JP5992548B2 - 組換えベクター - Google Patents
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Description
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、2008年9月26日に出願の米国特許仮出願第61/100,666号、2008年12月8日に出願の米国特許仮出願第61/120,618号及び2009年6月13日に出願の米国特許仮出願第61/186,823号への優先権を主張する。
構造を示すが、ビリオンが短い表面糖タンパク質スパイクを組み込むという点で、B型粒子に似ている。高電子密度コアも、粒子の中に偏在する。メイソンファイザーサルウイルス(MPMV)は、プロトタイプD型ウイルスである。
・The MIT/ICBP siRNA Database http:(//)web.mit.edu/sirna/-「The MIT [Massachusetts Institute of Technology]/ICBP [Integrative Cancer Biology Program] siRNAデータベースは、これらの実験的に検証された試薬の目録を作り、その情報をMITコミュニティの内外の他の研究者に利用可能にする、大学規模の努力である。(Massachusetts Institute of Technology)。
・The RNAi Web-http:(//)www.rnaiweb.com/一般資源。
・RNA干渉研究のためのsiRNAデータベース及び資源http:(//)www.rnainterference.org/
・siRNA Selector-http:(//)bioinfo.wistar.upenn.edu/siRNA/siRNA.htm.熱力学パラメータ(Khvorovaら、2003年、Schwarzら、2003年)及びDharmacon(Reynoldsら、2004年)によって開発された配列関連の決定因子に基づいてsiRNA機能を評価するために、規則のセットを用いた。特異性は、UniGeneデータベースに対してBLASTを用いて測定される。(Wistar Institute)
・siRNA Target Finder http:(//)www(.)ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html (Ambion)。
凝集素(HA)を用いることもできる。
pACE-GFPemdプラスミドの以前の骨格(米国特許第6,899,871号、Wang et al. Hum Gene Ther 14:117 2003)を、図3Eに示す三つの方法で改変した。改変を、PCRによるオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発(Logg et al.,J.Mol Biol 369:1214,2007;“Molecular Biology and Biotechnology" Eds. J M. Walker,R.Rapley,Royal Society of Chemistry,London UK,2000も参照されたい)によって行った。以下の改変を行った。1)両種性env遺伝子の3'末端のp15領域の核酸配列は、元は同種指向性エンベロープに由来した -この配列を、4070A両種性エンベロープ由来の対応する配列に置換した。;二つの構築物におけるコード化エンベロープアミノ酸は同一である。2)PstI1部位の挿入により、選択した導入遺伝子の挿入がより容易になるようにIRES配列の3'末端を改変し、またIRES導入遺伝子部位の一方の末端にある小さな不完全反復配列を除去した。3)3'LTRの下流にある残りのウイルス配列を除去した。得られたプラスミドはpACE-emdGFP(別名pACE-GFP、pACE-eGFP及びT5.0006)であり、シトシンデアミナーゼ及び変異体をコードするベクターの基礎として使用した。最初に、コード配列カセットを挿入するための二つの方法を使用した。第一の方法は、ATG開始コドンのすぐ上流に配列5'TTATAAT3'(配列番号73)をもたらし、第二の方法は配列5'TTATAA3'(配列番号74)をもたらした。第二の方法はより単純であり、ベクター並びに合成シトシンデアミナーゼ遺伝子中でシンプルにPstI1及びNot1で酵素切断し、その後再びライゲーションを行う。シトシンデアミナーゼ挿入断片を有するベクターを、CDopt(CD1)及びCDopt+3pt(CD2)(図2参照)コード配列を用いる両方の方法により作製し、実施例3に記載したように、293T細胞の一過性トランスフェクションによって感染性ウイルス調製物を作製した。その後、MOI 0.1で、U87細胞を培養液中で感染させ、これらの細胞を100%感染するまで増殖させた。100%感染した細胞の細胞抽出物を、実施例6に記載したようにしてシトシンデアミナーゼ活性についてアッセイしたところ、この酵素の比活性は、いずれか一方の上流配列を有する点以外は同一である構築物と同等であることが判明した。したがって、図2の表において、pACE-eGFP(T5.0006)及びpACE-yCD(T5.0007)は第一の上流配列を有するが、さらに試験した他の全ての構築物は第二の上流配列を有する。その後、異なる遺伝子挿入断片を有するベクターを、単純なPStI1及びNot 1切断を用いて通常法で構築した。
2セットの変更を行った:(1)酵母シトシンデアミナーゼタンパク質の熱安定性を増加させるため、三つのアミノ酸を変更する三つの位置変異(A23L、I140L及びV108I)並びに(2)アミノ酸配列をさらに変更することなく、ヒト細胞内でのタンパク質翻訳効率を改善するために、ヒトコドン使用配列(codon usage sequences)を増強する追加の遺伝子配列改変。
(配列番号43)
Conrad et al.及び国際公開第99/60008号のヒトコドン最適化シトシンデアミナーゼを比較すると、両方において全91個のコドンが最適化され、36個のコドンが同一であり、47個のコドンが三番目の塩基対変更を有し(全て同じアミノ酸をコードする)、並びに9個のコドンが異なった(しかし、それらは同じアミノ酸をコードした)ことが示される。9個コドンのうち異なったのは以下である:
AGC(Ser)がTCC(Ser)に、
CGT(Arg)がAGG(Arg)に、
CCA(Pro)がCCT(Pro)に変化。
(配列番号44)
シトシンデアミナーゼの安定性の増加のために、追加の改変を行った。三つのアミノ酸を変更して酵母のシトシンデアミナーゼタンパク質の熱安定性を増加させる三つの位置変異(A23L、I140L及びV108I)を含むように、野生型酵母シトシンデアミナーゼ遺伝子の遺伝子増強を行った。
アンチセンスプライマー:5'-gccaaaaagaataacgggtttcactcgccgatatcctcga-3'(配列番号46)
センスプライマー:5'tcggcgagtgatccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgccaacccgttatt-3'(配列番号47)
アンチセンスプライマー:5'-aataacgggttggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggatcactcgccga-3'(配列番号48)
天然酵母CDタンパク質の安定性を増加させるために、このタンパク質に三つのアミノ酸置換を遺伝子工学処理で行った。これらの置換は単独で行うか、あるいはヒトコドン最適化と組み合わせて行った。
並びに、IRESを有するRCRをコードするpAC3プラスミドベクターに挿入した時のT5.0002。下線のコドンは、アミノ酸置換に対する優先コドンを示す。
図10Bに示すスキームIIを使用してCD最適化-リンカー-UPRT配列を作製するために、CDポリペプチドとUPRTポリペプチドとの間にインフレームでリンカー(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4 (配列番号56)ドメインをクローニングすることによって、融合構築物も作製した。以下のプライマーを用いて、リンカーを挿入した。
図10Cに示すスキームIIIを用いてCD最適化-OPRTアーゼ(CDヒト化+3pt変異+ヒトのOPRTアーゼ機能ドメイン)を作製するために、OPRTポリペプチドに連結した上記のCDポリペプチドを含む融合構築物も作製した。
図10Dに示すスキームIVを用いてCD最適化-リンカー-OPRT配列を作製するために、CDポリペプチドとOPRTポリペプチドとの間にインフレームでリンカー(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4 (配列番号56)ドメインをクローニングすることによって、融合構築物も作製した。
ベクターは多くの方法で作製できるが、第一のステップは細胞にDNAベクターを導入して感染粒子の産生を可能にすることであり、これは、その後、細胞の上清から回収することができる。一度感染粒子を作製すれば、当業者は他の作製法を実行することができる。293T細胞の一過性トランスフェクションによりベクター粒子を作製した(Pear et al.Proc Natl Acad Sci U S A.90:8392〜8396 1993)。
機能的なベクターの濃度、又は力価を定量PCR(qPCR)に基づく方法を用いて決定する。この方法において、形質導入可能な宿主細胞系(例えば、PC-3ヒト前立腺ガン細胞、ATCC Cat# CRL-1435)を標準量のベクターで感染させ、形質導入後の宿主細胞内に存在する得られたプロウイルス量を測定することによって、ベクターを力価測定する。細胞及びベクターを標準的な培養条件下(37℃、5%CO2)、24時間インキュベートし、完全感染を可能にさせた後、ベクターの複製を停止するために抗レトロウイルスAZTを添加した。次に、細胞を培養皿から回収し、ゲノムDNA(gDNA)をインビトロジェン社のPurelink gDNA精製キットを用いて精製し、RNase/DNase不含滅菌水を用いて精製カラムから溶出する。分光光度計でA260/A280吸光度比を測定し、試料の濃度及び相対純度を決定する。qPCRのためのインプットDNAが全解析試料に対して一定になるように、RNase/DNase不含水を追加して、所与のセットのgDNA調製物のうち一番低い濃度にgDNA濃度を標準化する。エチジウムブロマイド染色された0.8%アガロースゲルにて、一定分量の各試料の電気泳動を行うことにより、ゲノムDNAの純度をさらに評価する。試料のA260/A280吸光度が1.8〜2.0の範囲であり、gDNAが単一バンドを示す場合、その試料をベクターのプロウイルスコピー数についてのqPCR解析に使用する。プロウイルス(逆転写されたベクターDNA及び宿主gDNAに組み込まれたベクターDNA)のLTR領域を調べるプライマーを用いてqPCRを行い、既知量のベクターを用いて既知数の細胞に形質導入した時に起こった形質導入事象の総数を推定する。試料として既知のコピー数の標的含有プラスミドを利用し、それを107から10コピーに段階希釈し、同一のqPCR条件下で測定した標準曲線から、反応あたりの形質導入事象の数を計算する。(以前に決定された濃度から)どれくらいのゲノム当量を各qPCR反応に使用したのか、どれくらいの形質導入事象が反応あたりに起こったのかを知るために、形質導入時に存在した細胞の総数に基づいて生じた形質導入事象の総数を決定する。この値は、最初の形質導入中に細胞を含む培地で希釈した後のベクターの力価である。補正した力価を
