酵素活性を弱化させることにより、酵母細胞内のγ−グルタミルジペプチド含量を高められることが判明した。また、本実施例においては、本培養のOD600が1.1になるタイミングはいずれの菌株で
も培養約25時間目であり、γ−グルタミルジペプチド含量の増大による生育の過度の悪化は認められなかった。 As a result, as shown in Tables 2 and 3, the content of tripeptides GSH and γ-Glu-Abu-Gly decreased in the ΔGLY1 strain compared to the control strain, and instead the dipeptide γ-Glu-Cys. And the content of γ-Glu-Abu was increased. Thus, it was found that the content of γ-glutamyldipeptide in yeast cells can be increased by weakening the intracellular glycine synthase activity. Moreover, in this example, the timing at which the OD600 of the main culture becomes 1.1 is about 25 hours in any strain, and no excessive deterioration of growth due to an increase in the content of γ-glutamyldipeptide was observed.

なお、抽出されたエキス分中に含まれる成分の乾燥重量と取り除かれた細胞デブリの乾燥重量の比率は、エキス分：細胞デブリ＝約１：３である。よって、△GLY1株から得られたエキス分（いわゆる酵母エキス）には、乾燥重量あたり約０．７〜０．８％（7.94μmol/g-DCW × 232.3（Ｍｗ）× 約 4 ≒ 0.74 % 乾燥重量）のγ-Glu-Abuが含まれる。また、同酵母エキスには、乾燥重量あたり約３〜４％（0.84 % × 約 4 ≒ 3.4 % 乾燥重量）のγ-Glu-Cysが含まれる。   The ratio of the dry weight of the components contained in the extracted extract and the dry weight of the removed cell debris is extract: cell debris = about 1: 3. Therefore, about 0.7-0.8% (7.94 μmol / g-DCW x 232.3 (Mw) x about 4 ≒ 0.74% dry) per dry weight of the extract obtained from △ GLY1 strain (so-called yeast extract) Weight) of γ-Glu-Abu. The yeast extract contains about 3-4% (0.84% × about 4≈3.4% dry weight) of γ-Glu-Cys per dry weight.

配列表の説明
配列番号１：サッカロミセス・セレビシエのGLY1の塩基配列
配列番号２：サッカロミセス・セレビシエのGly1pのアミノ酸配列
配列番号３：サッカロミセス・セレビシエのSHM1の塩基配列
配列番号４：サッカロミセス・セレビシエのShm1pのアミノ酸配列
配列番号５：サッカロミセス・セレビシエのSHM2の塩基配列
配列番号６：サッカロミセス・セレビシエのShm2pのアミノ酸配列
配列番号７：サッカロミセス・セレビシエのGSH1の塩基配列
配列番号８：サッカロミセス・セレビシエのGsh1pのアミノ酸配列
配列番号９、１０：GSH1のプロモーター置換に用いるプライマー
配列番号１１、１２：YCF1のプロモーター置換に用いるプライマー
配列番号１３、１４：ECM38破壊用プライマー
配列番号１５〜１８：ECM38破壊時に挿入されたURA3除去用プライマー
配列番号１９〜２２：TDH3プロモーターへのプロモーター置換用プラスミドpTUT構築用プライマー
配列番号２３、２４：BAT1プロモーター置換に用いるプライマー
配列番号２５、２６：CHA1プロモーター置換に用いるプライマー
配列番号２７、２８：ILV1プロモーター置換に用いるプライマー
配列番号２９、３０：URA3増幅用プライマー
配列番号３１、３２：URA3ローカスにTDH3p-BAT1を導入するために用いるプライマー
配列番号３３、３４：GLY1破壊株ゲノムを鋳型としたGLY1破壊用プライマー
配列番号３５、３６：プラスミドpYES2-ADH1p構築に用いるプライマー Description of the Sequence Listing SEQ ID NO: 1: SLY of Saccharomyces cerevisiae GLY1 SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of Gly1p of Saccharomyces cerevisiae SEQ ID NO: 3: Base sequence of SHM of Saccharomyces cerevisiae SEQ ID NO: 4: Shm1p of Saccharomyces cerevisiae Amino acid sequence SEQ ID NO: 5: Saccharomyces cerevisiae SHM2 nucleotide sequence SEQ ID NO: 6: Saccharomyces cerevisiae Shm2p amino acid sequence SEQ ID NO: 7: Saccharomyces cerevisiae GSH1 nucleotide sequence SEQ ID NO: 8: Saccharomyces cerevisiae Gsh1p amino acid sequence SEQ ID NO: 9, 10: Primer sequence number 11 used for GSH1 promoter substitution, 12: Primer sequence number 13 used for YCF1 promoter substitution, SEQ ID NO: 13: Primer for ECM38 destruction SEQ ID NO: 15-18: Removal of URA3 inserted at ECM38 destruction Primer SEQ ID NOs: 19 to 22: Primer for constructing a plasmid pTUT for replacing the promoter into TDH3 promoter SEQ ID NO: 23, 24: Primer used for replacing BAT1 promoter SEQ ID NO: 25, 26: Primer used for replacing CHA1 promoter SEQ ID NO: 27, 28: ILV1 promoter Primer sequence numbers 29 and 30 used for substitutions: Primer sequence numbers 31 and 32 for URA3 amplification, 32: Primer sequence numbers 33 and 34 used for introducing TDH3p-BAT1 into URA3 locus, GLY1 disruption using GLY1 disrupted strain genome as a template Primer SEQ ID NO: 35, 36: Primer used for construction of plasmid pYES2-ADH1p

