JP5997443B2 - 標的化凝固因子およびそれを使用する方法 - Google Patents
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Description
本発明は増加した有効性を有する標的化凝固因子に関する。本発明はさらに、凝固因子を生物学的作用部位に選択的に標的化することにより、例えば、第VIII因子(FVIII)を赤血球および血小板に標的化することにより、凝固因子欠乏症に罹患している患者を処置する方法に関する。本発明の標的化凝固因子を含む医薬組成物も提供する。
生物学的薬物の有効性は、しばしば、特に疾患が薬物による持続的な調節を必要とするとき、患者における作用期間により限定される。結果として、薬物動態特性の増強は、しばしば、病院における治療剤の成功のために薬効の最適化よりも重要である。半減期を延長するようにクリアランスの種々のメカニズムから薬物を保護する1つの手段は、循環において長寿命のタンパク質、例えば、基質タンパク質への、または細胞、例えば、血球または内皮細胞の表面への薬物結合を促進する標的ドメインを加えることである。例えば、治療ペプチドまたはタンパク質の血球表面への局在化は、正常クリアランスメカニズムを防止することにより、それらの循環半減期を延長することが示されている(Chen, et al., Blood 105(10):3902-3909, 2005)。多種多様の分子が標的ドメインとして使用され得る。
本発明の標的化凝固因子は、血球上の膜タンパク質に特異的に結合する少なくとも1つのドメインと結合した凝固因子を含む。新たに開示された標的化凝固因子を含む医薬組成物および標的化凝固因子を使用する血液病を処置するための方法も提供する。本発明はさらに、凝固因子にて血液病を処置する効率を増加させるために新たに開示された標的化凝固因子を使用することにより、凝固因子を血球の表面へ標的化するための方法を提供する。
本発明は、凝固因子をその作用部位、例えば、血球へ標的化することである。1つの態様において、因子が血球上の膜タンパク質に結合する少なくとも1つのドメインへ結合することを介して、血球へ特異的に標的化されている標的化凝固因子を提供する。凝固因子を血球へ標的化するためのドメインは、限定はしないが、血球の表面上の膜タンパク質に対する高親和性を有する抗体フラグメント、抗体、ペプチド、受容体リガンド、炭水化物または小分子であり得る。血球は、例えば、赤血球または血小板である。
FVIIIおよびFIXの血球、例えば、血小板または赤血球の表面への標的化は、これらの凝固因子のクリアランスを遅くするために役立ち得る。FVIIIの血小板の表面への標的化は特に興味深い。FVIIIはFXのFIX介在活性化における重要な補因子であり、これは凝固部位にて蓄積する活性化血小板の表面上で大部分が起こる。血小板の活性化は、その表面へのこれらの凝固因子の結合を引き起こし、FXa産生を促進する複合体を形成する。血小板は約9日間の平均循環寿命を有する。対照的に、血漿中のFVIII(大部分はフォン・ヴィレブランド因子に結合している)は約14時間の半減期を示す。したがって、FVIIIの血小板への結合は、分子の循環時間を大きく延長させる可能性を有する。FVIIIの本発明の標的ドメインを介する血小板の表面への標的化は、FVIII作用の効率を増加させ、FVIIIの半減期を延長すると予測される。
本発明は、また、治療有効量の本発明の標的化凝固因子および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物に関する。“薬学的に許容される賦形剤または担体”は、製剤化を助けるか、または製造物を安定化させるために活性成分に加えられ得、患者に有意な毒性有害事象を引き起こさない物質である。このような賦形剤または担体の例は、当業者に知られており、水、糖、例えば、マルトースまたはスクロース、アルブミン、塩などを含む。他の賦形剤または担体は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20th edition, 2000)に記載されている。このような組成物は、必要とする患者への有効な投与のために適当な薬学的に許容される組成物を製造するために、有効量の標的化凝固因子を適当な量の賦形剤または担体と共に含む。
本発明をより理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は説明の目的のみであり、どのような形であれ本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。本明細書に記載されているすべての文献は出典明示によりそれら全体を包含させる。