計算するために、力価量で割った培養液の体積及び力価量を掛け合わせることによって希釈を訂正する。これらの実験を複製培養中に行い、各条件に対して3連の測定を用いてqPCRにより解析し、平均力価並びにそれに関連する標準偏差及び変動係数を決定する。
効果的なベクター構築物及びそれらに由来する感染粒子であるためには、以下が必要である:1)ウイルスの良好な力価を一過性トランスフェクションにより達成する(実施例3及び4参照);2)複数継代において安定性である;3)5-FCの存在下で、効率的に細胞を死滅させる;及び4)標的細胞の感染において酵素活性を示す。実施例3は、有用な力価をこれらのベクターから得ることができることを示す。
安定性を証明するために、以下の実験を行った。最初に、約106の未処理のU-87細胞をMOI 0.01でウイルスベクターに感染させ、完全に感染するまで増殖させ、1サイクルの感染を完了した。その後、上清を未感染細胞に再継代し、このサイクルを繰り返す。この実験において、2連の試験で、12サイクルを完了した(図5は各2連の試験の一方を示し、2連の試験の他方において同じ結果を得た)。導入遺伝子挿入部位の近傍のMLV特異的プライマーを用いる、感染細胞由来の組み込まれたプロウイルスのPCR増幅により、yCD2又は他の導入遺伝子配列の遺伝的安定性を評価する。全長の増幅産物よりも小さいバンドが現れることは、ベクターの不安定性を示す。図5は、本開示のベクター(T5.0007-改変ベクター及びCD異種ポリヌクレオチドを含む)がpACE-CDよりも回数の多い継代に対して安定性を維持することを示す。さらに、T5.0003は多少安定性が低いが、T5.0004及びT5はpACE-CDとほとんど同じ安定性であると思われる。pACE-CDはマウス腫瘍研究において用いられてきており、マウスモデルにおいて良好な抗腫瘍効果を示す。しかし、特に、複数サイクルの5-FC処理を必要とする場合、より安定なウイルスゲノムは、動物及びヒトの治療においてはるかに効力があり長持ちする。T5.0001及びT5.0002の両方がT5.0007よりも顕著に安定であることは、タンパク質コード配列内のサイレント変化又は点変異をもたらす小さな変化が、より安定なベクターゲノムと共に予期せぬ優れた特性をもたらすことができることを示す。
Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)は、増殖アッセイにおいて生存可能な細胞数を決定する比色法である。細胞増殖の速度を決定するため、並びに5-フルオロシトシン(5-FC)及び5-フルオロウラシル(5-FU)に対する様々な細胞株の用量反応を測定するために、このアッセイを使用した。
U87細胞を感染多重度(MOI)0.1で形質導入し、5日間培養し、ウイルスを拡散させ、形質導入5日後の細胞を回収した。その後、5分間、800×gの遠心分離により細胞を回収した。細胞ペレットから吸引により上清を取り除き、リン酸緩衝食塩水(PBS)5mLで洗浄し、再び5分間、800×gで遠心分離をした。得られた細胞ペレットに1.5mLのPBSを加え、ピペッティングにより再懸濁し、-20℃の冷凍庫で保管した。細胞を凍結/溶解法により溶解させた。前もって再懸濁した細胞を室温で溶解させ、ピペッティングし、プロテアーゼ阻害剤混合液と混合し、再び-20℃で凍結させた。酵素アッセイの前に、試料を再び室温で溶解し、ピペッティングした。その後、5分間、卓上用遠心機の14,000rpmにおいて、懸濁液を遠心分離した。ペレットから上清をデカントして取り、新しいエッペンドルフ試験管に入れ、氷上に置いた。
293T細胞の一過性トランスフェクションにより、本開示のベクターを作製し(実施例3)、その後、細胞上清の回収、濾過、ベンゾナーゼ処理、膜分離/濃縮及び透析を行った。さらに、当業者に知られたクロマトグラフィーカラムステップを含んでもよい(例えば、米国特許第5,792,643号;T.Rodriguez et al.J Gene Med 9:233 2007;米国特許出願第61218063号参照)。臨床物質は、無菌性、マイコプラズマ及びエンドトキシン、並びに産物特有の効力、強度、及び同一性試験などの標準試験に基づいて発売される。標的細胞に組み込まれたウイルスベクターDNAのPCR定量化により、形質導入単位(TU)として力価を決定する(実施例4)。最終産物が、無菌注射剤として、等張トリス-ショ糖緩衝液で調製した109TU/mlまでの力価を有することを目的とする。
形質導入
PC-3細胞株由来の安定なヒト前立腺腺ガンを用いて、12-ウェル型プレートの中で形質導入を行う。各試験試料について、力価が決定していないベクター調製物の3種類の希釈を用いて、3ウェルずつPC-3細胞を形質導入する。形質導入24時間後に、アジドチミジン(AZT)を用いてウイルス複製を停止する。細胞をさらに24〜64時間維持し、その後回収し、ゲノムDNA精製を行う。
キアゲン社のDNeasy DNA Minikitsを用いて、メーカーの手順書に従い、形質導入して回収した細胞からゲノムDNAを調製する。UV/vis分光光度法を用いる直接的吸光度測定により、DNAの濃度及び質を評価し、A260及びA260/A280比を決定する。
バイオラッド社のCFX96リアルタイムPCR装置又はそれと同等の物を用いて定量PCRを行う。CMV/Psiプラスミドプロモーターに対する、組み込まれた又はプロ-レトロウイルスのU3/Psiパッケージングを増幅するように設計したTaqManプローブと併用して、特異的DNAオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、各試験試料中に存在するプロベクターのコピー数を測定する。コピー数標準曲線と比較して、ベクターの力価を表す。ベクターコピー数標準曲線を作成するために、プロ-レトロウイルスU3/Psi配列を含む固有のプラスミドをPC-3細胞のゲノムDNAに添加する。希釈ごとに複数の反応を用いて、複数の希釈物中の形質導入ゲノム数を計算することにより、ベクター試験試料の力価を得る。
形質導入
U87細胞を用いて、複数ウェル型プレートの中で形質導入を行う。各形質導入について、適切な3種類の希釈を用いて、各々3通りで行う。形質導入0、1、3及び5日後に細胞を回収する。
細胞を溶解し、基準としてBSAを用い、BCAタンパク質アッセイを用いて、全タンパク質濃度を決定する。yCD2酵素アッセイについて、37℃で1〜2時間にわたり5-FU形成速度が直線のままであるように、適切な量の細胞溶解物を5-FCを含む緩衝液に加える。反応混合物の最終体積は100μLである。2時間後、トリクロロ酢酸の添加により酵素反応を停止し、少しボルテックスをし、次のHPLC解析の準備をする。非形質導入細胞の細胞溶解物を陰性対照として用いる一方で、100%感染細胞の試料を用いる同様のアッセイを陽性対照として用いる。
室温で5分間、微量遠心機を用いて、停止した反応混合物を12,000rpmで遠心分離する。その後ペレットから上清をデカントして取り、さらに微粒子を除去するために0.2μフィルターに通過させ、pH約4.0のリン酸緩衝液を含む水溶性の移動相を備える前もって平衡化した逆相HPLCカラムに注入する。基質消費及び産物形成の両方をモニターするために、260nm及び280nmでクロマトグラムを行う。既知の基質又は産物の濃度から計算した、前もって作成した標準曲線と比較することにより、GraphPadのグラフ作成及び解析機能を用いて、基質又は産物のいずれかの濃度を決定する。1〜2時間にわたって生成した5-FU量を用いて、CDの活性単位(CD活性の1単位を、1分あたりの1nmolの5-FU形成として定義する)を決定し、この数字をアッセイに使用した(細胞溶解物の)タンパク質の量で割ることにより比活性を計算する。
一本鎖抗体は、所望の効果を有する既知の全抗体配列に由来する。かかる配列は入手可能である(例えば、WO2006048749、米国特許公開第2006/165706号、米国特許第7,034,121号、Genbankアクセッション番号DJ437648、CS441506、CS441500、CS441494、CS441488、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)。当業者に知られた一般的に使用されている方法(例えば、Gilliland et al.“Rapid and reliable cloning of antibody variable regions and generation of recombinant single chain antibody fragments."Tissue Antigens 47,1〜20,1996参照)により、かかる従来の抗体遺伝子配列を一本鎖抗体(scFv)配列に変換する。CTLA-4に対するファージの一本鎖抗体も、ファージ-scFvライブラリーから直接スクリーニングすることにより入手可能であり、本発明の複製型レトロウイルスベクター(Pistillo et al. Tissue Antigens 55:229 2000)に挿入するために直接使用することができる。どれくらい配列が由来するかに関わらず、scFvは一般に約700〜900塩基対の長さであり、前記のように、5'末端にあるPsi1部位及び3'末端の互換性のあるNot1部位を用いて、商業メーカー(BioBasic)が合成する。その後、yCD2配列の除去後、Psi1-Not1部位において、pAC3-yCD2の複製型レトロウイルス骨格にこの配列を挿入する。記載したようにベクターを産生し、力価を測定し、必要であれば上記のようにさらに精製する。ヒト及びマウスCTLA4は配列において非常に相同性があり、当業者に周知のCT26/Balb/cモデル及びs91マウス黒色腫モデルなどの適切な同系の免疫応答性マウスモデル(例えば、Hodge et al J.Immunol.174:5994 2005参照)において、本発明の複製型レトロウイルスを最初に試験する。1つ又は複数の以下のもの:腫瘍増殖の調節;毒性の欠失;抗腫瘍反応の発生;全身性免疫を示す遠隔病巣の縮小により結果を測定する。マウスに103〜107TUの範囲で投与する。患者には、腫瘍への病巣内注射により投与する、又は血液循環への投与によりこのベクターを投与し、その後、腫瘍にウイルスを運ぶ。105〜1011 TUの範囲で投与する。