Claims (10)

γ−グルタミルジペプチド合成酵素の活性が増大し、かつグリシン生成酵素の活性が低下するよう改変された酵母。   Yeast modified so that the activity of γ-glutamyl dipeptide synthase is increased and the activity of glycine-producing enzyme is decreased. γ−グルタミルジペプチド合成酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めることにより、または該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、γ−グルタミルジペプチド合成酵素の活性が増大するように改変された、請求項１に記載の酵母。   Claims modified to increase the activity of γ-glutamyl dipeptide synthase by increasing the copy number of the gene encoding γ-glutamyl dipeptide synthase or by modifying the expression regulatory sequence of the gene. The yeast according to 1. 前記γ−グルタミルジペプチド合成酵素がγ−グルタミルシステイン合成酵素である、請求項１または２に記載の酵母。   The yeast according to claim 1 or 2, wherein the γ-glutamyl dipeptide synthase is γ-glutamylcysteine synthase. グリシン生成酵素をコードする遺伝子の発現が弱化されることにより、または該遺伝子が破壊されることにより、グリシン生成酵素の活性が低下するように改変された、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母。   The glycine synthase is modified so that the activity of the glycine synthase is decreased by weakening the expression of the gene encoding the glycine synthase or by destroying the gene. Yeast as described in. 前記グリシン生成酵素がスレオニンアルドラーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母。   The yeast according to any one of claims 1 to 4, wherein the glycine-producing enzyme is threonine aldolase. さらに、Ｌ−システインの生合成経路および／またはα−アミノ酪酸の生合成経路が強化されるよう改変された、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵母。   Furthermore, the yeast of any one of Claims 1-5 modified | changed so that the biosynthesis pathway of L-cysteine and / or the biosynthesis pathway of (alpha) -aminobutyric acid might be strengthened. 前記酵母がサッカロミセス属に属する酵母である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の酵母。   The yeast according to any one of claims 1 to 6, wherein the yeast belongs to the genus Saccharomyces. 前記酵母がサッカロミセス・セレビシエである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵母。   The yeast according to any one of claims 1 to 7, wherein the yeast is Saccharomyces cerevisiae. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することを特徴とする、酵母エキスの製造方法。   A method for producing a yeast extract, comprising preparing a yeast extract using the yeast according to any one of claims 1 to 8 as a raw material. 請求項９に記載の方法により得られる酵母エキスを飲食品の原料に添加することを特徴
とする、飲食品の製造方法。 A method for producing a food or drink, comprising adding the yeast extract obtained by the method according to claim 9 to a raw material for the food or drink.