環状ペプチドは、GPIIb/IIIaに強力にかつ選択的に結合することが述べられている。インテグリリンがGPIIb/IIIaへ選択的に結合することができることが示されているため、このようなペプチドの1つであるインテグリリンをFVIIIと結合するための標的ドメインとして使用した。インテグリリンは、短いPEGリンカーを加えることにより修飾され、タンパク質中の遊離システイン残基へ選択的に結合することができるマレイミド部分となった。修飾されたインテグリリンは、リンカーのみを有するものをBHRF−1(図2A)ならびにリンカーおよびフルオレセイン(FITC)を有するものをBHRF−3(図2B)と称する。図3に示されるとおり、固定化されたGPIIa/IIIbへのフィブリノーゲン(Fbn)結合を強くブロックしたため、修飾されたインテグリリンは、GPIIb/IIIaに対する親和性を維持している。
全長FVIIIのポリペプチド配列は当分野で知られている(例えば、配列番号:1、配列番号:2およびWO2006/053299に記載されているもの、参照)。
組換えFVIIIのBドメインに位置するCys残基は、タンパク質発現中の培地において存在するシステインにより覆われているが、以下のとおり還元剤、例えば、TCEPでの処理により容易に除去することができる。FVIII(20mL)を解凍し、2つのAmicon(登録商標)−15カートリッジ(Millipore, Billerica, MA)で濃縮し、低温下で25分2000×g(約3153rpm)で回転させた。2.8mLの副産物の濃度は、NanoDrop(登録商標)分光光度計(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)を使用してA280により約0.8−0.9mg/mLである。次にバッファーを10mLのZeba desaltingカートリッジを使用して交換し、50mMのトリス、150mMのNaCl、2.5mMのCaCl2および100ppmのTween(登録商標)−80(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート)であらかじめ平衡にした。0.88mg/mLの濃度で2.8mLのタンパク質溶液を得た。次にTCEPを最終濃度0.68mMに加え、混合物を4℃で約3時間穏やかに回転させた。TCEPを2連続Zebaカートリッジスピンにより除去し、FVIIIを再酸化のために少なくとも30分放置し、ペプチドを加えた。TCEPの除去後、FVIII濃度は0.768mg/mLと測定された(“KG−R”)。
修飾されたインテグリリンペプチドBHRF−1をFVIIIへ結合させるために、0.294mgのペプチド(M.W.1225)を48μLの乾燥ジメチルスルホキシド(DMSO)に加え、5mMの貯蔵溶液を製造した。次にこの貯蔵溶液(34.4μL)を2.8mLのKG−Rに加えた。80分後に反応を等モル量のシステインの添加によりクエンチした。次に反応混合物を開始Trisバッファー(2リットル)に対して大規模に透析した。BHRF−1−FVIIIの最終濃度は0.74mg/mLであり、そして収量は2mgであった。同様の方法をBHRF−3−FVIIIを製造するために使用した。
表1
Bドメイン欠失FVIII(“BDD”)を結合するために使用するとき、WO2006/053299に記載されているBドメイン欠失FVIIIの種々のCys変異タンパク質を、標的ドメイン、例えば、本明細書に記載されている修飾されたRGDペプチドへBDDを結合するために使用することができる。
BHRF−1−FVIIIのGPIIb/IIIaへの結合活性を試験するために、ビオチン化GPIIb/IIIaをストレプトアビジンプレート上に固定し、結合バッファー(50mMのトリス、pH7.5、100mMのNaCl2、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、1mMのMnCl2および1mg/mLのBSA)中でBHRF−1−FVIIIまたは非修飾FVIIIのいずれかと処理した。非結合タンパク質を結合バッファーで3回洗浄することにより除去した。アッセイバッファー(25μL)をプレートに加え、FVIII活性を発色アッセイキット(Coatest(登録商標) SP4, Chromogenix, Lexington, MA)を使用して測定した。図4に示されるとおり、BHRF−1−FVIIIの結合が存在するが、ほんの少しの非修飾FVIIIの結合が検出された。BHRF−1−FVIIIの結合の増加は、GPIIb/IIIaへのBHRF−1結合に対して競合する環状RGDペプチド(GpenGRGDSPCA;配列番号:5)の添加により完全に除去された。さらに、GPIIb/IIIaがプレート上に固定化されていないとき、非常に低いバックグラウンドレベルのタンパク質が結合した。これらのデータは、BHRF−1−FVIIIがペプチド標的ドメインを介してGPIII/IIIIaへ標的化され得ることを示す。