目的
皮下黒色腫を保有するDBA/2マウス(Cloudman S91)における腫瘍内(IT)注射により送達する時、分化クラスター152(CD152)配列(pAC3-αCD152)とも称される、細胞毒性T-リンパ球抗原4(CTLA-4)に対して作られる一本鎖抗体を保有する、新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクターの黒色腫増殖における効果を評価することが本研究の目的である。
メスのDBA/2マウス(約8週齢)をジャクソン研究所(Bar Harbor,ME)から購入する。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させる。
Cloudman S91細胞(ATCC, Manassas VA)は、DBA/2マウスに由来する自然発生黒色腫である。10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタマックス(Hyclone,Logan UT、及びInvitrogen,San Diego CA)を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養する。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。S91細胞(100μL中1E6)を、DBA/2マウスの右わき腹に注射する。
一過性トランスフェクションにより(又はHT1080細胞内の産生細胞株から、米国特許出願参照)、約7E6TU/mlの力価を有するベクター調製物を作製する。最初の研究については、ベクターをさらに精製又は濃縮をしない。全用量反応曲線を得るための以後の実験のために、約10E8/mlと期待される力価を有する高い力価の精製物質を準備する。約7E5 TU/マウスとなる総投与量/マウスを50〜100μLの体積でITにより、また100μLの体積でIVによりベクターを投与する。αCD152を発現するベクターをToca αCD152とする。
メスDBA/2(55匹のマウス、9〜10週齢)の5群にS91黒色腫細胞を皮下に移植し(0日目)、その後、ビヒクル(第一群)、対照ベクター[AC3-GFP(V)(第二群)、Toca αCD152ベクターの腫瘍内(IT)注射(第三群)、又はToca αCD152ベクターの静脈内注射(第四群)を(S91腫瘍の増殖率に応じて4〜7日目に;約50〜100mm3)投与する。第五群のマウスには腫瘍が移植されておらず、Toca αCD152のみ静脈内注射する。
最初に到達した方に基づいて2000mm3又は60日目まで腫瘍増殖解析を行う。各群の10匹のマウスの腫瘍サイズを時間と共にプロットする。分散分析(ANOVA)を用いて統計的有意性を決定する。Prism 5統計ソフトウェア(GraphPad Software)又はそれと同等の物を用いて実行する全解析において、P値<0.05を統計的に有意であるとみなす。処理中のαCD152発現に対する任意の有害事象を評価するために、生存中の観察も行う。
対照と比較して、ITのMLVの複製によるαCD152の送達は統計的に有意な増殖遅延を示す。対照と比較して、静脈内のMLVの複製によるαCD152の送達は統計的に有意な増殖遅延を示し、DBA/2-Cloudman S91マウス黒色腫モデルの黒色腫量を抑制する。
実施例9: ACE-yCD2ウイルスベクターは、ヌードマウスでの頭蓋内ヒト異種移植片(U87)において治療効果がある。
A.ヒトpri-miRNA-128-1異種ポリヌクレオチド配列を含む組換え複製適合性レトロウイルスベクターの構築
miR-128-1を発現する複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-miR-128-1は、実施形態の一つに記載したpAC3-yCD2骨格に由来した。pAC3-miR-128-1ベクターのpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのMluI及びNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離し、IRES-yCD2ポリヌクレオチド配列を除去した。pri-miR-128-1のポリヌクレオチドDNA配列を、pEP-mir-128-1発現ベクター(Cell BioLabs Inc.)の製品シートから入手した(配列番号31)。2本鎖DNA断片の5'末端にMluI制限酵素部位及び3'末端にNotI制限酵素部位を有するpri-miR-128-1のDNA配列を合成し、続いて上記のMluI及びNotI消化pAC3-yCD2プラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-miR-128-1は、三つの遺伝子:gag、pol、及びenvをコードし、非コードpri-miR-128-1配列を有する(図11)。
miR-128-2を発現する複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-miR-128-2は、実施形態の一つに記載したpAC3-yCD2骨格に由来した。pAC3-miR-128-1ベクター内のpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのMluI及びNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離し、IRES-yCD2ポリヌクレオチド配列を除去した。pri-miR-128-2のポリヌクレオチドDNA配列を、pri-miR128-2を発現するLenti-miR-128-2発現ベクター(System Biosciences)の配列解析から得た(配列番号32)。2本鎖DNA断片の5'末端にMluI制限酵素部位及び3'末端にNotI制限酵素部位を有するpri-miR-128-2のDNA配列を合成し、続いて上記のMluI及びNotI消化したpAC3-yCD2プラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-miR-128-1は、三つの遺伝子:gag、pol、及びenvをコードし、非コードpri-miR-128-2配列を有する(図1)。
miR-128-2を発現する複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-miR-128-2は、実施形態の一つに記載したpAC3-yCD2骨格に由来した。pAC3-miR-128-1ベクター内のpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのMluI及びNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離し、IRES-yCD2ポリヌクレオチド配列を除去した。ヒトH1プロモーターのポリヌクレオチドDNA配列をpSilencer 3.1 H1 hygro発現ベクター(Ambion)の製品情報から得、低分子ヘアピン構造化pre-miR-128-1のポリヌクレオチドDNA配列を、http://www.mirbase.org/から得た。2本鎖DNA断片の5'末端にMluI制限酵素部位及び3'末端にNotI制限酵素部位を有する、ヒトH1プロモーターに連結したpre-miR128-1のDNA配列(配列番号33)を合成し、続いて上記のMluI及びNotIで消化したpAC3-yCD2プラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-H1-shRNAmiR128は、三つの遺伝子:gag、pol、及びenvをコート化し、並びに非コードの低分子ヘアピン構造化pre-miR-128-1配列を有する(図11)。
現在、組換え複製適合性レトロウイルスベクターの複製速度を求めるために少なくとも二つの一般的な方法がある:(1)フローサイトメトリー解析による、GFPタンパク質を発現するベクターを用いたGFP発現解析、及び(2)形質導入細胞を培養した培地から回収したベクターストックの逆転写酵素活性を測定することによる逆転写酵素アッセイ。力価が各々過大評価及び過小評価されたRNA及び導入遺伝子発現によって得られる力価と比較すると、形質導入細胞のDNA解析により評価した力価は、最も信頼性のある推定の機能的力価をもたらす(Sastry et al.,2002 Gene Therapy 9,1155〜1162)。ウイルス拡散の複製速度は、そのウイルスゲノムの、組み込まれたプロウイルスDNAが、そのウイルス配列に特異的なプライマーを用いて、培養中に試験するqPCRにより検出できる形質導入細胞集団の割合と相関する。複製速度の比較を行う場合、本アッセイは、試験する同じベクター内で及び様々なベクター間で、全ての時点の等量のインプットゲノムDNAを必要とする。1/C(t)値対複数の時点をプロットすることによって、複製速度グラフを作成した。図12A及び図12Bは、様々な組換え複製適合性レトロウイルスベクターの複製速度の比較を示す。様々なベクター間で、複製速度におけるわずかな違いを明らかにする上で本アッセイは敏感である。
本発明のpri-miR-128-1、pri-miR-128-2及びH1-pre-miR-128-1配列各々の組込みが正常に複製することを確かめるために、上記の一過性トランスフェクションから回収した計算した体積の各ベクターストックを用いて、新鮮な線維肉腫細胞HT1080及びヒト神経膠腫細胞U87-MGの各々にMOI 0.1で感染させた。形質導入細胞を、感染3、6及び9日後に継代した。各時点において、qPCR用のゲノムDNA抽出のために、一部の細胞を回収した。ゲノムDNAを希釈し、qPCRの等量のインプットゲノムのために同じ濃度を有する一定量のゲノムDNAを作製した。1/C(t)値対複数の時点をプロットすることによって、各ベクターの複製速度を作成した。対照のMLVウイルスと比較して、試験をした全ベクターが同様の速度で複製したことを図12A及び図12Bは示す。
miR-128を含む組換え複製適合性レトロウイルスベクターで形質導入した細胞のmiR-128発現を確かめるために、最大の感染力に達した(図12A及び12B)感染9日後の細胞を増殖させ回収して、成熟miRNA発現の検出のために全RNAを抽出した。非形質導入細胞と比較して、pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2、及びpAC3-H1-shRNAmiR128ベクター各々で形質導入したHT1080及びU87-MG細胞の両方における成熟miR-128の過剰発現を、Taqman microRNAアッセイの結果は示した(図13)。両細胞株において、pAC3-miR-128-1及びpAC3-H1-shRNAmiR128ベクターで形質導入した細胞は、pAC3-miR-128-2ベクターで形質導入した細胞よりも高レベルの成熟miR-128を発現した。
グリア芽腫を含む様々なヒトのガンにおいて、Bmi-1発現は上方制御されることが観察され、miR-128の標的であることが示された。miR-128の標的関与を確かめるために、pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2及びpAC3-H1-shRNAmiR128ベクター各々で形質導入した細胞におけるBmi-1発現をqRT-PCRによって検出した。pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2及びpAC3-H1-shRNAmiR128ベクター各々で形質導入したU87-MG細胞は、非形質導入細胞よりもより低レベルのBmi-1を発現したが、HT1080細胞においては、形質導入及び非形質導入細胞間で顕著な違いは観察されなかったことを図14は示す。このデータは中枢神経系において、miR-128が重要な機能的役割を担うという考えを支持する。
A.構築
複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128は、実施形態の一つに記載したpAC3-yCD2骨格に由来する。pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128ベクター内のpAC3-yCD2骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離する。ヒトH1プロモーターのポリヌクレオチドDNA配列をpSilencer 3.1 H1 hygro発現ベクター(Ambion)の製品情報から得、低分子ヘアピン構造化pre-miR-128-1のポリヌクレオチドDNA配列を、http://www.mirbase.org/から得る。2本鎖DNA断片の両末端にNotI制限酵素部位を有する、ヒトH1プロモーターに連結したpre-miR128-1のDNA配列(配列番号34)を合成し、続いて上記のNotIで消化したpAC3-yCD2プラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-H1-shRNAmiR128は、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びyCD2をコードし、非コード低分子ヘアピン構造化pre-miR-128-1配列を有する(図11)。
本発明のH1-pre-miR-128-1の組込みが正常に複製することを確かめるために、上記の一過性トランスフェクションから回収した計算した体積の各ベクターストックを用いて、新鮮な線維肉腫細胞HT1080及びヒト神経膠腫細胞U87-MGの各々にMOI 0.1で感染させる。形質導入細胞を、感染3、6及び9日後に継代する。各時点において、qPCR用のゲノムDNA抽出のために、一部の細胞を回収する。ゲノムDNAを希釈し、qPCRの等量のインプットゲノムのために同じ濃度を有する一定量のゲノムDNAを作製する。1/C(t)値対複数の時点をプロットすることによって、各ベクターの複製速度論を作成する。対照のMLVウイルスと比較して、ベクターが同様の速度で複製することを結果は示す。
組換え複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入した細胞のmiR-128の発現を確かめるために、最大の感染力に達する感染9日後の細胞を増殖させ回収し、成熟miRNA発現の検出のために全RNAを抽出する。非形質導入細胞と比較して、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入したHT1080及びU87-MG細胞の両方における成熟miR-128の過剰発現を、Taqman microRNAアッセイの結果は示す。
グリア芽腫を含む様々なヒトのガンにおいて、Bmi-1発現は上方制御されることが観察され、miR-128の標的であることが示された。miR-128の標的関与を確かめるために、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入した細胞におけるBmi-1発現をqRT-PCRによって検出する。pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入したU87-MG細胞は、非形質導入細胞よりもより低レベルのBmi-1を発現するが、HT1080細胞においては、形質導入及び非形質導入細胞間で顕著な違いは観察されなかったことを結果は示す。このデータは中枢神経系において、miR-128が重要な機能的役割を担うという考えを支持する。
組換え複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入した細胞におけるyCD2発現を確かめるために、最大の感染力に達する感染9日後の細胞を増殖させ回収し、yCD2発現の検出のために全タンパク質を抽出する。pAC3-yCD2形質導入細胞と比較して、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入したHT1080及びU87-MG細胞の両方における正常なyCD2発現を免疫ブロットの結果は示す。
miR-128を含む組換えレトロウイルスベクター(pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2、pAC3-H1-shRNAmiR128及びpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128)の多重連続感染サイクルを試験し、ベクターの安定性を評価する。最初に、HT1080及びU87-MG細胞を低いMOIにおいてベクターで感染し、培養液中に拡散させる。各感染サイクルのベクターストックを回収、濾過、希釈し、新鮮な細胞に感染させる。各感染サイクルの最後に、env遺伝子の3'及び3'LTRのベクター上流にある非翻訳領域の3'に結合するプライマーを用いる標準的なPCRによって導入遺伝子安定性を評価するために、細胞を回収し、ゲノムDNAを抽出する。試験する全ベクターが少なくとも8〜20サイクルにわたって安定な状態であることを結果は示す。
目的
ヒト神経膠腫異種移植片を有するヌードマウスに、三つの用量レベルのToca 511で頭蓋内(IC)注射により送達する時、miR128配列を保有する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクター(AC3-miR128-1(V);AC3-miR128-2(V);AC3-miR128-3(V)の生存に対する効果を評価することが本研究の目的である。
メスの胸腺欠損nude-Foxn1^nu(ヌード)マウス(約8週齢)をハーラン社(Indianapolis IN)から購入する。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させる。右線条体に移植する、3.5mmの突起を含む蓋を取り付けた3.0mmの突起を備える留置ガイドカニューレの外科的留置をマウスに行う。定位座標は、(十字縫合から)AP=+0.5mm、ML=-1.8mmである。
U-87 MG細胞(ATCC, Manassas VA)は、44歳の白人女性の悪性神経膠腫に由来する。10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタマックス(Hyclone,Logan UT、及びInvitrogen,San Diego CA)を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養する。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。ガイドカニューレを通して挿入した3.5mm突起を有する注射カニューレにより、U-87 MG細胞(1μL中に1E5)を1分あたり0.2μLでICに注入する(5分、その後5分間の保持が続く)。
メスの胸腺欠損nude-Foxn1^nuマウス(65匹、9〜10週齢)の6群にU-87腫瘍細胞をICに移植し(0日目)、その後、ビヒクル(第一群)、対照ベクター(AC3-GFP(V)、第二群)で(U-87細胞の増殖率に応じて4〜7日目に)ICに投与し、又はAC3-miR128-1(V);AC3-miR128-2(V);AC3-miR128-3(V)(第三〜五群)でICに投与する。第六群のマウスには腫瘍又はベクターを移植しなかった。
第一〜第六群の各10匹のマウスにおいて60日目まで生存分析を実行し、カプラン-マイヤープロットのようにプロットする。ログランク検定により生存曲線を比較する。Prism 5統計ソフトウェア(GraphPad Software)又はそれと同等の物を用いて実行する全分析において、P値<0.05を統計的に有意であるとみなす。
濃縮したヒト神経膠腫異種移植片のような「幹細胞」を有するヌードマウスに、三つの用量レベルで頭蓋内(IC)注射により送達する時、AC3-yCD2-H1-shRNAmiR128(V)と命名した、yCD2及びmiR-128を発現する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクターの生存に対する効果を評価することが本研究の目的である。
メスの胸腺欠損nude-Foxn1^nuマウス(66匹、9〜10週齢)の6群に「幹様」細胞をICに移植し(0日目)、その後、第一群:ビヒクル;第二群:対照ベクターAC3-GFP(V);第三群:TOCA511;第四群:AC3-yH1-shRNAmiR128(V);第五群:AC3-yCD2-H1-shRNAmiR128(V)を細胞の増殖率に応じて腫瘍移植7〜14日後にICに投与する;並びに第六群は腫瘍又はベクターを移植しない未処理マウスである。
第一〜第五群の各10匹のマウスにおいて60日目まで生存分析を実行し、カプラン-マイヤープロットのようにプロットする。ログランク検定により生存曲線を比較する。Prism 5統計ソフトウェア(GraphPad Software)又はそれと同等の物を用いて実行する全分析において、P値<0.05を統計的に有意であるとみなす。
このヒト神経膠腫異種移植モデルにおいて、対照ベクター又はビヒクルのみを用いた処理と比較して、ベクターを用いた処理の結果は統計的に有意な生存効果を示す。
A.GFPを発現し、1コピーの142-3p標的配列を含む複製適合性レトロウイルスベクターの構築
GFPをコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-emd-142-3pTは、上記のpAC3-emd骨格に由来した(現在存在する特許)。pAC3-emd-142-3pTベクターのpAC3-emd骨格を、pAC3-emdプラスミドDNAのNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。miR142-3pTの完全相補性標的配列を既刊文献(Brown et al.,2006 Nature Medicine 12:5 585〜591)から得た。2本鎖DNA断片の各末端に存在するNotI制限酵素部位を有するmiR-142-3pの標的配列(配列番号35)を合成し、続いてpAC3-emdプラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。142-3pT挿入断片の方向を、配列解析により確かめた。得られた構築物pAC3-emd-142-3pTは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びemdをコードし、非コード142-3pT配列を有する(図15)。
yCD2をコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-142-3pTは、上記のpAC3-yCD2骨格に由来した(現在存在する特許)。pAC3-yCD2-142-3pTベクターのpAC3-yCD2骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。miR142-3pTの完全相補性標的配列を既刊文献(Brown et al.,2006 Nature Medicine 12:5 585〜591)から得た。2本鎖DNA断片の各末端に存在するNotI制限酵素部位を有するmiR-142-3pの標的配列(配列番号35)を合成し、pAC3-yCD2プラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-yCD2-142-3pTは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びyCD2をコードし、非コード142-3pT配列を有する(図16)。
GFPをコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-emd-142-3pT4Xは、上記のpAC3-emd骨格に由来した(現在存在する特許)。pAC3-emd-142-3pT4XベクターのpAC3-emd骨格を、pAC3-emdプラスミドDNAのNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。四つのタンデムリピートのmiR142-3pT4Xの完全相補性標的配列を既刊文献(Brown et al.,2006 Nature Medicine 12:5 585〜591)から得た。2本鎖DNA断片の各末端に存在するNotI制限酵素部位を有するmiR-142-3p4Xの標的配列(配列番号36)を合成し、続いてpAC3-emdプラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。142-3pT挿入断片の方向を、配列解析により確かめた。得られた構築物pAC3-emd-142-3pT4Xは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びyCD2をコードし、非コード142-3pT4X配列を有する(図15)。
GFPをコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-142-3pT4Xは、上記のpAC3-emd骨格に由来した。pAC3-yCD2-142-3pT4XベクターのpAC3-emd骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。四つのタンデムリピートのmiR142-3pT4Xの完全相補性標的配列を既刊文献(Brown et al.,2006 Nature Medicine 12:5 585〜591)から得た。2本鎖DNA断片の各末端に存在するNotI制限酵素部位を有するmiR-142-3pT4Xの標的配列(配列番号36)を合成し、続いてpAC3-yCD2プラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。142-3pT4X挿入断片の方向を、配列解析により確かめた。得られた構築物pAC3-emd-142-3pT4Xは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びemdをコードし、非コード142-3pT4X配列を有する(図16)。
現在、組換え複製適合性レトロウイルスベクターの複製速度を求めるために少なくとも二つの一般的な方法がある:(1)フローサイトメトリー解析による、GFPタンパク質を発現するベクターを用いたGFP発現解析、及び(2)形質導入細胞を培養した培地から回収したベクターストックの逆転写酵素活性を測定することによる逆転写酵素アッセイ。力価が各々過大推定及び過小推定されたRNA及び導入遺伝子発現によって得られる力価と比較すると、形質導入細胞のDNA解析により評価した力価は、最も信頼性のある推定の機能的力価をもたらす(Sastry et al.,2002 Gene Therapy 9,1155-1162)。ウイルス拡散の複製速度は、そのウイルスゲノムの、組み込まれたプロウイルスDNAが、そのウイルス配列に特異的なプライマーを用いて、培養中に試験するqPCRにより検出できる形質導入細胞集団の割合と相関する。複製速度の比較を行う場合、本アッセイは、試験する同じベクター内で及び様々なベクター間で、全ての時点において等量のインプットゲノムDNAを必要とする。1/C(t)値対複数の時点をプロットすることによって、複製速度グラフを作成した。図17A及び図17Aは、組換え複製適合性レトロウイルスベクターの複製速度の比較を示す。様々なベクター間で、複製速度におけるわずかな違いを明らかにする上で本アッセイは敏感である。
非造血性ヒト細胞株における142-3pTを含む組換えレトロウイルスベクター
本発明の142-3pT配列の組込みベクターがそれらの親ベクターと同様に複製することを確かめるために、上記の一過性トランスフェクションから回収した計算した体積の各ベクターストックを用いて、新鮮な線維肉腫細胞HT1080及びヒト神経膠腫細胞U87-MGの各々にMOI 0.1で感染させた。形質導入細胞を、感染3、6及び9日後に継代した。各時点において、qPCR用のゲノムDNA抽出のために、一部の細胞を回収した。ゲノムDNAを希釈し、qPCRの等量のインプットゲノムのために同じ濃度を有する一定分量のゲノムDNAを作製した。
マウス及びヒトの成熟miR-142-3p配列が同一であるので、マウス及びヒトmiR-142-3pに特異的なプライマーセットを用いるTaqman microRNAアッセイにより、マウスT-リンパ球細胞株EL4、ヒトT-リンパ球細胞株SUP-T1及びヒト単球細胞株U937において、成熟miR-142-3pの発現を最初に確かめた。最初の感染がMOI 2である全三つの細胞株において、GFPを発現する組換えレトロウイルスベクター(pAC3-emd)の複製速度を試験した。感染28日後までにウイルス拡散が各々細胞集団の65%及び95%に達した時、ヒトT-リンパ球及び単球(SUP-T1及びU937)において、pAC3-emdベクターが効率よく複製したことを図19は示す。試験した時間枠の間、EL4細胞におけるベクター拡散は、5%未満のままであった。
GFPを発現する組換えレトロウイルスベクターのGFP発現抑制に対するmiR-142-3pの機能的効果をフローサイトメトリー解析により試験した。上記の一過性トランスフェクションから回収した計算した体積のpAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xベクターストックを用いて、新鮮なEL4、SUP-T1及びU937細胞をMOI 2で感染させた。フローサイトメトリー解析によるGFP発現解析のために、感染6、12及び18日後に一部の細胞を回収した。それらの親ベクターpAC3-emdと比較して、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xベクターで形質導入したEL4細胞において、GFP発現をバックグラウンドレベルにまで抑性したことを図20Aは示す。試験した時間枠内において、GFP抑性は持続した。それらの親ベクターpAC3-emdと比較して、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xベクターで形質導入した各々SUP-T1及びU937細胞におけるGFP発現の顕著な抑性を、図20B及び図20Cは示す。マウス及びヒト造血細胞におけるmiR-142-3p発現は、142-3pT配列を含む組換えレトロウイルスベクターで形質導入した細胞において、GFP発現を効果的に抑性することを結果は裏付ける。U937細胞において、4コピーの142-3pTを含むベクター(pAC3-emd-142-3pT4X)は、1コピーの142-3pTを含むベクター(pAC3-emd-142-3pT4X)よりもGFP発現抑制により効果的であり得ることを結果は示唆した。
上記のGFP発現抑制に対するmiR-142-3pTの機能的効果は、翻訳レベルにおけるGFP発現の直接的抑性に起因するのか、あるいは転写後レベルのウイルスゲノムの分解に起因するのかは不明である。実験の最後の時点において、標準的な分子生物学的方法を用いる全RNA抽出のために、一部の細胞を回収する。逆転写ウイルスRNAに由来するcDNAに特異的なプライマー(例えば、polプライマーセット及びenv2プライマーセット)を用いてqRT-PCRを行い、形質導入細胞のウイルス量を評価する。各々pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xで形質導入した細胞のウイルス量は、pAC3-emdベクターで形質導入した細胞よりも顕著に低いことを結果は示す。マウス及びヒト造血細胞におけるmiR-142-3pは、転写後レベルにおいてウイルスRNAゲノムを効果的に分解し、したがって、マウス及びヒト造血細胞におけるベクター拡散を制限するという考えを結果は支持する。
上記のGFP発現抑制に対するmiR-142-3pTの機能的効果は、翻訳レベルにおけるGFP発現の直接的抑性に起因するのか、あるいはウイルスゲノムの分解及びプロウイルスDNAの組込みに起因するのかは不明である。実験の最後の時点において、標準的な分子生物学的方法を用いるゲノムDNA抽出のために、一部の細胞を回収する。組み込まれたプロウイルスDNAに特異的なプライマーを用いてqPCRを行い、1細胞あたりの組み込まれたプロウイルスDNAのコピー数を評価する。各々pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xで形質導入した細胞の細胞あたりのコピー数は、pAC3-emdベクターで形質導入した細胞よりも顕著に低いことを結果は示す。マウス及びヒト造血細胞におけるmiR-142-3pは、転写後レベルにおいてウイルスRNAゲノムを効果的に分解し、したがって、マウス及びヒト造血細胞におけるベクター拡散を制限するという考えを結果は支持する。