止血活性におけるBHRF−1−FVIIIの血小板結合の効果を評価するため、その活性をLandskroner, et al., (Haemophilia 11:346-352, 2005)に記載されている全血凝固線溶分析装置(ROTEM(登録商標)、Pentapharm GmbH)システムを使用して非結合FVIIIの活性と比較した。凝固活性の測定、例えば、Coatest(登録商標)発色アッセイまたは活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)アッセイとは異なって、ROTEM(登録商標)アッセイは血小板の機能に依存し、したがって、血小板へのBHRF−1−FVIII結合の効果を示すことができる。アッセイを行うために、血友病Aマウスのクエン酸全血を室温で等量のBHRF−1−FVIII(1mIU)または非結合FVIII(Coatest(登録商標)発色アッセイに基づく)と混合した。自動ピペットにて300μLの処理血液を20μLのCaCl2(200mmol)を有し、外因性アクチベーター(NATEM)を有さないROTEM(登録商標)カップへ分配することにより、サンプルを再石灰化した。測定を最後のピペッティング後即座に開始し、血液凝固形成を37℃で2時間(7200秒)連続的にモニタリングした。
FVIII−BHRF−1のヒト血小板への結合
ヒト血小板は、5×109の血小板/チューブで14mLの血漿でAllcells(Emeryville, CA)から得た。血小板およびすべての洗浄液、バッファー、試薬および遠心機を室温に温め、実験工程中、室温で維持した。血小板のための洗浄バッファー(WB)は、20mMのHEPES、0.5%のBSAおよび50ng/mLのPGE1および2.5U/mLのアピラーゼ、pH7.4を補ったTyrodeのバッファーである。
A.5mLの結合バッファー+5mg/mLのBSA(BBB、50mMのトリス、100mMのNaCl、それぞれ1mMのCaCl2、MgCl2およびMnCl2)
B.FVIIIを欠いているがvWFは存在する5mLのHemA血漿
C.FVIIIおよびvWFの両方を欠いている5mLの免疫喪失血漿。
1.バッファー/血漿のみ+2.5nMのBHRF−1−FVIII(約20%の非結合FVIII(実施例3、参照)を含む)
2.バッファー/血漿+血小板+2.5nMのBHRF−1−FVIII(約20%の非結合FVIIIを含む)
3.バッファー/血漿のみ+2.5nMの組換えFVIII
4.バッファー/血漿+血小板+2.5nMの組換えFVIII。
BHRF−1−FVIIIは、また、図7に示されるとおりマウス血小板へ結合した。同様の結合アッセイを、血小板リッチ血漿(PRP)を回収するためにマウスクエン酸血を200×gで15分遠心することを除いて、ヒト血小板に記載されたとおりに実施した。PRPをクエン酸洗浄バッファー(11mMのグルコース、128mMのNaCl、4.3mMのNaH2PO4、7.5mMのNa2HPO4、4.8mMのクエン酸Na、2.4mMのクエン酸、0.35%のBSA、pH6.5)+50ng/mLのPGE1で希釈し、クエン酸洗浄バッファー+50ng/mLのPGE1で2回洗浄した(1200×gで10分遠心することにより)。最後に血小板を結合バッファー(50mMのトリス、100mMのNaCl、それぞれ1mMのCaCl2、MgCl2およびMnCl2)+5mg/mLのBSAに再懸濁した。非結合FVIIIおよびBHRF−1−FVIIIを血小板に加え、37℃で2時間後、血小板を遠心分離により回収し、上清における非結合FVIII活性を測定した。
血漿中の細胞(例えば、血小板)への結合におけるFVIII活性を反映する血友病Aマウスへの注射後の種々の時間での血液中のFVIIIのレベルを、全血凝固アッセイ、例えば、上記のROTEM(登録商標)を使用して測定する。
精製されたタンパク質および複合体のFVIII活性をCoatest(登録商標)SPアッセイキット(Chromogenix, Lexington, MA)を使用して評価した。アッセイを、96−ウェルプレートフォーマットにおいて製造業者の指示にしたがって行った。簡潔には、FVIIIまたは複合体を含む希釈されたサンプルを、活性化FIX/FX/リン脂質の混合物、次に25mMのCaCl2、発色基質S−2765/I−2581の順に混合した。それぞれの試薬添加中、サンプルを37℃で5分インキュベートした。最後の発色基質の添加後、反応を5分後に20%の酢酸を停止させ、プレート吸光度を405nmで読み、490nmバックグラウンドに対して標準化した。サンプル吸光度を、0.3−40mIU/mLの動作範囲でWHO/NIBSCの血漿由来FVIII標準曲線に対して調節した。
血液凝固の促進における標的化FVIII分子の有効性を示すため、およびこれらの作用期間を評価するために、血友病(HemA)マウスの尾クリップ損傷または尾静脈切断モデルを下記のとおりに使用することができる。
試験サンプルを尾静脈注射を介したマウスに投与する。投与後、マウスをケタミン/キシラジン(100mg/kg、10mg/kg)にて腹腔内(IP)で麻酔する。動物を完全に麻酔後、尾を個々に13mLの37℃にあらかじめ温められた塩水中に約10分置く。尾カットを鋭利なメスにて行い、尾を9mLの37℃の温塩水を有する新しいチューブに即座に入れる。血液を30分間連続的に回収する。出血量を血液回収チューブの重量により、または血液回収チューブ中の血液/塩水混合物の光学濃度により測定する。