142-3pTを含む組換えレトロウイルスベクターの多重連続感染サイクルを試験し、ベクターの安定性を評価する。最初に、HT1080及びU87-MG細胞を低いMOIにおいてベクターに感染させ、培養液中に拡散させる。各感染サイクルのベクターストックを回収、濾過、及び希釈し、新鮮な細胞に感染させる。env遺伝子の3'及びIRESに連結した異種ポリヌクレオチド配列のベクター下流にある非翻訳領域の3'に結合するプライマーを用いる標準的なPCRによって導入遺伝子安定性を評価するために、各感染サイクルの最後に細胞を回収し、ゲノムDNAを抽出する。1コピーの142-3pTを含むベクター(pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-yCD2-142-3pT)は少なくとも10〜20サイクルにわたって安定な状態であるが、142-3pTの四つのタンデムリピートを含むベクター(pAC3-emd-142-3pT4X及びpAC3-yCD2-142-3pT4X)は、初期の感染サイクルにおいて、142-3pT配列の欠損を示し得る。
下記の実施例27と同じ設計でこの実験を行う。移植したU87異種移植片を有する8週齢のBalb/Cマウスへの組換えレトロウイルスベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の静脈内注射により、造血細胞におけるベクター拡散を制限するmiR-142-3pの機能的効果をin vivoで試験する。各ベクターに対して、1つの時点(例えば、ウイルスベクター投与30日、60日及び90日後)をそれぞれ代表する3群のマウスがある。各ベクターストックの1E4〜1E7TU用量を全動物に静脈内注射により投与する。各時点の動物を屠殺し、脾臓、リンパ節及び骨髄及び腫瘍を摘出する。回収した亜集団細胞(例えば、CD4+、CD8+など)のGFP発現をフローサイトメトリー解析により解析する。重複実験において、各時点の動物を屠殺し、組織(例えば、肝臓、腎臓、脾臓、腫瘍など)をゲノムDNA抽出のために回収する。qPCRを行い、回収した組織中の組み込まれたプロウイルスDNAの存在を評価する。142-3pTを含むベクターのベクター拡散は造血組織において顕著に減少することを結果は示し、これらの組織におけるベクター複製の減少を示す。同時に、GFP及びPCRシグナルが腫瘍においてなお観察されることは、miR標的配列はリンパ組織における拡散を抑制するが、腫瘍組織における拡散をなお可能にさせることを示す。
完全な外科的切除の3か月後に再発性の退形成乏突起神経膠腫が現れるオスの35kgのボクサーイヌを、マンニトール及びスクロース、1mg/mlのHAS、0.1mg/mlのアスコルビン酸で等張にした等張Tris/NaCl、pH7.2で精製及び製剤化したT5.0002ウイルス(米国特許第5,792,643号;T.Rodriugez et al. J Gene Med 9:233 2007;米国特許出願第61218063号参照)で5-FCと併用して処置した。腫瘍は約13cm3であり、主要側脳室圧迫及び顕著な正中線偏位を引き起こした(図1参照)。大きいサイズの腫瘍であるため、対流増加送達(CED)を用いて、二つの別のカテーテル(400μL及び480μL)を通してToca 511を注射した。投与したToca 511の全用量は、約4.1×106TU/脳gであった。ProHance(登録商標)(ガドテリドール)をToca 511に加え、注射し、MRIによる送達の視覚化を可能にした。ベクターの分布量は、腫瘍体積の約10〜12%と推定された。
A.ヒトIFN-γ遺伝子をコードする複製適合性レトロウイルスベクターの構築及び試験
ヒトIFN-γ遺伝子をコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-hIFNgは、上記のpAC3-yCD2骨格に由来した。pAC3-hIFNgベクターのpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのPsi I及びNot Iでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。ヒトIFN-γ遺伝子のcDNA配列を同定し、異なるアクセッション番号(AM903379、BC070256、及びNM000619)から得た三つの配列間で確かめた。配列アラインメントはこの三つの間で同一の配列を示した。DNA断片の各末端に存在するPsi I及びNot I制限酵素部位を有するヒトIFN-γのオープンリーディングフレーム(配列番号38)を合成し、続いてpAC3骨格内の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-hIFNgは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びヒトIFN-γをコードする(図22)。
マウスIFN-γ遺伝子をコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-mIFNgは、上記のpAC3-yCD2骨格に由来した。pAC3-mIFNgベクターのpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのPsi I及びNot Iでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。マウスIFN-γ遺伝子のcDNA配列を同定し、異なるアクセッション番号(BC119063、BC119065及びNM008337)から得た三つの配列間で確かめた。配列アラインメントがこの三つの間で同一配列を示した。DNA断片の各末端に存在するPsi I及びNot I制限酵素部位を有するマウスIFN-γのオープンリーディングフレーム(配列番号39)を合成し、pAC3骨格内の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-mIFNgは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びマウスIFN-γをコードする(図22)。
目的
皮下結腸ガンを保有するBALB/cマウス(CT26.WT)に腫瘍内(IT)注射により送達する場合の、マウスγインターフェロン配列(pAC3-mIFNg)を保有する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクターの腫瘍増殖に対する効果を評価することが本研究の目的である。
メスのBALB/cマウス(8週齢)をジャクソン研究所(Bar Harbor,ME)から購入する。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させる。
CT26.WT細胞(ATCC, Manassas VA)は、N-ニトロソ-N-メチルウレタン(NNMU)で誘導される未分化結腸ガンの細胞株である。10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタマックス(Hyclone,Logan UT、及びInvitrogen,San Diego CA)を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養する。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。CT26.WT細胞(100μL中2E5)を、BALB/cマウスの右わき腹に注射する。
一過性トランスフェクションにより(又は、最初のトランスフェクション由来の感染ウイルスを用いた第二細胞株の感染後の産生細胞株から;米国特許出願第61218063号)、約3E6 TU/mlの力価を有するベクター調製物を作製する。最初の研究については、ベクターをさらに精製又は濃縮をしない。全用量反応曲線を得るための以後の実験のために、約10E8/mlと期待される力価を有する高い力価の精製物質を準備する。γインターフェロンは種交差反応性が低く、異種細胞株の使用が産生細胞に対するγインターフェロンの阻害作用を防ぐことから、高い力価の物質を得るために、イヌのCF2細胞株を産生のために選択する。本明細書に記載したように、ベクターを精製し、濃縮する。約3E3、3E4及び3E5 TU/マウスの総用量/マウスで、100μL体積でベクターをIT投与する。γインターフェロンを発現するベクターをToca 621とする。
メスBALB/c(99匹のマウス、9〜10週齢)の9群にCT26.WT腫瘍細胞を皮下移植し(0日目)、その後、ビヒクル(第一群)、対照ベクター[AC3-GFP(V)(第二群)、Toca 621ベクターのIT注射(第三〜五群)、又はToca 621ベクターの静脈内注射(第六〜八群)を(CT26腫瘍の増殖率に応じて4〜7日目に;約50〜100mm3)投与する。第九群のマウスには腫瘍を移植せず、ベクターのみ静脈内注射する。
最初に到達する方に基づいて2000mm3又は60日目まで腫瘍増殖解析を実行する。各群の10匹のマウスの腫瘍サイズを時間と共にプロットする。分散分析(ANOVA)を用いて統計的有意性を決定する。Prism 5統計ソフトウェア(GraphPad Software)又はそれと同等の物を用いて実行する全解析において、P値<0.05を統計的に有意であるとみなす。Toca 621投与に対する任意の有害事象を評価するために、生存中の観察も行う。
経時的な腫瘍サイズの測定結果は、対照ベクター又はビヒクルを注射した動物における腫瘍と比較して、γIFNを発現するベクターで処理した腫瘍増殖では統計的に有意な違いがあることを示す。
目的
皮下結腸ガンを保有するBALB/cマウス(CT26.WT)における腫瘍内(IT)注射により送達する場合の、マウスγインターフェロン配列(pAC3-mIFNg)を保有する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクターの腫瘍増殖における効果を評価することが本研究の目的である。
メスのBALB/cマウス(8週齢)をジャクソン研究所(Bar Harbor,ME)から購入する。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させる。
CT26.WT細胞(ATCC, Manassas VA)は、N-ニトロソ-N-メチルウレタン(NNMU)で誘導される未分化結腸ガンの細胞株である。10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタマックス(Hyclone,Logan UT、及びInvitrogen,San Diego CA)を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養する。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。CT26.WT細胞(100μL中2E5)を、BALB/cマウスの右わき腹に注射する。
一過性トランスフェクションにより(又は、最初のトランスフェクション由来の感染ウイルスを用いた第二細胞株の感染後の産生細胞株から;米国特許出願第61218063号)、約3E6TU/mlの力価を有するベクター調製物を作製する。最初の研究については、ベクターをさらに精製又は濃縮をしない。全用量反応曲線を得るための以後の実験のために、約10E8/mlと期待される力価を有する高い力価の精製物質を準備する。γインターフェロンは種交差反応性が低く、異種細胞株の使用が産生細胞に対するγインターフェロンの阻害作用を防ぐことから、高い力価の物質を得るために、イヌのCF2細胞株を産生のために選択する。本明細書に記載したように、ベクターを精製し、濃縮する。約3E3、3E4及び3E5 TU/マウスの総用量/マウスで、100μL体積でベクターをIT投与する。γインターフェロンを発現するベクターをToca 621とする。
メスBALB/c(99匹のマウス、9〜10週齢)の9群にCT26.WT腫瘍細胞を皮下移植し(0日目)、その後、溶媒(第一群)、対照ベクター[AC3-GFP(V)(第二群)、Toca 621ベクターのIT注射(第三〜五群)、又はToca 621ベクターの静脈内注射(第六〜八群)を(CT26腫瘍の増殖率に応じて4〜7日目に;約50〜100mm3)投与する。第九群のマウスには腫瘍を移植せず、ベクターのみ静脈内注射する。
最初に到達する方に基づいて2000mm3又は60日目まで腫瘍増殖解析を実行する。各群の10匹のマウスの腫瘍サイズを時間と共にプロットする。分散分析(ANOVA)を用いて統計的有意性を決定する。Prism 5統計ソフトウェア(GraphPad Software)又はそれと同等の物を用いて実行する全解析において、P値<0.05を統計的に有意であるとみなす。Toca 621投与に対する任意の有害事象を評価するために、生存中の観察も行う。
経時的な腫瘍サイズの測定結果は、対照ベクター又はビヒクルを注射した動物における腫瘍と比較して、γIFNを発現するベクターで処理した腫瘍増殖では統計的に有意な違いがあることを示す。
目的
マーカーの緑色蛍光タンパク質を保有する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクター(AC3-GFP(V))の、ヌードマウスの脳に移植したU87神経膠腫への静脈内送達の有効性を評価することが本研究の目的である。
メスの胸腺欠損nude-Foxn1^nu(ヌード)マウス(約8週齢)をハーラン社(Indianapolis IN)から購入した。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させた。右線条体に移植する、3.5mmの突起を含む蓋を取り付けた3.0mmの突起を備える留置ガイドカニューレの外科的留置をマウスに行った。定位座標は、(十字縫合から)AP=+0.5mm、ML=-1.8mmである。
U-87 MG細胞(ATCC, Manassas VA)は、44歳の白人女性の悪性神経膠腫に由来する。10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタマックス(Hyclone,Logan UT、及びInvitrogen,San Diego CA)を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養した。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。ガイドカニューレを通して挿入した3.5mm突起を有する注射カニューレにより、U-87 MG細胞(1μL中に1E5)を1分あたり0.2μLで頭蓋(IC)に注入した(5分、その後5分間の保持が続く)。
ベクター調製物を、一過性トランスフェクションにより作製し、全てのベクターは約2.8E7 TU/mlの力価を有した。約1.4E45 TU/マウスの最小総用量/マウスで、5μL以下の量で腫瘍内に(IT)ベクターを投与した。静脈内注射を2.8E6/100μLで尾静脈に行った。
メスの胸腺欠損nude-Foxn1^nuマウス(16匹、9〜10週齢)の5群にU-87腫瘍細胞をICに移植し(0日目)、その後、ビヒクルIV(第一群)、ベクターIV(第二群)で(U-87細胞の増殖率に応じて4〜7日目に)IT又はIVに、血液脳関門破壊物質バルデナフィル及びベクターでITに(第三群)、バルデナフィル及びベクターでITに(第四群)、又はベクターでITに(第五群)投与した。ベクター注射14日後、マウスを屠殺し、腫瘍を単離し、GFP発現について解析した。
マウスから単離しバラバラにした腫瘍のU87細胞を、第二〜五群のGFP陽性パーセントについて、フローサイトメトリーにより解析した(図26)。単離したU87細胞のGFPシグナルの分布を測定するために、第一、第三、及び第五群においてヒストグラム解析も行った(図27)。
GFPの静脈内送達は、ヌードマウスの頭蓋内に移植したU87神経膠腫細胞の腫瘍内注射と同等に効果的であった。
ヒトIL2遺伝子をコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-hIL2は、pAC3-yCD2骨格に由来する。pAC3-hIL2ベクターコード化プラスミドDNAのpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのPsi I及びNot Iでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。ヒトIFN-γ遺伝子のcDNA配列を、異なるアクセッション番号(BC066255及びBC066257)から得た配列を用いて同定し、確かめた。二つの配列アラインメントは同一配列を明らかにした。DNA断片の各末端に存在するPsi I及びNot I制限酵素部位を有するヒトIFN-γのオープンリーディングフレーム(配列番号40)を合成し、続いてpAC3骨格の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-hIL2は、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びヒトIL2をコードする(図28)。
目的
皮下結腸ガンを保有するBALB/cマウス(CT26.WT)における腫瘍内(IT)注射により送達する場合の、マウス白血球指向性ホルモンインターロイキン2(IL-2)配列(pAC3-mIL2)を保有する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクターの、腫瘍増殖における効果を評価することが本研究の目的である。
メスのBALB/cマウス(約8週齢)をジャクソン研究所(Bar Harbor,ME)から購入する。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させる。
CT26.WT細胞(ATCC, Manassas VA)は、N-ニトロソ-N-メチルウレタン(NNMU)で誘導される未分化結腸ガンの細胞株である。10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタマックス(Hyclone,Logan UT、及びInvitrogen,San Diego CA)を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養する。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。CT26.WT細胞(100μL中2E5)を、BALB/cマウスの右わき腹に注射する。
一過性トランスフェクションにより(又は産生細胞株から;仮出願参照)、約6E6 TU/mlの力価を有するベクター調製物を作製する。最初の研究については、ベクターをさらに精製又は濃縮をしない。全用量反応曲線を得るための以後の実験のために、約10E8/mlと期待される力価を有する高い力価の精製物質を準備する。約6E5 TU/マウスの総用量/マウスで、100μL量でITにベクターを投与する。γインターフェロンを発現するベクターをToca IL2とする。
メスBALB/c(55匹のマウス、9〜10週齢)の5群にCT26.WT腫瘍細胞を皮下移植し(0日目)、その後、ビヒクル(第一群)、対照ベクターAC3-GFP(V)(第二群)、Toca IL2ベクターのIT注射(第三群)、又はToca IL2ベクターの静脈内注射(第四群)を(CT26腫瘍の増殖率に応じて4〜7日目に;約50〜100mm3)投与する。第五群のマウスには腫瘍を移植せず、ベクターのみ静脈内注射する。
最初の状態に基づいて2000mm3又は60日目まで腫瘍増殖解析を実行する。各群の10匹のマウスの腫瘍サイズを時間と共にプロットする。分散分析(ANOVA)を用いて統計的有意性を決定する。Prism 5統計ソフトウェア(GraphPad Software)又はそれと同等の物を用いて実行する全解析において、P値<0.05を統計的に有意であるとみなす。治療中のIL-2発現に対する任意の有害事象を評価するために、生存中の観察も行う。
MLVを複製させることによるIL-2の送達は、BALB/c CT26マウスモデルの腫瘍量を減少させ、場合によっては除去する。
Claims (43)
- レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端に、配列番号19若しくは22のヌクレオチド9405位から9998位までに記載の配列を有する長末端反復(LTR)配列、前記レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端に哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、
配列番号19若しくは22のヌクレオチド1203位からヌクレオチド2819位までに記載の配列を有するgag核酸ドメイン、
配列番号19若しくは22のヌクレオチド2820位からヌクレオチド6358位までに記載の配列を有するpol核酸ドメイン及び
配列番号19若しくは22のヌクレオチド6359位からヌクレオチド8323位までに記載の配列を有するenv核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド;