HemAオスマウスを、それらの体重によって異なる処置グループにランダム化する。尾静脈の取り扱いの24時間前に、マウスに尾静脈注射によって投与する。尾静脈切断の前に、マウスを50μg/kgのケタミンおよび1mg/kgのメデトミジンを含む混合物にて麻酔する(IP)。尾にフレンチカテーテルを使用して直径2.7mMで印を付ける。メデトミジンの麻酔効果はIP注射による1mg/kgのアチパメゾールにて逆転される。尾静脈をメスの刃で切断する。次に尾を37℃の塩水チューブに入れ、血液を傷口から洗い流すためにチューブを回転させる。塩水が視覚化するためにあまりにも不透明になったとき、尾の出血が停止するまで新しいチューブと置き換える。出血が停止するためにかかる時間を急性凝固時間として記録する。次にマウスを4×8インチの湿布上に置かれた白色の紙寝具を備えた個々の透明なケージに戻す。再出血および瀕死の時間を、後の9−11時間を1時間毎に過剰血液喪失に関してモニタリングする。
1つの態様において、HKB11細胞を、5%CO2インキュベーター中で37℃でタンパク質フリー培地中でオービタルシェーカー(100−125rpm)上で懸濁液培地中にて培養し、0.25から1.5×106細胞/mL密度で維持する。トランスフェクションのためのHKB11細胞を遠心分離により回収し、次に発現培地、例えば、FreeStyleTM293発現培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)中で1.1×106細胞/mLで再懸濁した。細胞を6−ウェルプレート(4.6mL/ウェル)に播種し、37℃のCO2インキュベーター中でオービタルローター(125rpm)上でインキュベートする。それぞれのウェルにおいて、5μgのプラスミドDNAを0.2mLのOpti−MEM(登録商標)I培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)と混合する。それぞれのウェルにおいて、7μLの293fectinTM試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を0.2mLのOpti−MEM(登録商標)I培地と穏やかに混合し、室温で5分インキュベートする。希釈した293fectinTMを希釈したDNA溶液に加え、穏やかに混合し、室温で20−30分インキュベートし、次に5×106(4.6mL)のHKB11細胞で播種されたそれぞれのウェルに加える。次に細胞をCO2インキュベーター中で37℃で3日間オービタルローター(125rpm)上でインキュベートし、その後に細胞を1000rpmで5分遠心分離によりペレット状にし、上清を回収する。
Claims (13)
- 血球上の膜タンパク質に特異的に結合する少なくとも1つのドメインと結合している凝固因子を含む標的化凝固因子であって、該ドメインは、抗体フラグメント、抗体、RGDペプチド、受容体リガンド、またはエプチフィバチドであり、該凝固因子は機能性FVIIIポリペプチドであり、前記血球が血小板であり、前期膜タンパク質がGPIIb/IIIaである、標的化凝固因子。
- ドメインが抗体フラグメント、RGDペプチドまたはエプチフィバチドである、請求項1に記載の標的化凝固因子。
- ドメインがRGDペプチドまたは抗GPIIb/IIIa抗体の一本鎖フラグメントである、請求項2に記載の標的化凝固因子。
- ドメインがFVIIIのBドメインに結合している抗体フラグメント、RGDペプチドまたはエプチフィバチドである、請求項1に記載の標的化凝固因子。
- 血球が血小板であり、ドメインがRGDペプチドまたは抗GPIIb/IIIa抗体の一本鎖フラグメントである、請求項4に記載の標的化凝固因子。
- 治療有効量の請求項1に記載の標的化凝固因子および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物。
- 血液病を処置するため、請求項6に記載の医薬組成物。
- 凝固因子を血球上の膜タンパク質に結合する少なくとも1つのドメインと結合させることを含む、凝固因子を血球の表面に標的化するためのインビトロでの方法であって、該ドメインは、抗体フラグメント、抗体、RGDペプチド、受容体リガンド、またはエプチフィバチドであり、該凝固因子は機能性FVIIIポリペプチドであり、前記血球が血小板であり、前期膜タンパク質がGPIIb/IIIaである、方法。
- ドメインが抗体フラグメント、RGDペプチドまたはエプチフィバチドである、請求項8に記載の方法。
- ドメインがRGDペプチドまたは抗GPIIb/IIIa抗体の一本鎖フラグメントである、請求項8に記載の方法。
- ドメインがFVIIIのBドメインに結合している抗体フラグメント、RGDペプチドまたはエプチフィバチドである、請求項8に記載の方法。
- 血球が血小板であり、ドメインがRGDペプチドまたは抗GPIIb/IIIa抗体の一本鎖フラグメントである、請求項11に記載の方法。
- 凝固因子がさらに血球の表面から放出される、請求項8に記載の方法。
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