異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された内部リボソーム侵入部位(IRES)及びRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含むカセットであって、3'LTRの5'側、及びレトロウイルスエンベロープをコードするenv核酸ドメインの3'側に位置するカセット;並びに
標的細胞での逆転写、パッケージング及び組込みのために必要なシス作用性配列を含み、
前記カセットは配列番号21のIRESカセットと比べて、カセットのいずれかの側の直接反復を欠き、6継代培養後に、配列番号21を含むベクター(pACE)と比較してより高い複製能力を維持する、組換え複製適合性レトロウイルス(RCR)。 - 前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列が、マウス白血病ウイルス(MLV)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)又はテナガザル白血病ウイルス(GALV)に由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記MLVが両種性MLVである、請求項1又は2に記載のレトロウイルス。
- 前記レトロウイルスがガンマレトロウイルスである、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記標的細胞が、細胞増殖性障害を有する細胞である、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記標的細胞が新生物細胞である、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記細胞増殖性障害が、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、尿路癌、子宮癌、脳腫瘍、頭頚部癌、膵臓癌、黒色腫、胃癌及び卵巣癌、関節リウマチ又は他の自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項5に記載のレトロウイルス。
- 前記プロモーター配列が増殖調節遺伝子に関連する、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記プロモーター配列が組織特異プロモーター配列を含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記組織特異プロモーター配列が少なくとも一つのアンドロゲン応答エレメント(ARE)を含む、請求項9に記載のレトロウイルス。
- 前記アンドロゲン応答エレメントがプロバシンプロモーターに由来する、請求項10に記載のレトロウイルス。
- 前記組織特異プロモーター配列がプロバシンプロモーターを含む、請求項9に記載のレトロウイルス。
- 前記プロモーターが、配列番号19、20又は22のヌクレオチド1位からヌクレオチド582位までに記載の配列を有するCMVプロモーターを含み、一つ又は複数の核酸塩基に対する改変を含んでもよく、転写を誘導し開始することができる、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記プロモーターが、配列番号19、20又は22のヌクレオチド1位からヌクレオチド582位までに記載の配列を含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記プロモーターがCMV-R-U5ドメインポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記CMV-R-U5ドメインが、MLV R-U5領域に連結されたヒトサイトメガロウイルス由来の前初期プロモーターを含む、請求項15に記載のレトロウイルス。
- 前記CMV-R-U5ドメインポリヌクレオチドが、配列番号19、20若しくは22のヌクレオチド1位からヌクレオチド1202位までに記載の配列、又は配列番号19、20若しくは22に記載の配列に対し少なくとも95%同一である配列を含み、前記ポリヌクレオチドが、作動可能にそれに連結された核酸分子の転写を促進する、請求項16に記載のレトロウイルス。
- 前記gagポリヌクレオチドがガンマレトロウイルスに由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記ポリヌクレオチドのpolドメインがガンマレトロウイルスに由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記3'LTRがガンマレトロウイルスに由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記3'LTRがU3-R-U5ドメインを含む、請求項20に記載のレトロウイルス。
- 前記異種核酸配列が生体応答調節因子をコードする、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記生体応答調節因子が免疫増強サイトカインを含む、請求項22に記載のレトロウイルス。
- 前記免疫増強サイトカインが、インターロイキン1〜15、インターフェロン、腫瘍壊死因子(TNF)及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)からなる群から選択される、請求項23に記載のレトロウイルス。
- 前記免疫増強サイトカインがインターフェロンである、請求項23に記載のレトロウイルス。
- 前記インターフェロンがガンマインターフェロンである、請求項25に記載のレトロウイルス。
- 前記異種核酸が、無毒性プロドラッグを毒性薬物に変換するポリペプチドをコードする、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 無毒性プロドラッグを毒性薬物に変換する前記ポリペプチドが、チミジンキナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)又はシトシンデアミナーゼである、請求項27に記載のレトロウイルス。
- 前記異種核酸配列がターゲッティング部分をコードする、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記ターゲッティング部分が癌抗原を含む、請求項29に記載のレトロウイルス。
- 前記異種核酸配列が結合ドメインをコードする、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記結合ドメインが受容体ドメイン、抗体又は抗体断片を含む、請求項31に記載のレトロウイルス。
- 前記異種核酸配列が抑制性ポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
- 前記抑制性ポリヌクレオチドがRNAi又はsiRNA配列を含む、請求項33に記載のレトロウイルス。
- 細胞増殖性障害の治療における使用のための組成物であって、請求項1に記載のレトロウイルスを含み、前記異種核酸配列は新生物細胞の増殖を阻害する治療的タンパク質をコードする、組成物。
- 前記治療的タンパク質が、非細胞毒性薬物を細胞毒性薬物に変換するポリペプチドを含む、請求項35に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドがシトシンデアミナーゼ活性を有する、請求項36に記載の組成物。
- 前記非細胞毒性薬物が5-フルオロシトシンである、請求項36に記載の組成物。
- 細胞増殖性障害の治療における使用のための組成物であって、請求項1に記載のレトロウイルス、及び抗癌剤又は化学療法剤を含む組成物。
- 前記抗癌剤が、ベバシズマブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、AE-941、VEGF Trap、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブ、フェンレチニド、スクアラミン、INGN-241、経口テトラチオモリブデート、テトラチオモリブデート、Panzem NCD、2-メトキシエストラジオール、AEE-788、AG-013958、ベバシラニブナトリウム、AMG-706、アクシチニブ、BIBF-1120、CDP-791、CP-547632、PI-88、SU-14813、SU-6668、XL-647、XL-999、IMC-1121B、ABT-869、BAY-57-9352、BAY-73-4506、BMS-582664、CEP-7055、CHIR-265、CT-322、CX-3542、E-7080、ENMD-1198、OSI-930、PTC-299、Sirna-027、TKI-258、Veglin、XL-184及びZK-304709からなる群から選択される、請求項39に記載の組成物。
- レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端に、配列番号19若しくは22のヌクレオチド9405位から9998位までに記載の配列を有する長末端反復(LTR)配列、前記レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端に哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、
配列番号19若しくは22のヌクレオチド1203位からヌクレオチド2819位までに記載の配列を有するgag核酸ドメイン、
配列番号19若しくは22のヌクレオチド2820位からヌクレオチド6358位までに記載の配列を有するpol核酸ドメイン及び
配列番号19若しくは22のヌクレオチド6359位からヌクレオチド8323位までに記載の配列を有するenv核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド;
polIIIプロモーター及びsiRNA又はshRNAを含むカセット、
標的細胞での逆転写、パッケージング及び組込みのために必要なシス作用性配列、
を含み、前記カセットは配列番号21のIRESカセットと比べて、カセットのいずれかの側の直接反復を欠き、該ベクターは、細胞中で少なくとも6継代の間少なくとも90%安定である、組換え複製適合性レトロウイルス(RCR)。 - 前記ベクターが、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたIRESカセットをさらに含む、請求項41に記載のベクター。
- 前記IRESカセットがenv遺伝子のすぐ3'側に位置する、請求項42に記載のベクター。
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